CN116616113B - 杜鹃兰共生地栽育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括土地平整步骤；将树叶铺于土壤表面形成第一菌叶层的铺撒树叶步骤；将腐殖土铺在第一菌叶层表面形成第一腐殖土层的一次覆土步骤；将萌发菌、木材依次平铺于第一腐殖土层表面的菌床制备步骤；将杜鹃兰种子与萌发菌混合物均匀撒在菌床表面的种子播撒步骤；依次平铺第二腐殖土层和第二菌叶层的二次覆土步骤。菌床制备步骤中拟鬼伞属真菌栽培种的使用量500‑600g/m2。杜鹃兰种子与萌发菌混合物包括：一颗杜鹃兰蒴果、拟鬼伞属真菌栽培种500‑600g/m2、苦瓜粉8‑10g/m2及特丁基对苯二酚5‑8g/m2。本申请实现了杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌共生育苗，提高了杜鹃兰种子出芽率。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种杜鹃兰共生地栽育苗方法。
背景技术
杜鹃兰是兰科杜鹃兰属的多年生地生草本植物，假鳞茎卵球形或近球形，顶端渐突起，基部有须根痕，花期5-6月，果期9-12月。喜冷凉的环境，不耐暑热。生长期需保持基质湿润，并适当遮阴。山慈菇为杜鹃兰的干燥假鳞茎，其味甘、微辛，性凉，有小毒。可作药用。有清热解毒，化痰散结、消肿等功效，主要用于痈肿疔毒，瘰疬痰核，***结核，蛇虫咬伤等症，还应用于抗肿瘤药物中。
杜鹃兰虽然具有很高的药用价值和观赏价值，但是自然储量极少，同时市场高价诱惑促使杜鹃兰野生资源无序、过度采挖，导致野生杜鹃兰资源极度匮乏、濒危灭绝。
杜鹃兰作为兰科植物，种子多，但种胚发育不成熟，缺少胚乳，种皮双层，外种皮不易吸水，造成种子在自然条件下很难授粉、萌发率低。加之人类活动、采挖、自然生境被破坏等问题，野生资源严重枯竭。
目前，杜鹃兰的人工种植主要依靠现有的组织培养技术(组培技术)，需要经过种子萌发为原球茎，原球茎增殖后分化成具芽、叶片等器官的小苗，小苗再进行生根的途径进行育苗，该技术组织培养过程中需要准确控制种子萌发、出苗所需条件，其过程较为复杂，且该培育方法存在种子出苗率低的问题，难以形成种植规模，并且耗费大量杜鹃兰野生资源，加重杜鹃兰名贵珍稀中药材的供应短缺。
发明内容
本申请提供一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，用以解决背景技术中提到的上述问题。
本申请提供一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
选择山上背阴、排水良好的场地，将土壤表面除去杂物并铲平的土地平整步骤；将树叶均匀铺于土壤表面形成第一菌叶层的铺撒树叶步骤；将腐殖土铺在第一菌叶层表面形成第一腐殖土层的一次覆土步骤；将萌发菌平铺于第一腐殖土层表面形成萌发菌层，再将直径3-5cm的木材平铺于萌发菌层表面的菌床制备步骤；将杜鹃兰种子与萌发菌混合物均匀撒在菌床表面形成种子层的种子播撒步骤；在种子层表面依次平铺有第二腐殖土层和第二菌叶层的二次覆土步骤及田间管理步骤。
萌发菌为拟鬼伞属真菌栽培种，菌床制备步骤中用拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为500-600g/m2，杜鹃兰种子取自于杜鹃兰蒴果。
杜鹃兰种子与萌发菌混合物中包括：一颗杜鹃兰蒴果、拟鬼伞属真菌栽培种500-600g/m2、苦瓜粉8-10g/m2及特丁基对苯二酚5-8g/m2。
可选的，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中2-18h，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2；
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，得到吸水杜鹃兰种子，并将苦瓜粉及特丁基对苯二酚按照重量与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子；
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。
3.根据权利要求1的杜鹃兰共生地栽育苗方法，其特征在于，拟鬼伞属真菌栽培种的制备过程为：
将拟鬼伞属真菌原种无菌接种于栽培种培养基中，28℃下恒温培养，直至菌丝长满栽培种培养基，得到拟鬼伞属真菌栽培种。
可选的，栽培种培养基包括：锯末80-85重量份、麸皮14-16重量份、石膏1-2重量份、豆类粉1-2重量份、水溶性聚磷酸铵0.5-1.2重量份及四甲基哌啶醇0.3-1.0重量份。
