CN116790662A - 一种绵羊vasa基因报告载体的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绵羊VASA基因报告载体的构建方法及其应用，本发明的目的是利用CRISPR/Cas9技术，构建VASA基因的报告载体，并利用CRISP/dCas9***在成纤维细胞验证敲入载体的有效性。本发明载体的构建方法是：①构建EGFP‑PGK puro‑VASA报告载体；②基于VASA基因外显子序列设计靶向gRNA序列，并构建Cas9‑gRNA敲入载体，共同进行成纤维细胞转染；③利用CRISPR/dCas9激活***激活VASA基因表达。本发明的载体可以在体外细胞中进行有效性验证。通过本发明，可以实现外源基因VASA在绵羊成纤维细胞中的激活表达，为进一步探索生殖特异性基因的功能提供研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种绵羊VASA基因报告载体的构建方法及其应用。
背景技术
VASA基因是编码ATP依赖性RNA解旋酶的基因DEAD-box家族中的成员，又名DDX4或MVH，最初在果蝇中鉴定出来，研究表明VASA基因在无脊椎动物和脊椎动物中高度保守，且VASA蛋白的分子功能包括：可以与生殖细胞建立相关的靶mRNA相结合，以及控制卵子发生过程中翻译的起始。目前，VASA基因已经在果蝇、鱼类、蟹类、哺乳动物等的生殖细胞中有广泛研究。在鱼类原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)的起源和迁移研究中，VASA基因可作为标记物示踪PGCs的整个发育过程，且在***发生整个过程均有表达。VASA基因在青蟹的卵巢和睾丸中均表达，在***发生过程中VASA表达呈现动态变化，且主要在***和初级***细胞表达。在人类当中，VASA在***头部和尾部的细胞质膜表达，且在少***症男性中表达显著降低，因此，VASA可以作为***的分子标志物。VASA同源物(MVH)基因纯合突变小鼠以性别依赖的方式呈现出生殖缺陷，MVH纯合突变会导致雄性小鼠出现生精缺陷，造成睾丸中减数***损伤和细胞凋亡等，使胚胎中雄性性腺异常发育，但不影响雌性生殖细胞的发育。VASA基因在人胎儿和成年性腺中均有表达，主要在***细胞和成熟***表达较高，是人类生殖细胞高度特异性标记基因。此外，在不同物种中，VASA基因在不同性别的表达也不同，比如在雌性血吸虫中表达水平高于雄性；在亚洲黄塘鳖不同性别胚胎中，卵巢中表达水平高于睾丸，但出生后则相反。因此，VASA基因被认为是多种动物生殖细胞谱系鉴定的分子标记，是研究生殖细胞分化和发育的关键基因。
CRISPR/Cas9***包含Cas9蛋白和向导RNA(guide RNA，gRNA)，由Cas9蛋白发挥DNA双链切割作用，gRNA起向导识别作用，DNA双链断裂(DNAdouble strand breaks，DSB)后利用同源定向修复(homology directed repair，HDR)、微同源介导的末端连接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)、基于同源介导的末端连接(homology-mediated end joining，HMEJ)或非同源末端连接方式(non-homologous end joining，NHEJ)进行自我修复，进而完成基因的靶向突变、***、缺失或基因敲除，实现对基因组的修饰。CRISPR/Cas9基因编辑技术具有靶向效率高、脱靶效应低、技术难度低等优点，被广泛用于疾病防治、家畜育种等研究。CRISPR/Cas9敲入***可以将外源DNA有效敲入目标基因组位点，促进靶向基因的功能发挥，达到编辑基因组的目的。目前，基于CRISPR/Cas9基因敲入技术已经成功构建多个基因的敲入细胞系和小鼠模型。
VASA基因作为生殖细胞标记物，研究其对生殖细胞发育的影响至关重要，但关于绵羊VASA基因的研究甚少。本发明基于CRISPR/Cas9***，构建pEGFP-PGK puro-VASA敲入质粒，利用CRISPR/dCas9技术进一步验证敲入效率，成功构建绵羊VASA基因报告载体，为研究VASA基因在绵羊生殖细胞体外诱导分化及发育中的作用机制奠定基础。
发明内容
VASA基因是研究生殖细胞和生殖腺起源和发育的生殖系标记物，目前关于VASA基因在绵羊中的探索较少。本发明的目的在于利用CRISPR/Cas9***构建VASA基因报告载体，并采用CRISPR/dCas9技术进行VASA基因激活，明确VASA基因在绵羊成纤维细胞中可以成功进行激活表达，为未来进一步探索VASA基因参与绵羊生殖细胞发育的调控机制提供参考依据。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种VASA基因报告载体，该VASA基因报告载体包括重组EGFP-PGK puro-VASA质粒、Cas9-gRNA质粒和CRISPR dCas9激活载体；
所述的重组EGFP-PGK puro-VASA质粒是采用以下方法得到：根据VASA基因第24个外显子附近的序列信息，找到PAM位点，分别设计VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物，并以目标物种(如绵羊)基因组DNA为模板，扩增得到含有酶切位点的同源臂片段，并连接至pMD-19T载体，获得pMD-5&3HA中间载体；以TV-hPITX3-Reverse(Addgene，22208)为模板，设计引物并通过PCR扩增得到EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段再与线性化的pMD-5&3HA中间载体进行连接，获得重组EGFP-PGK puro-VASA质粒；
所述的Cas9-gRNA质粒是采用以下方法得到的：根据上述的PAM位点，设计并合成gRNA引物，将已合成的gRNA引物退火并进行酶切后连接***线性化的pX330质粒(Addgene，42230)得到Cas9-gRNA质粒；
所述的CRISPR dCas9激活载体是采用以下方法得到的：设计并合成靶向VASA基因启动子的sgRNA引物；sgRNA引物退火并进行酶切后连接***线性化的dCas9-p300质粒(Addgene，61361)，成功构建CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒。
作为一种优选技术方案，所述的VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物的核苷酸序列如下所示：
5’homologous arm-F：GCTAGCATCCCATGACTCATCATCTA(SEQ ID NO.1)
5’homologous arm-R：TCATCCAGCCCAGCATTTTG(SEQ ID NO.2)
3’homologous arm-F：GGTACCCCCCTGTATTTATGTCTCACTTGTT(SEQ ID NO.3)
3’homologous arm-R：CTCGAGGATGCAGAGAAGAAAGTAG(SEQ ID NO.4)；
所述EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段相关引物的核苷酸序列如下所示：
P2A-EGFP-F：
CAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGTGAGCAAGGG CGAGGAGCT(SEQ ID NO.5)
XHOI-LOXP-PURO-R：
ACTCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGAACCTCTTCGAGGGAC CTA(SEQID NO.6)
NHEI-P2A-F：
TCAGCTAGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCA(SEQ ID NO.7)。
作为一种优选技术方案，所述的gRNA引物为gRNA3引物或gRNA4引物，所述gRNA3引物和gRNA4引物的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
VASA-gRNA3-F：tttcttggctttatatatcttgtggaaaggacGAAAACAACCTGCAAGTTTG(SEQID NO.8)
VASA-gRNA3-R：tcaacttgctatgctgtttccagcatagctctgaaacCAAACTTGCAGGTTGTTTTC(SEQ ID NO.9)
VASA-gRNA4-F：tttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGACTCATCATCTACTGGATT(SEQ ID NO.10)
VASA-gRNA4-R：tcaacttgctatgctgtttccagcatagctctgaaacAATCCAGTAGATGATGAGTC(SEQ ID NO.11)。
作为一种优选技术方案，所述的sgRNA引物为sgRNA-a和sgRNA-b中的至少一种，所述的sgRNA-a和sgRNA-b的核苷酸序列如下所示：
sgRNA-a：TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAACTGTACC ACAAACTTGC(SEQ ID NO.12)
sgRNA-b：TCAACTTGCTATGCTGTTTCCAGCATAGCTCTGAAACGCAAGTTTGTGGT ACAGTTC(SEQ ID NO.13)。
一种VASA基因报告载体的构建方法也属于本发明的保护范围，所述的VASA基因报告载体包括重组EGFP-PGK puro-VASA质粒、Cas9-gRNA质粒和CRISPR dCas9激活载体；
(1)所述重组EGFP-PGK puro-VASA质粒的构建方法为：分别设计VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物，并以目标物种基因组DNA为模板，扩增得到含有酶切位点的同源臂片段，并连接至pMD-19T载体，获得pMD-5&3HA中间载体；以TV-hPITX3-Reverse为模板，设计引物并通过PCR扩增得到EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段再与线性化的pMD-5&3HA中间载体进行连接，获得重组EGFP-PGK puro-VASA质粒；
(2)所述Cas9-gRNA质粒的构建方法为：根据上述的PAM位点，设计并合成gRNA引物，将已合成的gRNA引物退火并进行酶切后连接***线性化的pX330质粒得到Cas9-gRNA质粒；
(3)所述CRISPR dCas9激活载体的构建方法为：设计并合成靶向VASA基因启动子的sgRNA引物；sgRNA引物退火并进行酶切后连接***线性化的dCas9-p300质粒，成功构建CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒。
上述构建方法中所涉及的引物如上所述。
上述的VASA基因报告载体在敲入并激活表达VASA基因中的应用也属于本发明的保护范围。
上述的VASA基因报告载体在研究VASA基因参与绵羊生殖细胞发育的调控机制中的应用也属于本发明的保护范围。
一种VASA基因报告并激活表达的方法，采用上述的VASA基因报告载体敲入并激活VASA基因。作为一种优选技术方案，先将重组pEGFP-PGK puro-VASA质粒和Cas9-gRNA质粒共同转染目标工具细胞，进行puro药筛，然后采用所述的CRISPR dCas9激活载体转染药筛后的细胞，激活细胞中VASA基因的表达。
本发明利用CRISPR/Cas9技术，构建VASA基因的敲入载体，并利用CRISP/dCas9***在成纤维细胞验证敲入载体的有效性。本发明载体的构建方法是：①构建EGFP-PGKpuro-VASA载体并进行成纤维细胞转染；②基于VASA基因外显子序列设计靶向gRNA序列，并构建Cas9-gRNA敲入载体；③利用CRISPR/dCas9激活***激活VASA基因表达。
本发明的载体可以在体外细胞中进行有效性验证。通过本发明，可以实现VASA-EGFP合成基因在绵羊成纤维细胞中的激活表达和示踪，为进一步探索生殖特异性基因的功能提供研究基础。
本发明的有益效果：
本发明利用CRISPR/Cas9技术体外构建VASA基因报告载体，成功转入绵羊成纤维细胞，并进一步结合CRISPR/dCas9***激活了VASA基因的表达，证明VASA基因报告载体的有效性，为下一步研究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞发育和分化的研究提供参考。
附图说明
图1：pEGFP-PGK puro-VASA载体构建示意图和结构图。
图2：pEGFP-PGK puro-VASA载体两侧同源臂扩增产物胶图。
图3：VASA基因gRNA打靶位点及体外引导切割验证胶图。
图4：VASA基因Cas9-gRNA载体构建示意图与gRNA序列***测序鉴定。
图5：成纤维细胞体外转染VASA基因报告载体后扩增产物胶图。
图6：靶向VASA基因的sgRNA设计图。
图7：成纤维细胞体外转染VASA基因sgRNA载体以激活VASA基因表达产物胶图及荧光表达图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不用来限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂供应商处购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
实施例1：荧光报告载体EGFP-PGK puro-VASA构建及验证
根据NCBI数据库中VASA基因序列信息，在24号外显子附近确定两个PAM位点，分别设计VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物，并以绵羊基因组DNA为模板，扩增得到含有酶切位点的同源臂片段，并连接至pMD-19T载体，获得pMD-5&3HA中间载体；以TV-hPITX3-Reverse(Addgene，22208)为模板，设计引物并通过PCR扩增得到EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段再与线性化的pMD-5&3HA中间载体进行连接，获得重组EGFP-PGK puro-VASA质粒；
VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物的核苷酸序列如表1所示：
表1VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物序列
EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段相关引物的核苷酸序列如下所示：
P2A-EGFP-F：CAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
XHOI-LOXP-PURO-R：ACTCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGAACCTCTTCGAGGGACCTA
NHEI-P2A-F：TCAGCTAGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCA。
详细过程如下所示：
1.先以绵羊基因组DNA为模板，以5’homologous arm-F和5’homologous arm-R为引物扩增得到含有酶切位点的5`同源臂(HA)片段，将5`同源臂(HA)连接至pMD-19T，然后测序选择M13-47F引物(F：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，R：CACACAGGAAACAGCTATGAC)测序为正向的菌液提取质粒。
2.以绵羊基因组DNA为模板，以3’homologous arm-F和3’homologous arm-R为引物扩增得到含有酶切位点的5`同源臂(HA)片段，将3`HA连接至pMD-19T后，两端测序，提取两端均含有KpnI的菌液的质粒。
3.使用KpnI酶切pMD-3HA和pMD-5HA回收线性化的pMD-5HA和3`HA，然后使用T4-连接酶连接，转化，测序得到正确方向的pMD-5&3HA。
4.以TV-hPITX3-Reverse(Addgene，22208)为模板，利用高保真酶参照说明利用P2A-EGFP-F和XHOI-LOXP-PURO-R引物扩增P2A(后)-EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP，然后取出扩增好的产物直接稀释十倍后用1μL作为模板用NheⅠ-P2A-F和XhoⅠ-loxp-puro-R引物扩增P2A-EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP，然后进行PCR产物回收。
