CN116769014A - 一种牛IgG Fc受体boFcγRI的线性配体结合表位 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛IgG Fc受体boFcγRI的线性配体结合表位，该表位序列为TNLSHNGI，位于boFcγRI第2胞外结构域EC2的E‑F环142‑149位。本发明将多肽偶联于载体蛋白，Dot‑blot筛选与牛IgG1特异结合的受体多肽，通过合成N端和C端系列截短多肽，获得特异结合牛IgG1的线性配体结合表位多肽。氨基酸突变分析表明，boFcγRI线性配体结合表位的Thr142、Asn143、Leu144、Gly148和Ile149为结合牛IgG1的关键氨基酸残基；阻断ELISA和玫瑰花环抑制试验结果显示，boFcγRI线性配体结合表位可有效抑制牛IgG1与boFcγRI重组蛋白及其细胞表面表达boFcγRI的结合，为IgG Fc受体靶标药物开发提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种细胞表面受体的配体结合表位，特别是涉及一种牛IgG Fc受体boFcγRI的线性配体结合表位。
背景技术
IgG Fc受体(FcγR)是结合免疫球蛋白G恒定区(Fc)的细胞表面受体，广泛表达于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞(DC)、B细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞等免疫细胞表面，它们通过与IgG Fc区的相互作用在体液和细胞免疫反应中发挥关键作用，成为开发针对自身免疫性疾病、传染性疾病和肿瘤的新型免疫治疗的潜在靶标。人类已鉴定了三种不同类别的受体FcγRI(CD64)、FcγRIIA/B/C(CD32)和FcγRIIIA/B(CD16)，在小鼠中发现了第四类受体FcγRIV，其中FcγRI是唯一已知的高亲和力受体，其结合IgG的亲和力为低亲和力受体FcγRII和FcγRIII的100-1000倍，FcγRI可在低抗体浓度下捕获免疫复合物，在免疫反应早期诱导免疫细胞对抗原的摄入、加工及提呈，其作用远远早于其它低亲和力受体FcγR，因此靶向FcγRI是提高抗体疗法疗效最有效策略之一。在结构上，FcγRI由三个细胞外免疫球蛋白(Ig)样结构域组成，其中细胞外结构域1(EC1)和2(EC2)与其他FcγR中发现的结构域同源，但EC3连接EC2与受体的跨膜部分，为FcγRI独有。目前，已解析了多个IgG1-huFcγRI胞外结构域复合物结构，高亲和力FcγRI的EC2结构域以与低亲和力FcγR相似的模式结合在IgG同源二聚体Fc区的马蹄形开口中，提示可用于设计抑制IgG与FcγRI结合的多肽分子。事实上，来自人IgG的多肽已表现出与FcγRI相结合的能力。因此，我们以源于高亲和力FcγR的Fc结合位点多肽将是调控Fc受体引发炎症反应的理想候选者。
目前已在牛、羊和猪中克隆鉴定FcγRI分子，其中牛FcγRI(boFcγRI)是家畜中首个克隆鉴定的FcγRI基因。Symons和Clarkson(1992)首先以huFcγRI的部分cDNA片段为探针，从牛淋巴细胞基因组文库中获得了编码boFcγRI胞外区的基因片段，长度为0.78kb，该片段未包含boFcγRI信号肽、跨膜区及胞内区编码序列。然而，boFcγRI在细胞中的表达与分布，以及配体特异性和受体与IgG相互作用等尚未见报道。
发明内容
本发明筛选鉴定出boFcγRI的线性配体结合表位及其关键氨基酸，分析线性配体结合表位多肽与牛IgG1的特异结合，探讨表位多肽对IgG-boFcγRI相互作用的调控，为IgGFc受体靶向药物开发提供了新思路。
本发明的技术方案：
一种牛IgG Fc受体boFcγRI的线性配体结合表位，其特征是：所述表位的序列为TNLSHNGI。
所述表位位于boFcγRI第2胞外结构域EC2的E-F环的142-149位。
所述线性配体结合表位特异结合牛IgG1抗体，但不结合牛IgG2抗体。
所述线性配体结合表位中的Thr142、Asn143、Leu144、Gly148和Ile149为结合牛IgG1抗体的关键氨基酸残基，突变其中任一氨基酸会导致所述线性配体结合表位丧失结合牛IgG1抗体的能力。
所述线性配体结合表位能有效抑制牛IgG1抗体与boFcγRI重组蛋白的结合，其半数抑制浓度为20.27μmol/L。
所述线性配体结合表位能有效抑制牛IgG1抗体与细胞表面表达的boFcγRI受体结合，其半数抑制浓度为86.75μmol/L。
所述的线性配体结合表位在FcγR靶向药物制备中的应用。
本申请将boFcγRI编码区cDNA亚克隆到表达载体pcDNA3，在COS-7细胞表面表达受体分子，通过玫瑰花环试验测定boFcγRI的配体特异性，IgG1-RBC在boFcγRI转染细胞上形成明显的玫瑰花环，但未发现boFcγRI与IgG2-RBC结合，表明boFcγRI特异亲和牛IgG1而不结合牛IgG2。
将boFcγRI胞外区cDNA亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1，在大肠杆菌BL21中表达boFcγRI胞外区，从包涵体中有效复性boFcγRI重组蛋白。
在boFcγRI的EC2结构域设计合成boFcγRI多肽，以Dot-blot筛选获得特异结合牛IgG1但不结合牛IgG2的最短有效多肽为142-149位的氨基酸TNLSHNGI，为boFcγRI的线性配体结合表位，位于受体EC2结构域E-F环；多肽突变分析表明，boFcγRI线性配体结合表位的Thr142、Asn143、Leu144、Gly148和Ile149是结合牛IgG1的关键氨基酸残基，突变其中任一氨基酸导致线性配体结合表位多肽丧失结合牛IgG1的能力。
本发明的积极有益效果：
本发明通过在COS-7细胞表面表达boFcγRI受体分子，确定boFcγRI结合牛IgG的配体特异性，并利用合成多肽筛选鉴定boFcγRI的线性配体结合表位，对深入理解IgG-boFcγRI的相互作用有重要意义。
(1)IgG Fc受体功能研究。本申请构建boFcγRI全长cDNA的真核表达质粒，将其转染COS-7细胞，在细胞表面表达boFcγRI分子，构建了boFcγRI功能研究平台。
(2)线性配体结合表位鉴定。本申请参照人或小鼠FcγRI-IgG复合物晶体结构，设计合成boFcγRI胞外结构域多肽，将该多肽偶联载体蛋白，以Dot-blot筛选鉴定与IgG特异结合多肽，建立了boFcγRI线性配体结合表位的鉴定方法。
(3)表位多肽功能分析。利用boFcγRI重组蛋白和HRP标记IgG1，建立表位多肽的阻断ELISA方法，分析表位多肽对boFcγRI重组蛋白与牛IgG结合的抑制作用；利用boFcγRI转染细胞和牛IgG1致敏红细胞，通过玫瑰花环抑制试验，分析表位多肽对细胞表面表达boFcγRI与牛IgG结合的调控作用。
结果表明，本发明的线性配体结合表位能有效抑制牛IgG1与boFcγRI重组蛋白的结合，其半数抑制浓度为20.27μmol/L；还能有效抑制牛IgG1与细胞表面表达boFcγRI受体的结合，其半数抑制浓度为86.75μmol/L。
(4)FcγR靶向药物设计。本发明筛选鉴定的boFcγRI线性配体结合表位及其多肽，对boFcγRI-IgG1结合有良好调控作用，为FcγR靶向药物设计提供新思路。
附图说明
图1：boFcγRI在转染细胞表面的表达。
图中，A.boFcγRI转染细胞+IgG1-RBC，B.boFcγRI转染细胞+IgG2-RBC，C.COS-7未转染细胞+IgG1-RBC。
图2：boFcγRI胞外区在大肠杆菌中的表达。
图中，A.SDS-PAGE，B.Western blot，M.蛋白质Marker，1.pGEX-boFcγRI未诱导菌体，2.pGEX-6P-1诱导菌体，3.pGEX-boFcγRI诱导菌体。
图3：FcγRI EC2结构域氨基酸序列比对。
图4：boFcγRI多肽与牛IgG1的结合。
图5：N端截短boRI5多肽与牛IgG1的结合。
图6：C端截短RI5-N1多肽与牛IgG1的结合。
图7：Ala-置换5N1-C2多肽与牛IgG1的结合。
图8：5N1-C2多肽抑制boFcγRI重组蛋白与牛IgG1的结合。
图9：5N1-C2多肽抑制细胞表面boFcγRI与牛IgG1的结合。
具体实施方式
实例1牛IgG纯化与标记
以硫酸钠盐析法从牛抗鸡红细胞(RBC)高免血清中分离纯化牛IgG，利用DEAE纤维素离子交换层析从牛IgG中分离牛IgG1和IgG2，并以蛋白A亲和层析进一步纯化牛IgG1或IgG2蛋白。利用辣根过氧化物酶(HRP)以改良过碘酸钠法标记牛IgG1和IgG2，以0.5％(wt)鸡红细胞RBC测定牛IgG1和IgG2的血凝效价，用于制备牛IgG致敏红细胞(RBC)。
实例2boFcγRI在细胞表面的表达
根据boFcγRI cDNA序列(NM_174538)，设计合成引物扩增boFcγRI全长ORF cDNA((含信号肽序列)，克隆入真核表达载体pcDNA3，转化E.coli JM109感受态细胞，经PCR和酶切鉴定，构建真核表达质粒pcboFcRI。以环状或BglII线性化真核表达质粒pcboFcRI转染COS-7细胞，分别用牛IgG1或IgG2致敏红细胞(RBC)进行玫瑰花环试验，检测受体分子在转染细胞表面的表达，并测定boFcγRI对牛IgG1及IgG2结合的配体特异性。
结果如图1显示，牛IgG1-RBC在boFcγRI转染细胞周围形成明显的玫瑰花环(图1A)，而IgG2-RBC则未见玫瑰花环形成(图1B)，表明boFcγRI特异亲和牛IgG1，而不结合牛IgG2，boFcγRI是牛IgG1的特异受体。
实例3boFcγRI胞外区在大肠杆菌中的表达纯化
设计引物扩增boFcγRI胞外区cDNA(不含信号肽序列)，克隆入原核表达载体pGEX-6P-1，转化E.coli JM109感受态细胞，经PCR和酶切鉴定，构建原核表达质粒pGEXboFcRI；将原核表达质粒pGEXsboRI转化到表达菌株E.coli BL21，以IPTG诱导表达。
SDS-PAGE和Western blot结果显示，含pGEXsboRI的E.coli BL21在IPTG诱导5h后表达59kDa左右的GST融合蛋白；而诱导的pGEX-6P-1对照菌体表达约28kDa的GST融合蛋白，未诱导菌体的未见明显的表达条带(图2)。
SDS-PAGE分析表明，大部分boFcγRI表达蛋白在胞浆内形成不溶性蛋白包涵体，分离表达的蛋白包涵体，将其溶于6M盐酸胍或8M尿素溶液进行变性，先后以快速稀释法和梯度透析法对变性蛋白进行复性。Dot-blot检测发现溶于2M尿素溶液的boFcγRI重组蛋白能有效与HRP-IgG1结合，具有良好的与牛IgG结合活性。
实例4boFcγRI多肽的设计合成
将boFcγRIA(NP_776963)与huFcγRI(AAH32634)和moFcγRI(NP_034316)的氨基酸序列进行序列比对(图3)，参照huFcγRI的晶体结构，根据boFcγRIA第二结构域(EC2)的氨基酸序列分段设计合成6条boFcγRI(简写boRI)多肽boRI1、boRI2、boRI3、boRI4、boRI5、boRI6，分别覆盖其EC2结构域的A-B、B-C、C-C’、D-E、E-F和F-G环，除boRI2和boRI6多肽N端含有Cys外，其余4条多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联(表1)。
表1boFcγRI多肽的特性
实例5boFcγRI多肽与牛IgG1特异结合
利用异型双功能试剂Sulfo-SMCC将上述的boFcγRI多肽boRI1、boRI2、boRI3、boRI4、boRI5、boRI6分别偶联于无IgG的牛血清白蛋白(BSA)载体蛋白(以提高多肽的反应性)，备用。将1mg Sulfo-SMCC(分子量：436.37，间隔臂长度：)溶于50μl二甲基亚砜中，然后加入4mg不含IgG的BSA溶于0.5ml偶联缓冲液(0.1mol/l PB pH 7.2，0.15mol/lNaCl，1mol/l EDTA)，混合后在室温下反应1小时或37℃ 30分钟，然后在4℃下用偶联缓冲液透析过夜。将20μl上述偶联载体蛋白的boFcγRI多肽(100μg)溶于含有5mM EDTA和12.5％(v/v)二甲基甲酰胺(DMF)的0.01mol/l PB缓冲液(pH 7.2)中，与等体积SMCC活化的BSA载体蛋白(100μg)在室温下孵育4小时，然后在4℃下过夜。以0.01M PB的缓冲液(pH7.2)将偶联载体蛋白多肽的浓度调节至1mg/ml，以Dot-blot检测偶联载体蛋白多肽与HRP-IgG1和IgG2的结合。
结果显示，HRP-IgG1与boRI5多肽特异结合，未见与其它5条boRI多肽有显色反应；而HRP-IgG2则不结合任何boFcγRI多肽(图4)。在Ig-结合阻断试验中，牛血清和纯化牛IgG1均有效阻断HRP-IgG1与boRI5多肽的结合，表明boRI5多肽特异亲和牛IgG1，但不亲和牛IgG2。
实例6boFcγRI线性配体结合表位的精确定位
为精确定位boFcγRI线性配体结合表位，分别从N端和C端逐个缺失boRI5多肽的氨基酸残基，合成N端或C端截短的系列多肽，并以Dot-blot检测其与牛IgG1的结合能力。首先，从N端逐个缩短boRI5多肽(Cys除外)，合成6条N端截短系列多肽RI5-N1、RI5-N2、RI5-N3、RI5-N4、RI5-N5、RI5-N6(表2)。
IgG1-结合试验结果，缺失Gln141未见影响boRI5多肽与HRP-IgG1的结合，而缺失Thr142的多肽则完全失去结合活性，表明Thr141为boFcγRI线性配体结合表位的N末端残基(图5)。
表2boRI5多肽的N端截短多肽
从C端逐个缩短RI5-N1多肽，合成6条C端截短系列多肽5N1-C1、5N1-C2、5N1-C3、5N1-C4、5N1-C5、5N1-C6(表3)。在IgG1-结合试验中，缺失Ile149的C端截短多肽5N1-C3、5N1-C4、5N1-C5、5N1-C6丧失与牛IgG1的结合能力，提示boFcγRI线性配体结合表位的C末端残基为Ile149(图6)。因此，5N1-C2对应的序列TNLSHNGI是结合牛IgG1最短的有效多肽，即为boFcγRI线性配体结合表位，定位于受体EC2结构域E-F环的142-149位。
表3RI5-N1多肽的C端截短多肽
实例7boFcγRI线性配体结合表位关键氨基酸残基的鉴定
以具有牛IgG1结合活性的5N1-C2多肽为基础，用Ala依次置换多肽的氨基酸残基，(Cys除外)，合成8条Ala-突变系列多肽5N1C2-T、5N1C2-N1、5NIC2-L、5N1C2-S、5N1C2-H、5N1C2-N2、5N1C2-G、5N1C2-I(表4)，鉴定boFcγRI线性配体结合表位的关键氨基酸残基。
Dot-blot结果显示，Thr142、Asn143、Leu144、Gly148或Ile149突变导致5N1-C2多肽丧失结合牛IgG1活性，Ser145或His146突变显著减弱多肽与HRP-IgG1的结合，而Asn147突变对HRP-IgG1的结合未产生明显影响(图7)，表明Thr142、Asn143、Leu144、Gly148和Ile149是boFcγRI线性配体结合表位的关键氨基酸残基，Ser145和His146参与配体的结合，但不是核心残基。
表4 5N1-C2多肽的Ala-置换多肽
实例8线性配体结合表位多肽对可溶性boFcγRI结合牛IgG1的抑制
用BSA偶联的5N1-C2多肽与HRP-IgG1相作用，测定其对可溶性boFcγRI结合牛IgG1的抑制作用。在竞争ELISA中，BSA偶联5N1-C2多肽有效抑制了HRP-IgG1在boFcγRI重组蛋白包被板上的结合，其半数抑制浓度(IC50)为20.27μmol/L；而不结合牛IgG1的对照多肽boRI1对HRP-IgG1与可溶性受体的结合未产生明显影响(图8)。
实例9线性配体结合表位多肽对细胞表面boFcγRI结合牛IgG1的抑制
以玫瑰花环抑制试验测定线性配体结合表位多肽对牛IgG1与细胞表面boFcγRI结合的抑制功效。不同浓度的BSA偶联5N1-C2多肽与IgG1-RBC相作用，在表达boFcγRI的转染细胞上测定多肽对IgG1-RBC玫瑰花环形成的抑制。
结果可见，BSA偶联5N1-C2多肽明显抑制了转染细胞表面玫瑰花环的形成，其半数抑制浓度(IC50)为86.75μmol/L，比boFcγRI重组蛋白(IC50＝1.13μmol/L)高75倍，表明boFcγRI线性配体结合表位多肽能有效抑制牛IgG1与细胞表面表达boFcγRI结合；而boRI1对照多肽在高浓度下也没有对玫瑰花环的形成产生明显影响(图9)。
Claims (7)
1.一种牛IgG Fc受体boFcγRI的线性配体结合表位，其特征是：所述表位的序列为TNLSHNGI。
2.根据权利要求1所述的的线性配体结合表位，其特征是：所述表位位于boFcγRI第2胞外结构域EC2的E-F环的142-149位。
3.根据权利要求1所述的的线性配体结合表位，其特征是：所述线性配体结合表位特异结合牛IgG1抗体，但不结合牛IgG2抗体。
4.根据权利要求1所述的的线性配体结合表位，其特征是：所述线性配体结合表位中的Thr142、Asn143、Leu144、Gly148和Ile149为结合牛IgG1抗体的关键氨基酸残基，突变其中任一氨基酸会导致所述线性配体结合表位丧失结合牛IgG1抗体的能力。
5.根据权利要求1所述的线性配体结合表位，其特征是：所述线性配体结合表位能有效抑制牛IgG1抗体与boFcγRI重组蛋白的结合，其半数抑制浓度为20.27μmol/L。
6.根据权利要求1所述的线性配体结合表位，其特征是：所述线性配体结合表位能有效抑制牛IgG1抗体与细胞表面表达的boFcγRI受体结合，其半数抑制浓度为86.75μmol/L。
7.一种权利要求1所述的线性配体结合表位在FcγR靶向药物制备中的应用。
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