CN116606961A - 一种用于EB病毒核酸检测的crRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物技术领域，具体公开了一种用于EB病毒核酸检测的crRNA及其应用，本申请的检测方法不需要专业人员及特殊仪器，操作方便，反应时间短(<1小时)，更适于现场检测和社区筛查的快速诊断。相比较于单纯ERA等温扩增检测，ERA联合CRISPR/Cas12a检测更灵敏，而且试纸条的操作更简单，不需要电泳。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于EB病毒核酸检测的crRNA及其应用。
背景技术
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常见的恶性肿瘤之一，EB病毒(Epsteinbarr virus，EBV)的检测是鼻咽癌早期筛查、疾病进展、治疗疗效和预后监测的重要指标。目前临床主要有两种方法检测EB病毒，一是血清学方法检测EB病毒抗体；另一种是荧光定量PCR方法检测EBV DNA病毒核酸。相比病毒抗体，病毒核酸检测结果能更稳定地反映EB病毒的感染、复制及其含量情况，因而EBV DNA核酸检测已成为鼻咽癌筛查和诊断的重要手段。荧光定量PCR检测是临床EB病毒核酸检测的“金标准”，目前商业化试剂盒的检测敏感度在100-500copies/ml。
虽然荧光定量PCR是EB病毒核酸检测的金标准，灵敏度较高，可检测到100-500拷贝，但对于早期感染的患者，该方法的检测灵敏度不够，容易出现假阴性结果而造成漏检；其次，荧光定量PCR是依赖专业仪器和专门培训才能实施，适合于实验室检测，不适于现场检测和社区筛查的快速诊断的要求。因此，研发操作方便、灵敏度更高的EB病毒核酸检测方法是诊断EB病毒及类似病原体的迫切需要，具有重要的临床应用价值。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种新型的核酸等温扩增技术，在温度为37℃-42℃，10-20min内对核酸进行有效扩增，扩增效率可达数十亿倍。而酶重组扩增(ERA)技术是RPA的升级版本，与PCR相比，ERA与RPA温度要求较低，不需要特殊的仪器，反应时间较短，简便、高效、快速，特异性与敏感性高，是可以替代PCR的核酸检测技术。检测ERA扩增结果有许多检测方法，包括琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量检测、侧向流动试纸条等检测手段。琼脂糖凝胶电泳较复杂，需对扩增产物进行纯化后再行电泳检测，且易产生气溶胶，对环境造成污染。荧光法或试纸条法检测各加入特异性探针，而ERA探针设计复杂，价格昂贵，不适于推广。
CRISPR/Cas基因编辑技术来源于某些细菌和古细菌内的免疫防御***，经过人工改造可对DNA或者RNA进行编辑。主要由具有核酸酶功能的Cas蛋白和一段特异的引导核酸序列组成，目前主要开发了Cas9、Cas12、Cas13和Cas14等CRISPR/Cas***，其中Cas9、Cas12和Cas14是RNA引导的DNA核酸酶，而Cas13则是RNA编辑酶。除了准确的靶向切割目标核酸序列外，Cas12、Cas13和Cas14蛋白还存在“附带切割效应”。当Cas12、Cas13和Cas14蛋白在引导RNA引导下与靶DNA(Cas12靶向双链dsDNA；Cas14靶向单链ssDNA)或者RNA序列(Cas13靶向RNA)通过碱基互补配对特异性地形成双链后即可激活Cas蛋白的酶活性，Cas酶则可以以一种非特异性的方式切割单链靶DNA或者RNA分子，即“附带切割”，利用这一特性，将靶DNA或者RNA分子改造成信号分子后，Cas12、Cas13和Cas14蛋白可以应用于核酸的定量和定性检测，极大提高检测的敏感度。
