CN116769748B - 一种5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及产b12前体ala的大肠杆菌 - Google Patents
一种5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及产b12前体ala的大肠杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种5‑氨基乙酰丙酸合成酶突变体及产B12前体ALA的大肠杆菌，属于生物技术领域。本发明基于高压分子动力学模拟的等温压缩系数扰动工程对ALA合成的关键酶5‑氨基乙酰丙酸合成酶进行改造，得到比酶活提高的突变体，然后通过在大肠杆菌中多基因组合表达发酵合成ALA，具体是将来源于大肠杆菌MG1655的两个关键基因琥珀酰辅酶A合成酶基因SUC和多聚磷酸激酶基因PPK和来源于荚膜红细菌的关键基因5‑氨基乙酰丙酸合成酶基因突变体导入到受体细胞中，从而在受体细胞中建立ALA的合成途径，为富含维生素B12的保健食品的开发奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及产B12前体ALA的大肠杆菌，属于生物技术领域。
背景技术
维生素B12，又称为钴胺素(cobalamin)，是生物科学领域公认的最小但结构复杂的分子之一，同时也是唯一含有金属离子的水溶性维生素，在医药和化妆品中有着广泛的应用，在脂肪生物化学反应、蛋白质合成和调节中起重要辅助因子的作用，目前发现仅有微生物有能力通过需氧和厌氧途径合成钴胺素。
5-氨基乙酰丙酸(ALA)是体内合成四吡咯(维生素B12、叶绿素和血红素的前体)的重要中间体。ALA的合成有C4和C5两种途径，其中，C5途径，主要存在于高等植物、藻类以及多种细菌中，ALA是由谷氨酸经过三步酶促反应而得到的。C4途径是两种前体物质甘氨酸和四碳化合物琥珀酰辅酶A按照1:1的比例，在ALA合成酶(ALAS，由hemA基因编码)的催化下缩合形成ALA。有氧和厌氧维生素B12合成途径可分为四个部分：ALA的合成、corrin环组分的合成、下轴向配体的构建和钴胺素的合成。工业微生物发酵被用作最初建立的维生素B12化学合成的替代方法，该化学合成需要至少60个步骤。
工业生产维生素B12主要利用脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrifican)、弗氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudennreichii)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)等微生物发酵。而近几年通过合成生物学和代谢工程技术构建的大肠杆菌已经可以用来生产维生素B12，大肠杆菌因具有生长快和遗传操作工具成熟等优势被广泛应用。如，2003年，Lee等利用慢生型大豆根瘤菌中的hemA转入E.coli BL21(DE3)中，优化了培养基中的C、N比例，将产量提高到3.8g/L。2004年，Kang等在E.coli BL21(DE3)中导入了来源于荚膜红细菌的hemA，测得ALA产量为2.8g/L。2008年，Choi等将来源于沼泽红假单胞菌KUGB306的hemA基因通过pGEX-KG载体转入到E.coli BL21(DE3)中进行表达，在培养基中添加琥珀酸、甘氨酸、葡萄糖，所得ALA产量为5.2g/L。2009年，Lin等将来源于放射形土壤杆菌zju-0121的hemA基因通过pET28a载体转入到E.coli Rosetta(DE3)中，在最佳的发酵条件下测得ALA产量高达7.3g/L。2013年，Zhang等克隆了来源于沼泽红假单胞菌的hemA与hemO基因，并在大肠杆菌中成功表达，测的发酵液中ALA产量分别为5.7g/L与6.3g/L。2014年，Lou等利用来源于荚膜红细菌的hemA导入了E.coli Rosetta(DE3)中，在最适培养条件下测得ALA产量为8.8g/l。但如专利CN102206606A所示，其经过改造后的大肠杆菌，在3L发酵罐中发酵56h，最终ALA产量仅达到4.13g/L，因此微生物合成维生素B12前体ALA的效果有待进一步提升。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种比酶活显著提升的5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体，并基于该突变体开发了一种高效制备维生素B12的前体物质ALA的方法，为富含维生素B12的保健食品的开发奠定了基础。
本发明的第一个目的是提供一种5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的5-氨基乙酰丙酸合成酶的第151位精氨酸突变为异亮氨酸得到(R151I)。
本发明的第二个目的是提供编码上述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供携带上述基因的重组质粒。
本发明的第四个目的是提供表达上述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体的宿主细胞。
进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
