CN116694466A - 一种用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明所公开的一种用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，包括至少一对入口井以及连通两两所述入口井之间的微通道；位于所述微通道的中间设置有供尿道粘膜损伤修复观察的损伤装置；所述损伤装置上设置有多层结构并形成尿道粘膜细胞培养的培养腔并将所述培养腔中的尿道粘膜细胞进行一次或多次损伤，各所述微通道对应连通所述损伤装置，并模拟尿道粘膜细胞在所述损伤装置中的修复情况。
Description
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其涉及一种用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片。
背景技术
尿道损伤是一种常见的泌尿***疾病，通常分为尿道内损伤和外损伤。尿道内损伤绝大多数是在应用经尿道器械操作或排出异物(如结石)时发生，少数由于异物***尿道而引起等等。而尿道外损伤，多见于暴力损伤，其中尿道外损伤经常发生于***部骑跨伤或踢伤时受损，受损部位多见于球部尿道而伴骨盆骨折等。目前尿道损伤往往需要手术或者药物来恢复尿道粘膜的修复完善其结构和功能。但是对于尿道粘膜的损伤修复需要在实验过程中进行测试和观察。
传统的细胞损伤修复按照造成缺损的方法分为机械损伤和化学损伤两种，目前的机械损伤的实际应用中主要以划痕法为主，即在体外培养的单层细胞上采用机械刮擦的方法形成物理刮痕，然后使用显微镜观察相应时间段内划痕的愈合情况。划痕法依赖于手工操作，其伤口区域的大小及宽度变化较大，初始损伤面积不易控制，拍照时缺损难以准确定位，而且划痕可能会对周围的细胞造成损伤从而影响其迁移的效率，因此这种“划痕”伤口愈合试验结果由于细胞间相互的多因素作用而不够理想，往往导致实验重复性不佳，难以被应用到高通量的研究中。
如今，微流控芯片技术成熟应用于细胞研究，并给细胞研究提供了新的方法和平台。其中微流控芯片是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个***，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。一般通常具有与细胞相似的微流体通道尺寸，能有效模拟和控制细胞及细胞群的环境(如观察细胞损伤修复)；具备高通量和高内涵分析潜力等。
虽然目前已经具有将微流控芯片作为细胞损伤修复观察的平台。但是，微流控芯片在研究尿道损伤的领域中作为生物医学实验室仍是挑战。作为一个能够模拟尿道粘膜损伤修复并进行观察的微流控芯片，需要切实模拟真实的尿道环境，并提供观察尿道粘膜损伤修复的平台。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术的不足而设计的一种提高使用效果和实用性能的。
本发明所设计的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，包括至少一对入口井以及连通两两所述入口井之间的微通道；位于所述微通道的中间设置有供尿道粘膜损伤修复观察的损伤装置；所述损伤装置上设置有多层结构并形成尿道粘膜细胞培养的培养腔并将所述培养腔中的尿道粘膜细胞进行一次或多次损伤，各所述微通道对应连通所述损伤装置，并模拟尿道粘膜细胞在所述损伤装置中的修复情况。
可选的，所述入口井包括两个对应的上层入口井以及两个对应的下层入口井，两个对应的所述上层入口井之间连通有上层微通道，两个对应的所述下层入口井之间连通有下层微通道；所述上层微通道位于所述下层微通道上方，所述损伤装置上设置有双层结构并形成有上层培养腔以及下层培养腔，并分别对应与所述上层微通道以及所述下层微通道连通。
可选的，所述入口井包括两个对应的上层入口井、两个对应的中层入口井以及两个对应的下层入口井，两个对应的所述上层入口井之间连通有上层微通道，两个对应的所述中层入口井之间连通有中层微通道，两个对应的所述下层入口井之间连通有下层微通道；所述上层微通道、所述中层微通道以及所述下层微通道按上中下顺序分布，所述损伤装置上设置有三层结构并形成有上层培养腔、中层培养腔以及下层培养腔，并分别对应与所述上层微通道、所述中层微通道以及所述下层微通道连通。
