CN116626196A - 一种同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法 - Google Patents
一种同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及中药检测技术领域，具体是一种同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法。本发明采用UPLC‑MS/MS方法，按如下条件进行UPLC‑MS/MS测定：超高效液相色谱柱：WatersBEHC18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温45℃；流动相为A、B两相：含0.1％甲酸的乙腈(A)和水(B)；等度洗脱程序如下：0～3min，5％A；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL。质谱分析条件：检测模式：电喷雾离子化(ESI)正离子；扫描方式：多反应监测(MRM)；数据采集及处理软件：MassLynxV4.1工作站，本发明的方法可以同时测定阿胶中18种游离氨基酸和核苷的含量，并且洗脱测定速度较快。
Description
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，具体是一种同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法。
背景技术
阿胶是马科动物驴Equus asinus L.的皮为原料，加入黄酒和冰糖等辅料制成的胶状固体中药。“阿胶”一名最早记载于《神农本草经》。其广泛用于养血、优化免疫应答和治疗妇科疾病等。阿胶的功效和安全性在中国历经2000多年的考验，具有广泛的应用。
核苷类成分具有较好的生理活性，是维持细胞生命活动不可或缺的成分，同时还参与DNA代谢过程，食源性核苷类化合物在免疫***调节中发挥着的重要作用。氨基酸是组成多肽和蛋白质的基本单位，是生物代谢过程中的重要物质，其对抗氧化、调节人体血压、增强免疫力、抗疲劳、改善皮肤水份状况、营养和能量代谢等具有重要的作用。游离氨基酸不需要经胃肠道水解，可直接被人体吸收，是身体补充营养良好的来源。游离氨基酸类和核苷类成分的含量在一定程度能反映阿胶的营养价值，目前测定阿胶中水解氨基酸含量的报道较多，阿胶中游离氨基酸和核苷类成分的研究较少，由于许多氨基酸在不能直接使用紫外检测器测定，因此使用液相色谱法测定其含量时，一般要对氨基酸进行化学衍生，使用的衍生试剂具有一定的毒性，安全性较低，操作繁琐。
因此，寻找一种能同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法是很有必要的，其可以用于寻找区分不同厂家阿胶的潜在指标成分，为进一步提升该药材的质量标准研究提供实验依据。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，具体如下：
一种同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，采用UPLC-MS/MS方法进行测定；其中超高效液相色谱柱条件如下：Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温45℃。
进一步的，其中超高效液相色谱柱洗脱程序如下：流动相为A、B两相：含0.1％甲酸的乙腈(A)和水(B)；等度洗脱程序如下：0～3min，5％A；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL。
进一步的，其中质谱分析条件如下：检测模式：电喷雾离子化(ESI)正离子；扫描方式：多反应监测(MRM)；数据采集及处理软件：MassLynx V4.1工作站。
进一步的，其中质谱参数如下：
| 参数 | 参数值 | 参数 | 参数值 |
| 毛细管电压 | 0.5kV | 去溶剂气温度 | 500℃ |
| 离子源温度 | 150℃ | 去溶剂气流速 | 1000L/h |
。
进一步的，其中各成分的质谱分析条件如下：
进一步的，所述供试品溶液通过如下步骤制备得到：精密称取待测阿胶粗粉，加水，超声处理，离心，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
进一步的，所述加水，是加50-100倍重量的水；所述超声处理，是功率250W，频率40kHz超声处理；所述离心，是在14000r/min下离心10min。