可选的，豆类粉包括大豆、绿豆、黑豆等磨成的粉末，豆类粉的细度为40-60目。
可选的，第一菌叶层和第二菌叶层的厚度均为1-3cm。
可选的，第一腐殖土层和第二腐殖土层的厚度为1-4cm。
可选的，菌床制备步骤中，木材的使用量为8-15kg/m2。
可选的，杜鹃兰共生地栽育苗方法还包括田间管理步骤，田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为50-55％，播种15天后土壤湿度为50-60％；温度为20-28℃。
可选的，杜鹃兰蒴果选择野生或人工授粉获得的成熟但尚未开裂的杜鹃兰蒴果。
本申请提供的杜鹃兰共生地栽育苗方法，实现了杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌共生萌发育苗，相比于现有技术，具有如下有益效果：
(1)通过在播种时由上至下依次设置第一菌叶层、第一腐殖土层、萌发菌层、菌材层、由杜鹃兰种子与萌发菌混合物组成的种子层以及第二腐殖土层和第二菌叶层，菌叶层设置上下两层，能够提高萌发菌定殖于杜鹃兰种子中的量，提高萌发菌为杜鹃兰种子提供营养物质的效率，促进杜鹃兰种子的萌发和出芽。腐殖土不仅透气性好，有利用腐殖土有利于杜鹃兰种子在萌发、出芽过程中保持良好的空气流通，还能在后期为杜鹃兰种子出芽时提供营养物质，对种子萌发、出芽具有促进作用。
(2)杜鹃兰种子与萌发菌混合物中还添加有苦瓜粉和特丁基对苯二酚，苦瓜苷中的羧基能够与特丁基对苯二酚中的羟基反应，生成分子量更大的含有六元环的物质，这样能够进一步对杜鹃兰种子与萌发菌混合物起到支撑作用，在吸水的同时，能够保持很好的透气性，同时能够进一步加强萌发菌与杜鹃兰种子之间的共生关系，有助于萌发菌与杜鹃兰种子之间的营养物质的传递，进一步加快杜鹃兰种子的出芽率。
(3)通过在拟鬼伞属真菌栽培种的制备过程中的培养基中加入水溶性聚磷酸铵能够为菌丝生长提供氮、磷元素，四甲基哌啶醇不仅能够提高栽培种培养基的保水性，-NH键中氮原子具有电负性，活性较强，容易成键，进而与萌发菌代谢产物及培养基中其他活性物质反应，促进萌发菌对营养物质的吸收，使得菌丝活力旺盛，进而更容易定殖于杜鹃兰种子或根部，提高杜鹃兰的种子萌发率和发芽率。
(4)本申请在仿自然环境下对杜鹃兰种子进行育苗，相比于通过组培技术经过种子萌发、圆球茎增殖、分化、生根等步骤，操作较复杂，本申请使得杜鹃兰在开始萌发时就处于自然环境中直至出苗，这样培育的杜鹃兰苗不仅出苗率高，而且在萌发、出芽过程中吸取萌发菌、土壤中的营养物质，存在物质的积累，移栽后对环境的抵抗能力更强，更容易成活。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请一实施例提供的杜鹃兰共生地栽育苗方法的流程图；
图2为本申请一实施例提供的杜鹃兰种子出芽的示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，也属于本申请保护的范围。
如图1和图2所示，本申请提供一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：选择山上背阴、排水良好的场地，将土壤表面除去杂物并铲平的土地平整步骤；将树叶均匀铺于土壤表面形成第一菌叶层的菌叶铺撒步骤；将腐殖土铺在第一菌叶层表面形成第一腐殖土层的一次覆土步骤；将萌发菌平铺于第一腐殖土层表面形成萌发菌层，再将直径3-5cm的木材平铺于萌发菌层表面的菌床制备步骤；将杜鹃兰种子与萌发菌混合物均匀撒在菌床表面形成种子层的种子播撒步骤；在种子层表面依次平铺有第二腐殖土层和第二菌叶层的二次覆土步骤及田间管理步骤。
萌发菌为拟鬼伞属真菌栽培种，菌床制备步骤中用拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为500-600g/m2，杜鹃兰种子取自于杜鹃兰蒴果。
杜鹃兰种子与萌发菌混合物中包括：一颗杜鹃兰蒴果、拟鬼伞属真菌栽培种500-600g/m2、苦瓜粉8-10g/m2及特丁基对苯二酚5-8g/m2。
具体地，杜鹃兰野生资源稀缺，杜鹃兰种子呈细长纺锤形，无子叶和胚乳，胚内仅存在油脂粒作为储藏物质，种胚小且与种皮间存在空气腔，自然条件下难以萌发，将种子直接播种于土壤中、无共生菌条件下繁殖困难。若将杜鹃兰种子经过组织培养技术萌发出苗，操作过程复杂且出苗率低，因此本申请提供一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，将杜鹃兰种子与共生菌播种于土壤中，在仿野生环境下提高杜鹃兰种子的出苗率。
具体操作：