可选的，所述入口井的一侧设置有供细胞液待培养的培养仓，所述培养仓的腔室与所述入口井的通道之间连通。
可选的，对应所述上层入口井或对应所述中层入口井或对应所述下层入口井中通入尿液，并模拟尿液在尿道中对损伤的尿道粘膜细胞的压迫，观察尿道粘膜细胞的修复情况。
可选的，对应所述上层入口井或对应所述中层入口井或对应所述下层入口井中设置有循环装置，所述循环装置上通入尿液进行循环模拟尿液在尿道中的环境。
可选的，所述循环装置上设置有增加尿液在尿道中压力的压力组件。
可选的，所述损伤装置包括培养腔、损伤腔以及观察腔；所述损伤装置包括有两种：在具有双层结构的所述损伤装置中包括培养尿道粘膜细胞的薄膜，一所述薄膜位于所述培养腔中并分隔出所述上层培养腔和所述下层培养腔；所述损伤腔包括供具有所述薄膜通过并将所述薄膜上的尿道粘膜细胞划伤的通道；所述观察腔中容纳有培养受损尿道粘膜细胞的所述薄膜并将所述观察腔分隔出上、下两个腔室；在具有三层结构的所述损伤装置中包括两个培养尿道粘膜细胞的薄膜，两所述薄膜位于所述培养腔中并分隔出所述上层培养腔、所述中层培养腔以及所述下层培养腔；所述损伤腔包括供具有所述薄膜通过并将所述薄膜上的尿道粘膜细胞划伤的两个通道；所述观察腔中容纳有两个培养受损尿道粘膜细胞的所述薄膜并将所述观察腔分隔出上、中、下两个腔室。
可选的，具有双层结构的所述微流控芯片上细胞的培养步骤为：S1、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述上层培养腔中，并正置于所述薄膜的上侧，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述上层培养腔的下壁；S2、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述下层培养腔中，并倒置于所述薄膜的下侧，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述下层培养腔的上壁；S3、将培养有尿道粘膜细胞的所述薄膜穿过所述通道并将所述薄膜上的尿道粘膜细胞划伤，再将培养有受损尿道粘膜细胞的所述薄膜固定在所述观察腔中；S4、在所述上层入口井以及所述下层入口井中分别通入各层细胞需要的各自的培养基。。
可选的，具有三层结构的所述微流控芯片上细胞的培养步骤为：S1、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述中层培养腔中，并侧方放置培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述中层培养腔的侧壁；S2、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述上层培养腔和所述中层培养腔中，并正置于所述薄膜上，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述中层培养腔的下壁；S3、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述下层培养腔和所述中层培养腔中，并倒置于所述薄膜上，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述中层培养腔的上壁；S4、将两个培养有尿道粘膜细胞的所述薄膜穿过所述通道并将所述薄膜上的尿道粘膜细胞划伤，再将两个培养有受损尿道粘膜细胞的所述薄膜固定在所述观察腔中；S5、在所述上层入口井、所述中层入口井以及所述下层入口井中分别通入各层细胞需要的各自的培养基。。
本发明所设计的微流控芯片具有以下有益效果：
1.本申请采用至少一对入口井并两两对应连接微通道，其中供尿道粘膜损伤修复观察的损伤装置，损伤装置能够培养尿道粘膜细胞，并将尿道粘膜细胞进行一次或多次损伤，然后再通过与各对应的微通道连接，并进行对损伤的尿道粘膜细胞进行修复观察，真实模拟尿道粘膜细胞在尿道中的真实环境；
