CN116603056A - 裂解蛋白抗菌活性的血液组分强化及其方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及裂解蛋白抗菌活性的血液组分强化及其方法和用途。本发明提供了方法、测定、组合物、制剂和构建体，特别是裂解肽构建体，其涉及且基于血液组分，特别是血清白蛋白和溶菌酶的活性和用途，及其增强或协同抗菌裂解蛋白和肽的细菌杀死效应的活性和用途。

Description

裂解蛋白抗菌活性的血液组分强化及其方法和用途
本申请是国际申请日为2018年7月10日的国际申请PCT/US2018/041498进入中国、申请号为201880058639.1的题为“裂解蛋白抗菌活性的血液组分强化及其方法和用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明总体上涉及血液组分，特别是血清白蛋白和溶菌酶，及其增强或协同抗菌裂解蛋白和肽的细菌杀死效应的活性和用途。本发明进一步涉及基于血液组分和/或其肽或蛋白质的裂解肽构建体、制剂、测定和方法。
背景技术
革兰氏阳性菌被含有多肽和多糖的细胞壁包围。革兰氏阳性细胞壁表现为宽而致密的壁，其为20-80nm厚，且由众多互联的肽聚糖层组成。60％至90％的革兰氏阳性细胞壁为肽聚糖，提供细胞形状、刚性结构以及对渗透休克的抗性。细胞壁不排除革兰氏染色剂结晶紫，允许细胞被染为紫色，且因此是“革兰氏阳性的”。革兰氏阳性菌包括但不限于放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、乳球菌属(Lactococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和梭菌属(Clostridium)。医学上有关的物种包括化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。形成孢子的芽孢杆菌属物种引起炭疽和胃肠炎。形成孢子的梭菌属物种负责肉毒中毒、破伤风、气性坏疽和假膜性结肠炎。棒状杆菌属物种引起白喉且李斯特菌属物种引起脑膜炎。
抑制细胞壁合成的抗菌剂，例如青霉素类和头孢菌素类，干扰肽聚糖的肽间连接，并且削弱革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者的细胞壁。因为革兰氏阳性菌的肽聚糖是暴露的，所以革兰氏阳性菌更易受这些抗生素的影响。有利地，真核细胞缺乏细胞壁，并且不易受这些药物或其它细胞壁试剂的影响。
随着更多的抗生素被用于广泛多样的病和其它状况，药物抗性，特别是抗生素抗性细菌的发展是医学中的主要问题。新型的抗微生物疗法包括基于酶的抗生素(“抗生酶(enzybiotics)”)，例如噬菌体溶素。噬菌体使用这些溶素来消化其细菌宿主的细胞壁，通过低渗裂解释放病毒后代。溶素针对革兰氏阳性病原体的高致死活性使其成为用于作为治疗剂开发的有吸引力的候选物(Fischetti，V.A.(2008)Curr Opinion Microbiol 11：393-400；Nelson，D.L.等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98：4107-4112)。噬菌体溶素最初提议用于根除致病性链球菌的鼻咽携带(Loeffler，J.M.等人(2001)Science 294：2170-2172；Nelson，D.等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98：4107-4112))。
噬菌体裂解酶已确定为可用于通过各种施用途径评价和特异性治疗受试者中的各种类型的感染。例如，美国专利5,604,109(Fischetti等人)涉及通过半纯化的C组链球菌噬菌体相关的溶素酶的酶促消化，快速检测临床样本中的A组链球菌。这种酶工作成为另外研究的基础，导致了治疗疾病的方法。Fischetti和Loomis的专利(美国专利5,985,271、6,017,528和6,056,955)公开了由感染有C1噬菌体的C组链球菌细菌产生的溶素酶的用途。美国专利6,248,324(Fischetti和Loomis)公开了通过使用在适合于局部应用于皮肤组织的载体中的裂解酶，用于皮肤病学感染的组合物。美国专利6,254,866(Fischetti和Loomis)公开了用于治疗消化道的细菌感染的方法，其包括施用对于感染细菌特异性的裂解酶。美国专利6,264,945(Fischetti和Loomis)公开了通过肠胃外引入(肌内、皮下或静脉内)由细菌产生的至少一种裂解酶、以及用于将裂解酶递送到患者内的适当载体，用于治疗细菌感染的方法和组合物，所述细菌感染有对于该细菌特异性的噬菌体。
美国专利7,402,309和8,580,553、7,638,600和8,389,469分别提供了不同的噬菌体相关裂解酶PlyG、γ和W和PlyPH，可用作用于治疗或减少炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)感染的抗菌剂。美国专利7,569,223描述了用于肺炎链球菌的Pal裂解酶。美国专利7,582291中描述了可用于肠球菌(粪肠球菌和屎肠球菌(E.faecium)，包括万古霉素抗性菌株)的溶素，特别是PlyV12。美国专利8，105,585描述了在杀死B组链球菌中高度有效的突变型PlyGBS溶素。WO 2010/002959和美国专利8,840,900中详细描述了被称为ClyS的嵌合溶素，具有针对葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌的活性。从猪链球菌(Streptococcussuis)分离，并且有效杀死链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和李斯特菌属菌株的PlySs2溶素描述于WO2012/145630和美国专利9,034,322中。
PlySs2溶素(在本文中也被称为CF-301、CF301、PlySs2/CF-301、PlySs2(CF-301))是进入并完成FDA允许的I期临床试验的首个溶素。PlySs2溶素描述于美国专利9,034,322和PCT申请PCT/US2012/34456，以及Gilmer等人(Gilmer DB等人(2013)Amimicrob AgentsChemother Epub 2013April 9[PMID 23571534])中。PlySs2(CF-301)溶素可以与护理标准抗生素(包括但不限于万古霉素或达托霉素)组合使用，以治疗由甲氧西林敏感性和抗性金黄色葡萄球菌引起的血液感染，包括心内膜炎。
为支持临床试验，体外抗生素敏感性测试(AST)用于评估且标准化细菌试剂。液体培养基微量稀释(BMD)可以用于测试溶素，例如PlySs2(CF-301)针对金黄色葡萄球菌分离株的活性，然而，标准方法(CLSI方法)不是可靠的测定，并且当应用于裂解多肽例如PlySs2(CF-301)时，证实了各种问题。PlySs2(CF-301)在人血液、血清和血浆中比在人工培养基中更有效。溶素例如PlySs2(CF-301)在人血液、血清和血浆中增强的活性和功能性的理解可以提供新型、有用和改进的抗菌法、方法和治疗剂。
本文参考文献的引用不应被解释为承认这是本发明的现有技术。
发明内容
在一个一般方面，本发明涉及与人血液中的潜在抗微生物因子相互作用以加强溶菌作用的溶素(特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，包括PlySs2(CF-301)溶素)的另外和新型能力的鉴定和表征。本发明涉及与血液组分协同并提供其活化的溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，包括PlySs2(CF-301)溶素的独特特性，所述血液组分其自身不具有或具有有限的固有抗菌活性，特别是抗葡萄球菌活性，因此允许最大的杀菌活性。
本申请涉及血液组分蛋白，特别是血清白蛋白和溶菌酶，特别是人血清白蛋白和人溶菌酶，以及抗菌裂解肽，特别是溶素的活性增强效应。在一个方面，血清白蛋白选自人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白和马血清白蛋白。血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，增强或以其它方式促进溶素多肽的抗菌活性，所述溶素多肽特别是具有SH-3型结合结构域的溶素多肽，例如选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，特别是PlySs2(CF-301)溶素。在一个方面，溶菌酶是人溶菌酶。溶菌酶，特别是人溶菌酶，作用于增强或以其它方式促进溶素多肽，特别是PlySs2(CF-301)溶素的抗菌活性。在一个方面，溶素多肽，特别是PlySs2(CF-301)溶素多肽和人溶菌酶的组合，协同作用以杀死革兰氏阳性菌。
在本发明的一个方面，提供了溶素多肽和一种或多种血液组分蛋白的组合。在本发明的一个方面，提供了溶素多肽与选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分蛋白的组合。在一个方面，提供了具有SH3型结合结构域的溶素多肽与选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分蛋白的组合。在一个特定方面，提供了组合物或组合产品，其包含能够结合革兰氏阳性菌(包括葡萄球菌)的溶素多肽与选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分蛋白，所述溶素多肽具有SH3型结合结构域，并且选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素或其有效变体。在一个特定方面，提供了组合物或组合产品，其包含能够结合革兰氏阳性菌(包括葡萄球菌)的溶素多肽与选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分蛋白，所述溶素多肽具有SH3型结合结构域，并且选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素或其有效变体。
在本发明的一个方面，提供了溶素多肽和一种或多种血液组分蛋白的协同组合产品，其中在溶素多肽的不存在下，所述一种或多种血液组分不具有或具有有限的固有抗菌活性。在本发明的一个方面，溶素多肽和一种或多种血液组分蛋白的组合具有针对革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌的协同杀死活性。在本发明的一个方面，提供了溶素多肽与选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分蛋白的协同组合产品。在一个方面，提供了具有SH3型结合结构域的溶素多肽与选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分蛋白的协同组合产品。在一个特定方面，提供了组合物或协同组合产品，其包含能够结合革兰氏阳性菌(包括葡萄球菌)的溶素多肽与选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分蛋白，所述溶素多肽具有SH3型结合结构域，并且选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素或其有效变体。在一个方面，该组合物或组合产品进一步包括例如选自油酸和棕榈酸的一种或多种血清脂肪酸。
