CN116640452A - 丝胶蛋白微支架的制备方法及应用 - Google Patents
丝胶蛋白微支架的制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116640452A CN116640452A CN202310479799.6A CN202310479799A CN116640452A CN 116640452 A CN116640452 A CN 116640452A CN 202310479799 A CN202310479799 A CN 202310479799A CN 116640452 A CN116640452 A CN 116640452A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sericin
- micro
- stent
- solution
- femtosecond laser
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 title claims abstract description 107
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 229920002120 photoresistant polymer Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 238000007639 printing Methods 0.000 claims description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N methacrylic anhydride Chemical compound CC(=C)C(=O)OC(=O)C(C)=C DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KLGDRWGOXDJNPH-UHFFFAOYSA-N P(=O)(O)(O)O.C1(=CC=CC=C1)C=1C(=C(C(=O)[Li])C(=CC1C)C)C Chemical compound P(=O)(O)(O)O.C1(=CC=CC=C1)C=1C(=C(C(=O)[Li])C(=CC1C)C)C KLGDRWGOXDJNPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 3
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- IGAAQDGISNXKQL-UHFFFAOYSA-L P(=O)(OC(C1=C(C(=C(C=C1C)C)C1=CC=CC=C1)C)=O)([O-])[O-].[Li+].[Li+] Chemical compound P(=O)(OC(C1=C(C(=C(C=C1C)C)C1=CC=CC=C1)C)=O)([O-])[O-].[Li+].[Li+] IGAAQDGISNXKQL-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 2
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000010146 3D printing Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010041 electrostatic spinning Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- -1 methacryloyl Chemical group 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
- B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
- B33Y10/00—Processes of additive manufacturing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
- B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
- B33Y40/00—Auxiliary operations or equipment, e.g. for material handling
- B33Y40/20—Post-treatment, e.g. curing, coating or polishing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
- B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
- B33Y70/00—Materials specially adapted for additive manufacturing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
- B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
- B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
-
- G—PHYSICS