(1)土地平整步骤：由于杜鹃兰多生长于阴凉，避免阳光直射，潮湿且空气流通良好的环境中，因此，应选择山上背阴、排水良好的场地，避免阳光直射或暴晒导致温度升高会抑制杜鹃兰种子的萌发。同时将土壤表面除去杂物并铲平，这样有利于提高种植场地的排水性，防止雨水排出不畅聚集在种植场地，抑制种子萌发。
(2)菌叶铺撒步骤：在平整好的土壤表面均匀撒上一层树叶，形成第一菌叶层，如该树叶为栓皮栎树叶。第一菌叶层的设计不仅能够起到沥水的作用，防止杜鹃兰种子泡水，避免杜鹃兰种子过度潮湿，还能为共生菌提供营养物质，有利于共生菌的生长繁殖和新陈代谢，进而使得共生菌为杜鹃兰种子提供营养物质，提高杜鹃兰种子的萌发率和出芽率。
(3)一次覆土步骤：一次覆土采用腐殖土，腐殖土不仅透气性好，利用腐殖土有利于杜鹃兰种子在萌发、出芽过程中保持良好的空气流通，对种子萌发具有促进作用；同时腐殖土中含有多种微生物、虫子以及腐朽树枝树叶等物质，这些物质都能够在杜鹃兰出芽过程中提供多种营养物质，有利于杜鹃兰种子的出芽。
(4)菌床制备步骤：杜鹃兰在自然条件下种子播种时，需萌发菌的浸染才可萌发。在第一腐殖土层的表面均匀播撒萌发菌，再将直径3-5cm的木材平铺于萌发菌表面形成菌材层，使得萌发菌以第一菌叶层和木材为营养物质，进行生长繁殖，进而将菌丝定殖于杜鹃兰种子中，形成菌丝团，菌丝团在杜鹃兰种子内逐渐消解，为种子提供养分，以促进杜鹃兰种子的萌发、出苗。菌丝消解后新的菌丝继续入侵定殖，提供种子萌发出芽需要的营养，且共生菌侵染可提升种子活力。种子出芽是指长出第一个绿叶为出芽成功。
其中，所选用的木材大于5cm时，将木材沿轴向方向劈开进行摆放，两两木材之间尽量接触，还能够在木材之间放置树枝，保证萌发菌的营养物质的连续不断，有利于萌发菌菌丝的生长，进而促进杜鹃兰种子的萌发、出芽。
(5)种子播撒步骤：取一颗杜鹃兰蒴果中的种子，将杜鹃兰种子与萌发菌混合物均匀撒在菌床表面形成种子层，结合菌床制备步骤，在杜鹃兰种子播种时设置两层萌发菌(萌发菌层和种子层的萌发菌)，由下至上形成萌发菌-木材-杜鹃兰种子与萌发菌混合物，这样能够提高萌发菌定殖于杜鹃兰种子中的量，提高萌发菌为杜鹃兰种子提供营养物质的效率，促进杜鹃兰种子的萌发和出芽。将杜鹃兰种子与萌发菌混合播撒，提高了杜鹃兰种子与萌发菌的接触几率和接触面积，使得萌发菌更加容易地定殖于杜鹃兰种子内，进一步提高杜鹃兰种子的萌发和出芽。杜鹃兰种子取自于杜鹃兰蒴果。
其中，本申请萌发菌为拟鬼伞属真菌栽培种，菌床制备步骤中用拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为500-600g/m2，杜鹃兰种子与萌发菌混合物中拟鬼伞属真菌栽培种500-600g/m2，萌发菌的用量不仅要保证萌发菌生长代谢活力旺盛，还要保证萌发菌为杜鹃兰种子萌发、出芽持续提供丰富的营养物质。因此，萌发菌量过多会产生浪费甚至因萌发菌过量生长过于旺盛而消耗杜鹃兰种子，对杜鹃兰种子的萌发产生抑制作用，而用量过少会导致杜鹃兰种子营养不良，同样抑制种子萌发。
且杜鹃兰种子与萌发菌混合物中还包括：苦瓜粉8-10g/m2及特丁基对苯二酚5-8g/m2。苦瓜粉含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类、纤维素、胡萝卜素、维生素、苦瓜苷、钙、铁、磷等。一方面能为萌发菌的生长代谢提供能量，另一方面，苦瓜粉中含有苦瓜苷，是一种五嗪三萜烯，苦瓜苷中含有羧基、苯环、六元环和酚羟基，羧基和酚羟基能够与土壤中的水分子形成氢键，因此，同时苦瓜粉的加入使得杜鹃兰种子与萌发菌混合物具有一定的吸水性，同时，苯环、六元环中的大π键具有一定的具有支撑作用，而萌发菌在生长过程中会产生少量粘性物质，导致杜鹃兰种子与萌发菌混合物透气性下降，因此，苦瓜粉的加入还使得杜鹃兰种子与萌发菌混合物保持一定的透气性，有利于杜鹃兰种子的萌发、出芽。
同时还加入特丁基对苯二酚，特丁基对苯二酚具有抗氧化性，有利于避免杜鹃兰种子萌发过程中少量光照对萌发菌和杜鹃兰种子的氧化，进而有利于提高杜鹃兰种子出芽率。且，苦瓜粉和特丁基对苯二酚各自发挥作用的同时，苦瓜苷中的羧基能够与特丁基对苯二酚中的羟基反应，生成分子量更大的含有六元环的物质，这样能够进一步对杜鹃兰种子与萌发菌混合物起到支撑作用，在吸水的同时，能够保持很好的透气性，进一步加快杜鹃兰种子的出芽率。同时羧基和羟基均是活性较强的基团，便于与土壤、萌发菌、萌发菌代谢产物以及杜鹃兰种子中的活性物质结合，进一步加强萌发菌与杜鹃兰种子之间的共生关系，有助于萌发菌与杜鹃兰种子之间的营养物质的传递，后期也能够提高土壤与杜鹃兰种子之间的营养物质的传递，从而能够加快杜鹃兰种子的萌发和出芽。
(6)二次覆土步骤：在种子层表面依次平铺有第二腐殖土层和第二菌叶层，第二腐殖土层在为杜鹃兰提供营养物质的同时，提高杜鹃兰出芽过程中的透气性，同时第二菌叶层能够避免杜鹃兰种子出芽过程受到阳光直射，还能提供营养物质，进一步提高杜鹃兰种子出芽率。