在本发明的一个方面，当与溶素多肽PlySs2(CF-301)组合时，溶菌酶，特别是人溶菌酶针对金黄色葡萄球菌有效。在本发明的一个方面，当在溶素多肽的存在下组合或以其它方式时，溶菌酶，特别是人溶菌酶致使针对金黄色葡萄球菌细菌有效。在一个方面，当在溶素多肽PlySs2(CF-301)的存在下组合或以其它方式时，金黄色葡萄球菌细菌对溶菌酶，特别是人溶菌酶敏感。
在本发明的一个方面，当在具有SH3型结合结构域的溶素多肽的存在下组合或以其它方式时，溶菌酶，特别是人溶菌酶致使针对金黄色葡萄球菌细菌有效。在本发明的一个方面，血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，增强或以其它方式促进具有SH3型结合结构域的溶素多肽的抗菌活性。
在本发明的一个特定方面，具有SH3型结合结构域的溶素多肽选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素或其能够结合革兰氏阳性菌包括葡萄球菌的有效变体。在本发明的一个特定方面，具有SH3型结合结构域的溶素多肽选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素、ALE-1溶素或其能够结合革兰氏阳性菌包括葡萄球菌的有效变体。
本申请涉及利用血液组分用于确定肽，特别是抗菌有效肽，特别是裂解肽的最低抑菌浓度且评价抗菌杀死有效性的修改方法和测定。本申请提供了用于确定肽，特别是抗菌有效肽，特别是裂解肽的最低抑菌浓度且评价抗菌杀死有效性的方法和测定，其中添加血清白蛋白和/或溶菌酶，以便准确地确定和/或预测抗菌有效肽，特别是裂解肽包括PlySs2(CF-301)在动物或体内，特别是在人中的抗菌杀死有效性和/或最低抑菌浓度。在一个方面，添加人溶菌酶。在一个方面，添加人血清白蛋白。在一个方面，添加来自人、兔、犬或马的血清白蛋白或者在序列中与之对应的血清白蛋白。在一个方面，添加血清白蛋白和溶菌酶两者。
本发明涉及用于确定MIC或者评估或定量抗菌肽，特别是裂解肽的抗菌活性和/或有效性的***或测定，其中利用补充有血清白蛋白的测定溶液、液体培养基或培养基进行测定。本发明涉及用于确定MIC或者评估或定量抗菌肽，特别是裂解肽的抗菌活性和/或有效性的***或测定，其中利用补充有溶菌酶的测定溶液、液体培养基或培养基进行测定。本发明涉及用于确定MIC或者评估或定量抗菌肽，特别是裂解肽的抗菌活性和/或有效性的***或测定，其中利用补充有血清白蛋白和溶菌酶的测定溶液、液体培养基或培养基进行测定。在本发明的一个方面，提供了用于确定抗菌肽的细菌杀死有效性的测定，其准确地反映抗菌肽，例如裂解肽或溶素在哺乳动物或患者，特别是人中的细菌杀死有效性。
在一个方面，溶菌酶是人溶菌酶。在一个方面，血清白蛋白是人、兔、犬、马、大鼠或小牛(母牛/牛)血清白蛋白，或者在氨基酸序列中对应于人、兔、犬、马、大鼠或小牛(母牛/牛)血清白蛋白。在一个方面，血清白蛋白是人、兔、犬或马血清白蛋白，或者在氨基酸序列中对应于人、兔、犬或马血清白蛋白。在一个方面，血清白蛋白与天然人、兔、犬或马血清白蛋白同源，并且在氨基酸序列中与天然人、兔、犬或马血清白蛋白相差一个或多个氨基酸序列。在本发明中使用的血清白蛋白或溶菌酶可以是纯化的或重组的。血清白蛋白或溶菌酶可以是全长蛋白质或肽或其片段，其中所述肽或其片段显示出全长蛋白质关于溶素多肽活性增强效应和/或关于溶素多肽结合能力的活性。血清白蛋白或溶菌酶可以是全长蛋白或肽或其片段，其中所述肽或其片段显示出与全长蛋白相比，关于溶素多肽活性增强效应和/或关于溶素多肽结合能力增加的活性。在一个方面，血清白蛋白或其肽或片段的氨基酸序列不同于天然序列。在一个方面，血清白蛋白或其肽或片段的氨基酸序列不同于天然序列，并且具有更大的增强活性或改善的溶素多肽结合活性。
根据本发明，提供了用于确定抗菌肽例如裂解多肽或溶素的细菌杀死活性的方法，其中所述杀死活性准确地模拟了所述抗菌肽在人中的细菌杀死，所述方法包括在补充有血清白蛋白的液体培养基、测定培养基或溶液中评估抗菌肽或者有效肽或其片段，所述血清白蛋白从人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白分离或者与其相对应。在本发明的一个方面，裂解多肽或溶素针对溶液、培养基或液体培养基中的敏感细菌进行评估，所述溶液、培养基或液体培养基补充有人血清白蛋白、马血清白蛋白、犬血清白蛋白或兔血清白蛋白。在一个方面，还原剂被另外加入液体培养基、测定培养基或溶液中。在一个方面，还原剂是DL-二硫苏糖醇(DTT)。在一个方面，还原剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。在一个方面，溶液、培养基或液体培养基补充有0.5mM DL-二硫苏糖醇(DTT)。
根据本发明，提供了修改的和改进的液体培养基微量稀释(BMD)方法和测定，用于测试肽，特别是抗菌有效肽，特别是裂解肽或溶素肽。在本发明的一个方面，提供了利用液体培养基或培养基用于评估的修改的BMD，其中所述液体培养基或培养基补充有血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、马血清白蛋白、犬血清白蛋白或兔血清白蛋白。在本发明的一个方面，提供了利用液体培养基或培养基用于评估的修改的BMD，其中所述液体培养基或培养基补充有溶菌酶，特别是人溶菌酶。在本发明的一个方面，提供了利用液体培养基或培养基用于评估的修改的BMD，其中所述液体培养基或培养基补充有血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、马血清白蛋白、犬血清白蛋白或兔血清白蛋白，以及溶菌酶，特别是人溶菌酶。
可以通过与人血清的比较来确定用于补充的血清白蛋白的量。在一个方面，补充的血清白蛋白的量与人血液或血清样品中通常存在的量可比较。
可以通过与人样品中存在的溶菌酶的通常量的比较来确定用于补充的溶菌酶的量。在一个方面，补充的溶菌酶的量与人血液或血清样品中通常存在的量可比较。
在一个方面，还原剂的量为0.1mM至10mM。在一个方面，还原剂的量为0.1mM至5mM。在一个方面，还原剂的量为0.1mM至2mM。在一个方面，还原剂的量为0.1mM至1mM。在一个方面，还原剂的量为0.1mM至0.9mM。在一个方面，还原剂的量为0.1mM至0.6mM。在一个方面，还原剂的量为0.2mM至0.6mM。在一个方面，还原剂的量为0.3mM至0.6mM。在一个方面，还原剂的量为0.4mM至0.6mM。在一个方面，还原剂的量为约0.5mM。在一个方面，还原剂的量为0.25mM至1mM。在一个方面，还原剂的量小于1mM。
在一个实施方案中，本发明的测定和方法用于裂解多肽的评价和分析中。在本发明的一个方面，具有补充剂的BMD方法用于确定针对链球菌属细菌活性的裂解多肽的细菌杀死有效性。在本发明的一个方面，具有补充剂的BMD方法用于确定针对链球菌属和葡萄球菌属细菌活性的裂解多肽的细菌杀死有效性。在本发明的一个方面，具有补充剂的BMD方法用于针对链球菌属细菌活性的裂解多肽的MIC测试中。在本发明的一个方面，具有补充剂的BMD方法用于针对葡萄球菌属细菌活性的裂解多肽的MIC测试中。在本发明的一个方面，具有补充剂的BMD方法用于针对链球菌属和葡萄球菌属细菌活性的裂解多肽的MIC测试中。在本发明的一个方面，具有补充剂的BMD方法用于针对肠球菌属细菌活性的裂解多肽的MIC测试中。在本发明的一个方面，具有补充剂的BMD方法用于针对革兰氏阳性菌的裂解多肽的MIC测试中。在本发明的一个方面，具有补充剂的BMD方法用于针对革兰氏阳性菌的多于一个物种的裂解多肽的MIC测试中。革兰氏阳性菌可以选自链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和李斯特菌属细菌。革兰氏阳性菌可以是抗生素抗性细菌或抗生素敏感性细菌。
根据本发明，提供了新型的或修饰的制剂，例如有效的抗菌组合物，其包含溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，以及一种或多种血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、小牛(母牛/牛)血清白蛋白或者有效或结合肽或其片段，和/或溶菌酶，特别是人溶菌酶或者有效肽或其片段。根据本发明的一个方面，提供了新型的或修饰的制剂，例如有效的抗菌组合物，其包含溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，以及一种或多种血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白或者有效或结合肽或其片段，和/或溶菌酶，特别是人溶菌酶或者有效肽或其片段。在一个方面，提供了有效的抗菌组合物，其包含溶素多肽，特别是选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素、ALE-1溶素或者其能够结合和/或杀死革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌属或链球菌属、或肠球菌属细菌的有效变体的溶素多肽，以及一种或多种血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白或小牛(母牛/牛)血清白蛋白或者有效或结合肽或其片段，或溶菌酶，特别是人溶菌酶或者有效肽或其片段。在另一个方面，提供了有效的抗菌组合物，其包含溶素多肽，特别是选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素、ALE-1溶素或者其能够结合和/或杀死革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌属或链球菌属、或肠球菌属细菌的有效变体的溶素多肽，以及一种或多种血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白或者有效或结合肽或其片段，或溶菌酶，特别是人溶菌酶或者有效肽或其片段。在一个方面，提供了抗菌组合物，其包含PlySs2(CF-301)溶素或其有效结合和/或杀死葡萄球菌属和链球菌属细菌的变体，以及血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白。在一个方面，提供了抗菌组合物，其包含PlySs2(CF-301)溶素或其有效结合和/或杀死葡萄球菌属和链球菌属细菌的变体，以及溶菌酶，特别是人溶菌酶。在一个方面，该制剂是局部或可吸入制剂。在一个方面，组合物关于针对皮肤感染或者肺感染或口腔感染的有效性进行配制。