- G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
- G03F—PHOTOMECHANICAL PRODUCTION OF TEXTURED OR PATTERNED SURFACES, e.g. FOR PRINTING, FOR PROCESSING OF SEMICONDUCTOR DEVICES; MATERIALS THEREFOR; ORIGINALS THEREFOR; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED THEREFOR
- G03F7/00—Photomechanical, e.g. photolithographic, production of textured or patterned surfaces, e.g. printing surfaces; Materials therefor, e.g. comprising photoresists; Apparatus specially adapted therefor
- G03F7/004—Photosensitive materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
Abstract
本发明属于生物材料技术领域,具体公开丝胶蛋白微支架的制备方法及应用,将甲基丙烯酰化丝胶蛋白和光引发剂(LAP)混合制备成光刻胶,通过飞秒激光双光子直写技术打印,制备丝胶蛋白微支架。实现了微纳尺度的丝胶蛋白微支架制备,通过该方法获得的微支架具有高精度的微观结构,为细胞生长提供可控的微环境,可以调控细胞以及其在组织工程领域的潜在应用。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,尤其涉及丝胶蛋白微支架的制备方法及应用。
背景技术
丝胶蛋白是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子蛋白。近年来,随着对丝胶蛋白生物学性能的深入研究,表明丝胶蛋白具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗氧化性、细胞黏附性等,已经在生物医学领域得到广泛应用,尤其是组织工程和再生医学领域。
丝胶蛋白已经被制备成水凝胶、泡沫、纺丝纤维等组织工程支架,用于外周神经、心肌、皮肤、骨等损伤修复。支架微纳拓扑结构在细胞的生长、增殖、分化等方面发挥着重要作用,在特定组织中需要不同的微纳结构实现对细胞精准调控,促进组织再生。传统的支架成型方法(如铸模法、静电纺丝法、冻干法等),这些支架成型方法难以对支架孔隙结构大小、贯通性、表面结构等微观结构实现精确控制。3D打印技术实现了对支架外形的可控制造,但常规的3D打印技术很难实现100微米以下的结构的精准控制,不能准确模拟细胞生长的微环境。
双光子飞秒激光直写技术是一种先进的3D打印技术,可以突破光衍射极限,实现纳米级的打印精度,理论上可以实现更加精细、复杂的微支架结构。因此,本发明为构建精确模拟细胞生长微环境的丝胶蛋白三维微支架,使用双光子飞秒激光直写技术对甲基丙烯酰化丝胶蛋白进行加工,证明其在组织工程领域的应用前景。
发明内容
针对上述问题,本发明提供丝胶蛋白微支架的制备方法及应用,主要解决了现有的丝胶蛋白无法直接通过3D打印技术进行打印,限制了丝胶蛋白在组织工程领域的应用。
为了解决上述问题,本发明采用如下技术方案:
本发明第一方面涉及丝胶蛋白微支架的制备方法,包括
S1.丝胶蛋白光刻胶的制备
S11.提取丝胶蛋白:取去除水分的蚕茧,加入Na2CO3溶液,在100℃条件下溶解丝胶蛋白,溶解后离心,去除不溶性杂质,收集澄清的丝胶蛋白溶液并透析,冻干后得到丝胶蛋白粉末,
S12.取丝胶蛋白粉末:溶解在酸性缓冲液中,配制丝胶蛋白溶液,加入甲基丙烯酸酐,反应完成后透析,冻干后得到甲基丙烯酰化丝胶蛋白粉,
S13.取甲基丙烯酰化丝胶蛋白,溶解在磷酸盐缓冲液或去离子水中,配制丝胶蛋白溶液,加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐,得到丝胶蛋白光刻胶备用;
S2.双光子直写丝胶蛋白微支架:通过双光子飞秒激光直写技术将丝胶蛋白光刻胶打印成丝胶蛋白微支架,其中,激光强度为10-40mW,扫描速度为100-1000μm/s,飞秒激光器的波长为700-1000nm。
将丝胶蛋白用于3D直写制备微支架,制备的丝胶蛋白支架具有高度可控性和可重复性,可以制备出预先设计的不同结构。且使用基于双光子聚合的3D直写技术,制备的丝胶蛋白支架具有高度可控的精度,单线精度可达几百纳米,能够制备具有多孔的三维微支架。使用丝胶蛋白作为光刻胶,在打印出高精度的微支架的同时,基于丝胶蛋白本身具有的良好生物相容性、细胞粘附性,可以支持细胞黏附生长,其在组织工程领域潜在的应用前景。
其中,所述双光子飞秒激光直写技术通过飞秒激光双光子直写平台实施,所述飞秒激光双光子直写平台包括飞秒激光脉冲***、亚微米级精度运动平台、光路***、CCD监控***、控制电脑。
在一些情况中,所述双光子飞秒激光直写技术的操作步骤为通过设计软件设计不同的三维模型,导出为stl文件导入到打印机中,获得建模数据;取洁净玻片,通过真空等离子清洗机和硅氧烷处理玻片表面备用;取适量光刻胶到处理后的玻片上,然后放置到打印机载物台上,打印生物支架;打印完成后,将玻片浸没到去离子水中去除多余没有固化的材料,得到打印的丝胶蛋白微支架。
在一些情况中,在步骤S12中,缓冲液的pH为8.5(±1误差可接受),丝胶蛋白溶液浓度为1%(w/v);