本发明的第五个目的是提供上述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体、基因、重组质粒或宿主细胞在制备5-氨基乙酰丙酸或维生素B12中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌异源表达了上述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体。
进一步地，所述重组大肠杆菌还过表达了琥珀酰辅酶A合成酶和多聚磷酸激酶。
进一步地，所述琥珀酰辅酶A合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述多聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，以E.coli BL21(DE3)为出发菌株。
本发明的第七个目的是提供上述重组大肠杆菌在制备5-氨基乙酰丙酸或维生素B12中的应用。
本发明的第八个目的是提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法，包括采用上述重组大肠杆菌进行发酵生产的步骤。
进一步地，以葡萄糖为底物进行发酵生产。
本发明的有益效果：
本发明通过基于高压分子动力学模拟的等温压缩系数扰动工程对ALA合成的关键酶ALAS(5-氨基乙酰丙酸合成酶)进行改造，得到比酶活提高的突变体。随后运用多基因组合表达工程技术，将5-氨基乙酰丙酸合成关键酶基因导入大肠杆菌表达体系中，在受体细胞体内建立一条ALA生物合成途径，实现了ALA的高水平生产，同时大肠杆菌易于实现高密度规模培养，从而大大降低生产成本。最终实现5L发酵罐中发酵32h后OD600达到23，ALA产量高达28g·L-1。
附图说明
图1为C4途径合成5-氨基乙酰丙酸的示意图。
图2为野生型及突变体比酶活。
图3为野生菌株及突变菌株摇瓶发酵生产ALA的产量图。
图4为野生菌株及突变菌株5L发酵罐发酵生产ALA的产量图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中涉及的材料及方法如下：
(1)序列：
5-氨基乙酰丙酸合成酶的野生型氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
琥珀酰辅酶A合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
多聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
(2)培养基：
种子培养基(g·L-1)：酵母提取物5.0，蛋白胨10.0，氯化钠5.0，pH7.0。
发酵培养基(g·L-1)：酵母提取物2.0，硫酸铵16.0，磷酸二氢钾3.0，十二水合磷酸氢二钠16.0，七水合硫酸镁1.0，一水合硫酸锰0.01，MgSO4·7H2O和MnSO4·H2O分别单独灭菌，再添加0.09M的甘氨酸和0.1M的琥珀酸作为反应底物。根据不同抗性需求添加抗生素，浓度要求为氨苄青霉素100μg·mL-1、卡那霉素50μg·mL-1、壮观霉素50μg·mL-1。
(3)产物ALA的检测方法：
取1mL菌液在12000r·min-1条件下离心1min，取胞外上清进行ALA浓度测定。配制反应体系：依次加入乙酸钠缓冲液400μL、上清液或上清液稀释液400μL，乙酰丙酮100μL，充分混合后，于沸水浴(100℃)中反应15min。拿出后冷却至室温，加入900μLModifiedEhrlich's试剂(将2g对二甲氨基苯甲醛加入16mL的70％高氯酸，用冰乙酸定容至100mL)，充分混合15min后，使用紫外分光光度计在540nm处测定反应液吸光值，根据标准曲线计算出ALA浓度。
实施例1
根据Genebank中公布的大肠杆菌MG1655琥珀酰辅酶A合成酶基因suc和多聚磷酸激酶基因ppk序列，设计适当引物，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻类红色素合成关键酶基因suc和ppk；
应用多基因组合表达工程方法，在ppk基因两端分别加上BamHI和HindⅢ酶切位点，并***到pACYC-duet质粒的第一个多克隆位点处，得到重组载体pACYC-duet-ppk。在基因suc两端分别加上Ndel和XhoI酶切位点，并克隆到pACYC-duet-ppk的另一个多克隆位点处，得到重组载体pACYC-duet-ppk-suc。
实施例2
1、高稳定性和活性突变体的虚拟筛选
通过高压分子动力学模拟的等温压缩系数扰动筛选出位于蛋白质表面远离活性中心的高可塑性区域(即对5-氨基乙酰丙酸合成酶体系施以梯度压力，计算不同压力下的等温压缩系数，选择在加压扰动模式下等温压缩系数波动大的区域作为高可塑性区域)，计算5-氨基乙酰丙酸合成酶高可塑性区域上氨基酸的动态柔性指数(DFI)，筛选％DFI>0.2的氨基酸，然后计算其与活性中心(H138-H143-E184)的动态耦合指数(DCI)，筛选DCI>0.8的氨基酸，并与Genbank报道的5-氨基乙酰丙酸合成酶氨基酸序列进行比对，突变为保守氨基酸。得到7个突变体K150E，R151I，G192L，R374V，V390F，V390W，L395F。
2、单点突变体重组质粒的构建
设计表1所示的引物。以质粒pET-28a-RphemA为原始模板进行全质粒PCR扩增，构建得到突变体重组质粒。PCR反应体系为50μL：ddH2O18μL；2xMaxBuffer25μL；dNTPMix(10mM)1μL；pET-28a-RphemA模板1μL；上下游引物(10mM)各2μL；PhantaMaxSuper-FidelityDNAPloymerase1μL。PCR反应条件：95℃30s；95℃15s，68℃15s，72℃5min，30个循环；72℃5min，4℃保存。反应结束后，利用DpnI酶对PCR产物进行消化，将消化产物转入E.coliJM109，最终将测序正确的重组子扩大培养并提取质粒，转入E.coliBL21(DE3)于-20℃保存。