在一个方面，提供了用于治疗革兰氏阳性菌皮肤感染，特别是葡萄球菌属或链球菌属细菌皮肤感染的组合物的局部制剂，其包含溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，以及一种或多种血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白或小牛(母牛/牛)血清白蛋白或者有效或结合肽或其片段。在另一个方面，提供了用于治疗革兰氏阳性菌皮肤感染，特别是葡萄球菌属或链球菌属细菌皮肤感染的组合物的局部制剂，其包含溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，以及一种或多种血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白或者有效或结合肽或其片段。在一个方面，提供了用于治疗革兰氏阳性菌皮肤感染，特别是葡萄球菌属或链球菌属细菌皮肤感染的组合物的局部制剂，其包含溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，以及溶菌酶，特别是人溶菌酶或者有效肽或其片段。在一个方面，提供了用于治疗革兰氏阳性菌皮肤感染，特别是葡萄球菌属或链球菌属细菌皮肤感染的组合物的可吸入或经口施用的制剂，其包含溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，以及一种或多种血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白或小牛(母牛/牛)血清白蛋白或者有效或结合肽或其片段。在另一个方面，提供了用于治疗革兰氏阳性菌皮肤感染，特别是葡萄球菌属或链球菌属细菌皮肤感染的组合物的可吸入或经口施用的制剂，其包含溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，以及一种或多种血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白或者有效或结合肽或其片段。在一个方面，提供了用于治疗革兰氏阳性菌皮肤感染，特别是葡萄球菌属或链球菌属细菌皮肤感染的组合物的可吸入或经口施用的制剂，其包含溶素多肽，特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，以及溶菌酶，特别是人溶菌酶或者有效肽或其片段。在一个特定方面，该局部或可吸入制剂用于治疗金黄色葡萄球菌感染。在一个特定方面，该局部或可吸入制剂用于治疗抗生素抗性金黄色葡萄球菌感染。在一个方面，具有SH3型结合结构域的溶素多肽选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。在一个方面，具有SH3型结合结构域的溶素多肽是PlySs2溶素或其有效变体。
可以通过与人血清的比较来确定制剂或组合物中的血清白蛋白的量。在一个方面，血清白蛋白的量与人血液或血清样品中通常存在的量可比较。
可以通过与人样品中存在的溶菌酶的通常量的比较来确定制剂或组合物中的溶菌酶的量。在一个方面，溶菌酶的量与人血液或血清样品中通常存在的量可比较。
本发明的进一步方面涉及嵌合、二聚或融合肽或溶素，其包含与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白可操作地连接或融合，或者与溶菌酶，特别是人溶菌酶可操作地连接或融合的SH3结合结构域。在一个方面，嵌合、二聚或融合肽或溶素包含与血清白蛋白或溶菌酶，特别是人血清白蛋白或人溶菌酶或者活性或结合片段或肽可操作地连接或融合的至少一个催化结构域和SH3结合结构域。在一个方面，包含与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白或小牛(母牛/牛)血清白蛋白(包括其细菌结合片段或肽)可操作地连接或融合的SH3结合结构域的嵌合、二聚或融合肽，可以用于递送有效针对革兰氏阳性菌(包括葡萄球菌属或链球菌属细菌)的治疗试剂、药物或其它有效负载。在另一个方面，包含与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白(包括其细菌结合片段或肽)可操作地连接或融合的SH3结合结构域的嵌合、二聚或融合肽，可以用于递送有效针对革兰氏阳性菌(包括葡萄球菌属或链球菌属细菌)的治疗试剂、药物或其它有效负载。在一个方面，治疗试剂、药物或其它有效负载可以是溶菌酶或其它抗菌肽包括嵌合或二聚溶素中的一种或多种。治疗试剂、药物或其它有效负载可以与SH3结合结构域共价结合、融合或可操作地连接。治疗试剂、药物或其它有效负载可能能够结合血清白蛋白，并且由于血清白蛋白的结合或亲和力而成为一个方面或有效负载。
在一个方面，本发明提供了与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白或小牛(母牛/牛)血清白蛋白的肽或细菌结合和溶素结合片段可操作地连接或融合的修饰的溶素多肽。在另一个方面，本发明提供了与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白的肽或细菌结合和溶素结合片段可操作地连接或融合的修饰的溶素多肽。在一个方面，溶素PlySs2或其有效变体与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、小牛(母牛/牛)血清白蛋白、或者血清白蛋白的肽或片段融合或共价附着，其中所述肽或片段能够结合细菌细胞，包括葡萄球菌属或链球菌属细菌。在一个方面，溶素PlySs2或其有效变体与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白、或者血清白蛋白的肽或片段融合或共价附着，其中所述肽或片段能够结合细菌细胞，包括葡萄球菌属或链球菌属细菌。在一个方面，溶素多肽是具有SH3型结合结构域的溶素多肽，其选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。在一个方面，溶素多肽是PlySs2(CF-301)。
在一个方面，本发明提供了与溶菌酶，特别是人溶菌酶的肽或细菌结合和溶素结合片段可操作地连接或融合的修饰的溶素多肽。在一个方面，选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、Phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素的溶素多肽或其有效杀死变体，与溶菌酶，特别是人溶菌酶，或能够切割革兰氏阳性菌肽聚糖的溶菌酶片段融合或共价附着。在一个方面，溶素PlySs2(CF-301)或者其能够杀死葡萄球菌属和链球菌属细菌的有效变体，与溶菌酶，特别是人溶菌酶，或能够切割革兰氏阳性菌肽聚糖的溶菌酶片段融合或共价附着。
根据本发明，提供了用于杀死革兰氏阳性菌的方法，其包括以下步骤：使细菌与组合物接触，所述组合物包含一定量的有效杀死革兰氏阳性菌的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，进一步使细菌与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，和/或溶菌酶，特别是人溶菌酶接触。在一个方面，提供了用于减少革兰氏阳性菌群体的方法，其包括以下步骤：使细菌与组合物接触，所述组合物包含一定量的有效杀死革兰氏阳性菌的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，进一步使细菌与血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，和/或溶菌酶，特别是人溶菌酶接触。在一个方面，提供了用于治疗人中的抗生素抗性金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括以下步骤：使细菌与组合物接触或向人施用组合物，所述组合物包含一定量的有效杀死革兰氏阳性菌的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，进一步使细菌与以下接触或向人施用以下：血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，和/或溶菌酶，特别是人溶菌酶。根据该方法，血清白蛋白和溶素多肽可以连续或伴随施用，或者可以在包含溶素多肽和血清白蛋白的组合物中施用。根据该方法，溶菌酶和溶素多肽可以连续或伴随施用，或者可以在包含溶素多肽和溶菌酶的组合物中施用。在本文方法的一个方面，进一步接触或施用一种或多种血清脂肪酸，特别是选自油酸和棕榈酸中的一种或多种。
根据本发明，提供了用于协同杀死革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌属和/或链球菌属细菌的方法，其包括使细菌与组合物接触，所述组合物包含有效杀死革兰氏阳性菌的量的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，其中所述组合物进一步包含选自血清白蛋白和溶菌酶，特别是选自人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白和小牛(母牛/牛)血清白蛋白和人溶菌酶的一种或多种血液组分。在一个方面，提供了用于协同杀死革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌属和/或链球菌属细菌的方法，其包括使细菌与组合物接触，所述组合物包含有效杀死革兰氏阳性菌的量的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，其中所述组合物进一步包含选自血清白蛋白和溶菌酶，特别是选自人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白和人溶菌酶的一种或多种血液组分。在根据本发明的一个方面，提供了用于协同杀死革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌属和/或链球菌属细菌的方法，其包括使细菌与组合物接触，所述组合物包含有效杀死革兰氏阳性菌的量的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，其中所述组合物进一步包含选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分，特别是人血清白蛋白和人溶菌酶。在本发明的一个方面，提供了用于协同杀死金黄色葡萄球菌细菌的方法，其包括以下步骤：使细菌与组合物接触，所述组合物包含有效杀死革兰氏阳性菌的量的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，其中所述组合物进一步包含选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分，特别是人血清白蛋白和人溶菌酶。
根据本发明，提供了用于杀死革兰氏阳性菌的方法，其包括以下步骤：使细菌与组合物接触，所述组合物包含有效杀死革兰氏阳性菌的量的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，其中所述组合物进一步包含血清白蛋白，并且其后进一步使细菌与溶菌酶，特别是人溶菌酶接触。在本发明的一个方面，提供了用于杀死对溶菌酶抗性或不敏感的金黄色葡萄球菌细菌的方法，其包括以下步骤：使细菌与组合物接触，所述组合物包含有效杀死革兰氏阳性菌的量的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，其中所述组合物进一步包含血清白蛋白，并且其后进一步使细菌与溶菌酶，特别是人溶菌酶接触。
在本发明的一个方面，提供了用于杀死对溶菌酶抗性或不敏感的金黄色葡萄球菌细菌的方法，其包括以下步骤：使细菌与组合物接触，所述组合物包含有效杀死革兰氏阳性菌的量的具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽，并且其后进一步使细菌与溶菌酶，特别是人溶菌酶接触。在其一个方面，另外施用血清白蛋白，特别是人血清白蛋白。在一个方面，首先评价或评估血清白蛋白的水平和/或天然血清白蛋白与金黄色葡萄球菌细菌的结合。如果血清白蛋白与细菌结合，则溶菌酶在溶素多肽施用后接触，或在组合中施用，包括借助于包含溶素和溶菌酶的组合或组合物。如果血清白蛋白未与细菌结合或未充分结合，则首先施用血清白蛋白，随后为溶素多肽施用，然后是溶菌酶施用，或可替代地溶菌酶在组合中施用，包括借助于包含溶素和溶菌酶的组合或组合物，在首先施用血清白蛋白后。在另一个方面，血清白蛋白与溶素多肽伴随地、序贯地或组合施用，随后为溶菌酶施用。