目前还没有研究公开采用酶重组扩增(ERA)联合CRISPR/Cas12a以检测EB病毒核酸。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于酶重组扩增联合CRISPR/Cas12a的EB病毒核酸检测试剂盒及检测方法，本申请利用酶促重组等温扩增技术(ERA)结合CRISPR/Cas12a基因编辑技术(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats/Cas12a)使得EB病毒核酸检测操作简单，灵敏度更高，更适于现场检测和社区筛查的快速诊断。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一目的，本申请提供了一种用于EB病毒核酸检测的crRNA，所述crRNA包括LMP1-crRNA1、LMP1-crRNA2、LMP1-crRNA3、LMP2-crRNA1、LMP2-crRNA2和LMP2-crRNA3中的至少一种，所述LMP1-crRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO：4；所述LMP1-crRNA2的核苷酸序列为SEQID NO：5；所述LMP1-crRNA3的核苷酸序列为SEQ ID NO：6；所述LMP2-crRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO：7；所述LMP2-crRNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO：8；所述LMP2-crRNA3的核苷酸序列为SEQ ID NO：9。
本申请新设计出以上六条crRNA，该crRNA切割靶序列的效率高，可以特异性识别EBV，可以提高检测的灵敏度和准确度。
第二目的，本申请提供了检测上述crRNA的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～21所示。
本申请筛选出检测以上crRNA的引物组，可以提高检测crRNA的敏感性，使得检测病毒的灵敏度更高。
第三目的，本申请提供了上述crRNA在制备EB病毒核酸检测产品中的应用。
优选地，所述检测产品包括检测试纸条或检测试剂盒。
第四目的，本申请提供了一种基于酶重组扩增联合CRISPR/Cas12a的EB病毒核酸检测产品，所述检测试纸条包括上述引物组和CRISPR/Cas12a检测体系；
所述CRISPR/Cas12a检测体系包括Cas12a蛋白、上述crRNA、ssDNA报告***。
优选地，所述Cas12a蛋白为LbCas12a。所述LbCas12a的浓度为1μM；所述crRNA的浓度为5μM。
作为本申请所述基于酶重组扩增联合CRISPR/Cas12a的EB病毒核酸检测产品的优选实施方式，所述ssDNA报告***包括含有浓度为0.1～10μM的ssDNA探针。优选为所述ssDNA探针的浓度为5μM。
本申请对LbCas12a、crRNA、ssDNA探针的浓度进行优选，使得检测EB病毒核酸更为准确，检测敏感性高，特异性强。
第五目的，本申请提供了一种非疾病诊断和治疗目的的检测EB病毒核酸的方法，包括以下步骤：
(1)取待测样品，提取EB病毒基因组；
(2)ERA酶促重组等温扩增：以上述引物组，扩增步骤(1)中得到的EB病毒基因组；
(3)CRISPR/Cas12a检测：取步骤(2)中的扩增产物，加入ssDNA探针、Cas12a蛋白和上述crRNA，进行CRISPR/Cas12a检测，并读取检测信号(试纸条法/荧光法)。试纸条法适合现场检测和社区筛查快速诊断，荧光法适合实验室高通量检查。
作为本申请所述检测EB病毒核酸的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，以5min为梯度，在10min-20min范围内扩增，所述EB病毒基因组的浓度为106copies/μL。
作为本申请所述检测EB病毒核酸的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述扩增产物的浓度稀释为102～105copies/μL。
