CN116769069A

CN116769069A - 一种小分子非抗凝肝素及其制备方法及其药物组合物与应用

Info

Publication number: CN116769069A
Application number: CN202310389803.XA
Authority: CN
Inventors: 姚亦明; 朱祥平; 钱建根; 金永生; 周华; 陆晓华; 靳彩娟; 李小明; 肖洋; 周巧云; 姚瑶; 尹洪洋; 任鑫
Original assignee: Suzhou Ronnsi Pharma Co ltd
Current assignee: Suzhou Ronnsi Pharma Co ltd
Priority date: 2023-04-12
Filing date: 2023-04-12
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明公开了一种小分子非抗凝肝素及其制备方法及其药物组合物与应用。该小分子非抗凝肝素的制备工艺，过程简单、高效，包括：首先通过解聚肝素制备小分子肝素，随后用高碘酸钠氧化破坏肝素抗凝血活性相关的肝素戊糖结构位点，最后精制。其分子结构明确，重均分子量为3000Da‑5000Da，糖链还原端主要由2,5‑脱水‑D‑甘露糖组成，糖链中间还保留有醛基，抗凝血活性低，但是保留了肝素的抗炎、抗过敏和抗肿瘤等生物学活性，可应用于肝素衍生物在非抗凝药物领域的应用。

Description

一种小分子非抗凝肝素及其制备方法及其药物组合物与应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种小分子非抗凝肝素及其制备方法及其药物组合物与应用。

背景技术

肝素(Heparin)及小分子肝素(Low Molecular Weight Heparin，LWMH)，在临床中被广泛用作抗凝抗栓药物，其分子结构主要由氨基葡萄糖(D-glucosamine，GlcN)和两种糖醛酸：艾杜糖醛酸(L-iduronic，IdoA)和葡萄糖醛酸(D-glucuronic，GlcA))中的一种组成二糖重复单元，且在糖单元的不同位置随机修饰有硫酸酯基。肝素的抗凝血活性主要依赖于与抗凝血酶-Ⅲ(AntithrombinⅢ，AT-Ⅲ)结合而产生抗-Ⅹa(抗血栓作用)与抗-Ⅱa活性抗凝血作用。肝素的结构可以用一个四糖单元表示，其结构式如图1所示。显示与抗凝血酶结合的五糖结构，如图2所示，是维持抗凝活性所必需的核心结构。

此外，肝素糖链中的主要部分为结构有序的“规则区”——结构规整的三硫酸化二糖重复单元——ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)，如图1中A所示；而图1中B所示为低硫酸化区域，是结构无序的“不规则区”，主要是一些含IdoA和GlcA(其后连有N–乙酰基–GlcN或N–磺酰基–GlcN(GlcNAc，GlcNS))的单元[R.J.Linhardt,J.Med.Chem.46,(2003)2551-2564.]，图1中B所示在肝素寡糖链中含量较小。另外，图2中显示了与抗凝血酶结合的五糖结构，粗体表示的是维持抗凝活性所必需的，如除去则抗凝活性下降95％，斜体表示的也很重要，脱去后抗凝活性将下降25-50％。值得注意的是，在图2中的五糖结构中，存在一个特殊的邻二醇结构，其可以被强氧化剂打断。

小分子肝素是由未分级肝素(Unfractionated Heparin，UFH)经化学或酶解方法制备的相对分子量较低的肝素，其相对分子量一般在3000-8000Da。众所周知，小分子肝素比未分级肝素的抗凝血作用(抗-IIa活性)降低，但抗血栓作用(抗-Xa活性)更强，出血倾向减小，更安全有效，并且生物利用度高、半衰期长。现有的肝素类抗凝抗栓药物，未分级肝素的抗-IIa活性和抗-Xa活性均在180IU/mg以上，而各种市售小分子肝素的抗-Xa活性一般也在100IU/mg左右，但是它们的抗-IIa活性存在着一些差异，在15–55IU/mg不等，平均在30IU/mg左右。领域内一般认为抗-IIa活性和抗-Xa活性的在10IU/mg以下的肝素为非抗凝肝素。

现代医学研究发现，肝素和小分子肝素及其衍生物具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒和降血脂等多种生物学功能，成为领域内国内外研究的热点，但是在临床应用时，由于这些肝素药物的强力抗凝抗栓活性，一是限制了药物的使用量，难以达到上述生物学活性的药效使用剂量，二是高抗凝活性易引起出血等副作用，使得无法在以上抗炎这些生物学功能领域发挥作用。

发明内容

本发明所需解决的技术问题是：提供一种小分子非抗凝肝素、小分子非抗凝肝素的制备方法、以及包含小分子非抗凝肝素的药物组合物，该小分子非抗凝肝素及药物组合物能应用于制备预防和治疗炎症、过敏和肿瘤、病毒、高血脂药物。

为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：所述的一种小分子非抗凝肝素，其结构式如下：

其中，

R₁＝H或SO₃Na；

R₂＝SO₃Na或COCH₃；

n＝0-24。

所述的小分子非抗凝肝素，具有下述结构特征：

(1)重均分子量为3000Da-5000Da；

(2)非还原端3,4-位氧化开环，形成二醛基结构；

(3)还原端主要由2,5-脱水-D-甘露糖组成；

(4)糖链中间保留有醛基。

所述的小分子非抗凝肝素，在药理药效学方面，抗-Xa因子效价在10IU/mg以下。

制备上述小分子非抗凝肝素的制备方法，合成路线示意图如图3所示，包括如下步骤：

S1、亚硝酸法解聚肝素制备小分子肝素；

S2、高碘酸氧化法破坏小分子肝素的抗凝血活性位点；

S3、精制。

亚硝酸降解法生产小分子肝素的作用机制，是在较低pH值作用下，亚硝酸与肝素中的N-硫酸糖葡胺反应使之脱去HSO₄-从而形成-NH₂，-NH₂再与亚硝酸发生重氮化反应，放出N₂的同时糖苷键发生断裂，电子转移，缩环生成2,5-脱水甘露糖。

优选地，本方案中步骤S1中亚硝酸法解聚肝素制备小分子肝素的制备方法为：将肝素以水溶解配制成终浓度为10–20％的第一溶液，用酸调节使第一溶液的pH值为2–4，加入肝素重量0.02–0.05倍的亚硝酸钠，在室温下反应2–5小时，得到第一反应液，室温温度为15–35℃；之后调节pH值至中性，加入第一反应液总体积0.05–0.1倍的氯化钠固体，搅拌溶解，再加入第一反应液总体积1.0–2.5倍的乙醇或甲醇进行沉降，收集沉淀，干燥，得到固体状的反应产物。

步骤S1所得到的肝素解聚后固体状的反应产物的分子量控制在5000Da或以下。其中，该反应产物的分子量，会基于解聚反应使用的亚硝酸钠用量、pH大小、温度、时间和醇沉条件等因素不同而有所变化。

步骤S1所得到的肝素解聚后固体状的反应产物为小分子肝素，主要寡糖链的还原端为缩环形成的2,5-脱水-D-甘露糖结构。

高碘酸氧化法去除小分子肝素抗凝血活性的作用机制，是在高碘酸钠作用下，将糖链特别是位于活性位点肝素戊糖中含有的邻二醇结构进行氧化，这种邻二醇碳链发生断裂生成醛，其反应机理如图4所示。

优选地，本方案中步骤S2中高碘酸氧化法破坏小分子肝素的抗凝血活性位点的方法为：将步骤S1中得到的反应产物，以水溶解配制成终浓度为10–20％的第二溶液，用酸调节使第二溶液的pH值为4–6，加入与第二溶液等体积的0.1mol/L高碘酸钠溶液，在阴凉处避光反应不少于16小时，得到第二反应液，阴凉处温度为10–20℃；之后调节pH至中性，加入第二反应液总体积0.05–0.1倍的氯化钠固体，搅拌溶解，再加入第二反应液总体积1.0–3.0倍的乙醇或甲醇进行沉降，收集沉淀。

优选地，所述制备方法中步骤S2的反应需避光处理，避免高碘酸的见光分解。

经过步骤S2制备得到的为小分子非抗凝肝素粗品，糖链中特别是位于活性位点肝素戊糖中含有的邻二醇结构发生氧化，使之分别断裂生成醛。此外，高碘酸氧化法会使所述经过步骤S1制备小分子肝素非还原端2-硫酸酯基-艾杜糖醛酸的3,4-位邻二醇碳链发生氧化断裂开环，形成二醛基结构，如图5所示。优选地，精制具体为：以双氧水氧化或活性炭吸附脱色，以过滤器滤除颗粒物，以有机溶剂：甲醇和/或乙醇沉淀去杂，以真空干燥或冷冻干燥去除水分，制得小分子非抗凝肝素成品。

所述小分子非抗凝肝素被去除了肝素药物的抗凝抗栓活性(抗凝抗栓活性功能所必需的活性中心—肝素戊糖，其存在的特殊邻二醇结构，被高碘酸钠氧化打断)，但是保留了其他抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒、降血脂等生物学活性。

一种药物组合物，包括：药学上可接受的载体、以及本方案所述的一种小分子非抗凝肝素。该药物组合物可应用于制备预防和治疗炎症、过敏和肿瘤、病毒、高血脂等药物。此外，本方案所述的一种小分子非抗凝肝素作为原料可应用于制备预防和治疗炎症、过敏和肿瘤、病毒、高血脂等药物。

本发明的有益效果是：提供了一种新型的小分子非抗凝肝素、小分子非抗凝肝素的制备方法、小分子非抗凝肝素的应用，该小分子非抗凝肝素的制备方法简单高效，具有独特的分子结构与修饰，重均分子量为3000Da–5000Da，(肝素)的生物学抗凝活性被去除，其抗-Xa的活性不大于10IU/mg，而充分保留了其抗炎、抗过敏和抗肿瘤等生物学活性，适用于开发制备预防和治疗炎症、过敏和肿瘤、病毒、高血脂药物。

附图说明

图1是背景技术中所述的肝素的结构可以用一个四糖单元表示的结构式。图2是背景技术中所述的显示与抗凝血酶结合的五糖结构的结构式。

图3是小分子非抗凝肝素的制备方法的合成路线示意图。

图4是高碘酸氧化法去除小分子肝素抗凝血活性的作用机制的反应机理图。

图5是高碘酸氧化法会使所述经过S1步骤制备小分子肝素非还原端2-硫酸酯基-艾杜糖醛酸的3,4-位邻二醇碳链发生氧化断裂开环，形成二醛基结构的示意图。

图6是分子非抗凝肝素的核磁氢谱(¹H-NMR)示意图。

图7是小分子非抗凝肝素的分子量及分子量分布示意图。

图8是小分子非抗凝肝素处理后LPS刺激24小时的BV-2细胞上清液中TNF-α的水平。

图9是小分子非抗凝肝素处理后LPS刺激24小时的BV-2细胞上清液中IL-6的水平。

图10是小分子非抗凝肝素处理后LPS刺激24小时的BV-2细胞上清液中IL-4的水平。

具体实施方式

下面结合附图及优选实施例对本发明所述的技术方案作进一步详细的说明。

实施例一

本发明所述的一种小分子非抗凝肝素，其结构式如下：

其中，

R₁＝H或SO₃Na；

R₂＝SO₃Na或COCH₃；

n＝0-24。

所述的小分子非抗凝肝素，具有下述结构特征：

(1)重均分子量为3000Da-5000Da；

(2)非还原端3,4-位氧化开环，形成二醛基结构；

(3)还原端主要由2,5-脱水-D-甘露糖组成；

(4)糖链中间保留有醛基。

上述小分子非抗凝肝素能应用于制备预防和治疗炎症、过敏和肿瘤、病毒、高血脂药物。

实施例二

本实施例所述的一种药物组合物，包括：药学上可接受的载体、以及实施例一所述的小分子非抗凝肝素。药学上可接受的载体包括：pH缓冲剂、等渗调节剂、防腐剂、赋形剂等，常规药学制剂明确的。

上述药物组合物能应用于制备预防和治疗炎症、过敏和肿瘤、病毒、高血脂药物。

实施例三

本实施例中所述的小分子非抗凝肝素的制备，根据图3所示的合成路线示意图，制备小分子非抗凝肝素，步骤如下：

(1)解聚：取肝素钠100g置1L三颈烧瓶中，加入500mL水搅拌至溶清，稀盐酸调节pH至2.0，放置35℃水浴锅中搅拌，加入亚硝酸钠溶液，其中亚硝酸钠溶液是由2g亚硝酸钠溶于约5mL水中形成，反应开始，5小时后稀碱液调节pH至中性终止反应；转移到烧杯中，加入6g氯化钠，搅拌溶解，再加入600mL乙醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，沉淀用300mL乙醇脱水，真空干燥，得解聚后的小分子肝素共87g；

(2)氧化：取解聚后的小分子肝素85g置2L三颈烧瓶中，加450mL水搅拌至溶清，稀盐酸调节pH至4.0，冷却并水浴在10℃保温，加入0.1mol/L高碘酸钠溶液450mL，避光，搅拌开始反应，16小时后调节pH至中性终止反应；转移到烧杯中，加入45g氯化钠，搅拌溶清，再加入900mL乙醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，收集沉淀；

(3)精制：向沉淀中加入5％氯化钠溶液450mL，搅拌至溶清，加入30％双氧水溶液30mL，搅拌后室温静置脱色，2小时后反应液呈淡黄色；调反应液至pH中性，0.45μm+0.22μm滤膜过滤，加入500mL乙醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，收集沉淀，加入300mL乙醇打浆脱水，收集沉淀，真空干燥，制得小分子非抗凝肝素，共63g，总收率63％。

产品检测结果如下：干燥失重为5.2％，重均分子量为4200Da，抗-Xa活性折干后为5.3U/mg，抗-IIa活性折干后为2.2U/mg。

实施例四

本实施例中所述的小分子非抗凝肝素的制备，根据图3所示的合成路线示意图，制备小分子非抗凝肝素，实验步骤如下：

(1)解聚：取肝素钠100g置2L三颈烧瓶中，加入1000mL水搅拌至溶清，稀盐酸调节pH至4.0，于15℃下搅拌，加入亚硝酸钠溶液，其中亚硝酸钠溶液是由5g亚硝酸钠溶于约10mL水中形成，反应开始，2小时后稀碱液调节pH至中性终止反应；转移到烧杯中，加入100g氯化钠，搅拌至溶清，再加入1650mL甲醇，充分搅拌后静置3小时；弃去上层清液，沉淀用300mL甲醇脱水，真空干燥，得解聚后的小分子肝素共89g；

(2)氧化：取解聚后的小分子肝素85g置2L三颈烧瓶中，加850mL水搅拌至溶清，稀盐酸调节pH至6.0，放置25℃水浴中，加入0.1mol/L高碘酸钠溶液850mL，搅拌开始反应，避光反应，搅拌20小时后，调节pH至中性终止反应；转移到烧杯中，加入170g氯化钠，搅拌溶解，再加入5000mL甲醇，充分搅拌后静置3小时；弃去上层清液，收集沉淀；

(3)精制：向沉淀中加入10％氯化钠溶液850mL，搅拌至溶清，加入30％双氧水溶液50mL，搅拌后室温静置脱色，3小时后反应液呈淡黄色；反应液pH调节至中性，0.22μm滤膜过滤，加入850mL甲醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，收集沉淀，加入400mL甲醇，进行打浆脱水，收集沉淀，真空干燥，制得小分子非抗凝肝素，共68g，总收率68％。

产品检测结果如下：干燥失重为4.8％，重均分子量为3850Da，抗-Xa活性折干后为4.8U/mg，抗-IIa活性折干后为2.3U/mg。

实施例五

(1)解聚：取肝素钠100g置2L三颈烧瓶中，加入1000mL水搅拌至溶清，用稀盐酸调节pH至3.0，放置20℃水浴锅中，加入亚硝酸钠溶液，其中亚硝酸钠溶液是由3g亚硝酸钠溶于约8mL水中形成，反应开始，3小时后，用稀碱液调节pH至中性终止反应；加入110g氯化钠，搅拌溶清，将溶液转移到烧杯中，再加入2200mL甲醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，沉淀用200mL甲醇脱水，真空干燥，得解聚后的小分子肝素共92g；

(2)氧化：取解聚后的小分子肝素85g置2L三颈烧瓶中，加850mL水搅拌至溶清，稀盐酸调节pH至5.0，冷却并水浴在15℃保温，加入0.1mol/L高碘酸钠溶液850mL，避光，开始反应，搅拌20小时后，调节pH至中性终止反应；加入170g氯化钠，搅拌溶清，再加入约3500mL甲醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，收集沉淀；

(3)精制：向沉淀中加入3％氯化钠溶液850mL，搅拌至溶清，加入30％双氧水溶液50mL，搅拌后室温静置脱色，4小时后反应液呈淡黄色；将反应液pH调节至中性，0.45μm+0.22μm滤膜过滤，加入1700mL甲醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，收集沉淀，加入400mL甲醇打浆脱水，收集沉淀，真空干燥，制得小分子非抗凝肝素，共71g，总收率71％。

产品检测结果如下：干燥失重为4.5％，重均分子量为3950Da，抗-Xa活性折干后为4.1U/mg，抗-IIa活性折干后为1.7U/mg。

从实施例三、实施例四、实施例五里，可以看到产品检测结果小分子非抗凝肝素的抗-Xa因子活性在10IU/mg以下，抗-IIa因子活性在5IU/mg以下。

实施例六

本实施例中所述的小分子非抗凝肝素的公斤级制备，根据图3所示的合成路线示意图，制备小分子非抗凝肝素，实验步骤如下：

(1)解聚：于100L反应釜中，加入肝素钠3.0Kg和纯化水30L，180rpm搅拌至溶清，控制反应温度为20℃，稀盐酸调节反应液的pH至3.0，加入亚硝酸钠溶液，其中亚硝酸钠溶液是由90g溶于约300mL水中形成，反应开始，3小时后，以稀碱液调节pH至7，终止反应；加入3.3Kg氯化钠，搅拌至溶清，转移反应液至醇沉釜，加入66L甲醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，沉淀用约6L甲醇脱水，湿沉淀真空干燥，得解聚后的小分子肝素共2.65Kg；

(2)氧化：取解聚后的小分子肝素2.5Kg，加入至150L反应釜(避光包裹)，以25L纯化水180rpm搅拌至溶清，冷水浴控15℃，稀盐酸调pH至5.0，加入0.1mol/L高碘酸钠溶液25L开启反应，20小时后，调节pH至7.1，5.0Kg氯化钠，搅拌至溶清，转移反应液至醇沉釜，加入110L甲醇，充分搅拌后静置过夜，弃上清，收集沉淀；

(3)精制：向沉淀罐中加入3％氯化钠溶液25L，搅拌至溶清，加入30％双氧水溶液1.5L，搅拌后室温静置脱色4小时；调反应液至pH中性，加入150g活性炭，180rpm搅拌15分钟，钛棒压滤去除炭渣，滤液再分别以0.45μm和0.22μm过滤器过滤，清液中加入50L甲醇，充分搅拌后静置过夜；弃上清，收集沉淀，加入约10L甲醇打浆脱水，收集沉淀，烘干；再以10L注射用水溶解，0.22μm过滤，装载进不锈钢冻干盘，冷冻干燥(程序：预冻-40℃，4小时，启动冷阱降温和真空泵(50Pa))，隔板升至0℃，2小时，保持0℃，12小时，真空20±5Pa；隔板升至40℃，2小时，保持40℃，2小时，极限真空；结束后泄真空，出箱)，共制得小分子非抗凝肝素1.89Kg，收率63％。

产品检测结果如下：干燥失重为1.2％。重均分子量为4050Da；抗-Xa活性折干后为4.3U/mg；，抗-IIa活性折干后为2.7U/mg；1.0g产品溶于10mL水的溶液，澄清且色度不深于6号标准色；1.0g产品溶于10mL水的溶液，pH为6.9；钠含量折干后为12.2％；磺酸根/羧酸根比例为2.2；重金属残留不大于20ppm；溶剂残留中甲醇为431ppm；细菌内毒素含量小于0.1EU/mg。

小分子非抗凝肝素的批检验检测：表1是连续三批次产品5Kg级的放大验证批的质检结果，制备方法同于实施例六，仅是批量大小不同和部分细节工艺参数的不同。

表1.连续三批5Kg级小分子非抗凝肝素的检验检测结果

以上数据，显示生产验证三批次小分子非抗凝肝素的质检结果高度一致，间接反映了制备工艺与质量的可控性。从以上数据可以得到小分子非抗凝肝素的抗-Xa因子活性在10IU/mg以下，抗-IIa因子活性在5IU/mg以下。

小分子非抗凝肝素的核磁共振氢谱(¹H-NMR)分析：对实施例六制备得到的小分子非抗凝肝素样品的¹H-NMR分析实验，用来确定其结构特征。

受试化合物：小分子非抗凝肝素样品(批号：20221001)。

样品配制：取35mg样品溶解于0.6mL氘水(添加0.002％的TSP作为内标校正零点)，将溶液转移到5mm的核磁管中，并超声处理2分钟。

仪器：NMR Bruker AC500HD；

软件：Bruker Top Spin 3.2(Bruker Biospin GmbH)；

结果：¹H-NMR谱图见图6。

如图6所示，小分子非抗凝肝素样品在5.42ppm、5.21ppm、3.28ppm(呈双峰)和2.05ppm处，分别存在GlcNAc6S/GlcNS6S的H1、IdoA2S的H1、GlcNS的H2和GlcNAc的乙酰基上-CH₃氢峰(甲基氢)，这显示小分子非抗凝肝素的主体结构与肝素多糖一致。此外，在10ppm–8.5ppm的低场区存在多组醛基信号，这与本品的化学反应作用机理相对应，也反映出其寡糖链中存在醛基结构。

小分子非抗凝肝素的分子量分布(SEC-HPLC)分析：实施例六制备得到的小分子非抗凝肝素样品的分子量分布(SEC-HPLC)分析实验，用来确定其结构特征。

(1)设备与试剂：

设备：Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent G1362A示差折光检测器，电子天平；

分子量校准品：USP标准物质；

试剂：硝酸锂(国药，AR)，超纯水；

受试化合物：小分子非抗凝肝素样品(批号：20221001)。

(2)检测条件：

按照高效液相色谱分析方法，选用TSKgel Guard Column SWXL，TSKgelG3000SWXL(7.8mm×30cm，5μm)和TSKgel G2000SWXL(7.8mm×30cm，5μm)色谱柱串联，以示差折光检测器进行检测，检测条件为：

高效液相色谱流动相：0.5M硝酸锂，pH 6.5；

流速：0.6mL/min；

检测时间：50min；

柱温：30℃；

参比池与检测池温度：30℃；

进样量：20μL；

高效液相色谱流动相配制：称取34.5g硝酸锂，置于1L容量瓶，700mL超纯水溶解后调节pH至6.5，超纯水稀释至刻度，摇匀，进行0.22μm微孔滤膜过滤；

检测结果：以SEC-HPLC分析检测并结合GPC软件进行计算，得到小分子非抗凝肝素的分子量和分子量分布，结果见表2和图7。

表2.小分子非抗凝肝素的分子量及分子量分布结果

备注：Mw为重均分子量，Mn为数均分子量，M₈₀₀₀为分子量大于8000Da组分的百分比，M_2000-8000为分子量介于2000Da至8000Da组分的百分比，M₂₀₀₀为分子量小于2000Da组分的百分比，Pd为分散度＝Mw/Mn；M_max为最大分子量。

从结果可知，小分子非抗凝肝素的重均分子量在4000Da左右，分子量大于8000Da组分(M₈₀₀₀)的百分比在10％以下，分子量介于2000Da至8000Da组分(M_2000-8000)的百分比在70％–85％之间，分子量小于2000Da组分(M₂₀₀₀)的百分比在20％以下。此外，根据前述，小分子非抗凝肝素的硫酸取代度(磺酸根/羧酸根比值)均为2.2，因此一个二糖单元的分子量约为550Da，以最大分子量15195Da计算，对应所述小分子非抗凝肝素的结构式中的重复二糖单元数量n的最大值为24。

本实验验证小分子非抗凝肝素对BV-2细胞经LPS诱导神经炎症的影响，利用脂多糖(LPS)刺激微胶质细胞BV-2诱导神经炎症，实验设置不同浓度的小分子非抗凝肝素(500μM、25μM和1μM)、阳性对照(***)和生理盐水空白对照处理，所有组别重复6份，收集细胞培养的上清液并使用电化学发光法(MSD)测定评估细胞因子水平。

实验如下：

将小鼠微胶质细胞BV-2，以含有10％胎牛血清(FCS)、1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺的Opti-MEM培养基培养，计数，细胞接种到96孔板中，每孔5000个BV-2细胞。48小时后，将培养基换成处理培养基(含5％ FCS、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基)，继续培养。

在LPS刺激诱导前1小时，设置不同浓度的小分子非抗凝肝素(500μM、25μM和1μM)、阳性对照(LPS+阳性药物(***10μM))和生理盐水空白对照和单独LPS处理的对照组分别进行相同方式处理。在LPS诱导后24小时，收集BV-2细胞上清液，稀释1倍，以ELISA试剂盒说明书方法，免疫吸附测定3种细胞因子：促炎细胞因子：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)；抗炎细胞因子：白细胞介素-4(IL-4)，结果以pg/mL表示。

实验结果：

图8、图9、图10分别为小分子非抗凝肝素处理后LPS刺激24小时的BV-2细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-4的水平。其中，BV-2细胞用3种浓度的小分子非抗凝肝素处理24小时，并通过MSD评估上清液中细胞因子的释放水平；数据单位为pg/mL，并显示为条形图，Mean±SEM(每组N＝6)；VC：生理盐水对照，T.I.：小分子非抗凝肝素，R.I.：阳性对照；与LPS刺激的对照组进行单向方差分析，用One way Anova检验组间数据的差异，**p<0.01，***p<0.001。

经过LPS的24小时刺激诱导，细胞因子TNF-α和IL-6的水平显著升高，相反地，LPS刺激后IL-4的水平显著降低，阳性对照组，由于阳性药物***的使用，TNF-α、IL-6的水平降低。

与单独的LPS处理对照组相比，三组不同浓度的小分子非抗凝肝素，TNF-α细胞因子显著降低，且呈剂量依赖，剂量越高，效果越好，如图8所示。IL-6的水平，与LPS对照组相比，500μM和25μM组别中显著降低，而在低浓度1μM组中没有影响，如图9所示。抗炎细胞因子IL-4，与LPS对照相比，高、中浓度组(500μM和25μM)小分子非抗凝肝素处理的BV-2细胞，显示出IL-4水平显著增加，如图10所示。

通过实验结果可知：利用脂多糖(LPS)刺激微胶质细胞BV-2诱导神经炎症，当用小分子非抗凝肝素处理后，能显著抑制细胞炎症因子TNF-α和IL-6的释放，提升抗炎因子IL-4的浓度，从而达到抗炎的效果。

最后说明的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明的保护范围不限于上述实施例的描述范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种小分子非抗凝肝素，其特征在于：其结构式如下：

其中，

R₁＝H或SO₃Na；

R₂＝SO₃Na或COCH₃；

n＝0-24。

2.根据权利要求1所述的一种小分子非抗凝肝素，其特征在于：重均分子量为3000Da-5000Da；非还原端3，4-位氧化开环，形成二醛基结构；还原端主要由2，5-脱水-D-甘露糖组成；糖链中间保留有醛基。

3.根据权利要求1或2所述的一种小分子非抗凝肝素，其特征在于：抗-Xa因子效价在10IU/mg以下。

4.根据权利要求1至3中任一种小分子非抗凝肝素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、亚硝酸法解聚肝素制备小分子肝素；

S2、高碘酸氧化法破坏小分子肝素的抗凝血活性位点；

S3、精制。

5.根据权利要求4所述的一种小分子非抗凝肝素的制备方法，其特征在于：步骤S1中亚硝酸法解聚肝素制备小分子肝素的制备方法为：将肝素以水溶解配制成终浓度为10–20％的第一溶液，用酸调节使第一溶液的pH值为2–4，加入肝素重量0.02–0.05倍的亚硝酸钠，在室温下反应2–5小时，得到第一反应液，室温温度为15–35℃；之后调节pH值至中性，加入第一反应液总体积0.05–0.1倍的氯化钠固体，搅拌溶解，再加入第一反应液总体积1.0–2.5倍的乙醇或甲醇进行沉降，收集沉淀，干燥，得到反应产物。

6.根据权利要求4或5所述的一种小分子非抗凝肝素的制备方法，其特征在于：步骤S1中亚硝酸法解聚肝素制备小分子肝素得到的反应产物的分子量控制在5000Da或以下。

7.根据权利要求4所述的一种小分子非抗凝肝素的制备方法，其特征在于：高碘酸氧化法破坏小分子肝素的抗凝血活性位点的方法为：将步骤S1中得到的反应产物，以水溶解配制成终浓度为10–20％的第二溶液，用酸调节使第二溶液的pH值为4–6，加入与第二溶液等体积的0.1mol/L高碘酸钠溶液，在阴凉处避光反应不少于16小时，得到第二反应液，阴凉处温度为10–20℃；之后调节pH至中性，加入第二反应液总体积0.05–0.1倍的氯化钠固体，搅拌溶解，再加入第二反应液总体积1.0–3.0倍的乙醇或甲醇进行沉降，收集沉淀。

8.根据权利要求4所述的一种小分子非抗凝肝素的制备方法，其特征在于：精制具体为：以双氧水氧化或活性炭吸附脱色，以过滤器滤除颗粒物，以甲醇和/或乙醇沉淀去杂，以真空干燥或冷冻干燥去除水分，制得小分子非抗凝肝素成品。

9.一种药物组合物，其特征在于：包括：药学上可接受的载体、以及权利要求1至3中任一种小分子非抗凝肝素。

10.如权利要求1至3中任一种小分子非抗凝肝素作为原料在制备预防和治疗炎症、过敏和肿瘤、病毒、高血脂药物中的应用。