同时本申请在仿自然环境下对杜鹃兰种子进行育苗，相比于通过组培技术经过种子萌发、圆球茎增殖、分化、生根等步骤，操作较复杂，本申请使得杜鹃兰在开始萌发时就处于自然环境中直至出苗，这样培育的杜鹃兰苗不仅出苗率高，而且在萌发、出芽过程中吸取萌发菌、土壤中的营养物质，存在物质的积累，移栽后对环境的抵抗能力更强，更容易成活。
本申请通过上述方案，实现了杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌共生萌发育苗，通过在播种时由上至下依次设置第一菌叶层、第一腐殖土层、萌发菌层、菌材层、由杜鹃兰种子与萌发菌混合物组成的种子层以及第二腐殖土层和第二菌叶层，菌叶层设置上下两层，能够提高萌发菌定殖于杜鹃兰种子中的量，提高萌发菌为杜鹃兰种子提供营养物质的效率，促进杜鹃兰种子的萌发和出芽。腐殖土不仅透气性好，有利用腐殖土有利于杜鹃兰种子在萌发、出芽过程中保持良好的空气流通，还能在后期为杜鹃兰种子出芽时提供营养物质，对种子萌发、出芽具有促进作用。同时，杜鹃兰种子与萌发菌混合物中还包括苦瓜粉和特丁基对苯二酚，苦瓜苷中的羧基能够与特丁基对苯二酚中的羟基反应，生成分子量更大的含有六元环的物质，这样能够进一步对杜鹃兰种子与萌发菌混合物起到支撑作用，在吸水的同时，能够保持很好的透气性，同时能够进一步加强萌发菌与杜鹃兰种子之间的共生关系，有助于萌发菌与杜鹃兰种子之间的营养物质的传递，进一步加快杜鹃兰种子的出芽率。
可选的，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中2-18h，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，得到吸水杜鹃兰种子，并将苦瓜粉及特丁基对苯二酚按照重量与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。
具体地，1)种子采集：用刀切除杜鹃兰蒴果的两端，划开侧面，用镊子夹取出杜鹃兰种子，将种子抖入至水中浸泡，杜鹃兰种皮透水透气性差，经过浸泡，使得种胚先膨大至突破种皮，便于播种后萌发菌的菌丝侵入后定殖，形成菌丝团，菌丝团在杜鹃兰种子内逐渐消解，为杜鹃兰种子提供养分和水，以便于促进杜鹃兰种子萌发。浸泡过程中，每隔0.5h搅拌一次，搅拌有助于种子表面的杂质及木质化的种皮脱落，便于胚的营养吸收。杜鹃兰种子出芽过程：种胚先膨大至突破种皮，后形成原球茎，原球茎的顶端分化叶芽，基部生根形成幼苗。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准。将苦瓜粉及特丁基对苯二酚按照重量与吸水杜鹃兰种子搅拌，使其均匀混合，便于苦瓜粉及特丁基对苯二酚与杜鹃兰种子均匀分散。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。先将杜鹃兰种子吸水、与苦瓜粉及特丁基对苯二酚混合，再与萌发菌混合，这样萌发菌只需经过一次搅拌混合，尽可能降低对菌丝的机械损伤。
可选的，拟鬼伞属真菌栽培种的制备过程为：
将拟鬼伞属真菌原种无菌接种于栽培种培养基中，28℃下恒温培养，直至菌丝长满栽培种培养基，得到拟鬼伞属真菌栽培种。
可选的，栽培种培养基包括：锯末80-85重量份、麸皮14-16重量份、石膏1-2重量份、豆类粉1-2重量份、水溶性聚磷酸铵0.5-1.2重量份及四甲基哌啶醇0.3-1.0重量份。
具体地，萌发菌生长时，菌丝生长旺盛有助于提高菌丝为杜鹃兰传递营养物质的效率，进而有利于杜鹃兰种子的萌发和出芽。而菌丝生长需要碳源、氮源及微量元素，锯末、麸皮、石膏和豆类粉为菌丝生长提供纤维素、木质素、戌聚糖、蛋白质、维生素、碳水化合物、树脂及矿物质，有利于萌发菌菌丝的生长。水溶性聚磷酸铵能够为菌丝生长提供氮、磷元素，四甲基哌啶醇能够提高栽培种培养基的保水性，-NH键中氮原子具有电负性，活性较强，容易成键，进而与萌发菌代谢产物及培养基中其他活性物质反应，促进萌发菌对营养物质的吸收，使得菌丝活力旺盛，进而更容易定殖于杜鹃兰种子或根部，提高杜鹃兰的种子萌发率和发芽率。四甲基哌啶醇用量过少对菌丝的生长作用较弱，若用量过多，不仅造成物料浪费，对菌丝的生长并没有进一步促进。
其中，将培养基置于栽培袋中，栽培袋选择15×32cm耐高温菌袋，接种后直至菌丝长满栽培袋，得到拟鬼伞属真菌栽培种。且将拟鬼伞属真菌原种接种前，将培养基放入栽培袋中，并将装有培养基的栽培袋进行灭菌。灭菌处理采用常压灭菌或高压灭菌：
高压灭菌温度为121-124℃，灭菌时间1.5-2.5h，压力为0.14-0.15MPa；