在该方法的一个方面，血清白蛋白可以是人、兔、犬、马、大鼠或小牛(母牛/牛)血清白蛋白。在该方法的一个方面，血清白蛋白可以是人、兔、犬或马血清白蛋白。在该方法的一个方面，血清白蛋白是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白、马血清白蛋白、大鼠血清白蛋白或小牛(母牛/牛)血清白蛋白，或其肽的活性或细菌结合片段，特别是血清白蛋白的金黄色葡萄球菌结合片段或肽。在该方法的一个方面，血清白蛋白是人血清白蛋白、兔血清白蛋白、犬血清白蛋白或马血清白蛋白，或其肽的活性或细菌结合片段，特别是血清白蛋白的金黄色葡萄球菌结合片段或肽。在该方法的一个方面，血清白蛋白是人血清白蛋白或其肽的活性或细菌结合片段，特别是血清白蛋白，特别是人血清白蛋白的金黄色葡萄球菌结合片段或肽。在该方法的一个方面，溶菌酶是人溶菌酶或其活性或裂解片段或肽。在一个方面，溶素多肽包含SH3型结合结构域。在一个方面，裂解多肽是包含能够结合革兰氏阳性菌的SH3型结合结构域的嵌合或融合肽。在一个方面，具有SH3型结合结构域的溶素多肽选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。在一个方面，溶素多肽是PlySs2(CF-301)。在一个方面，裂解多肽是PlySs2(CF-301)的嵌合或融合肽，其包含能够结合革兰氏阳性菌，特别是葡萄球菌属细菌的PlySs2(CF-301)SH3型结合结构域。
在一个方面，本发明的组分、方法或测定关于针对革兰氏阳性菌的裂解多肽利用，所述裂解多肽特别是包含SH3型结合结构域的溶素，例如并包括PlySs2(CF-301)多肽或其变体或衍生物。在一个方面，本发明的组分、方法或测定关于针对抗生素抗性细菌的裂解多肽利用，所述裂解多肽包括PlySs2(CF-301)多肽或其变体或衍生物。在一个方面，本发明的组分、方法或测定关于针对链球菌属和葡萄球菌属细菌的裂解多肽利用，所述裂解多肽包括PlySs2(CF-301)多肽或其变体或衍生物。在一个方面，本发明的组分、方法或测定关于针对抗生素抗性的链球菌属和/或葡萄球菌属细菌的裂解多肽利用，所述裂解多肽包括PlySs2(CF-301)多肽或其变体或衍生物。在一个方面，具有SH3型结合结构域的溶素多肽选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。在一个方面，裂解多肽是PlySs2(CF-301)或其衍生物或变体。在一个方面，该多肽包含本文提供的序列。
已发现，当与包含添加的血清白蛋白和/或溶菌酶的测定组合或在包含添加的血清白蛋白和/或溶菌酶的测定中组合时，裂解多肽，特别是具有SH3结合结构域的裂解多肽，特别是裂解多肽PlySs2(CF-301)、Sal、溶葡萄球菌素是明显更多活性的。与在不添加血清白蛋白的液体培养基例如阳离子调节的液体培养基中相比，在人血清白蛋白(以及其它物种特别是马、犬和兔的血清白蛋白或者与之相对应)的存在下，和/或在溶菌酶特别是人溶菌酶的存在下，抗菌裂解多肽，特别是示例性裂解多肽PlySs2(CF-301)、Sal、溶葡萄球菌素是更多活性的(特别是高达32倍至64倍至100倍更多的活性)。
在本发明的一个方面，在本发明的方法、测定、组合物、制剂和/或构建物中，利用衍生自链球菌属或葡萄球菌属细菌和/或针对链球菌属和/或葡萄球菌属细菌有效的噬菌体溶素。在一个特定的方面，溶素包含SH3型细菌结合结构域。本文提供了在本发明中使用或适用的示例性溶素多肽，包括PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，特别是PlySs2(CF-301)溶素。在一个此类方面，如本文证实的，溶素能够杀死金黄色葡萄球菌菌株和细菌。在一个方面，溶素能够杀死葡萄球菌属和链球菌属细菌。在一个方面，溶素有效针对抗生素抗性的金黄色葡萄球菌，例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(VRSA)、达托霉素抗性金黄色葡萄球菌(DRSA)和利奈唑胺抗性金黄色葡萄球菌(LRSA)。溶素可以有效针对万古霉素中间产物敏感性金黄色葡萄球菌(VISA)。
在一个此类方面，如本文证实的，溶素是PlySs2(CF-301)溶素，并且能够杀死金黄色葡萄球菌菌株和细菌。在一个方面，PlySs2(CF-301)溶素能够杀死葡萄球菌属和链球菌属细菌。PlySs2(CF-301)有效针对抗生素抗性的金黄色葡萄球菌，例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(VRSA)、达托霉素抗性金黄色葡萄球菌(DRSA)和利奈唑胺抗性金黄色葡萄球菌(LRSA)。PlySs2(CF-301)有效针对万古霉素中间产物敏感性金黄色葡萄球菌(VISA)。
分离的溶素多肽可以包含本文提供的溶素氨基酸序列或其变体，所述变体与本文的多肽具有至少80％的同一性、85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性或99％的同一性，并且有效杀死革兰氏阳性菌。分离的PlySs2(CF-301)溶素多肽可以包含本文提供的PlySs2(CF-301)氨基酸序列(SEQ ID NO：3)或其变体，所述变体与本文的多肽(SEQ ID NO：3)具有至少80％的同一性、85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性或99％的同一性，并且有效杀死葡萄球菌属和链球菌属细菌。分离的Sal溶素多肽可以包含本文提供的Sal1氨基酸序列(SEQ ID NO：5)或其变体，所述变体与本文的多肽(SEQ ID NO：5)具有至少80％的同一性、85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性或99％的同一性，并且有效杀死葡萄球菌属细菌。分离的LysK溶素多肽可以包含本文提供的LysK氨基酸序列(SEQ ID NO：6)或其变体，所述变体与本文的多肽(SEQ ID NO：6)具有至少80％的同一性、85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性或99％的同一性，并且有效杀死葡萄球菌属细菌。分离的溶葡萄球菌素溶素多肽可以包含本文提供的溶葡萄球菌素氨基酸序列(SEQ ID NO：7)或其变体，所述变体与本文的多肽(SEQ ID NO：7)具有至少80％的同一性、85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性或99％的同一性，并且有效杀死葡萄球菌属细菌、或葡萄球菌属和链球菌属细菌。分离的溶素多肽可以包含本文提供的或本领域已知的溶素多肽氨基酸序列，包括作为本文参考的其变体，所述变体与本文的或者本领域已知的或公认的多肽具有80％的同一性、85％的同一性、90％的同一性、95％的同一性或99％的同一性，并且有效杀死葡萄球菌属细菌、或葡萄球菌属和链球菌属细菌。
在上述任何一种或多种此类方法中，细菌可以选自金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、模拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、猪链球菌(Streptococcus suis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、马链球菌(Streptococcus equi)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi zoo)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(GBS)、化脓性链球菌(GAS)、血链球菌(Streptococcussanguinis)、戈登链球菌(Streptococcus gordonii)、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)、G组链球菌、E组链球菌、粪肠球菌和肺炎链球菌。
根据本发明的任何方法，细菌可以是抗生素抗性细菌。细菌可以是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素中间产物敏感性金黄色葡萄球菌(VISA)、万古霉素抗性金黄色葡萄球菌(VRSA)、达托霉素抗性金黄色葡萄球菌(DRSA)和利奈唑胺抗性金黄色葡萄球菌(LRSA)。敏感细菌可以是临床上有关的或致病性细菌，特别是对于人。在该方法的一个方面，溶素多肽有效杀死葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和李斯特菌属细菌菌株。
在本文提供的方法和组合物的一个另外方面或实施方案中，另一种不同的葡萄球菌特异性溶素在本文中单独使用，或与本文提供的溶素包括如本文提供且描述的PlySs2(CF-301)溶素组合使用。在本文提供的方法和组合物的一个此类方面或实施方案中，选自以下的一种或多种溶素在本文中单独使用，或与如本文提供且描述的PlySs2(CF-301)溶素组合使用：Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。在本文提供的方法和组合物的一个方面或实施方案中，选自以下的一种或多种溶素如本文提供且描述的彼此组合使用：Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。在本文提供的方法和组合物的一个方面或实施方案中，选自以下的溶素的一个或多个SH3结合结构域与另一种溶素的至少一个其它催化结构域包括如本文提供且描述的组合使用：Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。
根据参考下述说明性附图进行的下述说明书的综述，其它目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1A-1D描绘了在人血液基质中的PlySs2(CF-301)溶菌活性的增强。PlySs2(CF-301)的复合时间-杀死曲线针对在以下中测试的金黄色葡萄球菌MW2菌株与缓冲液对照进行比较：(A)来自16个人和4个合并样品的人血清、(B)10个人的人全血、(C)MHB(10个重复)和(D)合并的BALB/c小鼠血清。显示了关于每个时间点的平均值(±SEM)。
图2A-2N提供了如所示的人血液对一系列金黄色葡萄球菌菌株的作用的调查。关于PlySs2(CF-301)的复合时间-杀死曲线针对测试的所示的金黄色葡萄球菌菌株与缓冲液对照进行比较，使用在MHB或合并的人血清中的5个重复。显示了关于每个时间点的平均值(±SEM)。
图3A-3D描绘了人血液对另一种溶素样蛋白(溶葡萄球菌素)和小分子抗生素(万古霉素)的作用。关于所示化合物的复合时间-杀死曲线针对金黄色葡萄球菌菌株MW2与缓冲液对照进行比较。A和B，分别使用MHB或合并的人血清中的5个重复样品测试的溶葡萄球菌素。C和D，分别使用MHB或合并的人血清中的5个重复样品测试的万古霉素。显示了关于每个时间点的平均值(±SEM)。
图4描述了在动物血液基质中的PlySs2(CF-301)溶菌活性的增强。PlySs2(CF-301)的复合时间-杀死曲线针对在以下中测试的金黄色葡萄球菌MW2菌株与缓冲液对照进行比较：(A)胎牛血清(3个不同批次各3个重复)、(B)Sprague Dawley大鼠血清血液(两个合并批次各5个重复)、(C)兔血清(两个合并的混合物种批次各5个重复)和(D)来自8只个别动物的比格犬血清。显示了关于每个时间点的平均值(±SEM)。
图5提供了关于在不同的人血液基质中的金黄色葡萄球菌MW2的PlySs2(CF-301)MIC分布。显示了关于在多重不同样品中执行的分析的直方图，包括个别和合并的全血(n＝13)、血清(n＝32)和血浆(n＝15)。每个样品在补充表1中进行描述。MIC在x轴上标绘，且具有特定MIC的患者样品数目在y轴上标绘。