5.然后使用NheⅠ和XhoⅠ双酶切pMD-5&3HA和P2A-EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP PCR回收产物，然后回收酶切产物，然后通过T4连接酶连接，得到目的产物pVASA-EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP(即重组EGFP-PGK puro-VASA质粒)。
重组pEGFP-PGK puro-VASA载体构建示意图和载体图谱见图1；将载体进行凝胶电泳，如图2所示，表明可成功扩增出两侧同源臂，且符合目标大小。
实施例2：VASA基因gRNA设计及Cas9-gRNA表达质粒构建
根据上述VASA基因第24号外显子附近的PAM位点信息，涉及gRNA序列。本实施例针对VASA基因24号外显子设计3条gRNA，其中gRNA3位于正义链，gRNA1和4位于负义链，三条gRNA的打靶位点如图3所示，各gRNA序列如表2所示。
表2VASA基因gRNA序列
进一步采用张锋实验室构建的Cas9和gRNA共表达载体pX330，在gRNA序列两端加上BbsⅠ粘性末端，交由南京擎科生物技术有限公司合成。将已合成的gRNA引物进行退火，即用T4 PNK处理gRNA，并进行PCR反应，37℃30min、95℃5min，以5℃/min速度从95℃退火至25℃，4℃保存样品。退火后的样品进行酶切和连接***pX330质粒(质粒构建反应体系和酶切连接反应体系见表3和表4)，即37℃5min，21℃5min，6个循环。最后将酶切连接反应产物和Dh5α感受态细胞混合进行质粒转化和测序，提取DNA，进行体外引导切割实验，电泳结果证明三条gRNA条带明显，测序表明三个质粒Cas9-g1、Cas9-g3和Cas9-g4引导序列***正确(图4)。
表3gRNA PX330质粒构建反应体系
表4酶切连接反应体系
实施例3：体外转染VASA基因Cas9-gRNA及EGFP-PGK puro-VASA质粒载体及鉴定
采集绵羊耳朵组织，75％酒精消毒后，在超净工作台剪去羊毛，分离上皮组织，清洗多次后，剪成1mm2小组织块进行组织贴壁法进行成纤维细胞分离，用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基在37℃和5％ CO2培养箱进行培养，大概培养一周后，细胞成功分离，用于下一步实验。
为验证所构建敲入载体有效性，在绵羊耳成纤维细胞进行Cas9-gRNA和EGFP-PGKpuro-VASA质粒转染，主要包括将细胞培养至六孔板培养皿，用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基在37℃和5％ CO2培养箱进行培养，细胞汇合度达95％左右进行传代，待细胞密度达70-80％左右，根据3000试剂(Invitrogen，L3000-008)说明将已构建的Cas9-gRNA质粒和pEGFP-PGK puro-VASA质粒共同进行转染，即每个六孔板转染质粒DNA量共2.5μg，转染48h后进行药筛，即利用含抗生素puro的培养液进行细胞培养，每天换液，去除死细胞，3-5d后待细胞长满进行下一步实验及DNA和RNA提取。收集细胞基因组DNA进行靶向切割实验检测和扩增目的条带检测；如图5所示，T7E1检测表明Cas9-g3和Cas9-g4条带明显，证明两条gRNA可成功进行基因组切割；PCR扩增结果表明，转染后可成功扩出2627bp大小的片段，证明VASA基因被成功敲入细胞中，后续实验利用Cas9-gRNA3载体进行转染。
实施例4：CRISPR/dCas9激活VASA基因效率测定
为有效激活VASA基因在体外的表达，根据VASA基因启动子序列信息，在sgRNA设计网站设计靶向激活VASA的两条sgRNA(图6)，sgRNA序列见表。
表5VASA基因sgRNA序列
用BbsI在37℃条件下酶切载体质粒dCas9-p300，琼脂糖凝胶电泳后，用DNA片段回收试剂盒进行切胶回收目的载体片段，在PCR仪进行引物退火，进行酶连接后进行转化、提取质粒，送公司测序后，提取目的质粒，成功构建CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒。本实施例将sgRNA-a和sgRNA-b分别与酶切后的载体质粒dCas9-p300连接，分别构建含有sgRNA-a的CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒和含有sgRNA-b的CRISPR/dCas9-p300Activator表达质粒；
将已构建的CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒转染至前期药筛得到的绵羊耳成纤维细胞，48h后提取细胞总RNA进行下一步VASA基因定量表达鉴定及荧光鉴定，结果表明，单独转染含有sgRNA-a或sgRNA-b的CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒时，效果较差，同时转染含有sgRNA-a的CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒和含有sgRNA-b的CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒可有效提高VASA基因的表达水平(P<0.05)，同时在荧光显微镜下观察发现，通过转染两条sgRNA后，细胞出现目的荧光(图7)，证明同时转染两种CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒可有效激活绵羊耳成纤维细胞中VASA基因的表达。