第六目的，本申请提供了上述EB病毒核酸检测产品在检测EB病毒核酸中的应用。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本申请提供了一种用于EB病毒核酸检测的crRNA及其应用，本申请基于酶重组扩增联合CRISPR/Cas12a检测EB病毒核酸，本申请的检测方法不需要专业人员及特殊仪器，操作方便，反应时间短(<1小时)，更适于现场检测和社区筛查的快速诊断。相比较于单纯ERA等温扩增检测，ERA联合CRISPR/Cas12a检测更灵敏，而且试纸条的操作更简单，不需要电泳。
附图说明
图1为不同引物组合对LMP1靶序列扩增效率的结果图；
图2为不同引物组合对LMP2靶序列扩增效率的结果图；
图3为优化ERA扩增的引物用量的试验结果图；
图4为优化激活剂用量的试验结果图；
图5为优化模板(LMP1靶序列、LMP2靶序列)用量的试验结果图；
图6为荧光ERA扩增检测的最低检测限结果图；
图7为实施例4的优化CRISPR/Cas12a检测的crRNA筛选结果图I；
图8为实施例4的优化CRISPR/Cas12a检测的crRNA筛选结果图II；
图9为实施例4的不同ERA扩增时间的结果图；
图10为实施例4的不同Cas12a用量的结果图；
图11为实施例4的不同种类Buffer的结果图；
图12为实施例4的不同体积F-Q探针的结果图；
图13为实施例4的不同Cas12a反应模板用量的结果图；
图14为实施例4的不同浓度F-B探针的结果图；
图15为实施例4的Cas12a试纸条法不同反应时间的结果图；
图16为ERA/CRISPR-Casl2a试纸条***检测的最低检测限(LOD)的结果图；
图17为ERA/CRISPR-Cas12a试纸条***检测EBV的特异性结果图；
图18为ERA/CRISPR-Cas12a试纸条***的临床应用的结果图；
图19为ERA/CRISPR-Cas12a荧光***的临床应用的结果图；
图20为ERA/CRISPR-Cas12a反应的检测流程图。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中涉及到的“克隆”为现有技术手段。
实施例1、设计crRNA
1、通过NCBI查询到EBV-LMP-2A基因序列(如SEQ ID NO：1)，筛选确定两段合适的靶DNA序列(LMP1靶序列、LMP2靶序列，保守序列，适于设计ERA引物，且有Cas12a的PAM位点)，将靶DNA序列(如SEQ ID NO：2-3)克隆到pUC57质粒载体(金斯瑞生物科技公司)，作为后续实验模板。
2、针对EBV-LMP-2A靶序列，利用CRISPR-DT软件设计6条crRNA，通过实验选择最佳crRNA。不同靶DNA序列设计的crRNA切割效率有所差异，本申请设计并通过PCR、体外转录合成了切割效率较佳的6条crRNA(如表1所示)。
表1
实施例2、设计ERA引物
利用荧光ERA法(如表2反应体系)筛选引物，可避免开盖电泳跑胶引起的污染。按照ERA试剂盒(购自江苏先达基因科技有限公司)说明书的实验步骤进行操作，先以2*104copies/μl的质粒为模板剔除不扩增或扩增效率不好的引物对，再以更低浓度质粒(2*103copies/μl)为模板筛选出扩增效率更好的引物对。
表2ERA荧光法反应体系
将上述反应体系的预混液转移至反应管中；在反应管盖上加入激活剂1μl，紧盖管盖，短暂离心几秒钟，激活剂进入预混合液中。短暂充分振荡混匀且再次快速离心；将反应管放入QPCR仪(37℃)中孵育30分钟，每1分钟采集一次荧光值。
引物序列如下：
1.针对LMP1靶序列设计引物及荧光探针：
探针PB1：GTGACGAAGCAGCAGACGGCGGATATGGGAA(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)CAGAATGAGGTGG(C3-SPACER)；
LMP1-F1:F3295 AAATGGAAAGGCAGTGCGGCAATCAGAAG(SEQ ID NO：10)；
LMP1-F2:F3315 AATCAGAAGGGGGAGTGCGTAGTGTTGTG(SEQ ID NO：11)；
LMP1-F3:F3332 CGTAGTGTTGTGGGAAGCGGCAGTGTAAT(SEQ ID NO：12)；
LMP1-F4:F3439 GGTGAGGCAAGGCTGTGGGGTAACCGTAG(SEQ ID NO：13)；