常压灭菌温度为100-110℃，灭菌时间10-12h。灭菌过程中将栽培袋中的有害菌消灭，有利于拟鬼伞属真菌原种的生长，进而有利于栽培种的生长。栽培袋的规格选择跟俊实际栽培场地决定，本申请中不做限制。可选的，豆类粉包括大豆、绿豆、黑豆等磨成的粉末，豆类粉的细度为40-60目。
具体地，豆类粉的细度为40-60目，有利于萌发菌菌丝对营养物质的吸收。
可选的，第一菌叶层和第二菌叶层的厚度均为1-3cm。
具体地，第一菌叶层若过厚，可能对土壤中的水分隔绝过度，保持第一菌叶层厚度为1-3cm，不仅能够对菌丝生长提供能量，还能够使得土壤中的水分穿过第一菌叶层被萌发菌吸收。第二菌叶层厚度为1-3cm，不仅起到遮阳作用，还能够使得空气穿过第二菌叶层在种子层流通，保证种子层的透气性，提高杜鹃兰种子的出芽率。
可选的，第一腐殖土层和第二腐殖土层的厚度为1-4cm。
具体地，第一腐殖土层和第二腐殖土层不仅透气性好，还能够为杜鹃兰种子出芽提供营养，若腐殖土层过厚，反而使得种子层透气性变差。
可选的，菌床制备步骤中，木材的使用量为8-15kg/m2。
可选的，杜鹃兰共生地栽育苗方法还包括田间管理步骤，田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为50-55％，播种15天后土壤湿度为50-60％；温度为20-28℃。
具体地，种子播种15天内土壤湿度为50-55％，这期间处于种子萌发的关键时期，需要保证种子的湿度，有利于胚对菌丝输送的营养物质的吸收。播种15天后土壤湿度为50-60％，较播种15天内湿度有所增加，这期间处于杜鹃兰种子萌发后期至出苗期，提高土壤湿度有利于加速营养物质的传输，提高种子出芽率。
更进一步地，在杜鹃兰栽种植场地上方2-3m处搭设遮阳棚，遮阳棚的遮光度≥80％，同时在遮阳棚顶部设置喷水装置，用以对杜鹃兰栽种植场地进行喷水，保持杜鹃兰种子萌发、出苗所需的湿度在合适范围内，对杜鹃兰的萌发出苗具有促进作用。其中，喷水装置的数量，根据实际操作时种植场地的面积进行设置，本申请中对此不做限制。
可选的，杜鹃兰蒴果选择野生或人工授粉获得的成熟但尚未开裂的杜鹃兰蒴果。
具体地，杜鹃兰开裂蒴果种子不易萌发，而未开裂蒴果种子容易萌发，因为开裂蒴果成熟度较高，种子种皮木质化程度也较高，存在内外双层种皮，这样限制了胚的营养吸收，因而降低了种子萌发率。因此选择大小均匀、尚未开裂的杜鹃兰蒴果。
下面以具体的实施例对本申请的技术方案进行详细举例说明。
实施例1
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
(1)土地平整步骤：应选择山上背阴、排水良好的场地，也可在杜鹃兰栽种植场地上方2-2.5m处搭设遮阳棚，避免阳光直射或暴晒，同时将土壤表面除去杂物并铲平。
(2)菌叶铺撒步骤：在平整好的土壤表面均匀撒上一层树叶，形成第一菌叶层，该树叶为栓皮栎树叶。第一菌叶层的厚度均为1-3cm。
(3)一次覆土步骤：将腐殖土铺在第一菌叶层表面形成第一腐殖土层，第一腐殖土层的厚度为1-4cm。
(4)菌床制备步骤：杜鹃兰在自然条件下种子播种时，需萌发菌的浸染才可萌发。在第一腐殖土层的表面均匀播撒萌发菌，再将直径3-5cm的木材平铺于萌发菌表面形成菌材层，本申请使用的萌发菌为小脆柄菇科的拟鬼伞属真菌，菌床制备步骤中用小脆柄菇科的拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为500g/m2。菌材摆放时，两两木材之间尽量接触，还能够在木材之间放置树枝。木材的使用量为10kg/m2。
其中，拟鬼伞属真菌栽培种的制备过程为：
将拟鬼伞属真菌原种无菌接种于15×32cm耐高温菌袋中，28℃下恒温培养，直至菌丝长满栽培种培养基，得到拟鬼伞属真菌栽培种。
栽培种培养基包括：锯末80重量份、麸皮14重量份、石膏1重量份、豆类粉1重量份、水溶性聚磷酸铵0.5重量份及四甲基哌啶醇0.3重量份。
(5)种子播撒步骤：取一颗野生或人工授粉获得的成熟但尚未开裂的杜鹃兰蒴果中的种子，将杜鹃兰种子与萌发菌混合物均匀撒在菌床表面形成种子层。本申请中一颗杜鹃兰蒴果中的种子播撒约1m2。
其中，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中2h，浸泡过程中，每隔0.5h搅拌一次，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将苦瓜粉8g/m2及特丁基对苯二酚5g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。拟鬼伞属真菌栽培种用量500g/m2。
(6)二次覆土步骤：在种子层表面依次平铺有第二腐殖土层和第二菌叶层，第二腐殖土层的厚度为1-4cm，第二菌叶层的厚度均为1-3cm。
(7)田间管理步骤：田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为50％，播种15天后土壤湿度为50％；温度为22℃。
实施例2
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
与实施例1不同之处在于：
(4)菌床制备步骤：菌床制备步骤中用小脆柄菇科的拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为520g/m2。
(5)种子播撒步骤：
其中，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中6h，浸泡过程中，每隔0.5h搅拌一次，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将苦瓜粉8.5g/m2及特丁基对苯二酚5.5g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。拟鬼伞属真菌栽培种用量520g/m2。
(7)田间管理步骤：田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为52％，播种15天后土壤湿度为55％；温度为22℃。
实施例3
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
与实施例1不同之处在于：
(4)菌床制备步骤：菌床制备步骤中用小脆柄菇科的拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为540g/m2。
(5)种子播撒步骤：
其中，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中10h，浸泡过程中，每隔0.5h搅拌一次，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将苦瓜粉9g/m2及特丁基对苯二酚6g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。拟鬼伞属真菌栽培种用量560g/m2。
(7)田间管理步骤：田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为55％，播种15天后土壤湿度为60％；温度为25℃。
实施例4
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
与实施例1不同之处在于：
(4)菌床制备步骤：菌床制备步骤中用小脆柄菇科的拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为580g/m2。
(5)种子播撒步骤：
其中，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中14h，浸泡过程中，每隔0.5h搅拌一次，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将苦瓜粉9.5g/m2及特丁基对苯二酚6.5g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。拟鬼伞属真菌栽培种用量580g/m2。
(7)田间管理步骤：田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为55％，播种15天后土壤湿度为60％；温度为26℃。
实施例5
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
与实施例1不同之处在于：
(4)菌床制备步骤：菌床制备步骤中用小脆柄菇科的拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为600g/m2。
(5)种子播撒步骤：
其中，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中18h，浸泡过程中，每隔0.5h搅拌一次，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将苦瓜粉10g/m2及特丁基对苯二酚8g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。拟鬼伞属真菌栽培种用量600g/m2。
(7)田间管理步骤：田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为55％，播种15天后土壤湿度为60％；温度为28℃。
实施例6
与实施例4不同之处在于：
栽培种培养基包括：锯末82重量份、麸皮15重量份、石膏1.5重量份、豆类粉1.5重量份、水溶性聚磷酸铵0.8重量份及四甲基哌啶醇0.6重量份。
实施例7
与实施例4不同之处在于：
栽培种培养基包括：锯末85重量份、麸皮16重量份、石膏2重量份、豆类粉2重量份、水溶性聚磷酸铵1.2重量份及四甲基哌啶醇1.0重量份。
对比例1
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
与实施例4不同之处在于：
(5)种子播撒步骤：
其中，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中18h，浸泡过程中，每隔0.5h搅拌一次，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将苦瓜粉7g/m2及特丁基对苯二酚4g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。拟鬼伞属真菌栽培种用量600g/m2。
对比例2
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
与实施例4不同之处在于：
(5)种子播撒步骤：
其中，杜鹃兰种子萌与发菌混合物制备过程包括：
1)种子采集：用刀将杜鹃兰蒴果划破，取出杜鹃兰种子，并将杜鹃兰种子浸泡于水中18h，浸泡过程中，每隔0.5h搅拌一次，得到泡水杜鹃兰种子，杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2。
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将苦瓜粉12g/m2及特丁基对苯二酚10g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
3)种子与萌发菌混合：将处理杜鹃兰种子与拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物。拟鬼伞属真菌栽培种用量600g/m2。
(7)田间管理步骤：田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为55％，播种15天后土壤湿度为60％；温度为28℃。
对比例3
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
与实施例4不同之处在于：
(5)种子播撒步骤：
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将特丁基对苯二酚10g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
对比例4
一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，包括如下步骤：
与实施例4不同之处在于：
(5)种子播撒步骤：
2)种子预处理：将泡水杜鹃兰种子沥干水，以放置于手中一分钟内无水滴滴落为准，得到吸水杜鹃兰种子。并将苦瓜粉12g/m2与吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子。
对比例5
与实施例4不同之处在于：
栽培种培养基包括：锯末85重量份、麸皮16重量份、石膏2重量份、豆类粉2重量份、水溶性聚磷酸铵0.3重量份及四甲基哌啶醇0.2重量份。
对比例6
与实施例4不同之处在于：
栽培种培养基包括：锯末85重量份、麸皮16重量份、石膏2重量份、豆类粉2重量份、水溶性聚磷酸铵1.5重量份及四甲基哌啶醇1.2重量份。
对比例7
与实施例4不同之处在于：
栽培种培养基包括：锯末85重量份、麸皮16重量份、石膏2重量份、豆类粉2重量份及四甲基哌啶醇0.2重量份。
对比例8
与实施例4不同之处在于：
栽培种培养基包括：锯末85重量份、麸皮16重量份、石膏2重量份、豆类粉2重量份及水溶性聚磷酸铵1.5重量份。
实验例
本实验例中一颗杜鹃兰蒴果中的种子播撒1m2，一颗杜鹃兰蒴果中含有种子800-2000个。
对使用上述实施例1至实施例7中的方案相对于对比例1至对比例8中的方案培育的杜鹃兰种子的出苗率进行对比，得到如表一所示结果。
表一