细胞DNA、RNA提取与荧光定量PCR的详细过程为：在耳成纤维细胞转染cas9-gRNA及重组pEGFP-PGK puro-VASA质粒48h后，进一步经过puro药筛，待细胞汇合至95％左右，吸去培养液，DPBS洗三次，参照试剂说明进行细胞基因组DNA提取，纯化后进行下一步PCR实验；在药筛后耳成纤维细胞转染CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒48h后，加入Trizol试剂裂解细胞，充***解后转移至1.5mL离心管，根据说明书进行RNA提取，并根据诺维赞反转录说明书进行cDNA合成。利用NCBI数据库设计VASA基因引物，并由南京擎科生物技术有限公司合成。根据诺唯赞SYBR qPCR荧光定量预混酶说明进行荧光定量实验，其中反应体系包含：SYBR qPCR Master Mix 10μL、基因上下游引物(10μmol·L-1)各0.6μL、cDNA1μg、Nuclease Free Water补充至20μL。反应体系参照如下条件在荧光定量PCR仪进行反应，反应条件如下：50℃，2min；95℃预变性10min；依次95℃15s、60℃30s、72℃30s，共40个循环；最后72℃延伸10min。结果数据通过2-ΔΔCt法，以ACTB基因为内参基因对VASA基因表达量进行相对定量分析(序列见表6)。
表6基因引物序列
数据处理及分析：本发明所涉及试验均重复至少3次，试验数据以均值±标准误(mean value±SEM)表示。SPSS(24)软件对数据进行差异显著性分析，*、**与***分别代表差异性显著P<0.05、P<0.01与P<0.001。
Claims (10)
1.一种VASA基因报告载体，其特征在于，该VASA基因报告载体包括重组EGFP-PGKpuro-VASA质粒、Cas9-gRNA质粒和CRISPR dCas9激活载体；
所述的重组EGFP-PGK puro-VASA质粒是采用以下方法得到：分别设计VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物，并以目标物种基因组DNA为模板，扩增得到含有酶切位点的同源臂片段，并连接至pMD-19T载体，获得pMD-5&3HA中间载体；以TV-hPITX3-Reverse为模板，设计引物并通过PCR扩增得到EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段再与线性化的pMD-5&3HA中间载体进行连接，获得重组EGFP-PGK puro-VASA质粒；
所述的Cas9-gRNA质粒是采用以下方法得到的：根据上述的PAM位点，设计并合成gRNA引物，将已合成的gRNA引物退火并进行酶切后连接***线性化的pX330质粒得到Cas9-gRNA质粒；
所述的CRISPR dCas9激活载体是采用以下方法得到的：设计并合成靶向VASA基因启动子的sgRNA引物；sgRNA引物退火并进行酶切后连接***线性化的dCas9-p300质粒，成功构建CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒。
2.根据权利要求1所述的VASA基因报告载体，其特征在于，所述的VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物的核苷酸序列如下所示：
5’homologous arm-F：GCTAGCATCCCATGACTCATCATCTA
5’homologous arm-R：TCATCCAGCCCAGCATTTTG
3’homologous arm-F：GGTACCCCCCTGTATTTATGTCTCACTTGTT
3’homologous arm-R：CTCGAGGATGCAGAGAAGAAAGTAG；
所述EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段相关引物的核苷酸序列如下所示：
P2A-EGFP-F：
CAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
XHOI-LOXP-PURO-R：
ACTCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGAACCTCTTCGAGGGACCTA
NHEI-P2A-F：
TCAGCTAGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCA。
3.根据权利要求1所述的VASA基因报告载体，其特征在于，所述的gRNA引物为gRNA3引物或gRNA4引物，所述gRNA3引物和gRNA4引物的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
VASA-gRNA3-F：tttcttggctttatatatcttgtggaaaggacGAAAACAACCTGCAAGTTTG
VASA-gRNA3-R：tcaacttgctatgctgtttccagcatagctctgaaacCAAACTTGCAGGTTGTTTTC
VASA-gRNA4-F：tttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGACTCATCATCTACTGGATT
VASA-gRNA4-R：tcaacttgctatgctgtttccagcatagctctgaaacAATCCAGTAGATGATGAGTC。
4.根据权利要求1所述的VASA基因报告载体，其特征在于，所述的sgRNA引物为sgRNA-a和sgRNA-b中的至少一种，所述sgRNA-a和sgRNA-b的核苷酸序列如下所示：
sgRNA-a：TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAACTGTACCACAAACTTGC
sgRNA-b：TCAACTTGCTATGCTGTTTCCAGCATAGCTCTGAAACGCAAGTTTGTGGTACAGTTC。
5.一种VASA基因报告载体的构建方法，其特征在于，所述的VASA基因报告载体包括重组EGFP-PGK puro-VASA质粒、Cas9-gRNA质粒和CRISPR dCas9激活载体；
(1)所述重组EGFP-PGK puro-VASA质粒的构建方法为：分别设计VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物，并以目标物种基因组DNA为模板，扩增得到含有酶切位点的同源臂片段，并连接至pMD-19T载体，获得pMD-5&3HA中间载体；以TV-hPITX3-Reverse为模板，设计引物并通过PCR扩增得到EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段再与线性化的pMD-5&3HA中间载体进行连接，获得重组EGFP-PGK puro-VASA质粒；
(2)所述Cas9-gRNA质粒的构建方法为：根据上述的PAM位点，设计并合成gRNA引物，将已合成的gRNA引物退火并进行酶切后连接***线性化的pX330质粒得到Cas9-gRNA质粒；
(3)所述CRISPR dCas9激活载体的构建方法为：设计并合成靶向VASA基因启动子的sgRNA引物；sgRNA引物退火并进行酶切后连接***线性化的dCas9-p300质粒，成功构建CRISPR/dCas9-p300 Activator表达质粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述的VASA基因敲入位点附近的5’和3’同源臂引物的核苷酸序列如下所示：
5’homologous arm-F：GCTAGCATCCCATGACTCATCATCTA
5’homologous arm-R：TCATCCAGCCCAGCATTTTG
3’homologous arm-F：GGTACCCCCCTGTATTTATGTCTCACTTGTT
3’homologous arm-R：CTCGAGGATGCAGAGAAGAAAGTAG；
所述EGFP-LoxP-PGK-Puro-LoxP片段相关引物的核苷酸序列如下所示：
P2A-EGFP-F：CAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT
XHOI-LOXP-PURO-R：ACTCTCGAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGAACCTCTTCGAGGGACCTA
NheI-P2A-F：tcaGCTAGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCA。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的gRNA引物为gRNA3引物或gRNA4引物，所述gRNA3引物和gRNA4引物的上下游引物的核苷酸序列如下所示：
VASA-gRNA3-F：tttcttggctttatatatcttgtggaaaggacGAAAACAACCTGCAAGTTTG
VASA-gRNA3-R：tcaacttgctatgctgtttccagcatagctctgaaacCAAACTTGCAGGTTGTTTTC
VASA-gRNA4-F：tttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGACTCATCATCTACTGGATT
VASA-gRNA4-R：tcaacttgctatgctgtttccagcatagctctgaaacAATCCAGTAGATGATGAGTC；
所述的sgRNA引物为sgRNA-a和sgRNA-b中的至少一种，所述sgRNA-a和sgRNA-b的核苷酸序列如下所示：
sgRNA-a：TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAACTGTAC CACAAACTTGC
sgRNA-b：TCAACTTGCTATGCTGTTTCCAGCATAGCTCTGAAACGCAAGTTTGTGG TACAGTTC。
8.权利要求1～4中任一所述的VASA基因报告载体在以下(1)或(2)中的应用；
(1)敲入并激活表达VASA基因；
(2)研究VASA基因参与绵羊生殖细胞发育的调控机制。
9.一种VASA基因敲入并激活表达的方法，其特征在于，采用权利要求1～4中任一所述的VASA基因报告载体敲入并激活VASA基因。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，先将重组pEGFP-PGK puro-VASA质粒和Cas9-gRNA质粒共同转染目标工具细胞，进行puro药筛，然后采用所述的CRISPR dCas9激活载体转染药筛后的细胞，激活细胞中VASA基因的表达。
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