LMP1-R1:R3584 ACAGCCCACACCCTTTTCGCCTGAATCCG(SEQ ID NO：14)；
LMP1-R2:R3595 ATGACACTCGCACAGCCCACACCCTTTTC(SEQ ID NO：15)；
LMP1-R3:R3634 ATGCCCCAGCAAGCCGCAGCGACTTTCCG(SEQ ID NO：16)；
2.针对LMP2靶序列设计引物及荧光探针：
探针PB2：CAGTAAGGACAAGGAAAGAAGGCCAGAGGAA(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)GGAAAGATGAGCG(C3-SPACER)；
LMP2-F1:F840 GATGAGGAGCAGGCATAAAAGTCCAAACAG(SEQ ID NO：17)；
LMP2-F2:F862 CCAAACAGGACACAGAGTACCACCAGGAGT(SEQ ID NO：18)；
LMP2-F3:F871 ACACAGAGTACCACCAGGAGTAGTCTTAGT(SEQ ID NO：19)；
LMP2-R1:R1172 TAAGCACTTTAATCCCTCTCTCACACCCAG(SEQ ID NO：20)；
LMP2-R2:R1247 TGGATTCAGCCCAAGCCACACCTAACTCAT(SEQ ID NO：21)。
参考荧光图1-2，挑选出效率较高的引物组合，例如LMP1靶序列选择LMP1-F3和LMP1-R3，LMP2靶序列选择LMP2-F3+LMP2-R1、LMP2-F3+LMP2-R2。
实施例3、优化ERA酶促重组等温扩增的反应条件
1、对ERA扩增的引物用量，激活剂用量，模板(LMP1靶序列、LMP2靶序列)用量优化，并检测了最低检测限LOD。
1)在表2的反应体系中，其他条件不变的情况下，优化上下游引物对(各5μM)的用量(1.5μl，2.0μl，2.5μl)，例如选择LMP1-F3+LMP1-R3或LMP2-F3+LMP2-R1引物，进行荧光ERA扩增，参考图3。
2)在表2的反应体系中，其他条件不变的情况下，优化激活剂用量(1.0μl，1.25μl)，进行荧光ERA扩增，参考图4。
3)在表2的反应体系中，其他条件不变的情况下，优化模板用量(2.0μl，4.0μl)，进行荧光ERA扩增，参考图5。
4)按照上述优化后的反应条件，对10倍稀释的模板(200、20、2copies/μl)进行最低检测限的检测，荧光值信噪比(S/N)值大于等于2判定为阳性，参考图6。
表3优化后的ERA反应体系
实施例4、优化CRISPR/Cas12a检测的反应条件
Cas12a蛋白对目标DNA进行识别并切割，同时会激活其附带切割活性，切割非靶标DNA。因此，针对Cas12a蛋白对富含AT序列具有高亲和性，设计了用于荧光检测的F-Q探针(序列为5'-FAM-TTATTATT-BHQ-3')和用于试纸条F-B探针(序列为5'-FAM-TTATTATT-Biotin-3')，利用两种方法观察Cas12a切割效率。ssDNA探针由金斯瑞生物公司合成。
荧光检测法比较适合实验室的方法优化，所以利用荧光法进行Cas12a反应的条件优化。
使用CRISPR-DT软件，针对每段靶序列设计3条crRNA，通过重叠引物法合成crRNA(参考实施例1)。
1、crRNA筛选
以ERA产物(扩增时模板浓度是200cp/μl)为模板，加入Cas12a***反应，充分混合后，放入QPCR仪(37℃)中孵育30分钟，每1分钟采集一次荧光值。为了排除ERA体系对Cas12a反应体系的影响，设置空白对照(Cas12a反应的模板靶DNA用DEPC水代替)，及阴性对照(ERA扩增时的模板用水代替)，选择实验组荧光值高，阴性对照组荧光值低的crRNA。红色线是Cas12a实验的阴性对照，绿色线是ERA实验的阴性对照，灰色线是ERA实验组(模板是200cp/μl)，选择模板扩增好，对照组背景低的crRNA，综合比较LMP1片段选择LMP1-crRNA1，LMP2片段选择LMP2-crRNA1，参考图7-8。
筛选得到切割效率较好的crRNA后，对Cas12a反应中涉及到的ERA反应时间，Cas12a用量，Buffer种类，模板用量，F-Q及F-B探针用量进行优化。