表1PCR引物
3、突变体的酶学性质表征
将5-氨基乙酰丙酸合成酶基因采用大肠杆菌表达***进行蛋白表达，选用的质粒是pET-28a，以大肠杆菌E.coliBL21(DE3)为宿主。
挑取携带突变体重组质粒的E.coliBL21(DE3)转化子进行小规模扩大培养，并进行菌液PCR和测序验证。验证正确后，分别将9个突变体重组质粒的E.coliBL21(DE3)进行扩大培养，并诱导表达，诱导培养结束后，收集菌体，先用20mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)清洗一遍菌体，以尽量去除残留的培养基，再用该缓冲液重悬菌体，使用超声波破碎仪进行细胞破碎(450w，5s/5s，25min)。破碎完毕，将破碎液于4℃(10000r·min-1)离心1h，收集上清，用0.22μm微孔过滤器对上清进行过滤，即得粗酶液。
将9个突变体5-氨基乙酰丙酸合成酶粗酶液使用填料为Ni-NTA的镍离子亲和层析柱(1mLHisTrapFF)以及AKTA蛋白质纯化仪进行纯化，纯化步骤如下：(1)平衡柱子：用超纯水平衡柱子(20个柱体积)，再用咪唑终浓度为20mM的结合液平衡柱子(20个柱体积)。(2)上样：采用进样泵自动进样的方式，将粗酶液以1mL/min的流速进行上样。(3)洗脱：先用咪唑终浓度为20mM的缓冲液冲洗10个柱体积，以去除部分杂蛋白，再用咪唑终浓度为500mM的洗脱液冲洗30个柱体积，收集目标峰型下的洗脱产物并作好标记。(4)柱子再生：由于纯化过程中镍离子的流失，纯化结束后，用预先配好的再生溶液对镍柱进行再生处理，方便下次使用。(5)将纯化收集到的酶液进行SDS-PAGE验证和酶活力检测。
反应所得产物5-ALA用显色法进行酶活测定。集诱导后菌体进行超声破壁，壁后置于12000rpm离心5min，取1000μL上清液加入1000μL反应缓冲液：50mM的pH＝7.5的Tris-HC1，0.2mM琥珀酰CoA，0.1mM的磷酸吡哆醛(PLP)，混匀，分别于37℃反应20min。反应时间到时加入500μL的10％三氯乙酸中止反应。反应结束后在12000rpm下离心5min，上清转移入另管中。上清中分别加入2mL的浓度2mo1/L的醋酸钠(pH4.6)，500μL乙酰丙酮，混匀后煮沸15min，冷却至室温。加入2mL改良Ehrich's试剂，在室温下反应15min后于554nm吸收光下测其吸光度，从而计算酶活。酶活定义：在37℃，pH7.5的条件下，1min转化底物生成1nmol5-ALA所需的酶量。酶活结果见图2。
实施例3
将实施例2构建的野生型重组菌株及7个突变体重组菌株进行摇瓶发酵。摇瓶发酵生产ALA时，需添加终浓度0.1mmol·L-1IPTG诱导外源基因的表达，野生型及突变体摇瓶发酵产量如图3。
实施例5
为了进一步评估和验证上述摇瓶发酵效果最优的重组工程菌(含突变体R151I的重组菌)生产ALA的能力，在5L发酵罐中对该菌株进行了放大培养，分析细胞生长、碳源消耗和ALA合成情况。
在5L罐中，重组菌株的浓度相对摇瓶培养有了较大的提高，OD600最高达到23，提供了更多更密集的菌体进行ALA生产；随着碳源葡萄糖的消耗和菌体量的上升，ALA的产量也随着时间稳步上升，在32h左右达到了顶峰28g·L-1，比野生型菌株产量提高了255.5％左右。发酵32h时野生型及突变体发酵产量如图4。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体，其特征在于：通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的5-氨基乙酰丙酸合成酶的第151位精氨酸突变为异亮氨酸得到。
2.编码权利要求1所述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.表达权利要求1所述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体的宿主细胞。
5.权利要求1所述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组质粒或权利要求4所述宿主细胞在制备5-氨基乙酰丙酸或维生素B12中的应用。
6.一种生产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌异源表达了权利要求1所述5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体。
7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌还过表达了琥珀酰辅酶A合成酶和多聚磷酸激酶。
8.权利要求6或7所述的重组大肠杆菌在制备5-氨基乙酰丙酸或维生素B12中的应用。
9.一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于：包括采用权利要求6或7所述重组大肠杆菌进行发酵生产的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：以葡萄糖为底物进行发酵生产。
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