步骤S13中,丝胶蛋白溶液浓度为15%(w/v),加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐后终浓度为0.1%。
在一些情况中,步骤S12中,加入甲基丙烯酸酐后在35-37℃反应;缓冲液为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲。
本发明第二方面涉及前述任一制备方法制备而得的丝胶蛋白微支架。该丝胶蛋白微支架可由前述方法制备得,但又不限定其必须采用前述方法制备,在进行比对过程中应当主要考虑产品本身的性质。
本发明第三方面涉及前述丝胶蛋白微支架在制备施万细胞培养载体中的应用。丝胶蛋白微支架可以用于探究不同微结构对细胞命运的影响以及在组织工程领域中的潜在应用前景。该丝胶蛋白微支架具有更好的细胞培养效果,能够准确模拟细胞生长的微环境。
其中,具体而言,所述应用方法为将丝胶蛋白微支架经环氧乙烷消毒灭菌后,在微支架上接种了施万细胞(接种方式参考现有),体外培养。
在一些情况中,所述施万细胞为人施万细胞GFP-RSC96,或与人施万细胞GFP-RSC96类似的施万细胞。
本发明的有益效果是:
该方法实现了将丝胶蛋白用于制备3D打印光刻胶,且该方法稳定,可以形成任意微纳结构;丝胶蛋白微支架可以更好的模拟体内细胞外基质的微观结构,用于体外调控细胞行为、组织工程等研究。
附图说明
图1为不同pH条件下反应体系的图片;
图2为丝胶蛋白光刻胶和飞秒激光三维直写平台的组成;
图3为不同激光功率打印丝胶蛋白成型情况;
图4为不同激光条件下丝胶蛋白三维成型情况;
图5为打印的丝胶蛋白微支架;
图6为施万细胞在丝胶蛋白微支架上的生长情况;
图7为不同时间点施万细胞在丝胶蛋白微支架上的生长情况。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明。
1.丝胶蛋白光刻胶的制备:
(1)甲基丙烯酰化丝胶蛋白的制备:
提取丝胶蛋白:称取5g蚕茧(丝素缺陷型蚕茧),剪碎用水洗净,去除水分;按每克蚕茧加入40mL 0.02mol/LNa2CO3溶液,在100℃条件下溶解丝胶蛋白(1h),彻底溶解后3500rpm离心10分钟,去除不溶性杂质;收集澄清的丝胶蛋白溶液用用去离子水透析3天,冻干后得到纯的丝胶蛋白粉末。
(2)甲基丙烯酰化丝胶蛋白制备:
称取上述丝胶蛋白粉末,溶解在pH8.5的磷酸盐缓冲液中,得到1%(w/v)丝胶蛋白溶液;按每克丝胶蛋白加入0.6g的甲基丙烯酸酐,于35℃反应24小时;反应完成后转移到透析袋(Mw=3500Da)中,去离子水透析3天,冻干后得到甲基丙烯酰化丝胶蛋白粉。图1展示了不同pH条件下反应体系的图片,中性和酸性条件下丝胶蛋白会变性沉淀,冻干后产物难以溶解。
(3)丝胶蛋白光刻胶制备:
称取上述得到的甲基丙烯酰化丝胶蛋白,溶解在磷酸盐缓冲液或去离子水中,配置15%(w/v)的丝胶蛋白溶液,加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP),终浓度为0.1%,得到丝胶蛋白光刻胶备用。
2.双光子直写丝胶蛋白微支架:
(1)飞秒激光双光子直写平台搭建:实例图2展示了平台组成,包括飞秒激光脉冲***、亚微米级精度运动平台、光路***、CCD监控***、控制电脑。
(2)丝胶蛋白三维微支架的双光子聚合直写方法过程为:预制模型、激光直写、显影。
通过Solidworks、CAD等软件,设计不同的三维模型,导出为stl文件导入到打印机中,获得建模数据;取洁净玻片,通过真空等离子清洗机和硅氧烷处理玻片表面备用;取适量光刻胶到处理后的玻片上,然后放置到打印机载物台上,打印生物支架;打印完成后,将玻片浸没到去离子水中30分钟后取出,去除多余没有固化的材料,得到打印的丝胶蛋白微支架。图3展示了不同激光功率下直写成型情况,在激光功率2-20mW范围内均能成型,打印线宽可达几百纳米。进一步的,选取了几个激光功率进行三维成型能力测试,使用不同激光功率打印30×30×5微米的块状结构,如图4所示,双光子直写甲基丙烯酰化丝胶蛋白具有较好的三维成型能力。
为了使本方案可以制备更加复杂的微结构,设计了不同的打印模型,如图5,可以打印出预先设计的各种三维结构。本发明可以通过对不同组织微环境进行分析建模,打印出特定的丝胶蛋白微支架,用于不同细胞调控、组织工程应用等。
3.丝胶蛋白微支架用于施万细胞培养
基于上述打印的丝胶蛋白曲线结构,经环氧乙烷消毒灭菌后,在微支架上接种了绿色荧光蛋白标记的人施万细胞(GFP-RSC96),体外培养三天,观察细胞的生长情况如图6所示。本实施例中,图7展示了施万细胞可以在支架上黏附生长,具有沿着线条生长的趋势。
本领域的技术人员可以明确,在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下,可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
Claims (9)
1.丝胶蛋白微支架的制备方法,其特征在于,包括
S1.丝胶蛋白光刻胶的制备
S11.提取丝胶蛋白:取去除水分的蚕茧,加入Na2CO3溶液,在100℃条件下溶解丝胶蛋白,溶解后离心,去除不溶性杂质,收集澄清的丝胶蛋白溶液并透析,冻干后得到丝胶蛋白粉末,
S12.取丝胶蛋白粉末:溶解在酸性缓冲液中,配制丝胶蛋白溶液,加入甲基丙烯酸酐,反应完成后透析,冻干后得到甲基丙烯酰化丝胶蛋白粉,
S13.取甲基丙烯酰化丝胶蛋白,溶解在磷酸盐缓冲液或去离子水中,配制丝胶蛋白溶液,加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐,得到丝胶蛋白光刻胶备用;
S2.双光子直写丝胶蛋白微支架:通过双光子飞秒激光直写技术将丝胶蛋白光刻胶打印成丝胶蛋白微支架,其中,激光强度为10-40mW,扫描速度为100-1000μm/s,飞秒激光器的波长为700-1000nm。