进一步的，所述对照品溶液通过如下步骤制备得到：取L-天冬氨酸(Asp)、鸟苷(Guad)、腺苷(Adeno)、L-精氨酸(Arg)、腺嘌呤(Ade)、胞苷(Cyti)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-亮氨酸(Leu)、L-异亮氨酸(Ile)、L-谷氨酸(Glu)、L-丝氨酸(Ser)、L-谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-羟脯氨酸(Hyp)、L-苏氨酸(Thr)、L-脯氨酸(Pro)和L-赖氨酸(Lys)对照品，加水使溶解并制成质量浓度分别为1.138mg/mL、1.096mg/mL、1.115mg/mL、1.092mg/mL、1.010mg/mL、1.114mg/mL、1.166mg/mL、1.183mg/mL、1.112mg/mL、1.135mg/mL、1.020mg/mL、1.058mg/mL、1.009mg/mL、1.217mg/mL、1.183mg/mL和1.070mg/mL对照溶液，备用。
进一步的，所述多种核苷类和游离氨基酸类成分，具体是L-天冬氨酸(Asp)、鸟苷(Guad)、腺苷(Adeno)、L-精氨酸(Arg)、腺嘌呤(Ade)、胞苷(Cyti)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-亮氨酸(Leu)、L-异亮氨酸(Ile)、L-谷氨酸(Glu)、L-丝氨酸(Ser)、L-谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-羟脯氨酸(Hyp)、L-苏氨酸(Thr)、L-脯氨酸(Pro)和L-赖氨酸(Lys)。
本发明的具体操作步骤如下：
(1)对照品溶液的制备：
取Asp、Guad、Adeno、Arg、Ade、Cyti、Phe、Leu、Ile、Glu、Ser、Gln、Gly、Ala、Hyp、Thr、Pro和Lys对照品约10mg(精密称定)，加水使溶解并制成质量浓度分别为1.138mg/mL、1.096mg/mL、1.115mg/mL、1.092mg/mL、1.010mg/mL、1.114mg/mL、1.166mg/mL、1.183mg/mL、1.112mg/mL、1.135mg/mL、1.020mg/mL、1.058mg/mL、1.009mg/mL、1.217mg/mL、1.183mg/mL和1.070mg/mL对照溶液，备用。
(2)供试品溶液的制备：
精密称取待测阿胶粗粉约0.10g，置10ml容量瓶中，加8mL水，然后超声处理(功率250W，频率40kHz)60min，加水至刻度，摇匀，取溶液1mL，在14000r/min下离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
(3)UPLC-MS/MS处理：
分别取对照品溶液和供试品溶液，按如下条件进行UPLC-MS/MS测定：
超高效液相色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温45℃；流动相为A、B两相：含0.1％甲酸的乙腈(A)和水(B)；等度洗脱程序如下：0～3min，5％A；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL。质谱分析条件：检测模式：电喷雾离子化(ESI)正离子；扫描方式：多反应监测(MRM)；数据采集及处理软件：MassLynx V4.1工作站；质谱参数见表1；Asp等18种成分(Asp、Guad、Adeno、Arg、Ade、Cyti、Phe、Leu、Ile、Glu、Ser、Gln、Gly、Ala、Hyp、Thr、Pro和Lys)的质谱条件见表2。
表1质谱参数Tab 1The mass spectrometric conditions
表2Asp等成分的质谱条件Table 2Mass spectrometric conditions for18components in CCA
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
本发明采用UPLC-MS/MS方法，按如下条件进行UPLC-MS/MS测定：超高效液相色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温45℃；流动相为A、B两相：含0.1％甲酸的乙腈(A)和水(B)；等度洗脱程序如下：0～3min，5％A；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL。质谱分析条件：检测模式：电喷雾离子化(ESI)正离子；扫描方式：多反应监测(MRM)；数据采集及处理软件：MassLynx V4.1工作站；质谱参数见表1；Asp等18种成分的质谱条件见表2。
本申请最终建立了UPLC-MS/MS同时测定阿胶中游离氨基酸类和核苷类成分的含量，该方法快捷，准确可靠，可以同时测定阿胶中L-天冬氨酸(Asp)、鸟苷(Guad)、腺苷(Adeno)、L-精氨酸(Arg)、腺嘌呤(Ade)、胞苷(Cyti)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-亮氨酸(Leu)、L-异亮氨酸(Ile)、L-谷氨酸(Glu)、L-丝氨酸(Ser)、L-谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-羟脯氨酸(Hyp)、L-苏氨酸(Thr)、L-脯氨酸(Pro)和L-赖氨酸(Lys)的含量，并且测定速度较快，仅需要三分钟即可完成洗脱分析测定，可通过阿胶中氨基酸类和核苷类成分的含量测定，为进一步提升该药材的质量标准研究提供实验依据。
附图说明
图1是对照品溶液(A～C)、供试品溶液(D～F)和水(G～I)的色谱图，其中1.Asp；2.Guad；3.Adeno；4.Arg；5.Ade；6.Cyti；7.Phe；8.Leu；9.Ile；10.Glu；11.Ser；12.Gln；13.Gly；14.Ala；15.Hyp；16.Thr；17.Pro；18.Lys。
图2是不同厂家阿胶聚类分析树状图。
图3是17个厂家阿胶主成分分析得分图。
图4是17个厂家阿胶主成分分析模型载荷图。
图5是17份阿胶OPLS-DA得分图。
图6是OPLS-DA模型的200次置换检验结果图。
图7是阿胶的OPLS-DA的VIP值图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例：
1、材料：
UPLC-TQ-D型液相色谱-质谱联用仪(AcquityTM UPLC-TQD***，美国Waters公司)；EL2041/1十万电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；Allegra 30R Centrifuge低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；超声清洗机(KQ-500DE数控型，中国KunshanUltrasound Instrument公司)。
17批阿胶：购自全国不同厂家(批号分别为：20220208、2010062、2109013、220204、220302、202038、21120429、220303、21120101、21120302、21120603、202111110、2010067、21052001、20220225、20220114、211203，依次编号为S1～S17，产地：S1～S8：山东；S9～S10：河南；S11～S13：河北；S14～S15：湖南；S16：安徽；S17：吉林)，经贵州省药物制剂重点实验室刘春花副教授鉴定为正品，并符合《中华人民共和国药典》2020年版中鉴别项下的规定；对照品L-天冬氨酸(Asp)、鸟苷(Guad)、腺苷(Adeno)、L-精氨酸(Arg)、腺嘌呤(Ade)、胞苷(Cyti)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-亮氨酸(Leu)、L-异亮氨酸(Ile)、L-谷氨酸(Glu)、L-丝氨酸(Ser)、L-谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-羟脯氨酸(Hyp)、L-苏氨酸(Thr)、L-脯氨酸(Pro)和L-赖氨酸(Lys)(成都埃法生物科技有限公司，批号分别为AF20080263、AF20073152、AF20122001、AF20080251、AF21020151、AF21041451、AF20080254、AF20080253、AF20080256、AF20071254、AF20080260、AF22040751、AF20102451、AF20071851、AF21032351、AF20080258、AF20080255和AF20080261，纯度≥98％)。
2、方法与结果：
2.1溶液的制备
2.1.1对照品溶液的制备
取Asp、Guad、Adeno、Arg、Ade、Cyti、Phe、Leu、Ile、Glu、Ser、Gln、Gly、Ala、Hyp、Thr、Pro和Lys对照品约10mg(精密称定)，加水使溶解并制成质量浓度分别为1.138mg/mL、1.096mg/mL、1.115mg/mL、1.092mg/mL、1.010mg/mL、1.114mg/mL、1.166mg/mL、1.183mg/mL、1.112mg/mL、1.135mg/mL、1.020mg/mL、1.058mg/mL、
1.009mg/mL、1.217mg/mL、1.183mg/mL和1.070mg/mL对照溶液，备用。
2.1.2供试品溶液的制备
精密称取本品粗粉约0.10g，置10ml容量瓶中，加8mL水，然后超声处理(功率250W，频率40kHz)60min，加水至刻度，摇匀，取溶液1mL，在14000r/min下离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
2.2色谱和质谱条件
超高效液相色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温45℃；流动相为A、B两相：含0.1％甲酸的乙腈(A)和水(B)；等度洗脱程序如下：0～3min，5％A；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL。质谱分析条件：检测模式：电喷雾离子化(ESI)正离子；扫描方式：多反应监测(MRM)；数据采集及处理软件：MassLynx V4.1工作站；质谱参数见表1；Asp等18种成分的质谱条件见表2。
表1质谱参数
Tab 1 The mass spectrometric conditions
| 参数 | 参数值 | 参数 | 参数值 |
| 毛细管电压 | 0.5kV | 去溶剂气温度 | 500℃ |
| 离子源温度 | 150℃ | 去溶剂气流速 | 1000L/h |
表2 Asp等成分的质谱条件
Table 2 Mass spectrometric conditions for 18 components in CCA
2.3方法学考察
2.3.1***适应性
将水(空白)、混合对照溶液和供试品溶液，按2.2项下的条件分析，结果见图1。结果表明，在供试品与对照品溶液中，Asp、Guad、Adeno、Arg、Ade、Cyti、Phe、Leu、Ile、Glu、Ser、Gln、Gly、Ala、Hyp、Thr、Pro和Lys的出峰时间一致，而水的相应位置无色谱峰。结果表明，该方法可用于阿胶的含量测定。
2.3.2线性关系考察和检测限及定量限的测定
精密吸取适量2.1.1项下的各对照溶液，用水稀释成不同浓度梯度的混合对照溶液，进样分析后，分别以不同化合物的峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)制备标准曲线，以信噪比计算得到检出限和定量限，见表3。结果表明，Asp等成分的线性关系良好。
表3Asp等成分的线性关系Table 3linearrelationships of18 compounds
2.3.3精密度试验
取一定浓度的对照品混合溶液，进样6次，分别计算得到Asp等成分峰面积的RSD为2.8％、3.2％、1.8％、4.5％、4.6％、2.4％、3.5％、2.4％、2.4％、3.6％、3.2％、1.6％、3.5％、3.0％、2.8％、1.3％、2.3％和4.5％，表明该仪器的精密度良好。
2.3.4稳定性试验
将样品S3按2.1.2项下方法制成供试品溶液后，于0、2、4、8、12、24h进样，结果，Asp等峰面积的RSD均小于4.2％，表明该溶液稳定，能用于含量测定。
2.3.5重复性试验
将样品S3精密称取6份，制成供试品溶液后，进样分析，结果，样品中Asp等18种成分的平均质量分数分别为19.45、14.72、8.23、14.50、22.71、4.27、47.23、38.25、2.68、13.69、11.59、4.04、164.65、85.88、50.04、7.63、38.44和6.47ug/g，RSD分别为1.8％、1.0％、3.2％、3.2％、3.0％、2.0％、2.1％、2.8％、4.5％、0.9％、3.3％、1.8％、3.4％、2.6％、4.3％、2.3％、1.9％和2.9％，说明该方法具有较好的重复性。
2.3.6加样回收率试验
将样品S3精密称取6份，每份约0.1g，加入特定浓度的对照品混合溶液，按供试品溶液制备方法制成溶液，按2.2项下条件进行测定，计算得到各成分的加样回收率并计算其RSD，见表4。Asp等18种成分的平均加样回收率为98.0％～104.9％，RSD为1.6％～4.9％，表明该方法可用于测定阿胶中Asp等18种成分的含量。
表4阿胶样品中Asp等成分的加样回收率Table4 Samplerecoverytestof18components in CCA
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/>
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2.4含量测定
精密称取来自各厂家的阿胶粉末0.10g，按2.1.2项方法制成供试品溶液，用2.2项下条件分析，分别将峰面积代入标准曲线来计算Asp、Guad、Adeno、Arg、Ade、Cyti、Phe、Leu、Ile、Glu、Ser、Gln、Gly、Ala、Hyp、Thr、Pro和Lys的含量，见表5。
表5不同厂家阿胶中18种成分的含量(μg/g，n＝3)
Table 5 The content of 18 components in 17 batches of CCA(μg/g，n＝3)
| 编号 | Asp | Guad | Adeno | Arg | Ade | Cyti | Phe | Leu | Ile |
| S1 | 18.36 | 4.64 | 0.65 | 8.83 | 3.98 | 0.61 | 40.42 | 51.59 | 6.12 |
| S2 | 31.93 | 12.57 | 3.34 | 18.19 | 19.56 | 3.02 | 49.53 | 38.92 | 3.00 |
| S3 | 14.58 | 35.86 | 5.45 | 14.80 | 21.63 | 4.52 | 22.95 | 75.86 | 3.25 |
| S4 | 25.59 | 9.75 | 7.07 | 17.75 | 2.02 | 0.95 | 28.89 | 41.32 | 2.64 |
| S5 | 27.18 | 11.61 | 8.98 | 13.78 | 5.56 | 1.90 | 32.52 | 45.82 | 2.20 |
| S6 | 39.21 | 54.52 | 64.65 | 15.56 | 49.64 | 7.39 | 82.94 | 127.18 | 6.74 |
| S7 | 26.14 | 8.27 | 9.42 | 12.06 | 4.53 | 0.43 | 44.57 | 36.79 | 3.76 |
| S8 | 44.75 | 7.44 | 8.50 | 16.32 | － | 0.76 | 49.95 | 42.95 | 3.40 |
| S9 | 8.56 | 18.82 | 0.80 | 12.87 | 7.59 | 0.61 | 74.15 | － | 4.97 |
| S10 | 24.79 | 6.83 | 7.60 | 23.11 | 5.34 | 0.90 | 45.42 | 30.59 | 2.35 |
| S11 | 16.44 | 11.68 | 4.89 | 13.12 | 4.91 | 1.68 | 24.46 | 25.03 | 2.42 |
| S12 | 10.59 | 14.81 | 14.87 | 12.25 | 19.42 | 3.08 | 34.85 | 36.25 | 3.58 |
| S13 | 33.90 | 18.63 | 6.24 | 13.64 | 3.42 | 0.17 | 96.67 | 113.99 | 13.02 |
| S14 | 29.98 | 14.92 | 5.29 | 27.34 | 26.47 | 3.34 | 86.26 | 78.62 | 9.86 |
| S15 | 27.29 | 5.43 | 5.39 | 14.05 | 2.94 | 0.74 | 25.42 | 22.52 | 2.96 |
| S16 | 43.16 | 6.48 | 6.69 | 22.80 | 5.83 | 0.50 | 62.40 | 33.23 | 4.99 |
| S17 | 44.93 | 19.68 | 3.53 | 26.92 | 34.28 | 1.96 | 66.50 | 60.04 | 4.49 |
续表5
/>
注：－为未检测到。
2.5化学模式识别
2.5.1层次聚类分析(hierarchical clustering analysis，HCA)
为了考察不同厂家阿胶中18种氨基酸类和核苷类成分的含量差异，将17个厂家阿胶的18种成分的含量(部分缺失含量以0计)为变量，导入SIMCA 13.0，采用Ward法，以欧氏距离作为度量标准进行HCA，见图2。当分类距离为70时，S6、S13、S14、S17号样品聚为第一类，即1批山东，1批河北，1批湖南，1批吉林样品聚为一类；S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S15、S16号样品聚为第二类，即7批山东，2批河南，2批河北，1批湖南，1批安徽样品聚为一类，共聚为2类。从聚类分析结果可知,山东、河南、河北产地的阿胶大致按产地聚为一类，表明阿胶中氨基酸的含量高低可能与产地有一定的关系，其中7批山东，2批河南，2批河北的样品聚为一大类，表明这三个产地阿胶差异较小，8批山东产的阿胶除S6外，聚为1类，表明山东产的阿胶差异较小，质量也较为稳定。
2.5.2主成分分析(principal component analysis，PCA)
运用SIMCA 13.0软件对17个厂家的阿胶进行PCA，以18种成分的含量测定结果作为变量，采用SIMCA 13.0软件对17个厂家的阿胶样品进行PCA。结果显示，2个主成分的累计贡献率为60.75％，PCA得分图(图3)，聚类结果与HCA的结果一致。图4为18种成分的载荷散点图，变量离原点越远，则表明该变量对主成分的影响权重越大。由图可知，Phe、Leu、Ade和Guad对主成分1的贡献率较大，Gly、Hyp和Ala对主成分2的贡献率较大。
2.5.3正交偏最小二乘-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)
将17份样品的18种成分的含量导入SIMCA 13.0，对17份样品进行OPLS-DA，OPLS-DA得分图见图5，在该模型下R2X、R2Y和Q2分别为0.791、0.885和0.722，大于0.5，表明该模型具有比较好的预测能力。进行200次置换检验(图6)，表明模型有效，没有过度拟合。进一步以18个变量的重要值(variable importance in projection，VIP)大于1为标准，筛选出Leu、Phe、Ade和Guad(图7)可能是导致样品之间产生差异的主要原因，提示这些成分可作为区分不同企业阿胶的潜在指标成分，该结果与PCA载荷图中寻找的重要性权重变量基本一致。
3讨论
3.1供试品处理方法考察
分别对提取的溶剂(0.1mol/L盐酸、水、10％甲醇、25％甲醇、10％乙醇、25％乙醇)、超声的时间(15min、30min、45min、60min)和样品与提取溶剂体积的比例(1:50、1:100、1:250)进行了考察，根据峰面积和峰型确定提取溶剂为水，超声时间为60min，料液比为1:100，最终确定供试品处理方法，见2.1.2。
3.2进样量的选择
分别对进样量1，5，10μL进行了考察，结果进样量为1μL时，各成分峰型较差，且Adeno、Ade和Cyti等含量较低的成分就不能检测到；进样10μL时，含量较高的成分，线性关系较差，且重复性不好；进样量5μL时，各成分均能检测到，峰型较好，且线性关系良好，故选择进样量为5μL。
3.3色谱质谱条件的优化
首先以梯度洗脱方式进样分析后发现，各成分保留时间均较为靠前，且精密度较差；采用等度洗脱方式进样，各成分保留时间有所延迟，且精密度达到要求，因此采用等度洗脱方式进样分析。将对照品直接推入质谱，选定测定离子对，并优化这些离子的质谱条件，最终的质谱条件见2.2。
3.4结论
本申请使用液相色谱串联质谱法测定17家企业阿胶中的18种游离氨基酸类和核苷类成分，并且目前未有测定阿胶中游离氨基酸类和核苷类成分含量的内容公开，结合HCA、PCA和OPLS-DA这3种化学模式识别手段进一步对测定结果进行分析后发现，Leu、Phe、Ade和Guad可能是导致样品之间产生差异的主要原因，提示这4种成分可作为区分不同企业阿胶的潜在指标成分。本申请建立了UPLC-MS/MS同时测定阿胶中游离氨基酸类和核苷类成分的含量的方法，该方法快捷，准确可靠，可用阿胶中氨基酸类和核苷类成分的含量测定，为进一步提升该药材的质量标准研究提供实验依据。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，采用UPLC-MS/MS方法进行测定；其中超高效液相色谱柱条件如下：WatersBEHC18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温45℃。
2.根据权利要求1所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS方法，其中超高效液相色谱柱洗脱程序如下：流动相为A、B两相：含0.1％甲酸的乙腈(A)和水(B)；等度洗脱程序如下：0～3min，5％A；流速：0.35mL/min；进样体积：5μL。
3.根据权利要求1所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS方法，其中质谱分析条件如下：检测模式：电喷雾离子化正离子；扫描方式：多反应监测；数据采集及处理软件：MassLynxV4.1工作站。
4.根据权利要求1所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS方法，其中质谱参数如下：
。
5.根据权利要求1所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS方法，其中各成分的质谱分析条件如下：
6.根据权利要求1所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述供试品溶液通过如下步骤制备得到：精密称取待测阿胶粗粉，加水，超声处理，离心，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，即得。
7.根据权利要求6所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述加水，是加50-100倍重量的水。
8.根据权利要求6所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述超声处理，是功率250W，频率40kHz超声处理；所述离心，是在14000r/min下离心10min。
9.根据权利要求1所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述对照品溶液通过如下步骤制备得到：取L-天冬氨酸、鸟苷、腺苷、L-精氨酸、腺嘌呤、胞苷、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-羟脯氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸和L-赖氨酸对照品，加水使溶解并制成质量浓度分别为1.138mg/mL、1.096mg/mL、1.115mg/mL、1.092mg/mL、1.010mg/mL、1.114mg/mL、1.166mg/mL、1.183mg/mL、1.112mg/mL、1.135mg/mL、1.020mg/mL、1.058mg/mL、1.009mg/mL、1.217mg/mL、1.183mg/mL和1.070mg/mL对照溶液，备用。
10.根据权利要求1所述的同时测定阿胶中多种核苷类和游离氨基酸类成分含量的方法，其特征在于，所述多种核苷类和游离氨基酸类成分，具体是L-天冬氨酸、鸟苷、腺苷、L-精氨酸、腺嘌呤、胞苷、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-羟脯氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸和L-赖氨酸。
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