CN116694565A - 一种扩增间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种扩增间充质干细胞的方法。所述方法包括：将间充质干细胞与含有聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架共培养得到间充质干细胞。本发明通过将干细胞与含有聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架共培养，能够高效、快捷、大量地获得间充质干细胞，不仅能大规模迅速扩增所需的细胞数量，同时也避免了胰酶在传统消化过程中对细胞的损伤作用，适用间充质干细胞或其他贴壁细胞的培养，极具推广价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种扩增间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞来源于中胚层，具有自我更新和多向分化成脂肪细胞，软骨细胞，成骨细胞等细胞的潜能。间充质干细胞可来源于骨髓、脐带、脂肪、胎盘、皮肤、毛囊、羊水、外周血、脐带血、尿和月经血等。因为间充质干细胞具有归巢能力、多能性潜力、分泌抗炎因子能力、免疫调节作用，使间充质干细胞在临床应用和科学研究方面都表现出诱人的前景。然而，由于细胞数量不足，一直制约着间充质干细胞的应用与发展。
间充质干细胞一般采用培养皿或培养瓶等传统方法培养，虽然该技术已经成熟，但是存在获取细胞数量较少，培养成本高，重复传代培养易导致干细胞衰老和丧失多能性的弱点。例如CN102876630A公开了一种高效分离和扩增人脐带血间充质干细胞的方法，所述方法包括：将单核细胞成分接种于包被蛋白基质成分的培养皿，细胞接种于上述包被的细胞培养板后，使用脐带血间充质干细胞培养基培养，除去未贴壁细胞并更换培养基，继续使用脐带血间充质干细胞培养基培养，直至细胞为80-95％融合；细胞用胰酶进行消化，接种于一般培养板，实现间充质干细胞的扩增，但是这种方法在传统细胞传代过程中使用胰酶进行细胞消化，对细胞损伤很大，最终获取的细胞数量较少。
例如CN110484500A公开了一种分离和扩增人尿源间充质干细胞的方法，所述方法包括将尿液进行离心，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入低血清分离培养基或无血清分离培养基，吹打混匀后进行培养，得到原代细胞，记作第0天；第12-13天，对所述原代细胞进行消化，使用所述低血清分离培养基或无血清分离培养基对细胞进行重悬、接种，记为P1代，即完成人尿源间充质干细胞的分离；使用低血清扩增培养基或无血清扩增培养基对P1代细胞进行传代培养，即完成人尿源间充质干细胞的扩增。此方法在传代过程中仍需进行细胞消化，对细胞损伤大，最终获取的细胞数量较少，安全性低，成本较高。
因此，亟需开发一种高效，安全，适用于间充质干细胞大规模扩增的方法，以便获取足够数量的间充质干细胞。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种扩增间充质干细胞的方法，解决了采用传统方法扩增间充质干细胞存在的获取细胞数量较少，培养成本高，重复传代培养易导致间充质干细胞衰老和丧失多能性，胰酶进行细胞消化，对细胞损伤大等问题，能够高效、快捷、大量地获得间充质干细胞，不仅能大规模迅速扩增所需的细胞数量，同时也避免了胰酶在传统消化过程中对细胞的损伤作用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种扩增间充质干细胞的方法，所述方法包括：
将间充质干细胞与含有聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架共培养得到间充质干细胞。
本发明通过将间充质干细胞与含有聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架共培养，能够高效、快捷、大量地获得间充质干细胞，不仅能大规模迅速扩增所需的细胞数量，同时也避免了胰酶在传统消化过程中对细胞的损伤作用，适用间充质干细胞或其他贴壁细胞的培养，极具推广价值。
所述聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)为温度敏感型水凝胶，其能够感知外面环境微小变化以及具有良好的生物相容性，当环境温度高于最低临界温度(LCST)时，其体积会突然剧烈收缩，此时其表面是疏水的，细胞可以黏附生长，当细胞长到一定密度后，降低温度到LCST下，使水凝胶表面亲水，这样细胞就会脱离水凝胶，而不用传统的酶消化，很好的保持了细胞表面的结构与功能，避免了酶消化细胞的操作繁琐，大大减少了工作量。
聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的大分子链上同时具有亲水性的酰氨基和疏水性的异丙基，水溶液具有最低临界温度32℃，能够在37℃交联成水凝胶，在常温下则为线型的水溶液。利用PNIPAAm在LCST附近发生可逆相转变的特性，可以将PNIPAAm设计成分子开关，结合干细胞培养，用聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的温度敏感性，使细胞在临界温度之上时贴附在材料表面生长，温度在临界温度以下时细胞脱附，改变了传统的酶解脱附细胞的方法。且细胞在水凝胶三维空间里，细胞生长状态良好且状态培养效率升高。
优选地，所述共聚物纳米纤维支架中共聚物包括聚乳酸、聚乙交酯、聚苯乙烯或聚乳酸-羟基乙酸中任意一种或至少两种的组合，所述共聚物分子量为50000-500000。
上述50000-500000中的具体点值可以选择50000、50001、50002、50003、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、490000、499996、499997、499998、499999、500000等。
优选地，所述共聚物纳米纤维支架的共聚物为聚乳酸-羟基乙酸。
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸和羟基乙酸的质量比为(2-8):1。
上述(2-8)中的具体点值可以选择2、3、4、5、6、7、8等。
优选地，所述共聚物纳米纤维支架中聚N异丙基丙烯酰胺和共聚物的质量比为(15-35):1。
上述(15-35)中的具体点值可以选择15、16、17、18、20、25、29、30、31、32、33、34、35等。
优选地，所述聚N异丙基丙烯酰胺的数均分子量为30000-300000。
上述30000-300000中的具体点值可以选择30000、30001、30002、30003、60000、70000、80000、90000、100000、200000、220000、240000、260000、289996、299997、299998、299999、300000等。
优选地，所述共聚物为羧基封端。
优选地，所述共聚物纳米纤维支架的构建方法包括：静电纺丝。
优选地，所述静电纺丝的电压为5-25KV，推液速度为3-30mL/h，针头-收集器距离为5-20cm，收集器旋转速度为50-2000rpm/min，纤维收集时间为9-11h。
上述5-25中的具体点值可以选择5、6、7、8、10、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25等。
上述3-30中的具体点值可以选择3、4、5、8、10、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等。
上述5-20中的具体点值可以选择5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。
上述50-2000中的具体点值可以选择50、51、52、53、54、60、70、80、90、100、200、500、1000、1800、1900、1930、1970、1990、2000等。
上述9-11中的具体点值可以选择9、9.1、9.2、9.3、10、10.2、10.4、10.6、10.7、10.8、10.9、11等。
优选地，所述聚N异丙基丙烯酰胺为氨基封端。
优选地，所述聚N异丙基丙烯酰胺通过交联剂交联接枝或同轴共纺的方法与共聚物连接。
单独的使用静电纺丝制备的三维支架用于细胞培养，可以增加细胞的比表面积，可以生产大量的细胞，但是单独使用三维支架，收获细胞时仍需要使用传统胰酶的消化，而传统胰酶会对细胞表面的蛋白造成不同程度的损伤。单独使用聚N异丙基丙烯酰胺涂敷在培养皿表面，只是在收获细胞时避免了胰酶的使用，并且使用后需要重新喷涂，费时费力，本申请使用化学接枝的方法，将聚N异丙基丙烯酰胺接枝于三维支架表面，此时三维支架和聚N异丙基丙烯酰胺通过化学键连接，温度低于35℃时溶于水，温度在37℃是附着于三维支架表面，该方法可以重复多次使用，并且兼具有三维支架的特性和温控特性。
优选地，所述间充质干细胞的来源包括：骨髓、脐带、脂肪、胎盘、皮肤、毛囊、羊水、外周血、脐带血、尿或月经血中任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种间充质干细胞，所述间充质干细胞由第一方面所述的扩增间充质干细胞的方法扩增得到。
第三方面，本发明提供了第二方面所述的间充质干细胞在在器官移植和免疫疾病治疗中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)采用静电纺丝技术构建三维共聚物纳米纤维支架，该支架具有超高的比表面积以及相互连通的孔隙三维结构，能够最很好地仿生人体的细胞外基质，并且静电纺丝技术实验条件温和、成本低廉、快速便捷；
(2)采用聚N异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)温敏材料，PNIPAAm分子链上同时具有亲水性的酰胺基和疏水性的异丙基，水溶液能够表现出最低临界温度(LCST)，即在32℃以上交联成水凝胶，发生相分离，在小于32℃为线型的均匀水溶液，利用PNIPAAm在最低临界温度的可逆性相转变，可以将PNIPAAm设计成分子开关，能够通过调控温度来实现细胞的消化，从而避免在细胞消化过程中使用胰酶；