表3Cas12a反应体系
注：F-Q或F-B探针是在金斯瑞生物公司合成的，序列是5'-FAM-TTATTATT-Biotin-3'。
2、在表3的反应体系中，其他条件不变的情况下，优化ERA扩增时间(15，20，25min)，的ERA产物的Cas12a反应的荧光值，选择最大荧光值(S/N)，ERA扩增时间选择20min。
25min产生的荧光值较20min低，是因为CRISPR-Cas12a***检测的靶标为ERA产物，该检测受到ERA扩增的影响。当ERA扩增时间延长，dNTPs被不断消耗，并与ERA7***中的Mg2+反应，形成不溶性焦磷酸镁溶液，溶液变得。扩增浑浊产物随后转移到Cas12a***，该***相应变浑浊，导致荧光值降低。参考图9。
3、在表3的反应体系中，其他条件不变的情况下，优化Cas12a用量(1、2、3μl)反应的荧光值，选择最大荧光值(S/N)，选择Cas12a用量为1μl，参考图10。
4、在表3的反应体系中，其他条件不变的情况下，比较不同种类Buffer(NEB2.1Buffer，NEB 3.1Buffer，NEB 4Buffer)反应的荧光值，选择最大荧光值(S/N)，Buffer选择NEB 2.1Buffer，参考图11。
5、在表3的反应体系中，其他条件不变的情况下，比较不同体积F-Q探针(1、1.5、2、2.5μl)反应的荧光值，选择最大荧光值(S/N)，F-Q探针选择体积为2μl，参考图12。F-Q探针越多，荧光值增加，但相应的噪声也增加，选择信噪比(S/N)最高的。
6、在表3的反应体系中，其他条件不变的情况下，比较加入不同体积模板量(2、4、6、8μl)反应的荧光值，选择最大荧光值(S/N),选择加入模板量8μl，参考图13。
7、F-B探针的优化：
探针两端为分子标记物FAM和生物素，两者相当于抗原，抗原的浓度不恰当会引起“钩状效应”，所以，需要优化探针浓度，将不同体积的探针用试纸条2稀释液稀释。F-B探针浓度稀释为不同的浓度梯度(10μM，5μM，2.5μM，1.25μM，0.625μM，0.1μM)，再将空试纸条放入稀释的探针稀释液中，静待几秒，观察条带，T线消失的最低探针浓度为最佳浓度。参考图14(F-B探针的浓度选择2.5μM)。
8、Cas12a试纸条法反应时间优化：
在上述反应体系其他条件相同的情况下，37℃水浴锅孵育不同时间(10，20，30，40min)，反应结束后，吸取5μl产物至试纸条样品吸收垫并***缓冲液种，比较T线的条带颜色，模板为2*104copies/μl的ERA产物，参考图15(Cas12a试纸条法反应时间选择30min)。
9、ERA-Cas12a最低检测限(LOD)：
按照上述优化后的反应条件，对10倍稀释的模板(105、104、103、102copies/μl)进行最低检测限的检测，参考图16(选择103copies/μl)。
实施例5、一种非疾病诊断和治疗目的的检测EB病毒核酸的方法
本实施例提供了一种非疾病诊断和治疗目的的检测EB病毒核酸的方法，包括以下步骤：
(1)按照实施例1的记载获得MP1靶序列、LMP2靶序列；
(2)以实施例2筛选得到的引物组，利用实施例3优化后的ERA酶促重组等温扩增条件进行反应，扩增步骤(1)中得到的EBV-LMP-2A靶序列，得到ERA扩增产物；
(3)CRISPR/Cas12a检测：取步骤(2)中的ERA扩增产物，将ERA扩增产物的浓度105copies/μL以10为梯度往下稀释，稀释为105、104、103、102copies/μL，使用ERA/CRISPR-Casl2a试纸条***(使用优化CRISPR/Cas12a检测的反应条件)进行检测，以无酶水为阴性对照，每个样本重复三遍，观察条带变化情况以确定CRISPR/Cas12a-ERA***浓度检测下限(LOD)，检测流程参考图20。ERA/CRISPR-Casl2a试纸条***检测的最低检测限(LOD)为103copies/μl。
对比例1
与实施例5相比，其采用检测EB病毒核酸不包括使用CRISPR/Cas12a，仅单纯使用ERA检测(参考实施例5的步骤(2))，其最低检测限(104copies/ul)(单纯ERA法不能检出临床样本)。