2.本申请采用的损伤装置上设置有多层结构并形成多个供损伤后的尿道粘膜细胞培养的培养腔，损伤装置通过与薄膜厚度接近的通道使细胞从薄膜上刮落，制造出缺损，使细胞不连续，从而模拟伤口的形成，并通过使得多层细胞损伤，模拟伤口损伤环境，有助于探索修复重建中细胞相互作用；
3.本申请采用在对应入口井处设置有循环装置，实现尿液在微通道中对尿道粘膜细胞的模拟，并通过循环装置上的压力组件模拟尿液在微通道过程中的压力，提高微流控芯片模拟的真实性。
附图说明
图1是实施例1中微流控芯片的整体结构示意图；
图2是实施例1的微流控芯片的线框图；
图3是实施例1的损伤装置的示意图；
图4是实施例1的损伤装置使用示意图；
图5是实施例2中微流控芯片的整体结构示意图；
图6是实施例2的微流控芯片的线框图；
图7是实施例2的损伤装置的示意图；
图8是实施例2的损伤装置使用示意图；
图9是本申请实施例中循环装置中的一简要示意图；
图10是本申请实施例中循环装置中的另一简要示意图；
1、入口井；11、上层入口井；12、中层入口井；13、下层入口井；2、微通道；21、上层微通道；22、中层微通道；23、下层微通道；3、损伤装置；31、培养腔；311、上层培养腔；312、中层培养腔；313、下层培养腔；32、损伤腔；321、通道；33、观察腔；4、培养仓；51、培养瓶；52、蠕动泵；53、压力传感器；54、收集瓶；6、薄膜。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
如图1和图2所示，本实施例所描述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，包括入口井1以及与入口井1两两对应连接的微通道2。对应的两个入口井1设置于微通道2的两侧。入口井1包括两个对应的上层入口井11以及两个对应的下层入口井13，两个对应的上层入口井11之间连通有上层微通道2，两个对应的下层入口井13之间连通有下层微通道2，并且上层微通道2位于下层微通道2上方。
位于微通道2的中间设置有供尿道粘膜损伤修复观察的损伤装置3；损伤装置3上设置有双层结构并形成有上层培养腔311以及下层培养腔313供尿道粘膜细胞培养，各微通道2对应连通损伤装置3，并模拟尿道粘膜细胞在损伤装置3的修复情况。
另外，参照图2，入口井1的一侧设置有供细胞液待培养的培养仓4，培养仓4的腔室与入口井1的通道321之间连通，进而将待培养的细胞液进行培养后，通入入口井1进而在损伤装置3中形成一层尿道粘膜细胞。并且，上层入口井11与对应的上层入口井11、或者下层入口井13与对应下层入口井13中通入尿液，并模拟尿液在尿道中对损伤的尿道粘膜细胞的压迫，观察尿道粘膜细胞的修复情况。并且在入口井1处设置有循环装置，循环装置上通入尿液进行循环模拟尿液在尿道中的环境。作为进一步优选的，循环装置上设置有增加尿液在尿道中压力的压力组件。模拟尿液在微通道2过程中的压力，提高微流控芯片模拟的真实性。
循环装置包括有两种，参照图9，第一种循环装置包括培养瓶51、蠕动泵52、压力传感器53、收集瓶54以及将上述组件连接在一起的微管道。其中模拟尿液在尿道中的环境过程中，尿液位于培养瓶51中，由于蠕动泵52设置，尿液通过微管道从培养瓶51到微流控芯片上的入口井1中，再通过微通道将尿液从微流控芯片上的另一入口井1中到收集瓶54中进行收集，其中微通道上还设置有压力传感器53对通过微流控芯片的尿液进行压力检测
参照图10，第二种循环装置包括培养瓶51、蠕动泵52、压力传感器53以及将上述组件连接在一起的微管道。该循环装置在模拟尿液在尿道中的环境过程中，尿液位于培养瓶51中，由于蠕动泵52设置，尿液通过微管道从培养瓶51到微流控芯片上的入口井1中，再通过微通道将尿液从微流控芯片上的另一入口井1中到培养瓶51中进行一个循环模拟人体中的内环境。除此之外，***设备还设有微量注射泵、温控***、以及紫外、荧光、电化学、色谱等检测部件，并设置有电器设备驱动和控制微流体的流动，以及对于温度和自动化的控制等因素、另外，由于芯片上包含有不同功能的通道、泵、阀、混合室、检测区等，改变了过去需要大型设备、定环境、复杂操作的要求，达到了高精确、高效率、低污染的效果，可以广泛应用于临床检验医学、生物化学和分子生物等领域。