(3)羧基封端的共聚物支架与氨基封端的PNIPAAm通过交联剂接枝包覆于支架表面或者通过同轴共纺实现包覆，然后再通过交联剂交联实现PNIPAAm包覆于共聚物支架表面，可以实现支架的重复利用。
附图说明
图1为制备例1中PLGA纳米纤维支架示意图；
图2A为实施例1收集到的脐带图；
图2B为实施例1分离的华通氏胶图；
图2C为实施例1培养7天细胞生长情况图；
图3为实施例1中间充质干细胞在PLGA-PNIPAAm纳米纤维支架上的生长情况图；
图4为实施例1中间充质干细胞在PLGA-PNIPAAm支架与普通培养皿中增殖曲线图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
制备例1
制备含有聚N异丙基丙烯酰胺的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架
(1)将羧基封端的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)溶于四氢呋喃和二甲基甲酰胺(THF:DMF＝7:3)的混合溶剂中，配置成PLGA溶液，所述PLGA溶液中PLGA的体积百分比为8％，然后将该溶液置于0.8mm内径针头的10mL注射器内，然后用以下参数进行静电纺丝：电压为20KV，推液速度15mL/h，针头-收集器距离为10cm，收集器旋转速度为800rpm/min，纤维收集10h，获得PLGA支架；
(2)在25℃下配置10％的PNIPAAm溶液，加入1‰的碳二亚胺，然后再将步骤(1)获得的PLGA支架剪成1mm2大小放入PNIPAAm溶液中过夜，取出支架后紫外灭菌，得到含有聚N异丙基丙烯酰胺的聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架(图1)。
制备例2
制备含有聚N异丙基丙烯酰胺的聚乳酸纳米纤维支架
(1)将羧基封端的聚乳酸溶于四氢呋喃和二甲基甲酰胺(THF:DMF＝7:3)的混合溶剂中，配置成聚乳酸溶液，所述聚乳酸溶液中聚乳酸的体积百分比为8％，然后将该溶液置于0.8mm内径针头的10mL注射器内，然后用以下参数进行静电纺丝：电压为5KV，推液速度3mL/h，针头-收集器距离为5cm，收集器旋转速度为50rpm/min，纤维收集10h，获得聚乳酸支架；
(2)在25℃下配置3％的PNIPAAm溶液，加入1‰的碳二亚胺，然后再将步骤(1)获得的聚乳酸支架剪成1mm2大小放入PNIPAAm溶液中过夜，取出支架后紫外灭菌，得到含有聚N异丙基丙烯酰胺的聚乳酸纳米纤维支架。
制备例3
制备含有聚N异丙基丙烯酰胺的聚苯乙烯纳米纤维支架
(1)将羧基封端的聚苯乙烯溶于四氢呋喃和二甲基甲酰胺(THF:DMF＝7:3)的混合溶剂中，配置成聚苯乙烯溶液，所述聚苯乙烯溶液中聚苯乙烯的体积百分比为20％，然后将该溶液置于0.8mm内径针头的10mL注射器内，然后用以下参数进行静电纺丝：电压为25KV，推液速度30mL/h，针头-收集器距离为20cm，收集器旋转速度为2000rpm/min，纤维收集10h，获得聚苯乙烯支架；
(2)在25℃下配置20％的PNIPAAm溶液，加入1‰的碳二亚胺，然后再将步骤(1)获得的聚苯乙烯支架剪成1mm2大小放入PNIPAAm溶液中过夜，取出支架后紫外灭菌，得到含有聚N异丙基丙烯酰胺的聚苯乙烯纳米纤维支架。
实施例1
人脐带间充质干细胞培养。
(1)从健康足月孕妇生产时无菌获取脐带(图2A)，分离出华通氏胶(图2B)，剪成2mm3的小块后加入10mL间充质干细胞专用培养基在37℃、5％CO2培养箱中培养，培养7天细胞生长情况图2C所示，培养10天后细胞逐渐爬出，然后进行扩增培养并传代后冻存作为后续实验的细胞来源；
(2)将制备1获得的聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架放入24孔板中，加入1mL培养基(DMEM/F12培养基+10％胎牛血清)后，在37℃，5％CO2培养箱中过夜；
(3)在外界温度37℃的环境下吸出培养基，加入1×104个细胞，放入37℃，5％CO2培养箱中培养5h，然后加入1mL培养基(DMEM/F12培养基+10％胎牛血清)培养，每隔两天换液；
(4)分别在2、4、6、8、10天通过将温度降到25℃收集细胞，并用血球计数板进行计数。
传统培养皿培养细胞的收获：移除培养皿表面的培养基，然后用PBS洗涤2遍，加入0.25％的胰酶进行消化，消化3min，加入2mL完全培养基终止消化，收集细胞后300g，离心5min，将收集到的细胞加入100mL的PBS重悬，然后用血球计数板计数。
结果：间充质干细胞在接枝PNIPAAm的PLGA支架上生长情况如图3所示，数量达到传统培养皿培养细胞数量的2.5倍(图4)。
实施例2
脂肪来源间充质干细胞培养。
(1)收集大腿内侧脂肪，剪成2mm3小块，用胶原酶37℃消化24h，然后用100μm滤网过滤，将滤液300g离心5min，收集沉淀，加入培养基(DMEM/F12培养基+10％胎牛血清)重悬，然后接种到培养皿中在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)将制备1获得的聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架放入24孔板中，加入1mL培养基(DMEM/F12培养基+10％胎牛血清)后，在37℃，5％CO2培养箱中过夜；
(3)在外界温度37℃的环境下吸出培养基，加入1×104个细胞，放入37℃，5％CO2培养箱中培养5h，然后加入1mL培养基(DMEM/F12培养基+10％胎牛血清)培养，每隔两天换液；
(4)分别在2、4、6、8、10天通过将温度降到25℃收集细胞，并用血球计数板进行计数。
结果：间充质干细胞在接枝PNIPAAm的聚乳酸支架上生长数量达到传统培养皿细胞数量的2.5倍。
实施例3
骨髓来源间充质干细胞培养。
(1)收集股骨骨髓，将磷酸缓冲盐溶液与骨髓组织等比例混匀后760g离心20min，使骨髓组织分层，取白膜层提取人骨髓间充质干细胞，将收集到的白膜层加入培养基(DMEM/F12培养基+10％胎牛血清)重悬，然后接种到培养皿中在37℃、5％CO2培养箱中培养；
(2)将制备3获得的聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架放入24孔板中，加入1mL培养基(DMEM/F12培养基+10％胎牛血清)后，在37℃，5％CO2培养箱中过夜；
(3)在外界温度37℃的环境下吸出培养基，加入1×104个细胞，放入37℃，5％CO2培养箱中培养5h，然后加入1mL培养基(DMEM/F12培养基+10％胎牛血清)培养，每隔两天换液；
(4)分别在2、4、6、8、10天通过将温度降到25℃收集细胞，并用血球计数板进行计数。
结果：间充质干细胞在接枝PNIPAAm的聚苯乙烯支架上生长数量达到传统培养皿细胞数量的2.5倍。
综上所述，本发明通过将干细胞与含有聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架共培养，能够高效、快捷、大量地获得干细胞，不仅能大规模迅速扩增所需的细胞数量，同时也避免了胰酶在传统消化过程中对细胞的损伤作用，适用间充质干细胞或其他贴壁细胞的培养，极具推广价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种扩增间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
将间充质干细胞与含有聚N异丙基丙烯酰胺的共聚物纳米纤维支架共培养以扩增间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共聚物纳米纤维支架中共聚物包括聚乳酸、聚乙交酯、聚苯乙烯或聚乳酸-羟基乙酸中任意一种或至少两种的组合，所述共聚物的数均分子量为50000-500000；
优选地，所述共聚物纳米纤维支架的共聚物为聚乳酸-羟基乙酸；
优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸中乳酸和羟基乙酸的质量比为(2-8):1。
优选地，所述共聚物纳米纤维支架中聚N异丙基丙烯酰胺和共聚物的质量比为(15-35):1；
优选地，所述聚N异丙基丙烯酰胺的数均分子量为30000-300000。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述共聚物为羧基封端。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述共聚物纳米纤维支架的构建方法包括：静电纺丝。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述静电纺丝的电压为5-25KV，推液速度为3-30mL/h，针头-收集器距离为5-20cm，收集器旋转速度为50-2000rpm/min，纤维收集时间为9-11h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述聚N异丙基丙烯酰胺为氨基封端。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述聚N异丙基丙烯酰胺通过交联剂交联接枝或同轴共纺的方法与共聚物连接。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的来源包括：骨髓、脐带、脂肪、胎盘、皮肤、毛囊、羊水、外周血、脐带血、尿或月经血中任意一种或至少两种的组合。
9.一种间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞由权利要求1-8任一项所述的扩增间充质干细胞的方法扩增得到。
10.权利要求9所述的间充质干细胞在在器官移植和免疫疾病治疗中的应用。
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