由表一可知，对比实施例1至实施例5与对比例3和对比例4，可以看出，杜鹃兰种子与萌发菌混合物中添加了苦瓜粉和特丁基对苯二酚后有利于杜鹃兰出苗率的提高。苦瓜粉一方面能为萌发菌的生长代谢提供能量，另一方面，苦瓜粉中的苦瓜苷中含有羧基、苯环、六元环和酚羟基，羧基和酚羟基能够与土壤中的水分子形成氢键，使得杜鹃兰种子与萌发菌混合物具有一定的吸水性，同时，苯环、六元环中的大π键具有一定的具有支撑作用，使得杜鹃兰种子与萌发菌混合物保持一定的透气性，有利于杜鹃兰种子的萌发、出芽。而特丁基对苯二酚能够与苦瓜苷中的羧基发生反应，生成分子量更大的含有六元环的物质，两者协同作用，进一步加快杜鹃兰种子的出芽率。同时羧基和羟基均是活性较强的基团，便于与土壤、萌发菌、萌发菌代谢产物以及杜鹃兰种子中的活性物质结合，进一步加强萌发菌与杜鹃兰种子之间的共生关系，从而能够加快杜鹃兰种子的萌发和出芽。
对比实施例1至实施例5与对比例1和对比例2，可以看出，苦瓜粉和特丁基对苯二酚的添加量应保持在适宜范围内，对促进杜鹃兰的出芽率具有积极作用，而减少用量则导致促进杜鹃兰的出芽率降低，但增加苦瓜粉和特丁基对苯二酚的添加量至大于适宜范围，反而降低了杜鹃兰的出芽率。
对比实施例6、实施例7与对比例5至对比例8，发现水溶性聚磷酸铵及四甲基哌啶醇的添加能够促进小脆柄菇科拟鬼伞属真菌栽培种的生长，这是由于水溶性聚磷酸铵能够为菌丝生长提供氮、磷元素，四甲基哌啶醇能够提高栽培种培养基的保水性，四甲基哌啶醇中的-NH键中氮原子具有电负性，活性较强，容易成键，进而与萌发菌代谢产物及培养基中其他活性物质反应，促进萌发菌对营养物质的吸收，使得菌丝活力旺盛，进而更容易定殖于杜鹃兰种子或根部，提高杜鹃兰的种子萌发率和发芽率。且水溶性聚磷酸铵及四甲基哌啶醇的添加量不宜过大或过小，会导致萌发菌的菌丝生长缓慢。
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (6)
1.一种杜鹃兰共生地栽育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：
选择山上背阴、排水良好的场地，将土壤表面除去杂物并铲平的土地平整步骤；将树叶均匀铺于所述土壤表面形成第一菌叶层的铺撒树叶步骤；将腐殖土铺在所述第一菌叶层表面形成第一腐殖土层的一次覆土步骤；将萌发菌平铺于所述第一腐殖土层表面形成萌发菌层，再将直径3-5cm的木材平铺于所述萌发菌层表面的菌床制备步骤；将杜鹃兰种子与萌发菌混合物均匀撒在所述菌床表面形成种子层的种子播撒步骤；在所述种子层表面依次平铺有第二腐殖土层和第二菌叶层的二次覆土步骤；
所述萌发菌为拟鬼伞属真菌栽培种，其制备过程为：将拟鬼伞属真菌原种无菌接种于栽培种培养基中，28℃下恒温培养，直至菌丝长满所述栽培种培养基，得到所述拟鬼伞属真菌栽培种；所述栽培种培养基包括：锯末80-85重量份、麸皮14-16重量份、石膏1-2重量份、豆类粉1-2重量份、水溶性聚磷酸铵0.5-1.2重量份及四甲基哌啶醇0.3-1.0重量份；
所述菌床制备步骤中所述拟鬼伞属真菌栽培种的使用量为500-600g/m2，所述杜鹃兰种子取自于杜鹃兰蒴果；
所述杜鹃兰种子与萌发菌混合物中包括：一颗所述杜鹃兰蒴果、所述拟鬼伞属真菌栽培种500-600g/m2、苦瓜粉8-10g/m2及特丁基对苯二酚5-8g/m2；
所述杜鹃兰种子与萌发菌混合物的制备过程包括：
1)种子采集：用刀将所述杜鹃兰蒴果划破，取出所述杜鹃兰种子，并将所述杜鹃兰种子浸泡于水中2-18h，得到泡水杜鹃兰种子，所述杜鹃兰种子与水的比例为1：1-2；
2)种子预处理：将所述泡水杜鹃兰种子沥干水，得到吸水杜鹃兰种子，并将所述苦瓜粉及所述特丁基对苯二酚按照重量与所述吸水杜鹃兰种子搅拌混合，得到处理杜鹃兰种子；
3)种子与萌发菌混合：将所述处理杜鹃兰种子与所述拟鬼伞属真菌栽培种搅拌混合，得到杜鹃兰种子与萌发菌混合物；
所述杜鹃兰共生地栽育苗方法还包括田间管理步骤，所述田间管理步骤中杜鹃兰地栽育苗条件是：种子播种15天内土壤湿度为50-55%，播种15天后土壤湿度为50-60%；温度为20-28℃。
2.根据权利要求1所述的杜鹃兰共生地栽育苗方法，其特征在于，所述豆类粉包括大豆、绿豆、黑豆等磨成的粉末，所述豆类粉的细度为40-60目。
3.根据权利要求1所述的杜鹃兰共生地栽育苗方法，其特征在于，所述第一菌叶层和第二菌叶层的厚度均为1-3cm。
4.根据权利要求1所述的杜鹃兰共生地栽育苗方法，其特征在于，所述第一腐殖土层和第二腐殖土层的厚度为1-4cm。
5.根据权利要求1所述的杜鹃兰共生地栽育苗方法，其特征在于，所述菌床制备步骤中，所述木材的使用量为8-15kg/m2。
6.根据权利要求1-5任一项所述的杜鹃兰共生地栽育苗方法，其特征在于，所述杜鹃兰蒴果选择野生或人工授粉获得的成熟但尚未开裂的杜鹃兰蒴果。
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