2.根据权利要求1所述的丝胶蛋白微支架的制备方法,其特征在于,所述双光子飞秒激光直写技术通过飞秒激光双光子直写平台实施,所述飞秒激光双光子直写平台包括飞秒激光脉冲***、亚微米级精度运动平台、光路***、CCD监控***、控制电脑。
3.根据权利要求2所述的丝胶蛋白微支架的制备方法,其特征在于,所述双光子飞秒激光直写技术的操作步骤为通过设计软件设计不同的三维模型,导出为stl文件导入到打印机中,获得建模数据;取洁净玻片,通过真空等离子清洗机和硅氧烷处理玻片表面备用;取适量光刻胶到处理后的玻片上,然后放置到打印机载物台上,打印生物支架;打印完成后,将玻片浸没到去离子水中去除多余没有固化的材料,得到打印的丝胶蛋白微支架。
4.根据权利要求1所述的丝胶蛋白微支架的制备方法,其特征在于,在步骤S12中,缓冲液的pH为8.5,丝胶蛋白溶液浓度为1%(w/v);
步骤S13中,丝胶蛋白溶液浓度为15%(w/v),加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐后终浓度为0.1%。
5.根据权利要求1所述的丝胶蛋白微支架的制备方法,其特征在于,步骤S12中,加入甲基丙烯酸酐后在35-37℃反应;缓冲液为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲。
6.权利要求1-5任一所述制备方法制备而得的丝胶蛋白微支架。
7.权利要求6中的丝胶蛋白微支架在制备施万细胞培养载体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述应用方法为将丝胶蛋白微支架经环氧乙烷消毒灭菌后,在微支架上接种施万细胞,体外培养。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述施万细胞为人施万细胞GFP-RSC96。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310479799.6A CN116640452B (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 丝胶蛋白微支架的制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310479799.6A CN116640452B (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 丝胶蛋白微支架的制备方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116640452A true CN116640452A (zh) | 2023-08-25 |
CN116640452B CN116640452B (zh) | 2024-06-11 |
Family
ID=87617880
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310479799.6A Active CN116640452B (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 丝胶蛋白微支架的制备方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116640452B (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105233336A (zh) * | 2015-07-15 | 2016-01-13 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用 |
CN105751511A (zh) * | 2016-04-20 | 2016-07-13 | 清华大学深圳研究生院 | 双光子聚合3d打印机及打印方法 |
CN106039416A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-10-26 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 壳聚糖—丝胶蛋白复合生物支架及其制备方法和应用 |
CN106075598A (zh) * | 2016-09-22 | 2016-11-09 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种光交联丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN108653741A (zh) * | 2018-05-24 | 2018-10-16 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用 |
CN112835268A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-25 | 烟台魔技纳米科技有限公司 | 一种生物基水溶性负性光刻胶及其在飞秒激光直写加工方法中的应用 |
CN115869465A (zh) * | 2022-12-12 | 2023-03-31 | 之江实验室 | 一种天然蛋白光刻胶和活性氧清除细胞支架的制备方法 |
-
2023
- 2023-04-28 CN CN202310479799.6A patent/CN116640452B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105233336A (zh) * | 2015-07-15 | 2016-01-13 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 丝胶蛋白神经导管及其制备方法与应用 |
CN105751511A (zh) * | 2016-04-20 | 2016-07-13 | 清华大学深圳研究生院 | 双光子聚合3d打印机及打印方法 |
CN106039416A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-10-26 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 壳聚糖—丝胶蛋白复合生物支架及其制备方法和应用 |
CN106075598A (zh) * | 2016-09-22 | 2016-11-09 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种光交联丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用 |
CN108653741A (zh) * | 2018-05-24 | 2018-10-16 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用 |
CN112835268A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-25 | 烟台魔技纳米科技有限公司 | 一种生物基水溶性负性光刻胶及其在飞秒激光直写加工方法中的应用 |
CN115869465A (zh) * | 2022-12-12 | 2023-03-31 | 之江实验室 | 一种天然蛋白光刻胶和活性氧清除细胞支架的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116640452B (zh) | 2024-06-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110790950A (zh) | 光交联重组胶原蛋白水凝胶、制备方法及其在3d生物打印中的应用 | |
CN104888277B (zh) | 一种细胞‑生物支架复合体及其3d打印成形方法 | |
US20050019488A1 (en) | Layered aligned polymer structures and methods of making same | |
US20020151974A1 (en) | Tympanic membrane patch | |
Biazar et al. | The healing effect of stem cells loaded in nanofibrous scaffolds on full thickness skin defects | |
CN108653810B (zh) | 一种可实现细胞包裹的丝素蛋白/明胶互穿网络水凝胶及其制备方法 | |
CN111500523A (zh) | 一种生物质核壳结构细胞微载体的制备方法 | |
CN111228574A (zh) | 组织工程半月板支架及其制备方法 | |
CN111671973A (zh) | 一种聚吡咯/丝素蛋白复合导电组织工程支架的制备方法 | |
CN114917412A (zh) | 一种光敏性水凝胶材料在制备促进皮肤伤口愈合和/或毛囊再生产品中的应用及产品 | |
CN112870439A (zh) | 核壳-串晶结构的纳米纤维骨组织工程支架及其制备方法 | |
Gill et al. | Towards the fabrication of artificial 3D microdevices for neural cell networks | |
WO2021012677A1 (zh) | 一种仿生的预脉管化材料及其制备方法和应用 | |
CN111166937A (zh) | 脱细胞细胞外基质及其制备方法和生物墨水 | |
CN104163622A (zh) | 一种锂皂石生物陶瓷的制备方法及其用途 | |
CN116640452B (zh) | 丝胶蛋白微支架的制备方法及应用 | |
Song et al. | Corneal bioprinting using a high concentration pure collagen I transparent bioink | |
CN110755685A (zh) | 一种3d打印瓜尔胶水凝胶支架及其制备方法 | |
CN115869465B (zh) | 一种天然蛋白光刻胶和活性氧清除细胞支架的制备方法 | |
CN116726247A (zh) | 一种3d打印强韧丝素蛋白支架材料的制备方法和应用 | |
US20200215228A1 (en) | Collagen microfiber scaffolds | |
CN116426003A (zh) | 一种用于细胞扩增培养的3d水凝胶及其制备方法 | |
CN114259601B (zh) | 活细胞仿生角膜前板层及其制备方法 | |
CN114763399B (zh) | 一种数字光处理3d打印人工角膜及其打印方法和应用 | |
CN108939148A (zh) | 一种3d打印pcl-pda-锂离子骨修复组织工程支架及制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |