CN1167801C - 重组人vegf腺病毒载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有VEGF 165基因的质粒型腺病毒载体,构建方法包括将人VEGF165.cDNA正向***到穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下,构建穿梭质粒pAd-hVEGF165,后者与pJM17通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得含人VEGF基因的重组腺病毒Ad-hVEGF165。该载体可用于治疗严重性冠心病和外周严重性缺血性疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有VEGF165基因的腺病毒载体,该腺病毒载体的构建以及它们作为冠心病和外周动脉缺血性血管疾病等的治疗剂的应用。
背景技术
冠心病(coronary artery disease,CAD)的防治有了长足的进展,但CAD的治疗仍有许多棘手的问题。经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)术后3-6个月的再狭窄率高达30-50%。再狭窄的防治研究多,动物实验中证实有效的方法,运用到人体时则无效或治疗效果不明显;临床工作中防治PTCA术后再狭窄方法曾寄希望于冠状动脉内支架的应用,但支架植入术后的再狭窄率仍高达15-54%(参见所列文献1);近几年来动物实验及临床试验证明冠状动脉内32P放射治疗对防治PTCA术后再狭窄有效,但Verin等报道了用β射线(90Y)进行冠状动脉内放射治疗,6个月后再狭窄的发生率为40%。冠状动脉旁路移植术(CABG)术后桥血管病变让人困惑。对于严重弥漫性冠状动脉病变,常规药物治疗效果差,不能做血管介入治疗和CABG,采用pHVEGF165基因或bFGF的治疗性血管生成,促进新的血管形成,建立侧支循环,心肌缺血得到治疗,甚至治愈(参见所列文献3、4),让人们看到了基因治疗的希望。同样,将phVEGF165基因注射到缺血肢体肌肉治疗外周动脉缺血性血管疾病(Peripheral artery disease,PAD),也取得了令人鼓舞的效果。在目前应用细胞生长因子所做的动物实验和临床研究中,VEGF是研究最为深入并已进入临床试验的细胞生长因子(参见所列文献3-7),特异性的作用于内皮细胞,促进侧支循环形成。
近年来,国外学者采用VEGF165的真核表达载体的裸露质粒phVEGF 165下肢肌肉中注射治疗PAD,取得了令人鼓舞的效果,部分患者避免了截肢(参见所列文献5和6)。CAD的基因治疗近年来已有报道,可在CABG时,在病变血管供血区心肌内注射或采用左侧胸壁微切口将裸露质粒phVEGF165或bFGF注射到缺血心肌内(参见所列文献3和4),使难治性CAD患者的心绞痛发作次数明显减少,***日用量明显减少,运动耐量明显增加,基因治疗后1-2月,冠状动脉造影显示,心肌缺血区侧支循环开通,心肌供血改善。Rosengart等采用腺病毒介导的VEGF121经左侧胸壁微切口缺血心肌内注射治疗CAD,治疗后心绞痛发作次数明显改善,室壁运动好转(参见文献7)。说明了CAD和PAD基因治疗的临床应用价值。直接心肌内注射DNA或通过脂质体冠脉内转导的方法,基因转导率低,不足1%,在猪慢性心肌缺血模型中证实了在注射点周围0-15mm的范围内有较高的基因表达,离注射点较远的心肌,基因表达较低。Barr报道通过导管经冠状动脉内导入含有细菌lacZ基因的复制缺损型腺病毒(AdCMV.lacZ)1010pfu/ml,心肌转染效率高达32%(参见所列文献13)。导入基因在外周器官表达少,Giordano报道仅有1.3%腺病毒到达冠脉循环以外(参见所列文献14)。另外,心肌内注射DNA常导致细胞的炎症反义和心肌纤维化(参见所列文献15)。相对开胸手术而言,冠脉内导入基因是无创伤的,并且经冠状动脉内导入重组腺病毒载体,检测不出伴随的炎症反应和心肌纤维化。目前国内外尚未见到腺病毒介导的VEGF165基因治疗上述疾病的报道,通过心导管经冠状动脉内导入腺病毒介导的基因治疗,可能是一种安全有效的方法,具有重大的临床应用价值。
发明内容
本发明构建了表达人VEGF165基因的重组腺病毒载体,为采用VEGF165基因治疗CAD和PAD奠定了基础。
VEGF是最重要的促血管生成的细胞因子,是内皮细胞特异性最强的丝裂原,VEGF有四种单体存在形式,分别称为VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。其中VEGF165的生物活性占VEGF的60%,通过内皮细胞上其特异性受体KDR/flt-1的信号传导,促进内皮细胞增殖、迁移。在缺血组织内,血管内皮细胞上调VEGF mRNA及其受体的表达,从母血管中通过***以芽孢方式生长出新血管(参见所列文献11),建立侧支循环。VEGF是新生的不成熟血管的生存因子(参见所列文献12),可促使新生血管的成熟和分化。
基因治疗关键的环节之一就是如何有效地将外源基因导入靶细胞内并使其稳定表达。腺病毒载体被认为是高效表达的基因转移载体(参见文献10),由于腺病毒宿主范围广,不仅可感染复制***的细胞,也可感染静止期细胞;包装容量大,可以***7.5kb的外源性基因片段;不会整合到宿主细胞的染色体中,不存在激活致癌基因或***突变等危险;病毒经繁殖、纯化,可达到很高滴度,并达100%的感染率;性质比较稳定,对人类相对安全等诸多优点,使其在基因转移中具有较大优势,成为目前基因治疗中最主要的载体。
本发明构建的Ad-hVEGF165是E1区缺失的复制缺陷型腺病毒,E1区基因是腺病毒复制所必需的基因,这就要求这种完整腺病毒的复制必须在E1区基因转染的细胞中进行,而293细胞正是为适应这一需要而转化了E1区基因的包装细胞,这就决定了复制缺陷型腺病毒在靶细胞中只有一次感染机会而无复制能力,从而完成腺病毒载体的功能,避免腺病毒本身对靶细胞的损害,达到基因转移的目的,我们构建的可表达人VEGF的Ad-hVEGF165是将人VEGF165.cDNA正向***到穿梭质粒pHCMVSP1A的CMV启动子之下,构建穿梭质粒pAd-hVEGF165,后者与pJM17通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得含人VEGF165基因的重组腺病毒Ad-hVEGF165。经EcoRI、NcoI和XhoI酶切鉴定和PCR扩增法鉴定,证明构建的穿梭质粒pAd-hVEGF165和重组腺病毒Ad-hVEGF165是正确的,后者在靶细胞中表达VEGF。
附图说明
图1是琼脂糖凝胶电泳鉴定pAd-hVEGF 165的酶切结果:
1、PCR marker:237、377、515、697、994、1543bp;
2、pAd-hVEGF165(Nco I+Xho I):有511bp片段;
3、pAd-ahVEGF165(Nco I+Xho I):有101bp片段;
4、pAd-hVEGF165(EcoR I):576、6797bp;
5、pAd-ahVEGF165(EcoR I):576、6797bp。
图2是琼脂糖凝胶电泳鉴定Ad-hVEGF165的PCR共扩增结果:
1、PCRmarker:237、377、515、697、994、1543bp;
2、pAd-hVEGF165为模板,扩增出576bp的VEGF165片段;
3、pHCVSP1A为模板,扩增出860bp腺病毒骨架基因片段;
4、Ad-hVEGF165病毒基因组DNA为模板,同时扩增出576bp和860bp两个片段。
图3是临床试验中例2患者治疗前和治疗后的右冠状动脉造影,图示治疗后右冠状动脉末梢与左冠状动脉之间侧支循环增加。
在下面的实施例中,我们选择了VEGF165为目的基因,用E1区缺失的复制缺陷型腺病毒作为有效的载体,构建的重组腺病毒Ad-hVEGF165,病毒滴度为1.94×1012pfu/ml,纯度为1.5,说明病毒滴度及纯度均较高,可满足在体基因治疗的需要,为治疗CAD和PAD奠定了基础。
以下通过实施例来描述本发明,应该指出的是,所列举的实施例不应理解为对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1 携带VEGF165的腺病毒穿梭质粒的构建
1、材料和方法
1.1试剂
EcoRI、T4 DNAligase购自华美生物工程公司;牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、低熔点琼脂糖购自promega公司;NcoI、XhoI购自BioLabs公司;特级新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM、Lipofectamine购自GIBCO/BRL公司;CsCl购自Sigma公司。
1.2质粒和菌株
pHCMVSP1A(带有腺病毒基因)和pJM17由军事医学科学院二所提供;DH5α由北京医科大学第一医院心内科提供;pUCCAGGS/hVEGF165由日本九州大学医学院病理系提供。
1.3细胞系
293细胞为腺病毒E1区基因转化的人胚肾细胞系,培养条件为20%新生牛血清的高糖DMEM培养液,在37℃、5%CO2孵箱中培养。
1.4仪器
二氧化碳培养箱(Sanyo,日本),高速冷冻离心机(Jouan,意大利),超速冷冻离心机(Hitachi,日本),倒置相差显微镜(Olympus IX-70,日本),紫外分光光度计(752型,上海),空气浴,水浴摇床。
1.5携带VEGF165的腺病毒穿梭质粒的构建
pHCMVSP1A经EcoRI酶切后,70℃灭活15分钟,用CIAP使载体5’端去磷酸化后,回收6797bp片段。将去磷酸化的6797bp的载体片段与576bp的VEGF165 cDNA片段用T4DNA Ligase 4℃连接过夜,得到重组穿梭质粒,后者转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选菌落扩增,小量提取质粒后以EcoRI酶切,若电泳后得到了576bp和6797bp两个片段,则证明VEGF165 cDNA已***到腺病毒穿梭载体。将***了VEGF165 cDNA的穿梭质粒以NcoI、XhoI双酶切,电泳后有511bp者为正义VEGF165的重组腺病毒穿梭质粒pAd-hVEGF165,有101bp者为反义VEGF165的重组腺病毒穿梭质粒pAd-ahVEGF165。
1.6 Lipofectamine介导的pAd-hVEGF165和pJM17共转染293细胞
(1)将293细胞接种于9cm的平皿中,37℃、5%CO2孵箱中培养,使其达到80%融合时进行转染;
(2)在Eppendorf管中按等摩尔数配置DNA/脂质体复合物:在1ml无血清DMEM培养液中稀释质粒pAd-hVEGF165和pJM17,旋转1sec,再加入Lipofectamine混悬液,混匀,室温下放置30min,使DNA结合在脂质体上;
(3)吸去培养皿中含血清的DMEM培养基,加1ml无血清DMEM培养液洗细胞1次,吸出无血清的DMEM,加入DNA/脂质体复合物,37℃培养4h;
(4)再于培养皿中加入足量的含血清的DMEM,继续培养8h;
(5)吸去DMEM/DNA/脂质体混合物,加入0.5%琼脂糖覆盖(0.5%琼脂糖中含1×DMEM,10%FCS),待其凝固后置于37℃,5%CO2孵箱中培养,观察细胞病变情况。
1.7重组人VEGF165的腺病毒载体的PCR鉴定
从共转染后出现细胞病变的293细胞中取培养上清100ul,离心去除细胞碎片,收集上清加入裂解液(0.5%SDS,20mmol/L EDTA,50ug/ml ProteinaseK)400ul,于55℃作用1h后,加等量酚/氯仿/异戊醇抽提1次,上清加2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA。用70%乙醇洗1次,沉淀溶于20ul消毒三蒸水中,并以此DNA为模板进行PCR扩增。引物1和引物2为扩增VEGF165基因的引物,引物3和4为扩增腺病毒骨架基因片段的引物。PCR反应体系为取模板DNA 10ul,20umol/L引物各5ul,10×PCRBuffer 5ul,2mmo/L dNTP 5ul,Taq酶1ul,加水至PCR反应终体积50ul,用矿物油覆盖,94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 60s循环30次,最后72℃延伸10min,在1.2%琼脂糖进行电泳鉴定PCR扩增产物,同时扩增出576bp的VEGF165基因片段和860bp的腺病毒骨架基因片段者,则为含人VEGF165的重组腺病毒Ad-ahVEGF165。引物序列如下:
引物1:5’atg aac ttt ctg ctg tct tgg 3’
引物2:5’tca ccg cct cgg ctt gtc aca 3’
引物3:5’teg ttt ctc agc agc tgt tg 3’
引物4:5’cat ctg aac tca aag cgt gg 3’
1.8重组人VEGF165腺病毒Ad-hVEGF165的扩增、纯化及滴度测定
取重组腺病毒上清500ul,加入至90%融合的293细胞中,37℃、5%CO2孵箱中培养,镜下观察到95%~100%细胞出现病变后,离心收集上清,并将细胞于-80℃和37℃之间反复冻融3次,以3000r/min离心收集上清,按Graham的方法(参见所列文献9)对腺病毒上清进行CsCl密度梯度离心纯化,将纯化后的腺病毒上清对透析液(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L MgCl2,10%甘油)4℃透析2次,每次24h。将透析后的病毒液进行滴度测定。取纯化后的病毒液100ul,10%SDS 20ul,PBS 880ul,测定病毒基因组DNA的A260和A280的光吸收值,据此计算病毒的颗粒及纯度,1A260=1012pfu/ml,A260/A280>1.3表明纯度较高,病毒滴度pfu/ml=A260×稀释倍数×1012。
2 结果
2.1重组质粒pAd-ahVEGF165的酶切鉴定结果
pAd-hVEGF165以EcoRI酶切后得到了576bp和6767bp两个片段,证实了人VEGF165***了腺病毒穿梭质粒的启动子之下。为了鉴别正向和反向***VEGF165的腺病毒穿梭质粒,以NcoI和XhoI双酶切,得到51Ibp片段的正义VEGF165的重组腺病毒质粒pAd-hVEGF165及101bp片段的反义VEGF165的重组腺病毒质粒pAd-ahVEGF165。见图1。
2.2 PCR扩增法鉴定Ad-hVEGF165的结果
以提取的病毒基因组DNA为模板,同时加入VEGF165基因的引物和腺病毒骨架基因片段引物,经扩增后同时获得了576bp的VEGF基因片段和860bp的腺病毒基因片段。以pHCMVSP1A为模板扩增出860bp片段,以pAd-hVEGF165为模板扩增出576bp基因片段。证实了pAd-hVEGF165和pJM17共转染293细胞后,经同源重组产生了含人VEGF的重组腺病毒,见图2。
2.3重组Ad-hVEGF165的滴度及纯度
重组腺病毒经繁殖、扩增、纯化后,测得A260为0.097和A280为0.066,计算出病毒滴度为1.94×1012pfu/ml,纯度为1.5,说明病毒滴度及纯度均较高,可满足在体基因治疗的需要。
实施例2 临床试验
1、资料与方法
1.1病例资料
例1,男,50岁,心绞痛5年,加重1年,于2001年1月发生广泛前壁心肌梗塞,当时未行再灌注治疗,此后频繁发作严重心绞痛及左心功能不全,冠脉造影示左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)及右冠状动脉(RCA)均自近段完全闭塞,仅靠分支血管供血。
例2,男,59岁,胸痛史2年,2000年2月发生广泛前壁心肌梗塞,当时血压降低,明显呼吸困难,肺部水泡音,不能平卧。冠脉造影示左主干中远段狭窄50-90%,LAD、LCX均自起始处闭塞,右冠状动脉近段狭窄50-80%。
1.2经皮冠脉内腺病毒载体导入
经病人及家属的同意,于2000年4月3日行经皮冠状动脉内腺病毒载体导入,注射过程中未出现不良反应,2例病人均在术后1小时出现寒战、发热,体温39℃,静脉推注***20mg,异丙嗪25mg及输液治疗后,3小时后体温正常,此后未再出现发热。2周后出院。术后每1-2周随访一次。
2、结果
2.1临床症状
两例病人在治疗后一周开始心绞痛发作减轻、次数减少。例1在术后2周时自行停服鲁南欣康、恬尔心等药物,但心绞痛持续减轻,每天仅在夜间发作2次,持续时间短,心绞痛分级为II级。例2在术后2周时胸痛发作明显减轻,活动能力增加,停用消心痛、恬尔心、阿斯匹林等药物,术后6周可平地行走5km,仅有轻微气短,无心绞痛发作,心绞痛分级为II级。
2.2冠脉造影结果
例1,术后6周时左侧冠脉造影分支和侧支显影程度同前,而右冠状动脉造影时圆锥支、锐缘支之间及与左前降支、间隔支之间可见丰富的侧支循环,使LAD、LCX中远段显影,达到侧支循环3+级。
例2,术后6周时左主干远段完全闭塞,仅见两支细小分支显影,右冠近段病变同前,远端与LAD、LCX及间隔支、对角支之间侧支循环丰富,使LAD、LCX及对角支显影较充分,达到侧支循环3+级,见图3。
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Claims (4)
1、一种质粒型腺病毒载体,其特征在于它含有VEGF 165基因。
2、权利要求1的质粒型腺病毒载体,其特征在于VEGF 165基因连接于腺病毒穿梭质粒的CMV启动子之下。
3、权利要求1或2的质粒型腺病毒载体在用于制备治疗冠心病的治疗剂中的应用。
4、权利要求1或2的质粒型腺病毒载体在制备治疗外周动脉缺血性血管疾病的治疗剂中的应用。
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CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |