CN116735888B - 一种特异性多克隆抗体检测cog5的间接elisa方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法，包括以下步骤：使用包被液将COG5重组蛋白进行包被；第二天倒掉板孔内包被液，用PBST洗涤；使用封闭剂对包被后的酶标板进行封闭处理；倒掉封闭液，用PBST洗涤；用PBST将多抗血清倍比稀释，同时设空白对照和阴性对照，温箱孵育；倒掉免疫血清，用PBST洗涤；用PBST将酶标二抗稀释，箱孵育，洗板；加入双组份显色液A，B温浴；加入终止液，终止显色反应；进行双波长OD值检测。该方法测定血清COG5具有良好的检测性能，可初步满足临床需求。

Description

一种特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法
技术领域
本发明属于基因工程技术技术领域，具体地说，涉及一种特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法。
背景技术
心血管疾病是当代社会致死率较高的疾病之一，显著高于恶性肿瘤和其他疾病，是威胁人类生命安全和身体健康的首要杀手。研究显示，血脂异常是AS形成的核心因素。高尔基体是脂类和蛋白质转运/分选的中心枢纽，也是蛋白质和脂类糖基化的主要部位。据报道，保守寡聚高尔基体(COG)复合物位于高尔基体的膜质表面，由八个亚基组成(Cog1-Cog8)，分布在两个叶中。其中，COG5在稳定高尔基体的结构和功能方面起着重要作用，并且可以影响细胞内膜运输。既往研究发现，敲低COG5会导致导致细胞内LDLR积聚。进一步研究发现，在人类动脉粥样硬化斑块中，COG5表达与动脉粥样硬化斑块中LDLR表达负相关。因此，COG5与冠状动脉粥样硬化密切相关。
因此，我们推断在动脉粥样硬化性心血管病的疾病进程中，COG5有可能从冠状动脉粥样硬化斑块释放入血。那么能否运用一种检测方法，通过检测血清中COG5浓度判断冠状动脉有无狭窄及狭窄程度？将基础研究转化为临床诊断应用。
目前，关于COG5的基础研究较多，国内外仍没有血清COG5检测的参考方法，各实验室的检测结果也没有可比性，更无法投入临床应用。因此，有必要提供一种新的特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法，包括以下步骤：
(1)包被∶使用包被液将COG5重组蛋白，在96孔板上进行100μl/孔包被；
(2)洗板：第二天倒掉板孔内包被液，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干；
(3)封闭∶使用封闭剂对包被后的酶标板进行封闭处理，每孔加200μl，条件37℃温浴1h；
(4)洗板：倒掉板孔内封闭液，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干；
(5)加入一抗免疫血清∶用PBST将多抗血清倍比稀释，同时设空白对照和阴性对照，每孔100μl，加完后，于37℃温箱孵育1h；
(6)洗板：倒掉板孔内免疫血清，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干；
(7)加酶标二抗∶上述一抗孵育结束并洗涤后，用PBST将酶标二抗稀释为1∶10000稀释度，每孔100μl，37℃避光温箱孵育1h，洗板；
(8)加入双组份显色液A，B每孔各50μl，置于恒温水浴箱中，全程避光操作，37℃温浴1-15min不等；
(9)终止液每孔加100μl，终止显色反应；
(10)用Thermo酶标仪在450-630nm进行双波长OD值检测。
可选地，所述的COG5重组蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选地，所述步骤(1)的COG5重组蛋白的浓度为0.0514ng/ml～11.1111ng/ml。
可选地，所述步骤(1)的包被液与COG5重组蛋白抗原按1∶10进行稀释；包被条件为37℃，1小时，然后放4℃冰箱，24小时过夜。
可选地，所述步骤(3)的封闭剂为1％BSA。
可选地，所述步骤(5)的用PBST将抗血清稀释度为1∶5000。
可选地，所述步骤(7)的酶标二抗为加入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，酶标二抗的稀释度为1∶10000。
可选地，所述步骤(8)中的双组份显色液A，B分别为TMB双组分显色液PR1210-100ml。
可选地，所述步骤(9)中的显色反应为3min。
可选地，所述步骤(10)的终止液为C1058。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
以COG5特异性多克隆抗体为基础，建立了一种特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法。该方法测定血清COG5具有良好的检测性能，可初步满足临床需求。COG5作为判断有无冠脉粥样硬化斑块的指标有较好的诊断效能。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明COG5与OD值关系曲线；
图2是本发明COG5重组蛋白拟合线性曲线；
图3是本发明COG5多抗1:5000；
图4是本发明COG5多抗1:10000；
图5是本发明COG5多抗1:20000；
图6是本发明不同浓度BSA封闭液选择；
图7是本发明显色时间的选择；
图8是本发明正常对照和CAA组间COG5数据分布；
图9是本发明正常对照和CAA组间COG5水平比较；
图10是本发明COG5诊断本地区胸痛人群患CAA的ROC曲线；
图11是本发明模型1和2诊断胸痛人群冠脉粥样硬化ROC曲线；
图12是本发明COG5与GENSINI评分的相关性；
图13是本发明GENSINI评分组间COG5水平分析；
图14是本发明冠脉狭窄度模型的校准曲线；
图15是本发明冠脉狭窄度模型区分度的ROC曲线；
图16是本发明冠脉狭窄程度列线图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
COG5重组蛋白抗原购自中国CUSABIO公司，货号：CSB-EP890771HU，表达宿主为大肠杆菌，体积为20μL/支，质量为20μg/支，分子量为33.8KDa，分装浓度为1.0mg/ml，保存条件：-20℃或-80℃冷冻保存，氨基酸序列为MGWVGGRRRDSASPPGRSRSAADDINPAPANMEGGGGSVAVAGLGARGSGAAAATVRELLQDGCYSDFLNEDFDVKTYTSQSIHQAVIAEQLAKLAQGISQLDRELHLQVVARHEDLLAQATGIESLEGVLQMMQTRIGALQGAVDRIKAKIVEPYNKIVARTAQLARLQVACDLLRRIIRILNLSKRLQGQLQGGSREITKAAQSLNELDYLSQGIDLSGIEVIENDLLFIARARLEVENQAKRLLEQGLETQNPT，如SEQ IDNO.1所示；
Anti-COG5抗体IgG(兔源性多克隆抗体)，货号ab229830，购自美国Abcam公司，免疫原为：Recomtinant frogment coresponding to Human COG5s 1.300Database link:Q9UP83，分装浓度为0.39mg/ml，体积为50μL/支。
Goat anti-Human IgG Fc(HRP)羊抗兔HRP标记IgG(多克隆抗体)，货号ab205718，购自美国Abcam公司，免疫原为：Rabbt IgG,whole molecule，分装浓度为2.0mg/ml，体积为500μL/支。
所有试剂和重组蛋白，全部分装保存，重组蛋白为每管2.0μl，Anti-COG5多克隆抗体为2.5μl/管，酶标二抗为2.0μl/管，冻存于-20℃，一次一管，以保证分装抗体的稳定状态。
主要试剂如下表1：
表1主要试剂
实施例1优化特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法
1、确定COG5重组蛋白抗原标准品的线性浓度范围
通过建立不同浓度COG5重组蛋白抗原与OD值的关系模型，从关系模型中选择COG5线性较好的部分进行R2值计算，从而缩小COG5检测浓度范围，并再次检测直至得到较高的R2值。实验方法具体如下∶
(1)包被∶使用包被液将倍比稀释浓度的COG5重组蛋白(900ng/ml、300ng/ml、100ng/ml、33.3333ng/ml、11.1111ng/ml、3.7037ng/ml…、0.0064ng/ml)，在96孔板板上进行100μl/孔包被，条件为∶37℃，1小时，然后放4℃冰箱，24小时过夜。
(2)洗板：第二天倒掉板孔内包被液，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干。
(3)封闭∶使用封闭剂对包被后的酶标板进行封闭处理，每孔加200μl，条件37℃温浴1h。(暂用1％BSA+PBST进行封闭处理。)
(4)洗板：倒掉板孔内封闭液，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干。
(5)加入免疫血清∶用PBST将多抗血清稀释成1∶5000的稀释度，同时设空白对照和阴性对照，每孔100μl，加完后，于37℃温箱孵育1h。
(6)洗板：倒掉板孔内免疫血清，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干。
(7)加酶标二抗∶上述一抗孵育结束并洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗(用PBST按1∶10000稀释)，每孔100μl，37℃避光温箱孵育1h，洗板。
(8)加入双组份显色液A，B每孔各50μl，置于恒温水浴箱中，全程避光操作，37℃温浴1-15min不等。
(9)终止液每孔加100μl，终止显色反应。
(10)用Thermo酶标仪在450-630nm进行双波长OD值检测。
(11)运用相应统计软件进行结果分析。
建立梯度浓度COG5重组蛋白标准品与吸光度值的关系模型，见图1、图2所示，当COG5重组蛋白的浓度在0.0514ng/ml～11.1111ng/ml之间时，COG5浓度与OD值成线性相关，其相关系数R2为0.9910。
2、优化COG5多克隆抗体、酶标二抗的稀释度
通过正交实验选择COG5多克隆抗体、酶标二抗的最适稀释浓度，将浓度为0.39mg/ml COG5多克隆抗体以1∶5000、1∶10000、1∶20000的倍数稀释，并用2mg/ml酶标二抗以1∶10000、1∶20000、1∶40000的梯度加样，运用ELISA检测，比较检测结果中吸光度值的高低差值与R2值。实验方法具体见下∶
步骤(1)中使用包被液将比例稀释浓度的COG5重组蛋白11.1111ng/ml、3.7037ng/ml…、0.0514ng/ml；
步骤(3)中暂用1％BSA+PBST进行封闭处理；
步骤(5)中用PBST将多抗血清稀释成1∶5000，1∶10000，1∶20000的稀释度；
步骤(7)中用PBST倍比稀释为1∶10000,1∶20000,1∶40000稀释；
其余步骤同实施例1中的1中的实验方法。
将0.39mg/mlCOG5多克隆抗体以(1∶5000、1∶10000、1∶20000)3种不同浓度进行稀释，2mg/ml酶标二抗以(1∶10000、1∶20000、1∶40000)3种不同浓度进行加样，运用正交试验，对COG5多克隆抗体和酶标二抗的最适浓度分别进行选择，检测结果见表2、图3-5所示，当COG5多克隆抗体浓度为1∶5000、酶标二抗加样浓度为1∶10000时，其相关系数R2值为0.9935，与COG5多克隆抗体浓度在1∶10000、酶标二抗加样浓度为1∶10000相关系数R2值的结果0.9946相差无几，但由于COG5多克隆抗体浓度为1∶5000时OD值高低差的结果2.137高于COG5多克隆抗体浓度为1∶10000时OD值高低差的结果1.721，因此选择COG5多克隆抗体浓度在1∶5000、抗酶标二抗加样浓度为1∶10000为两种抗体的最佳稀释浓度。
表2COG5多克隆抗体和酶标二抗正交试验结果
3、封闭液的选择
分别用1％BSA、5％BSA作为封闭液选择最适合的封闭方式。将0.39mg/mlCOG5多克隆抗体固定为1∶5000的稀释度，将2mg/ml酶标二抗稀释为1∶10000倍数，通过建立数学关系模型中的R2值选择封闭液的最佳浓度。具体实验方法如下∶
步骤(1)中使用包被液将比例稀释浓度的COG5重组蛋白(11.1111ng/ml、3.7037ng/ml…、0.0514ng/ml)；
步骤(3)中用每孔200μl的1％BSA、5％BSA对包被后的酶标板板进行封闭处理；
步骤(5)中用PBST将多抗血清稀释成1∶5000的稀释度；
步骤(7)中用PBST将酶标二抗稀释为1∶10000稀释度；
其余步骤同实施例1中的1中的实验方法。
运用2种浓度的封闭液(1％BSA、5％BSA)封闭后，根据实验结果分析不同浓度封闭液的测定效果，结果如表3、图6，1％BSA封闭液和5％BSA封闭液的吸光度值高低差和相关系数R2值分别是1.544、0.9920和0.661、0.9840，1％BSA封闭液的结果好于5％BSA封闭液，所以选择1％BSA封闭液为本实验的封闭液。
表3不同浓度封闭液吸光度值结果
4、显色时间的选择
在显色步骤中加入显色A、B液后，在3种反应时间1min、3min、10min中选择一种作为最适反应时间。将0.39mg/ml COG5多克隆抗体固定为1∶5000的稀释度，将2mg/ml酶标二抗稀释为1∶10000倍，通过建立标准曲线进行ELISA检测，并比较检测结果中的高低差值和R2值。具体实验方法如下∶
步骤(1)中使用包被液将比例稀释浓度的COG5重组蛋白(11.1111ng/ml、3.7037ng/ml…、0.0514ng/ml)；
步骤(3)中用每孔200μl的1％BSA对包被后的酶标板板进行封闭处理；
步骤(5)中用PBST将多抗血清稀释成1∶5000的稀释度；
步骤(7)中用PBST将酶标二抗稀释为1∶10000稀释度；
其余步骤同实施例1中的1中的实验方法。
HRP能够与底物液反应形成蓝色，加入酸性终止液后会变成黄色，在450nm波长下检测其OD值。显色时间长短和温度会影响检测值的大小。在一定范围内的时间，阴性对照孔保持无色，阳性孔颜色随着显色时间的增长变深。通过比较酶和底物反应的3种不同的显色时间(1min、3min、10min)，根据ELISA实验结果判断不同显色时间条件下的测定效果，结果表明(见表4、图7)，当显色时间为3min时，即加入A和B显色液各50ml后反应3min再加入终止液100ml，混匀后再5分钟内进行比色，虽然OD值高低差不是最高，但其线性相关系数R2值均最高(为0.9947)，因此，确定中后的显色反应时间为3min。
表4不同显色时间吸光度值结果
5、血清样本稀释倍数的选择
使用COG5重组蛋白构建梯度稀释浓度为11.1111ng/ml、3.7037ng/ml…、0.0514ng/ml的标准曲线，从收集的冠状动脉粥样硬化病人组和正常体检组血样标本中，各抽取10份血样进行梯度稀释5％、10％、20％、40％、80％(即5μl血清+95μl包被液、10μl血清+90μl包被液、20μl血清+80μl包被液、40μl血清+60μl包被液、80μl血清+20μl包被液)，进行血样COG5间接ELISA检测，通过比较不同稀释度血样中的COG5浓度与线性范围，选择最佳的血样稀释度。具体实验操作如下：
(1)包被∶使用COG5重组蛋白构建标准曲线，将冠状动脉粥样硬化病人组和正常体检组血样各十份用包被液进行梯度稀释(5％、10％、20％、40％、80％)，在96孔板板上进行100μl/孔包被，条件为∶37℃，1小时，然后放4℃冰箱，24小时过夜。
步骤(3)中用每孔200μl的1％BSA对包被后的酶标板板进行封闭处理；
步骤(5)中用PBST将多抗血清稀释成1∶5000的稀释度；
步骤(7)中用PBST将酶标二抗稀释为1∶10000稀释度；
其余步骤同实施例1中的1中的实验方法。
比较冠状动脉粥样硬化病人组和正常体检组血样各10份进行梯度稀释5％、10％、20％、40％、80％(即5μl血清+95μl包被液、10μl血清+90μl包被液、20μl血清+80μl包被液、40μl血清+60μl包被液、80μl血清+20μl包被液)，根据ELISA实验结果分析不同梯度血清稀释的测定效果，结果显示(见表5)，当病人组和正常组血样为5％和10％稀释时，血样中COG5终浓度差异不大，且高于20％、40％、80％的血样稀释浓度，说明血清在10％稀释时，包被液就能够把COG5抗原完全包被，达到血样最佳包被条件，为了节省包被液用量，因此确定血清样本的稀释浓度为10％(即稀释10倍)。
表5血清样本不同稀释倍数的检出量
实施例2特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法
步骤具体如下：
(1)包被∶使用COG5重组蛋白构建标准曲线，用包被液将COG5重组蛋白按1∶10进行稀释，在96孔板板上进行100μl/孔包被，条件为∶37℃，1小时，然后放4℃冰箱，24小时过夜；COG5重组蛋白的浓度为0.0514ng/ml～11.1111ng/ml。
(2)洗板：第二天倒掉板孔内包被液，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干。
(3)封闭∶以每孔200μl的1％BSA对包被后的酶标板板进行封闭处理，条件37℃温浴1h。
(4)洗板：倒掉板孔内封闭液，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干。
(5)加入免疫血清∶用PBST将抗血清稀释成1∶5000的倍，同时设空白对照和阴性对照，每孔100μl，加完后，于37℃温箱孵育1h。
(6)洗板：倒掉板孔内免疫血清，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次3-5分钟，尽量拍干。
(7)加酶标二抗∶上述一抗孵育结束并洗涤后，用PBST将酶标二抗稀释为1∶10000稀释度，每孔100μl，37℃避光温箱孵育1h，洗板。
(8)加入双组份显色液A，B(组分显色液PR1210-100ml)每孔各50μl，置于恒温箱中，全程避光操作，在37℃温浴3min。
(9)使用终止液每孔100μl，终止反应。
(10)用Thermo酶标仪在450-630nm进行双波长OD值检测。
(11)运用相应统计软件进行结果分析。
实施例3特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法的性能初评
1、线性：
线性定义为在一定的浓度范围，物质浓度与吸光度值的线性相关性，一般用R2表示。R2一般要求达0.97以上，越接近1其线性相关性越好。具体试验方法同实施例1中的1中实验方法。
当COG5重组蛋白的浓度在0.0514ng/ml～11.1111ng/ml之间时，COG5浓度与OD值成线性相关，运用平均斜率法拟合的直线回归方程为：Y＝0.09643+0.1446X，其相关系数R2为0.9910，符合ELISA方法的技术指标，结果如图2所示。
2、回收率实验：
回收率能反映样品分析过程中被分析物的损失程度，损失越少，回收率越高。实验操作具体见下：取一8份混合血清的样品，测得其COG5浓度是2.121ng/ml，进一步分成3份，每份加样50μL。再在样品中分别加入三种不同浓度的COG5抗原重组蛋白(3ng/ml、1.5ng/ml、1.0ng/ml)各50μL，测定三份溶液的实际浓度，并运用回收率计算公式得出对应回收率的百分比。公式为P＝C2*V2-C1*V1/C0*V0×100％，其中V0为标准品体积；C0为标准品浓度；V1为样品体积；C1为样品浓度；V2为(样品+标准品)混合体积；C2为(样品+标准品)混合浓度。
回收率越高，表明检测方法的可靠性越好。3份样品的回收率结果分别是90.8％、99.8％、88.5％，回收率较高。实验结果如下∶(表6)
表6回收率实验数据
注：C0为标准品浓度；C1为样品浓度；C2为(样品+标准品)混合浓度。
3、批内和批间的重复性实验：
批内实验是将3份浓度不同(在本室测得分别为7.131ng/ml、6.362ng/ml、4.140ng/ml)的血清样本于同一块酶标板上重复测定6次，检测出3份血清样本的CV值。批间实验是将3份浓度不同(在本室测得分别为14.944ng/ml、9.691ng/ml、8.373ng/ml)的血清样本分别于6块不同酶标板上进行测定，同样检测出3份血清样本的CV值。通过分析批内和批间差异评价方法的稳定性。
运用实施例2的间接ELISA检测法，对3份浓度不同的血清样本进行批内和批间重复性分析，结果如(表7)所示，3份血清样本批内变异系数分别是10.12％、6.43％、11.61％，批间变异系数分别是10.57％、12.96％、11.75％，批内和批间变异系数均低于15％(CLIA-88)，表明稳定性良好。
表7批内和批间重复性实验数据
实施例4特异性多克隆抗体检测COG5的间接ELISA方法的临床应用
本实施例通过建立临床冠状动脉粥样硬化患者的病例对照研究，采用实施例2建立的间接ELISA法测定来自昆明医科大学第一附属医院心内科住院的630例因胸痛行冠脉造影确诊为CAA患者和315例正常对照者(包括无胸痛胸闷正常体检人群264例和因胸痛于心内科行冠脉造影明确无狭窄人群51例)的血清COG5，分析血清COG5水平在通过冠脉造影明确的冠状动脉粥样硬化患者与非冠状动脉性疾病患者之间、不同狭窄程度的冠状动脉粥样硬化患者之间的差异。探讨COG5诊断本地区胸痛人群发生CAA的临床价值，并深入研究是否可以将COG5作为无创的手段应用于临床评估冠状动脉狭窄严重程度。
1、研究对象
1.1研究对象的选择
选取自2020年6月——2020年12月于我院心脏内科病房就诊并经冠状动脉造影的冠状动脉粥样狭窄患者630例为病例组，年龄为18～90岁；选择同期无胸闷胸痛体检人群264例和因胸痛于心内科行冠脉造影明确无狭窄人群51例为正常对照，年龄为18～90岁。本研究取得纳入研究对象的知情同意，在收集临床资料和分析数据过程中，对相应信息保密。
1.2研究对象的纳入标准
(1)正常对照者
无胸闷胸痛，行血管超声检查未发现斑块形成，未发现血管壁内膜中层厚度增厚；经冠状动脉造影检查无斑块形成及因其导致的冠脉狭窄。
(2)冠状动脉粥样硬化患者
冠状动脉粥样硬化参照Al-Mallah等(Al-Mallah,MH；Qureshi,W；Lin,FY；etal.Does coronary CT angiography improve risk stratification over coronarycalcium scoring in symptomatic patients with suspected coronary arterydisease？Results from the prospective multicenter international CONFIRMregistry.[J].Eur Heart J Cardiovasc Imaging.2014,15(3):267-74)发表在《欧洲心脏杂志-心血管影像》的论文定义为行冠状动脉造影检查发现任何狭窄或斑块者。
1.3研究对象的排除标准
有下列情况之一者均被排除：①年龄<18岁或>90岁；②急性创伤或感染；③有严重肝肾功能不全(血ALT高于正常上限的3倍、血肌酐
>133μmol/L)、严重血凝功能障碍；④既往有恶性肿瘤、自身免疫性疾病、传染性炎性疾病、血液性疾病以及精神异常等相关病史；⑤信息资料不完善；⑦有其他原因不能够耐受冠脉造影检查。
2实验方法
2.1冠状动脉造影检查和Gensini积分
由经验丰富的介入心脏病学医师对所有患者进行冠状动脉造影，用Seldinger法穿刺到右侧桡动脉后采用Terumo左右共用导管进行冠状动脉造影术。并由两名心脏病介入专业医生用统一的标准对造影结果进行分析，根据管腔直径判定冠状动脉狭窄程度(用％表示)。
依据造影结果，运用Gensini评分***(Gensini G G.A more meaningfulscoring system for determining the severity of coronary heart disease.Am JCardiol,1983,51(3):606.)对各支冠脉病变狭窄程度进行评定，主要包括两个方面：①首先依据冠状动脉狭窄程度确定基本积分，管腔狭窄<25％计为1分，≥25％～<50％计为2分，≥50％～<75％计为4分，≥75％～<90％计为8分，≥90％～<99％计为16分，99％～100％计为32分；②然后依据不同冠状动脉分支确定对应系数，分别是：左主干支(LM)病变×5；左前降支(LAD)的病变：近段×2.5，中段×1.5，远段×1；对角支的病变：D1×1，D2×0.5；左回旋支(LCX)的病变：近段×2.5，钝缘支×1，后降支×1，远段×1，后侧支×0.5；右冠状动脉(RCA)的病变：近、中、远及后降支均×1。用每一支冠状动脉的狭窄基本积分乘以该病变部位的系数，作为该病变血管的积分，各病变血管积分之和即是该患者的Gensini总评分(表8)。
表8Gensini评分***细节表
2.2受试者一般临床资料和实验室指标收集
通过查阅患者临床资料，主要包括基本人口学资料(年龄、性别、身高和体重)、基本生命体征(心率、呼吸、血压和体温)、既往病史、吸烟史及用药史。同时收集研究对象此次就诊的实验室相关检查指标，在研究对象入院后24小时内，禁食12小时后，经静脉采集血样标本。运用昆明医科大学第一附属医院检验科的实验室设备进行测试。包含入院次日清晨空腹生化指标(胆红素、肌酐、尿酸)、入院首次血细胞分析结果、纤维蛋白原和甲状腺功能检查等。其中，生化指标的血清浓度通过罗氏cobas8000 c701全自动生化分析仪进行测量，血常规检查通过SYSMEX XN-1000血细胞分析仪进行测量，甲状腺功能检测通过罗氏cobase 601全自动电化学发光免疫分析仪进行测量。
2.3血清样本收集及COG5浓度检测
采集静脉血2ml，收集到非抗凝真空采血管中，于低温条件下迅速离心分离出血清(转速4000r/min，时间10min)，并冻存于-80℃冰箱待测。同时避免收集严重脂血、溶血、黄疸等有干扰的血样标本。使用上述本实验室建立的间接ELISA法对血清COG5进行检测，运用美国Thermo FC半自动酶标仪检测血清COG5的吸光度值，严格按照仪器厂家要求设置参数，并确保每日质控在控。检测步骤具体如实施例2。
2.4COG5诊断本地区胸痛人群冠状动脉粥样硬化的切点
检验被纳入的造影阴性组及冠状动脉粥样硬化组COG5浓度分布特征，依据数据的分布类型选择对应的统计学方法，进一步分析比较组间COG5浓度差异。以发生冠状动脉粥样硬化为阳性事件，运用SPSS 20软件制作ROC曲线得到特异度(specificity，Spe)和敏感度(sensitivity，Sen)，并计算出约登指数(Youden index)。选择Youden指数最大值对应浓度作为切点，确定COG5诊断本地区人群冠状动脉粥样硬化的cut-off值，通过计算阳性似然比(positive likelihood ratio，+LR)及阴性似然比(negative likelihood ratio，-LR)评估诊断能力。
2.5建立两模型诊断本地区胸痛人群发生冠状动脉粥样硬化
将上述基线资料分析结果中具有统计学差异的变量(中性粒细胞计数、单核细胞数、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血尿酸、血肌酐、空腹血糖、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原(P<0.05)通过SPSS软件进行二元Logistic逐步回归分析，并建立回归模型1。进一步，加入COG5指标后，再次建立回归模型2。最后，以胸痛人群冠脉造影狭窄为阳性事件，用ROC曲线比较两模型的诊断效能。
2.6冠状动脉粥样硬化患者COG5水平分析
本实验共选取630例首次经冠状动脉造影诊断为CAA的患者作为研究对象。首先用简单线性回归分析患者血清COG5浓度与Gensini总评分之间的Pearson相关性。然后，依据Gensini总评分不同对冠脉狭窄严重程度分组：Gensini评分≤25分为轻度狭窄，25分<Gensini评分≤75分为中度狭窄，＞75分为重度狭窄，进而比较造影阴性、轻度狭窄、中度狭窄和重度狭窄四组受试者的COG5浓度水平差异。进而把CAA患者分成两组：轻中度狭窄组和重度狭窄组，运用二元Logistic回归分析探讨冠状动脉狭窄严重程度的危险因子，并构建回归模型。用校准曲线和ROC曲线分别对模型的校准度和区分度进行评价。最后，采用列线图展示该模型的优点和临床应用价值。
3统计学分析
采用SPSS 20、Microsoft Excel 2016、GraphPadPrism 8.0及R 2.6.2软件进行数据处理、作图和统计分析。数据分布的特征用Shapiro-Wilk正态性检验结合偏度系数和频率分布直方图综合分析。正态分布的计量资料用平均值±(标准差)即〔X±(S)〕表示，组间差异性分析运用独立样本t检验，相关性运用Pearson相关分析，单因素方差分析，相关系数用r表示。非正态分布的计量资料用中位数(四分位数间距)即〔M(IQR)〕表示，运用独立样本Mann-WhitneyU检验，相关性用Spearman秩相关分析，相关系数采用rs表示。计数资料用相对数表示，组间比较运用χ2检验。用向前逐步回归法建立Logistic回归模型，纳入水准为0.05，排除水准为0.10。以P＜0.05作为差异有统计学意义。
4结果
4.1纳入研究对象一般临床资料和实验室结果比较
经过严格筛选和排除，本课题共纳入945名研究对象。正常对照315人，其中，造影阴性组51人，平均年龄为55.41(10.92)岁，男性25人(49％)；CAA患者630人，平均年龄60.31(10.18)岁，男性441人(70％)。结果显示，两组受试对象除了年龄、性别、吸烟史、高血压史、糖尿病史、白细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞数、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血尿酸、血肌酐、空腹血糖、超敏C反应蛋白、纤维蛋白原和COG5差异有统计学意义外(P<0.05)，其余指标无统计学差异。所有受试对象基本临床特征和实验室资料如表9。
表9造影阴性组和CAA组临床资料数据
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注：正态分布的计量资料用平均值±(标准差)即(X±S)表示，非正态分布的计量资料用中位数(四分位数间距)即〔M(IQR)〕表示。
4.2组间COG5水平分析
正常对照(包括正常体检人群和冠脉造影阴性人群)和CAA患者血清COG5均呈偏态分布(图8)，采用独立样本Mann-Whitney U检验两两比较。结果显示(图9)，CAA组(冠状动脉粥样硬化组)COG5高于正常体检人群，浓度分别为62.68ng/ml[IQR(56.31，69.21)]和42.00ng/ml[IQR(36.84，48.36)](P＜0.001)；且CAA组COG5高于冠脉造影阴性人群，浓度分别为62.68ng/ml[IQR(56.31，69.21)]和41.14ng/ml[IQR(35.45，45.18)](P＜0.001)；正常体检人群COG5与冠脉造影阴性人群无统计学差异，浓度分别为42.00ng/ml[IQR(36.84，48.36)]和41.14ng/ml[IQR(35.45，45.18)](P＝0.301)。
4.3COG5诊断本地区胸痛人群患CAA的切点
以患CAA为阳性事件，制作ROC曲线得出Sen和Spe(如图10)。COG5诊断冠状动脉粥样硬化的cut-off值为49.41ng/ml，AUC为0.913(P<0.05)，Sen和Spe分别是90.3％和92％，Youden指数为0.823，-LR和+LR分别是0.11和11.29。
对比CAA其他有统计学差异的指标，发现在使用单项指标诊断冠状动脉粥样硬化时，COG5的曲线下面积(AUC)均大于其他指标的AUC。
4.4比较两模型诊断本地区胸痛人群冠状动脉粥样硬化的诊断效能
将上述基线资料分析结果中具有统计学差异的变量(中性粒细胞计数、单核细胞数、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、血尿酸、血肌酐、空腹血糖、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原(P<0.05))通过SPSS软件进行二元Logistic逐步回归分析。运用似然比检验和Wald统计量完成回归系数的显著性检验(见表10)。结果显示，中性粒细胞计数与胸痛人群造影有冠脉狭窄呈正相关(P<0.05)，高密度脂蛋白胆固醇与胸痛人群造影有冠脉狭窄呈负相关(P<0.05)。最终得到的回归模型1为Logit P1＝3.708+0.322×中性粒细胞－1.987×高密度脂蛋白胆固醇。进一步，加入COG5指标，用中性粒细胞计数、高密度脂蛋白胆固醇和COG5三个指标再次建模，同样运用似然比检验和Wald统计量完成回归系数的显著性检验(见表11)。最终得到的回归模型2为Logit P2＝－7.414+0.207×COG5+0.509×中性粒细胞－2.446×高密度脂蛋白胆固醇。最后，用ROC曲线比较两模型的诊断效能。结果显示以胸痛患者冠脉造影狭窄为阳性事件，绘制ROC曲线得出Sen和Spe(如图11)。模型1的cut-off值为2.66，AUC为0.745(P<0.05)，Sen和Spe分别是71.7％和72.5％，Youden指数为0.442；模型2的cut-off值为1.97，AUC为0.962(P<0.05)，Sen和Spe分别是92.2％和92.1％，Youden指数为0.844。
对比模型1和模型2，发现在用模型诊断胸痛患者冠脉造影狭窄时，模型2的曲线下面积(AUC)大于模型1的AUC。
表10模型1的Logistic回归分析数据
表11模型2的Logistic回归分析数据
4.5COG5与Gensini评分的相关性
选择此次入院经冠脉造影检查诊断为冠状动脉粥样硬化的630例患者为受试对象。Pearson相关分析的结果表明，Gensini评分与COG5浓度呈正相关关系(r＝0.541，P<0.001)。以Gensini评分作为X，以COG5浓度作为Y制作的散点图呈线性趋势(见图12)。进而用线性回归分析，其结果显示，随着CAA患者冠脉狭窄程度加重，血清COG5浓度也随之增加B＝0.297(95％CI，0.26～0.34)，决定系数R2＝0.293，P<0.001)(如表12)。Gensini评分与COG5的直线回归见图12。
表12线性回归方程的参数结果
4.6冠脉严重狭窄危险因子的Logistic回归分析
4.6.1基于Gensini积分，对CAA患者冠脉狭窄严重程度进行分组。与造影阴性组41.14ng/ml[IQR(35.36，45.72)]相比，轻度狭窄(＜25)、中度狭窄(25-75)、重度狭窄(＞75)患者的COG5浓度均增高(P<0.001)见图13，浓度分别为54.23ng/ml[IQR(44.61，62.25)]、62.52ng/ml[IQR(56.40，68.84)]和66.07ng/ml[IQR(60.78，76.73)]。
4.6.2为探讨冠脉狭窄的危险因子，进一步将CAA患者分成两组[即轻中度狭窄(Gensini评分≤75分，n＝523例)和严重狭窄(Gensini评分>75分，n＝107例)]。对两组病人基线资料进行统计学差异分析。结果只有性别、年龄、BMI、淋巴细胞、血小板和COG5有统计学差异(P＜0.05)。见表13。
表13GENISINI评分基线资料
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注：正态分布的计量资料用平均值±(标准差)即(X±S)表示，非正态分布的计量资料用中位数(四分位数间距)即〔M(IQR)〕表示。
4.6.3将上述基线资料分析结果中具有统计学差异的变量与COG5通过SPSS软件进行二元Logistic逐步回归分析。运用似然比检验和Wald统计量完成回归系数的显著性检验(见表14)。结果显示，年龄和BMI在建模过程中没有统计学意义(P＞0.05)，予以剔除。最终保留性别、淋巴细胞、血小板和COG5四个变量进行二元Logistic回归分析(见表15)，结果显示，性别(女)、淋巴细胞和血小板与Log-GENISINI评分呈负相关(P均<0.05)，COG5水平与Log-GENISINI评分呈正相关(P<0.05)。最终得到的回归模型为Logit P＝－4.191－0.770×性别(女)－0.001×淋巴细胞－0.002×血小板+0.050×COG5。
表14多因素Logistic逐步回归
表15冠状动脉狭窄程度多因素Logistic回归
4.6.4运用内戈尔科(Nagelkerke)R2系数(R2＝0.097)、错判矩阵(分界值为0.5时，总体正确百分比为82.9％)及霍斯默-莱梅肖(Hosmer-Lemeshow)检验(P＝0.795)对模型的拟合优度进行分析，结果均显示该模型拟合较好(如图14)。
4.6.5采用ROC曲线分析评价模型的区分度。结果显示，以冠状动脉重度狭窄为阳性事件ROC曲线下的面积(AUC)为0.667(95％CI，0.608～0.726)，在最佳临界值(P＝-1.808时)进行诊断，该模型区分冠状动脉严重狭窄患者的Sen和Spe分别是80.5％、56.6％(图15)。
4.6.6为了更直观展示该预测模型的临床应用价值，我们制作了冠状动脉狭窄程度预测列线图(图16)。依据模型中各个危险因素对冠状动脉狭窄的影响程度，对各危险因素进行赋值，然后将各个指标的积分相加得到总积分，最后通过总积分与发生冠状动脉严重狭窄频率之间的转换关系，得出不同个体发生冠状动脉严重狭窄的可能性。列线图能将复杂的回归方程转变成简单可视化的图表工具，以便更清晰的展示预测为冠状动脉严重狭窄的概率，具有方便、简单、准确等特点，能给临床决策提供一种新的辅助工具。
据此，CAA患者血清COG5水平较正常对照升高，且COG5作为区分有无冠脉粥样硬化斑块的指标有较好的诊断能力。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种特异性多克隆抗体检测 COG5 的间接ELISA方法，其特征在于，COG5 重组蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括以下步骤：
（1）包被∶使用包被液将COG5 重组蛋白，在96孔板上进行 100μl/孔包被；
（2）洗板：第二天倒掉板孔内包被液，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次 3-5
分钟，尽量拍干；
（3）封闭∶使用封闭剂对包被后的酶标板进行封闭处理，每孔加200μl，条件37 ℃温浴1h；
（4）洗板：倒掉板孔内封闭液，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次 3-5分钟，尽量拍干；
（5）加入一抗免疫血清∶用PBST将多抗血清倍比稀释，同时设空白对照和阴性对照，每孔100 μl，加完后，于37℃温箱孵育1h；
（6）洗板：倒掉板孔内免疫血清，用PBST洗涤三次，每孔250μl，每次 3-5分钟，尽量拍干；
（7）加酶标二抗∶上述一抗孵育结束并洗涤后，用PBST将酶标二抗稀释为1∶10000稀释度，每孔100 μl，37℃避光温箱孵育1h，洗板；
（8）加入双组份显色液A，B每孔各50μl，置于恒温水浴箱中，全程避光操作，37℃温浴1-15min；
（9）终止液每孔加100 μl，终止显色反应；
（10）用Thermo酶标仪在450-630nm进行双波长OD值检测。
2.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述步骤（1）的COG5 重组蛋白的浓度为 0.0514 ng/ml～11.1111 ng/ml。
3.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述步骤（1）的包被液与COG5重组蛋白抗原按 1∶10 进行稀释；包被条件为37℃，1小时，然后放4℃冰箱，24小时过夜。
4.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述步骤（3）的封闭剂为1%BSA。
5.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述步骤（5）的用PBST将抗血清稀释度为1∶5000。
6.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述步骤（7）的酶标二抗为加入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗，酶标二抗的稀释度为1∶10000 。
7.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述步骤（8）中的双组份显色液A，B分别为TMB双组分显色液PR1210-100ml。
8.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述步骤（9）中的显色反应为3min。
9.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述步骤（10）的终止液为C1058。
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