试验例
采用实施例5的检测方法对临床样本进行检测，以临床qPCR结果为标准，对ERA-CRISPR/Cas12a检测结果的特异性，敏感性进行评估。
1、特异性验证：
利用以上优化的检测方法(ERA/CRISPR-Cas12a反应体系)分别检测从临床收集的甲流病毒，乙肝病毒和EBV病毒的核酸样本，观察条带变化情况，以确定ERA/CRISPR-Cas12a试纸条***检测EBV是否特异，参考图17-18。
为了评价ERA/CRISPR-Cas12a荧光***的临床应用，本研究从临床收集了更多的EB病毒(14例，参考图19)、甲流病毒、甲肝病毒和乙肝病毒的核酸样本进行检测。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种用于EB病毒核酸检测的crRNA，其特征在于，所述crRNA包括LMP1-crRNA1、LMP1-crRNA2、LMP1-crRNA3、LMP2-crRNA1、LMP2-crRNA2和LMP2-crRNA3中的至少一种，所述LMP1-crRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO：4；所述LMP1-crRNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO：5；所述LMP1-crRNA3的核苷酸序列为SEQ ID NO：6；所述LMP2-crRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO：7；所述LMP2-crRNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO：8；所述LMP2-crRNA3的核苷酸序列为SEQID NO：9。
2.检测如权利要求1所述的crRNA的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：10～21所示。
3.如权利要求1所述的crRNA在制备EB病毒核酸检测产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测产品包括检测试纸条或检测试剂盒。
5.一种基于酶重组扩增联合CRISPR/Cas12a的EB病毒核酸检测产品，其特征在于，所述检测产品包括如权利要求2所述的引物组和CRISPR/Cas12a检测体系；
所述CRISPR/Cas12a检测体系包括Cas12a蛋白、如权利要求1所述的crRNA和ssDNA报告***。
6.如权利要求5所述的EB病毒核酸检测产品，其特征在于，所述ssDNA报告***包括含有浓度为0.1～10μM的ssDNA探针。
7.一种非疾病诊断和治疗目的的检测EB病毒核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取待测样品，提取EB病毒基因组；
(2)ERA酶促重组等温扩增：以权利要求2所述的引物组，扩增步骤(1)中得到的EB病毒基因组；
(3)CRISPR/Cas12a检测：取步骤(2)中的扩增产物，加入ssDNA探针、Cas12a蛋白和权利要求1所述的crRNA，进行CRISPR/Cas12a检测，并读取检测信号。
8.如权利要求7所述的检测EB病毒核酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，以5min为梯度，在10min-20min范围内扩增，所述EB病毒基因组的浓度为106copies/μL。
9.如权利要求7所述的检测EB病毒核酸的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述扩增产物的浓度稀释为102～105copies/μL。
10.如权利要求5或6所述的EB病毒核酸检测产品在检测EB病毒核酸中的应用。
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2023
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