具体的，参照图3，损伤装置3中开设有包括培养腔31、损伤腔32以及观察腔33。本实施例以有双层结构的损伤装置3为例。结合图4，该损伤装置3包括培养尿道粘膜细胞的一层薄膜6，该一层薄膜6位于培养腔31中并分隔出上层培养腔311和下层培养腔313；同时，损伤腔32包括供具有薄膜6通过并将薄膜6上的尿道粘膜细胞划伤的通道321；观察腔33中容纳有培养受损尿道粘膜细胞的薄膜6并将观察腔33分隔出上、下两个腔室，同时并与上下两个微通道2连接，进而在微通道2上通过上皮、成纤维、肌细胞各自的培养基，并模拟损伤修复的情况并进行观察。
具体的，薄膜6为一种生物相容性强的半透膜，薄膜的孔径为1μm。在本实施例中，其主要材质为聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚二甲基硅氧烷等。并且，薄膜6上设置有四个定位点与损伤装置3中通道321的对应位置连接并固定，亦可在培养腔31又或者观察腔33的腔壁上进行固定。进而使得薄膜6能够长期稳定固定在培养腔3上或者在观察腔上。当上皮、成纤维以及肌细胞的培养基通过薄膜6时，薄膜6能够稳定得抗住液体流动带来的压力，有利于对尿道粘膜细胞修复的模拟进而对此进行观察。
另外，微流控芯片是采用采用透明材料制成，能清晰观察尿道粘膜损伤修复的效果。具体的，微流控芯片主体结构分为上下两层片基，由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃等材料所制成。
双层微流控芯片的操作步骤：
S1、将待观察的尿道粘膜细胞注入上层培养腔311中，并正置于薄膜6的上侧6小时，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于上层培养腔311的下壁；
S2、将待观察的尿道粘膜细胞注入下层培养腔313中，盖上入口井1将入口井1封闭，并倒置于薄膜6的下侧6小时，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于下层培养腔313的上壁；
S3、在37℃下，消毒和预热管件和流体零件整夜；在超净工作台或生物安全柜中搭建微流控装置；在安装***之前，细胞须良好地附着在通道表面；
S4、将培养有尿道粘膜细胞的薄膜6穿过通道321并将薄膜6上的尿道粘膜细胞划伤，再将培养有受损尿道粘膜细胞的薄膜6固定在观察腔33中；
S5、设备流通的通道或入口/出口处需填充培养基；入口和出口设计便于使用连接器(1/4”-28)；
S6、在上层入口井11以及下层入口井13中分别通入各层细胞需要的各自的培养基。
在上述步骤中需要注意的是在接种过程中向通道中加入适量液相，有助于让细胞附着于薄膜下壁。在上层流体通道进行接种时，在通道中加入适量液相，有助于保存细胞并让细胞浓缩。这可以沿通道轻松、快速地创建一个细胞单层。
实施例2：
实施例2与实施例1不同之处在于微流控芯片具有三层结构：
参照图5和图6，入口井1包括两个对应的上层入口井11、两个对应的中层入口井12以及两个对应的下层入口井13，两个对应的上层入口井11之间连通有上层微通道2，两个对应的中层入口井12之间连通有中层微通道2，两个对应的下层入口井13之间连通有下层微通道2。同时，上层微通道2、中层微通道2以及下层微通道2按上中下顺序分布。
另外，损伤装置3上设置有三层结构并形成有上层培养腔311、中层培养腔312以及下层培养腔313，并分别对应与上层微通道2、中层微通道2以及下层微通道2连通。
参照图7，在具有三层结构的损伤装置3中包括两个培养尿道粘膜细胞的薄膜6，两个薄膜6位于培养腔31中并分隔出上层培养腔311、中层培养腔312以及下层培养腔313；损伤腔32包括供具有薄膜6通过并将薄膜6上的尿道粘膜细胞划伤的两个通道321；观察腔33中容纳有两个培养受损尿道粘膜细胞的薄膜6并将观察腔33分隔出上、中、下两个腔室。同时上层微通道2、中层微通道2、下层微通道2同时通过上、中、下两个腔室进而同时模拟尿道粘膜细胞损伤修复的情况并进行观察。
三层微流控芯片的操作步骤：
S1、将待观察的尿道粘膜细胞注入中层培养腔312中，盖上入口井1将入口井1封闭，并侧方放置培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于中层培养腔312的侧壁；
S2、将待观察的尿道粘膜细胞注入上层培养腔311和中层培养腔312中，并正置于薄膜6上，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于中层培养腔312的下壁；
S3、将待观察的尿道粘膜细胞注入下层培养腔313和中层培养腔312中，盖上入口井1将入口井1封闭，并倒置于薄膜6上，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于中层培养腔312的上壁；
S4、在37℃下，消毒和预热管件和流体零件整夜；在超净工作台或生物安全柜中搭建微流控装置；在安装***之前，细胞须良好地附着在通道表面；
S5、将两个培养有尿道粘膜细胞的薄膜6穿过通道321并将薄膜6上的尿道粘膜细胞划伤，再将两个培养有受损尿道粘膜细胞的薄膜6固定在观察腔33中；
S6、设备流通的通道或入口/出口处需填充培养基；入口和出口设计便于使用连接器(1/4”-28)；
S7、在上层入口井11、中层入口井12以及下层入口井13中分别通入各层细胞需要的各自的培养基。。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，包括至少一对入口井(1)以及连通两两所述入口井(1)之间的微通道(2)；位于所述微通道(2)的中间设置有供尿道粘膜损伤修复观察的损伤装置(3)；所述损伤装置(3)上设置有多层结构并形成尿道粘膜细胞培养的培养腔(31)并将所述培养腔(31)中的尿道粘膜细胞进行一次或多次损伤，各所述微通道(2)对应连通所述损伤装置(3)，并模拟尿道粘膜细胞在所述损伤装置(3)中的修复情况。
2.根据权利要求1所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，所述入口井(1)包括两个对应的上层入口井(11)以及两个对应的下层入口井(13)，两个对应的所述上层入口井(11)之间连通有上层微通道(2)，两个对应的所述下层入口井(13)之间连通有下层微通道(2)；
所述上层微通道(2)位于所述下层微通道(2)上方，所述损伤装置(3)上设置有双层结构并形成有上层培养腔(311)以及下层培养腔(313)，并分别对应与所述上层微通道(2)以及所述下层微通道(2)连通。
3.根据权利要求1所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，所述入口井(1)包括两个对应的上层入口井(11)、两个对应的中层入口井(12)以及两个对应的下层入口井(13)，两个对应的所述上层入口井(11)之间连通有上层微通道(2)，两个对应的所述中层入口井(12)之间连通有中层微通道(2)，两个对应的所述下层入口井(13)之间连通有下层微通道(2)；
所述上层微通道(2)、所述中层微通道(2)以及所述下层微通道(2)按上中下顺序分布，所述损伤装置(3)上设置有三层结构并形成有上层培养腔(311)、中层培养腔(312)以及下层培养腔(313)，并分别对应与所述上层微通道(2)、所述中层微通道(2)以及所述下层微通道(2)连通。
4.根据权利要求1-3任意所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，所述入口井(1)的一侧设置有供细胞液待培养的培养仓(4)，所述培养仓(4)的腔室与所述入口井(1)的通道(321)之间连通。
5.根据权利要求4所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，对应所述上层入口井(11)或对应所述中层入口井(12)或对应所述下层入口井(13)中通入尿液，并模拟尿液在尿道中对损伤的尿道粘膜细胞的压迫，观察尿道粘膜细胞的修复情况。
6.根据权利要求5所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，对应所述上层入口井(11)或对应所述中层入口井(12)或对应所述下层入口井(13)中设置有循环装置，所述循环装置上通入尿液进行循环模拟尿液在尿道中的环境。
7.根据权利要求6所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，所述循环装置上设置有增加尿液在尿道中压力的压力组件。
8.根据权利要求2或3所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，所述损伤装置(3)包括培养腔(31)、损伤腔(32)以及观察腔(33)；
所述损伤装置(3)包括有两种：
在具有双层结构的所述损伤装置(3)中包括培养尿道粘膜细胞的薄膜(6)，一所述薄膜(6)位于所述培养腔(31)中并分隔出所述上层培养腔(311)和所述下层培养腔(313)；所述损伤腔(32)包括供具有所述薄膜(6)通过并将所述薄膜(6)上的尿道粘膜细胞划伤的通道(321)；所述观察腔(33)中容纳有培养受损尿道粘膜细胞的所述薄膜(6)并将所述观察腔(33)分隔出上、下两个腔室；
在具有三层结构的所述损伤装置(3)中包括两个培养尿道粘膜细胞的薄膜(6)，两所述薄膜(6)位于所述培养腔(31)中并分隔出所述上层培养腔(311)、所述中层培养腔(312)以及所述下层培养腔(313)；所述损伤腔(32)包括供具有所述薄膜(6)通过并将所述薄膜(6)上的尿道粘膜细胞划伤的两个通道(321)；所述观察腔(33)中容纳有两个培养受损尿道粘膜细胞的所述薄膜(6)并将所述观察腔(33)分隔出上、中、下两个腔室。
9.根据权利要求8所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，具有双层结构的所述微流控芯片上细胞的培养步骤为：
S1、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述上层培养腔(311)中，并正置于所述薄膜(6)的上侧，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述上层培养腔(311)的下壁；
S2、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述下层培养腔(313)中，并倒置于所述薄膜(6)的下侧，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述下层培养腔(313)的上壁；
S3、将培养有尿道粘膜细胞的所述薄膜(6)穿过所述通道(321)并将所述薄膜(6)上的尿道粘膜细胞划伤，再将培养有受损尿道粘膜细胞的所述薄膜(6)固定在所述观察腔(33)中；
S4、在所述上层入口井(11)以及所述下层入口井(13)中分别通入各层细胞需要的各自的培养基。。
10.根据权利要求8所述的用于模拟尿道粘膜损伤修复的微流控芯片，其特征在于，具有三层结构的所述微流控芯片上细胞的培养步骤为：
S1、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述中层培养腔(312)中，并侧方放置培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述中层培养腔(312)的侧壁；
S2、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述上层培养腔(311)和所述中层培养腔(312)中，并正置于所述薄膜(6)上，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述中层培养腔(312)的下壁；
S3、将待观察的尿道粘膜细胞注入所述下层培养腔(313)和所述中层培养腔(312)中，并倒置于所述薄膜(6)上，培养尿道粘膜细胞并将尿道粘膜细胞贴于所述中层培养腔(312)的上壁；
S4、将两个培养有尿道粘膜细胞的所述薄膜(6)穿过所述通道(321)并将所述薄膜(6)上的尿道粘膜细胞划伤，再将两个培养有受损尿道粘膜细胞的所述薄膜(6)固定在所述观察腔(33)中；
S5、在所述上层入口井(11)、所述中层入口井(12)以及所述下层入口井(13)中分别通入各层细胞需要的各自的培养基。。
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