图6A-6D证实了PlySs2(CF-301)显示出与人血清中的其它抗微生物剂有效的协同作用。关于所示的单一试剂(浓度在括号中)的复合时间-杀死曲线针对金黄色葡萄球菌菌株MW2与两种缓冲液对照和两种试剂的组合(各自在所示的单一试剂浓度下)进行比较。基于一式三份执行的测定，显示了关于每个时间点的平均值(±SEM)。A-C，在恒定量的DAP的存在下，以亚MIC量测试的PlySs2(CF-301)。D，使用亚MIC量测试的PlySs2(CF-301)和溶葡萄球菌素。
图7提供了在18小时，使用Alamar针对金黄色葡萄球菌MW2的比色MIC测定。向每个孔中添加阿尔玛蓝色染料(刃天青)2小时，允许评价在log10稀释范围内的活力(粉红色)和细胞死亡(蓝色)。A，在MHB、HuS和MuS中的活力测定。样品在未处理或用蛋白酶K-琼脂糖珠预处理3小时的HuS中进行测定。作为关于蛋白酶携带污染的对照，在分析前将蛋白酶K预处理的血清3：4稀释到未处理的血清内。B，在一定温度范围内预处理30分钟的HuS中的活力测定。C，与具有MHB作为稀释剂的HuS组合的PlySs2(CF-301)的棋盘分析。红色方块指示在其下增强剂效应减弱的HuS稀释物。
图8A-8C描绘了HuLYZ和HSA对PlySs2(CF-301)活性的作用。提供了将亚MIC量的溶素与一系列huLYZ浓度组合的时间-杀死测定。B和C描绘了基于处理的培养物中的光密度损失的第二体外测定，伴随HuLYZ(B)和HSA(C)的添加。
图9提供了使用抗PlySs2(CF-301)抗体的蛋白质印迹研究。
图10描绘了在rHSA的存在和不存在下，PlySs2(CF-301)(红色)的标记。在未显示的数据中，含或不含HSA的以25μg/ml标记的PlyGGFP和PlyCAF均未显示。
图11描绘了不同血清类型(和MHB)的预温育对PlySs2(CF-301)(红色)的后续标记的作用。
图12描绘了在PlySs2(CF-301)(1x-0.25x MIC)的存在和不存在下，用HuLYZ(绿色)的标记。
图13描绘了用在人血清(HuS)或MHB中的PlySs2(CF-301)处理15分钟的金黄色葡萄球菌菌株MW2的TEM分析。
图14A和14B描绘了对于加入达托霉素的各种PlySs2(CF-301)给药方案，在大鼠(A)和兔(B)感染性心内膜炎(IE)模型中的功效。数据标绘为关于每个剂量组的治疗方案相对于平均log10CFU/g组织。还显示了中值±SEM。
图15呈现了在大鼠和兔中，关于各种PlySs2(CF-301)给药方案的AUC值和AUC剂量比例性。
具体实施方案
根据本发明，可以采用在本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如，Sambrook等人，″MolecularCloning：A Laboratory Manual″(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″第I-III卷[Ausubel，R.M.，编辑(1994)]；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″第I-III卷[J.E.Celis，编辑(1994))]；″Current Protocols in Immunology″第I-III卷[Coligan，J.E.，编辑(1994)]；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait编辑1984)；″Nucleic AcidHybridization″[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；″Transcription AndTranslation″[B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑(1984)]；″Animal Cell Culture″[R.I.Freshney，编辑(1986)]；″Immobilized Cells And Enzymes″[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，″A Practical Guide To Molecular Cloning″(1984)。
另外，各种术语根据本发明利用且提及，并且可以具有如本文和下文提供的定义或描述。
在本发明的一般方面，已认识到某些溶素，特别是具有SH-3型结合结构域的溶素，包括PlySs2(CF-301)溶素，在人血液、血清和血浆中比在人工培养基中更有效。已鉴定了高达100倍的增加和增强的活性。除人血清之外，在兔、犬和马的血清中也观察到增强效应。在大鼠血清中观察到中等效应。小鼠血清未显示出增强剂效应。本发明人假设并且现在显示出某些噬菌体溶素，特别是具有SH-3型结合结构域的溶素，包括PlySs2(CF-301)，能够与血液或血液级分中的一种或多种组分有利的抗菌相互作用。
根据本发明，已鉴定了与溶素包括PlySs2(CF-301)协同作用的血液组分。在一个方面，血清白蛋白，特别是人血清白蛋白，增强了溶素包括PlySs2(CF-301)溶素的抗菌活性。血清白蛋白是人血液血浆中最丰富的蛋白质，构成约一半的血清蛋白。关于血清中的白蛋白浓度的参考范围为大约35-50g/L或3.5-5.0g/dL。白蛋白具有大约20天的血清半衰期。
关于白蛋白的基因位于4号染色体上，并且拆分成对称地置于3个结构域内的15个外显子，所述3个结构域被认为已通过单个原始结构域的三倍重复而出现。除其它功能外，白蛋白还转运激素、脂肪酸和其它化合物，缓冲pH，并且维持胶体渗透压。人血清白蛋白(Uniprot P02768)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO：1)：
在这个序列的609个氨基酸中，血液中存在的最终产物中观察到585个氨基酸；在翻译后切割前24个氨基酸(在此处为斜体且加下划线)，包括信号肽(1-18)和前肽部分。
在一个进一步方面，溶菌酶，特别是人溶菌酶，增强了溶素包括PlySs2(CF-301)溶素的抗菌活性。溶菌酶，也称为胞壁质酶或N-乙酰胞壁酰胺聚醣水解酶，是由动物产生的抗微生物酶，其形成先天性免疫***的部分。溶菌酶催化肽聚糖(革兰氏阳性菌细胞壁的主要组分)中的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰基-D-葡萄糖胺(NAG)残基之间的1，4-β-键合的水解，其转而又破坏细菌细胞壁的完整性，引起细菌的裂解。值得注意的是，金黄色葡萄球菌细菌是完全溶菌酶抗性的，这极大地促成其在定殖人和动物的皮肤和粘膜区域中的持久性和成功性(Bera，A等人(2004)Molecular Microbiology 55(3)：778-787；Pushkaran，AC等人(2015)J Chem InfModel 55(4)：760-770)。
人溶菌酶是具有148个氨基酸的蛋白质，包括18个氨基酸的信号肽序列，提供成熟的129氨基酸的蛋白质。人溶菌酶的序列对应于Uniprot P61626和Genbank NP_000230，且如下(SEQ ID NO：2)(信号肽为斜体且加下划线的)：
根据本发明，在本发明中使用和有关的溶素多肽可以特别是具有SH3型结合结构域的溶素多肽。Src同源3(SH3)酶结构域具有特征性的β-桶折叠，其由排列为两个紧密堆积的反平行β片层的五条或六条β链组成。经典的SH3结构域通常在蛋白质中发现，所述蛋白质与其它蛋白质相互作用，并且介导特定蛋白质复合物的组装，包括经由与其分别的结合配偶体中的富含脯氨酸的肽结合。蛋白质的许多SH3结合表位具有含有脯氨酸的序列基序。SH3结构域和序列在现有技术中得到描述且综述，包括在Whisstock，J.C.和Lesk，A.M.(1999)TIBS 24：132-133，以及Ponting，C.P.等人(1999)J Mol Biol 289：729-745中。
在其一个方面，具有SH3型结合结构域的溶素多肽选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。在一个方面，溶素多肽是PlySs2。
术语“PlySs溶素”、“PlySs2溶素”、“PlySs2″、″PlySs2(CF-301)″、″PlySs2/CF-301″、″CF-301″、″CF301″以及未具体列出的任何变体，可以在本文中互换使用，并且如本申请和权利要求中自始至终使用的，指包括单个蛋白质或多重蛋白质的蛋白质材料，并且延伸至具有本文所述且在下文呈现的氨基酸序列数据的那些蛋白质，以及本文和权利要求中阐述的活性概况。相应地，同样考虑了展示基本上等价或改变的活性的蛋白质，这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变获得的修饰，或者可以是偶然的，例如通过其为复合物或其命名的亚基的生产者的宿主中的突变获得的那些。另外，术语“PlySs溶素”、“PlySs2溶素”、“PlySs2″、″PlySs2(CF-301)″、″PlySs2/CF-301″、″CF-301″、″CF301″预期在其范围内包括本文具体叙述的蛋白质以及所有基本上同源的类似物、片段或截短和等位基因变异。在美国专利9,034,322和PCT申请PCT/US2012/34456中描述了PlySs2溶素。Gilmer等人还描述了PlySs2溶素(Gilmer DB等人(2013)Antimicrob Agents Chemother Epub 2013年4月9日[PMID 23571534])。PlySs2(CF-301)氨基酸序列在下文提供(SEQ ID NO：3)。PlySs2(CF-301)多肽溶素N末端CHAP结构域(半胱氨酸-组氨酸酰胺水解酶/肽酶)(以LNNV…开始且以...HYIT结束)、以及C末端SH3型结合结构域(以RSYR…开始且..YVAT结束)在下文是加下划线的。
术语“ClyS”、“ClyS溶素”指具有针对葡萄球菌属细菌，包括金黄色葡萄球菌的活性的嵌合溶素ClyS，在WO 2010/002959中详细描述，并且也在Daniel等人(Daniel，A等人(2010)Antimicrobial Agents and Chemother 54(4)：1603-1612)中描述。ClyS没有SH3型结合结构域。下文提供了ClyS的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
在几个Yoon等人的参考文献，包括美国专利8,232,370、8,377,431和8,377,866中描述了Sal溶素，可替代地被称为Sal1。下文提供了示例性的Sal 1序列(SEQ ID NO：5)。
LysK溶素是抗葡萄球菌溶素，并且包括酰胺酶、CHAP结构域和SH3型结合结构域。LysK在O′Flaherty S等人(2005)J Bacteriol 187(20)：7161-7164中描述。融合蛋白，特别是LysK和溶葡萄球菌素融合物在Donovan等人的美国专利8,568,714中描述。具有Ply187内肽酶结构域和LysK SH3细胞壁结合结构域的嵌合体/嵌合溶素在USSN 13/432,758和WO2013/149010中描述。LysK序列在下文提供(SEQ ID NO：6)。
值得注意的是，Sal-1和LysK在序列中非常相似，并且仅在上文的每个序列中加下划线的氨基酸26、114和485处不同。
溶葡萄球菌素和重组溶葡萄球菌素在各种参考文献，包括Sloan GL等人(1982)Int J Sys Bacteriol 32：170-174，以及Oldham ER和Daley MJ(1991)J Dairy Science74：1127-1131中进行描述。来自模拟葡萄球菌的克隆的溶葡萄球菌素序列由Recsei PA等人(1987)PNAS USA 84：1127-1131描述，并且在美国专利4,931,390中提供。成熟的溶葡萄球菌素由246个氨基酸残基组成。前蛋白包含在前体蛋白中的三个不同区域：典型的信号肽(约30-38aa)、具有14个重复序列的亲水性和高度有序的蛋白质结构域(296aa)和疏水性成熟溶葡萄球菌素。溶葡萄球菌素的示例性序列在下文提供(SEQ ID NO：7)。成熟的序列为粗体。
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ALE-1溶素是溶葡萄球菌素的同系物，并且在Liu JZ等人(2006)J Biol Chem281：549-558中进行描述。
Phill噬菌体溶素包含两个水解酶结构域(内肽酶和酰胺酶)以及SH3B型结合结构域，并且是本领域已知且描述的，包括Donovan DM等人(2006)FEMS Microbiol Lett 265(1)：133-139。LysH5溶素类似地由三个结构域组成：两个水解酶结构域(内肽酶和酰胺酶)以及SH3B型结合结构域，并且在Obeso JM等人(2008)Int J Food Microbiol 128(2)：212-228中描述且已知。噬菌体溶素MV-L在Rashel M等人(2007)J Infect Dis 196(8)：1237-1247中描述。MV-L溶素由与单个细胞壁靶向(CWT)结构域(一类结合结构域)连接的两个催化结构域(内肽酶和酰胺酶结构域)组成。除非另有说明，否则本文提及“结合结构域”包括CWT结构域。MV-L CWT结构域，如同staphylolytic酶溶葡萄球菌素，展示与SH3b样结构域的同源性。SH3b样结构域与葡萄球菌细胞壁中的肽横桥(cross-bridge)(五甘氨酸)结合。
多肽和裂解酶
“裂解酶”包括在合适的条件下以及在有关时间段过程中，杀死一种或多种细菌的任何细菌细胞壁裂解酶。裂解酶的实例包括但不限于各种酰胺酶细胞壁裂解酶。
“猪链球菌裂解酶”包括在合适的条件下以及在有关时间段过程中，能够杀死至少一种或多种猪链球菌细菌的裂解酶。
“噬菌体裂解酶”指从噬菌体中提取或分离的裂解酶，或维持裂解酶功能性的具有相似蛋白质结构的合成裂解酶。
裂解酶能够特异性切割存在于细菌细胞的肽聚糖中的键，以破坏细菌细胞壁。目前还假定细菌细胞壁肽聚糖在大多数细菌中是高度保守的，并且仅少数键的切割可能破坏细菌细胞壁。噬菌体裂解酶可以是酰胺酶，尽管其它类型的酶也是可能的。切割这些键的裂解酶的实例是各种酰胺酶，例如胞壁质酶、氨基葡糖苷酶、内肽酶或N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶。Fischetti等人(1974)报道C1链球菌噬菌体溶素酶是酰胺酶。Garcia等人(1987，1990)报道来自Cp-1噬菌体的肺炎链球菌的Cpl溶素是溶菌酶。Caldentey和Bamford(1992)报道来自phi 6假单胞菌属(Pseudomonas)噬菌体的裂解酶是内肽酶，拆分由melo-二氨基庚二酸和D-丙氨酸形成的肽桥。大肠杆菌(E.coli)T1和T6噬菌体裂解酶是酰胺酶，如来自李斯特菌属噬菌体(ply)的裂解酶一样(Loessner等人，1996)。还存在本领域已知的其它裂解酶，其能够切割细菌细胞壁。
“由噬菌体遗传编码的裂解酶”包括例如通过具有针对宿主细菌的至少一些细胞壁裂解活性，能够杀死宿主细菌的多肽。多肽可以具有涵盖天然序列裂解酶及其变体的序列。多肽可以从各种来源例如从噬菌体(“噬菌体”)中分离，或者通过重组或合成方法制备，所述方法例如由Garcia等人描述并且也如本文提供的那些。该多肽可以包含在羧基末端侧处的胆碱结合部分，并且特征可以在于能够在氨基末端侧处切割细胞壁肽聚糖的酶活性(例如作用于肽聚糖中的酰胺键的酰胺酶活性)。已描述了包括多重酶活性例如两个酶促结构域的裂解酶，例如PlyGBS溶素。一般而言，裂解酶的分子量可以为25,000至35,000道尔顿，并且包含单条多肽链；然而，这可以取决于酶链而变。分子量最方便地可以通过在变性十二烷基硫酸钠凝胶电泳上的测定，以及与分子量标记物的比较来确定。
“天然序列噬菌体相关的裂解酶”包括具有与衍生自细菌的酶相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列酶可以是分离的，或者可以通过重组或合成手段产生。
术语“天然序列酶”涵盖酶的天然存在的形式(例如，可变剪接或改变形式)和天然存在的变体。在本发明的一个实施方案中，天然序列酶是成熟或全长多肽，其由来自对于链球菌属特异性或能够杀死链球菌属的噬菌体的基因遗传编码。当然，许多变体是可能的且是已知的，如以下出版物中公认的：例如Lopez等人，Microbial Drug Resistance 3：199-211(1997)；Garcia等人，Gene 86：81-88(1990)；Garcia等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：914-918(1988)；Garcia等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：914-918(1988)；Garcia等人，Streptococcal Genetics(J.J.Ferretti和Curtis编辑，1987)；Lopez等人，FEMSMicrobiol.Lett.100：439-448(1992)；Romero等人，J.Bacteriol.172：5064-5070(1990)；Ronda等人，Eur.J.Biochem.164：621-624(1987)和Sanchez等人，Gene 61：13-19(1987)。各参考的内容，特别是序列表和与序列比较相关的文本(包括关于序列同源性的陈述)，以其整体通过引用具体地并入本文。
“变体序列裂解酶”包括特征在于多肽序列的裂解酶，所述多肽序列不同于天然存在的裂解酶的那种，但保留功能活性。在一些实施方案中，裂解酶可以是通过对于细菌例如链球菌属特异性的噬菌体遗传编码的，与其裂解酶序列具有特定氨基酸序列同一性，如本文提供或提及的。例如，在一些实施方案中，功能活性的裂解酶可以杀死链球菌属细菌以及如本文提供的其它敏感细菌，包括通过破坏细菌的细胞壁。如本文提供或提及的，活性裂解酶可以与其裂解酶序列具有60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99或99.5％的氨基酸序列同一性。此类噬菌体相关的裂解酶变体包括例如裂解酶多肽，其中如本文提供或提及的，在其裂解酶序列的N末端或C末端处添加或缺失一个或多个氨基酸残基。在一个特定方面，噬菌体相关的裂解酶与天然噬菌体相关的裂解酶序列具有至少约80％或85％的氨基酸序列同一性，特别是至少约90％(例如90％)的氨基酸序列同一性。最特别地，如本文提供或提及的，噬菌体相关的裂解酶变体与其裂解酶序列相关的天然噬菌体具有至少约95％(例如95％)的氨基酸序列同一性。
关于所鉴定的噬菌体相关的裂解酶序列的“氨基酸序列同一性百分比”，在本文中定义为在相同读码框中比对序列，并且在必要时引入缺口实现最大序列同一性百分比后，并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分，候选序列中与噬菌体相关的裂解酶序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。
关于本文鉴定的噬菌体相关的裂解酶序列的“核酸序列同一性百分比”，定义为在比对序列，并且在必要时引入缺口实现最大序列同一性百分比后，候选序列中与噬菌体相关的裂解酶序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。
为了确定两个核苷酸序列或氨基酸序列的同一性百分比，序列为了最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一核苷酸序列的序列中引入缺口)。然后比较在相应核苷酸或氨基酸位置处的核苷酸或氨基酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸或氨基酸占据时，则分子在该位置处是等同的。两个序列之间的同一性百分比是由序列共享的等同位置数目的函数(即，％同一性＝等同位置#/总位置#×100)。
两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性例子是Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993)的算法。此类算法掺入NBLAST程序内，所述程序可以用于鉴定与本发明的核苷酸序列具有所需同一性的序列。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人，Nucleic Acids Res，25：3389-3402(1997)中所述，可以利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用分别程序(例如NBLAST)的缺省参数。参见由美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)、美国国家医学图书馆(National Library of Medicine)、美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)提供的程序。在一个实施方案中，用于序列比较的参数可以设为W＝12。参数也可以是改变的(例如，W＝5或W＝20)。值“W”确定多少个连续核苷酸必须是等同的，用于程序将两个序列鉴定为含有同一性的区域。
“多肽”包括由以线性方式连接的多重氨基酸组成的聚合物分子。在一些实施方案中，多肽可以对应于由天然存在的多核苷酸序列编码的分子。多肽可以包括保守取代，其中天然存在的氨基酸被替换为具有相似特性的氨基酸，其中此类保守取代不改变多肽的功能(参见例如，Lewin″Genes V″Oxford University Press第1章，第9-13页1994)。
术语“改变的裂解酶”包括改组的和/或嵌合的裂解酶。
已发现对于被特定噬菌体感染的细菌特异性的噬菌体裂解酶有效地且高效地分解所讨论的细菌的细胞壁。裂解酶被认为缺乏蛋白酶解酶促活性，并且因此当在细菌细胞壁的消化过程中存在时，对哺乳动物蛋白质和组织是非破坏性的。如通过Loeffler等人，″Rapid Killing of Streptococcus pneumoniae with a Bacteriophage Cell WallHydrolase，″Science，294：2170-2172(2001年12月7日)显示的，以及由Science杂志在线出版的关于其的补充材料，所述参考文献整体引入本文作为参考，纯化的肺炎球菌噬菌体裂解酶，例如Pal，能够杀死各种肺炎球菌。Loeffler等人通过这些实验已显示，在接触后的几秒钟内，裂解酶Pal能够在体外杀死15种肺炎链球菌的临床菌株，包括最频繁分离的血清群和青霉素抗性菌株。用Pal治疗小鼠还能够以剂量依赖性方式消除或显著减少血清型14的鼻携带。此外，由于已发现如同其它噬菌体裂解酶一样，但与抗生素不同，Pal对于靶病原体是更特异性的，很可能正常菌群保持基本上完整(引入本文作为参考的M.J.Loessner，G.Wendlinger，S.Scherer，Mol Microbiol 16，1231-41.(1995))。相比之下，本发明的某些溶素多肽具有非常广泛的和临床上显著的细菌杀死概况。例如，分离的猪链球菌溶素PlySs2有效杀死猪链球菌，以及各种其它链球菌属菌株包括B组链球菌(GBS)、葡萄球菌属菌株包括金黄色葡萄球菌、肠球菌属和李斯特菌属。本发明的溶素可以显示出跨越葡萄球菌属和/或链球菌属菌株或细菌的细菌细胞杀死的广度。
一种或多种裂解酶或多肽可以是截短的、嵌合的、改组的或“天然的”，并且可以是组合的。有关的美国专利号5,604,109整体引入本文作为参考。“改变的”裂解酶可以以多种方式产生。在一个实施方案中，将关于改变的裂解酶的基因放入转移载体或可移动载体，优选质粒内，并且将该质粒克隆到表达载体或表达***内。用于产生本发明的溶素多肽或酶的表达载体可以适合于大肠杆菌、芽孢杆菌或许多其它合适的细菌。载体***也可以是无细胞表达***。表达基因或基因集合的所有这些方法是本领域已知的。
“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含与异源多肽可操作地连接的本发明的多肽的全部或(优选生物活性)部分。有关的生物活性部分可以是催化结构域。有关的生物活性部分可以是结合结构域。嵌合蛋白或肽例如通过组合具有两个或更多个活性位点的两种或更多种蛋白质来产生。嵌合蛋白和肽可以独立作用于相同或不同的分子，并且因此具有同时治疗两种或更多种不同细菌感染的潜力。因此，嵌合蛋白可以将单个结合结构域，例如SH3型结合结构域，与多于一个催化结构域组合。嵌合蛋白和多肽还可以通过在多于一个位置中切割细胞壁用于治疗细菌感染，例如借助于两个(或更多个)催化结构域或两种(或更多种)催化活性，因此潜在地提供来自单个溶素分子或嵌合肽的更快速或有效(或协同)杀死。
DNA构建体或肽构建体的“异源”区域是在较大的DNA分子内的DNA的可鉴定片段或在较大的肽分子内的肽，其在自然界中并未与较大的分子结合发现。因此，当异源区域编码哺乳动物基因时，该基因通常侧翼为在来源生物的基因组中不侧接哺乳动物基因组DNA的DNA。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列本身在自然界中未发现的构建体(例如，其中基因组编码序列含有内含子的cDNA，或具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生如本文定义的DNA或肽的异源区域。
术语“可操作地连接”意指本公开内容的多肽和异源多肽在框内融合。异源多肽可以融合至本公开内容的多肽的N末端或C末端。嵌合蛋白通过化学合成或重组DNA技术酶促生产。已生产且研究了许多嵌合裂解酶。使基因E-L(分别由噬菌体phi X174与MS2裂解蛋白E和L构建的嵌合裂解)经受内部缺失，以产具有改变的裂解或杀死特性的生一系列新E-L克隆。在这项研究中调查了亲本基因E、L、E-L和内部截短形式的E-L的裂解活性，以基于不同跨膜结构域的体系结构中的差异来表征不同的裂解机制。电子显微镜检查以及关于细胞质和周质空间的标记物酶的释放揭示，取决于大肠杆菌的内膜或内膜和外膜蛋白质的渗透，可以区分两种不同的裂解机制(FEMS Microbiol.Lett.(1998)164(1)：159-67(引入本文作为参考)。有用的融合蛋白的一个实例是GST融合蛋白，其中本公开内容的多肽与GST序列的C末端融合。此类嵌合蛋白可以促进本公开内容的重组多肽的纯化。
在另一个实施方案中，嵌合蛋白或肽含有在其N末端处的异源信号序列。例如，可以去除本公开内容的多肽的天然信号序列，并且替换为来自另一种蛋白质的信号序列。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可以用作异源信号序列(Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人，编辑，John Wiley&Sons，1992，引入本文作为参考)。真核异源信号序列的其它实例包括蜂毒素和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；LaJolla，Calif.)。在另外一个实例中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等人，同上)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，N.J.)。
融合蛋白可以将溶素多肽与具有不同能力，或者向溶素多肽提供另外能力或附加特性的蛋白质或多肽组合。融合蛋白可以是免疫球蛋白融合蛋白，其中本公开内容的多肽的全部或部分与衍生自免疫球蛋白家族成员的序列融合。免疫球蛋白可以是抗体，例如针对敏感细胞或靶细菌的表面蛋白或表位的抗体。免疫球蛋白融合蛋白可以掺入药物组合物内，并且施用于受试者，以抑制配体(可溶性或膜结合的)与细胞表面上的蛋白质(受体)之间的相互作用，以从而压制体内的信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可以改变本公开内容的多肽的同源配体的生物利用度。配体/受体相互作用的抑制可以是治疗上有用的，用于治疗细菌相关疾病和病症用于调节(即促进或抑制)细胞存活。此外，本公开内容的免疫球蛋白融合蛋白可以用作免疫原，以在受试者中产生针对本公开内容的多肽的抗体，纯化配体，并且在筛选测定中鉴定抑制受体与配体的相互作用的分子。可以通过标准重组DNA技术产生本公开内容的嵌合和融合蛋白和肽。
融合基因可以通过常规技术包括自动DNA合成仪来合成。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，其随后可以进行退火且再扩增，以生成嵌合基因序列(参见，即，Ausubel等人，同上)。此外，已经编码融合部分(即，GST多肽)的许多表达载体是商购可得的。可以将编码本发明的多肽的核酸克隆到此类表达载体内，使得融合部分与本发明的多肽在框内连接。
如本文使用的，改组的蛋白质或肽、基因产物或关于多于一种有关的噬菌体蛋白的肽或蛋白肽片段已被随机切割，并且重新组装成更多活性或特异性的蛋白质。选择或筛选改组的寡核苷酸、肽或肽片段分子，以鉴定具有所需功能特性的分子。这种方法例如在Stemmer，美国专利号6,132,970(改组多核苷酸的方法)；Kauffman，美国专利号5,976,862(经由基于Condon的合成的进化)和Huse，美国专利号5,808,022(直接密码子合成)。这些专利的内容引入本文作为参考。改组可以用于产生比模板蛋白更多活性，例如高达10至100倍更多活性的蛋白质。模板蛋白选自不同变种的溶素蛋白。改组的蛋白质或肽构成例如一个或多个结合结构域和一个或多个催化结构域。每个结合或催化结构域衍生自相同或不同的噬菌体或噬菌体蛋白。改组的结构域是基于寡核苷酸的分子，作为基因或基因产物，其可以单独或者与其它基因或基因产物组合翻译成肽片段，或者它们是基于肽的分子。基因片段包括DNA、RNA、DNA-RNA杂交体、反义RNA、核酶、EST、SNIP的任何分子以及其它基于寡核苷酸的分子，所述分子单独或与其它分子组合产生能够或不能翻译成肽的寡核苷酸分子。
如本文公开的，蛋白质或肽和肽片段的修饰或改变形式包括通过重组DNA技术化学合成或制备的蛋白质或肽和肽片段、或两者。这些技术包括例如嵌合和改组。当蛋白质或肽通过化学合成产生时，它优选基本上不含化学前体或其它化学制品，即，它与蛋白质合成中涉及的化学前体或其它化学制品分开。相应地，除目的多肽外，蛋白质的此类制剂具有小于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化合物。
多肽的信号序列可以促进本公开内容的蛋白质以及肽和肽片段进出粘膜的跨膜运动，以及通过促进分泌的蛋白质或其它目的蛋白质的分泌和分离。信号序列通常的特征在于疏水性氨基酸的核心，所述疏水性氨基酸一般在分泌期间的一个或多个裂解事件中从成熟蛋白中切割。此类信号肽含有加工位点，当成熟蛋白通过分泌途径时，所述加工位点允许从其中切割信号序列。因此，本公开内容可以涉及具有信号序列的所述多肽，以及信号序列本身以及在信号序列的不存在下的多肽(即，切割产物)。编码本公开内容的信号序列的核酸序列可以在表达载体中可操作地连接至目的蛋白质，例如通常不分泌或难以分离的蛋白质。信号序列指导蛋白质例如从表达载体转化到其内的真核宿主中的分泌，并且随后或伴随地切割信号序列。然后可以通过本领域公认的方法容易地从细胞外培养基中纯化蛋白质。可替代地，可以使用促进纯化的序列，例如用GST结构域，将信号序列与目的蛋白质连接。
本发明还涉及本发明多肽的其它变体。此类变体可以具有改变的氨基酸序列，其可以充当激动剂(模拟物)或拮抗剂。变体可以通过诱变，即不连续的点突变或截短而生成。激动剂可以保留与蛋白质的天然存在形式基本上相同或部分的生物活性。蛋白质的拮抗剂可以例如通过竞争性结合包括目的蛋白质的细胞信号传导级联的下游或上游成员，来抑制蛋白质的天然存在形式的一种或多种活性。因此，可以通过用有限功能的变体的治疗来引发特定的生物效应。相对于用蛋白质的天然存在形式的治疗，用具有蛋白质的天然存在形式的部分生物活性的变体治疗受试者，可以在受试者中具有较少的副作用。可以通过在本公开内容的蛋白质的突变体，即截短突变体的组合文库中筛选激动剂或拮抗剂活性，来鉴定充当激动剂(模拟物)或拮抗剂的本公开内容的蛋白质的变体。在一个实施方案中，通过在核酸水平下的组合诱变生成变体的多变文库(variegated library)，并且由多变的基因文库编码。可以通过例如将合成寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列内，使得潜在蛋白质序列的简并集合可表达为各个多肽，或可替代地可表达为较大融合蛋白的集合(例如，用于噬菌体展示)，来生成变体的多变文库。存在可以用于从简并的寡核苷酸序列产生本公开内容的多肽的潜在变体文库的各种方法。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见，即Narang(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acid Res.11：477，全部引入本文作为参考)。
另外，本公开内容的多肽的编码序列片段的文库可以用于生成多变的多肽群体，用于变体、活性片段或截短的筛选和随后选择。例如，编码序列片段的文库可以通过以下生成：在其中切口仅发生约一次/分子的条件下，用核酸酶处理目的编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性，以形成可以包括来自不同切口产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶的处理从改造的双链体中去除单链部分，并且将所得到的片段文库连接到表达载体内。通过这种方法，可以衍生出表达文库，其编码目的蛋白质的各种大小的N末端片段和内部片段。几种技术在本领域中已知用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物，以及用于在cDNA文库中筛选具有选择特性的基因产物。用于筛选大基因文库，可顺应高流通量分析的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体内，用所得到的载体文库转化适当的细胞，并且在其中所需活性的检测促进分离编码检测到其产物的基因的载体的条件下，表达组合基因。递归总体诱变(Recursive ensemblemutagenesis)(REM)，增强文库中的功能性突变体的频率的技术，可以与筛选测定组合使用，以鉴定本公开内容的蛋白质的变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)，蛋白质或肽片段的免疫活性部分包括与识别噬菌体酶的抗体结合的区域。在这个上下文中，根据实施方案的蛋白质(或编码该蛋白质的核酸)的最小部分是表位，其可识别为对于制备溶素蛋白质的噬菌体特异性的。相应地，可以预期结合靶或受体如抗体，并且对于一些实施方案有用的最小多肽(以及编码该多肽的相关核酸)可以是8、9、10、11、12、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、85或100个氨基酸长。尽管短至8、9、10、11、12或15个氨基酸长的小序列可靠地包含足够的结构，以充当靶或表位，但5、6或7个氨基酸长的较短序列可以在一些条件下显示出靶或表位结构，并且在一个实施方案具有价值。因此，本文提供的蛋白质或溶素多肽的最小部分，包括如SEQ ID NOS：3或5-6中所示，包括小至5、6、7、8、9、10、12、14或16个氨基酸长的多肽。
如本文所述，实施方案的蛋白质或肽片段的生物活性部分包括多肽，所述多肽包含与本公开内容的噬菌体蛋白的氨基酸序列充分等同或衍生自其的氨基酸序列，其包括比噬菌体蛋白的全长蛋白质更少的氨基酸，并且显示出相应的全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本公开内容的蛋白质或蛋白质片段的生物活性部分可以是多肽，其为例如长度10、25、50、100个更少或更多的氨基酸。此外，可以通过重组技术制备其中蛋白质的其它区域缺失或添加的其它生物活性部分，并且评估实施方案的多肽的天然形式的一种或多种功能活性。
可以制备与此类小蛋白质和/或核酸(或大分子的蛋白质和/或核酸区域)共享功能性的同源蛋白质和核酸，如技术人员将了解的。可以是同源的此类小分子和较大分子的短区域特别预期作为实施方案。优选地，与本文提供的溶素多肽，包括如提供或引用的多肽，包括SEQ ID NO：3和5-6相比，此类有价值区域的同源性为至少50％、65％、75％、80％、85％，并且优选至少90％、95％、97％、98％或至少99％。这些同源性百分比率值不包括由于保守氨基酸取代的改变。
当至少约70％的氨基酸残基(优选至少约80％、至少约85％，且优选至少约90或95％)等同时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”，或代表保守取代。当溶素多肽的一个或多个、或几个、或至多10％、或至多15％、或至多20％的氨基酸被相似或保守的氨基酸取代所取代时，可比较的溶素，例如可比较的PlySs2溶素、或可比较的Sal或LysK溶素的序列是基本上同源的，并且其中可比较的溶素具有本文公开的溶素，例如PlySs2和/或Sal或LysK溶素的活性、抗菌效应和/或细菌特异性的概况。
本文所述的氨基酸残基优选为“L”异构形式。然而，以“D”异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保留了免疫球蛋白结合的所需功能特性。NH2指存在于多肽的氨基末端处的游离氨基。COOH指存在于多肽的羧基末端处的游离羧基。与标准多肽命名法，J.Biol.Chem.，243：3552-59(1969)保持一致，关于氨基酸残基的缩写显示于下述对应表中：
对应表
应该注意，所有氨基酸残基序列在本文中都由式表示，所述式的左和右取向为氨基末端至羧基末端的常规方向。此外，应该注意，在氨基酸残基序列的开始或结束时的破折号指示与具有一个或多个氨基酸残基的进一步序列的肽键。呈现上表以使在本文中可能交替出现的三字母和一字母记号法相关联。
可以在氨基酸序列中或者在编码本文的多肽和溶素的核酸序列中，包括在本文提供或提及的溶素序列中，或在其活性片段或截短中制备突变，使得特定密码子改变为编码不同氨基酸的密码子，一个氨基酸取代另一个氨基酸，或者缺失一个或多个氨基酸。一般通过使氨基酸或核苷酸的变化尽可能少来制备此类突变。可以制备这种取代突变，以非保守方式(例如，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变成属于另一个分组的氨基酸)、或以保守方式(例如，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变成属于相同分组的氨基酸)，改变所得到的蛋白质中的氨基酸。此类保守改变一般导致所得到的蛋白质的结构和功能中的较少改变。非保守改变更可能改变所得到的蛋白质的结构、活性或功能。本发明应该视为包括含有保守改变的序列，所述保守改变不显著改变所得到的蛋白质的活性或结合特征。
因此，基于本文提供的溶素多肽，特别是具有本文提供的SH-3型结合结构域的溶素多肽的序列的综述，并且基于其对于其它溶素多肽可获得的知识和***息，可以在溶素多肽序列中制备氨基酸改变或取代。可以制备氨基酸改变，以替换或取代本文提供的溶素的序列中的一个或多个、一个或少数、一个或几个、一至五个、一至十个或此类其它数目的氨基酸，以生成其突变体或变体。可以预测其此类突变体或变体的功能或测试用于杀死细菌的功能或能力，所述细菌包括葡萄球菌属、链球菌属、李斯特菌属或肠球菌属细菌，和/或具有与本文提供的溶素可比较的活性。因此，可以例如通过修饰如本文列出或提及的氨基酸序列，可以对具有SH-3型结合结构域的本发明的溶素多肽的序列制备改变，所述溶素多肽包括PlySs2(CF-301)、Sal、LysK以及本文提供且提及的其它，并且可以使用本文包括在实施例中描述且例证的测定和方法，测试在序列中具有变化的突变体或变体。基于其溶素的结构域结构，本领域技术人员可以预测适合于取代或替换的一个或多个、一个或几个氨基酸和/或不适合于取代或替换，包括合理的保守或非保守替代的一个或多个氨基酸。
在这方面，并且示例性提及PlySs2(CF-301)溶素但不限于其，应指出，PlySs2(CF-301)多肽溶素包含N末端CHAP结构域(半胱氨酸-组氨酸酰胺水解酶/肽酶)和C末端SH3型5结构域，如本文所述。描绘了结构域，其中CHAP结构域对应于以LNNV…开始且以...HYIT结束的第一个氨基酸序列区域，而SH-3型结构域对应于以RSYR…开始且以...YVAT结束的第二个氨基酸序列区域。类似地，可以容易地鉴定在本文中提及且具有在本发明中的用途的溶素多肽中的有关N末端催化和/或C末端结合结构域，特别是SH-3型结合结构域，所述溶素多肽包括但不限于Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素以及phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。CHAP域包括在几种先前表征的链球菌属和葡萄球菌属噬菌体溶素中。因此，本领域技术人员可以合理地制备且测试对PlySs2(CF-301)的CHAP结构域和/或SH-3结构域的取代或替换。可以用CHAP和/或SH-3结构域序列中的任一或两者、或用PlySs2(CF-301)溶素完全氨基酸序列，进行与Genbank数据库的序列比较，例如，以鉴定用于取代的氨基酸。CHAP结构域例如包括保守的半胱氨酸和组氨酸氨基酸序列(在本文的PlySs2(CF-301)序列中加下划线的)。合理地预测，例如保守的半胱氨酸和组氨酸残基应该维持在PlySs2(CF-301)的突变体或变体中，以便维持活性或能力。值得注意的是，在PlySs2(CF-301)序列中的缬氨酸氨基酸19处具有丙氨酸替换缬氨酸的突变体或变体是活性的，并且能够杀死革兰氏阳性菌，其方式与最初分离且测序的PlySs2(CF-301)溶素相似且一样有效。
例如，PlySs2(CF-301)溶素(SEQ ID NO：3)包含N末端CHAP结构域(LNNV...HYIT；氨基酸8到146)和C末端SH3结构域((RSYR...YVAT；氨基酸162到228)。具有结构域序列同源性的这两个区域一起构成PlySs2(CF-301)氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的总共245个氨基酸中的206个，代表多肽序列的84％。因此，PlySs2(CF-301)溶素氨基酸序列中的许多对应于结构域同源序列。另外，关于CHAP和SH3结构域序列中的每一个，并且促成变体的半合理设计的结构/功能信息，对于本领域技术人员是可获得的。例如，Bateman和Rawlings(Bateman，A.和Rawlings N.D.(2003)Trends in Biochemical Sciences 28(5)：234-237″The CHAP domain：a large family of amidases including GSP amidase andpeptidoglycan hydrolases″)描述并鉴定了众多多肽中的CHAP结构域，证实了示例性比对中的序列变异，并且鉴定了关键的不变的半胱氨酸和组氨酸残基。这个分析和信息由Zou和Hou(Zou，Y和Hou，C.(2010)Computational Biology and Chemistry 34：251-257″Systematic analysis of an amidase domain CHAP in 12 Staphylococcus aureusgenomes and 44staphylococcal phage genomes″)在超过50个细菌和噬菌体基因组中的CHAP结构域的详细***分析中加以扩展，所述详细***分析包括序列比对、共有二级结构、序列变异的分析、以及高度保守残基的表征和序列签名。在已公开的技术中描述且表征了原核或细菌SH3结构域，包括良好保守的残基和荷电残基、疏水性残基等的结构表征和鉴定。例如，Whisstock，J.C.和Lesk，A.M.(″SH3 domains in prokaryotes″Trends inBiochemical Sciences 24：132-133(1999))描述了细菌中的SH3结构域同源性，并且比对表示保守残基和方面的氨基酸序列。在这个出版物之后，Ponting等人(″EukaryoticSignaling Domain Homologues in Archae and Bacteria.Ancient Ancestry andHorizontal Gene Transfer″J Mol Biol(1999)289：729-745)评估了各种结构域同源物包括SH3，并且提供了跨越众多细菌SH3b结构域序列的扩展序列评价和比对，描述了示例性取代并突出显示了良好保守的氨基酸。
下述是氨基酸的各种分组的一个实例：
具有非极性R基团的氨基酸
丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸
具有非荷电的极性R基团的氨基酸
甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺
具有荷电的极性R基团的氨基酸(在Ph 6.0下带负电荷)
天冬氨酸、谷氨酸
碱性氨基酸(在pH 6.0下带正电荷)
赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在pH 6.0下)
另一个分组可以是具有苯基的那些氨基酸：
苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸
另一个分组可以根据分子量(即，R基团的大小)：
特别优选的取代是：
-Lys取代Arg且反之亦然，使得可以维持正电荷；
-Glu取代Asp且反之亦然，使得可以维持负电荷；
-Ser取代Thr，使得可以维持游离的-OH；和
-Gln取代Asn，使得可以维持游离的NH2。
示例性和优选的保守氨基酸取代包括以下任一种：
谷氨酰胺(Q)取代谷氨酸(E)且反之亦然；亮氨酸(L)取代缬氨酸(V)且反之亦然；丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)且反之亦然；异亮氨酸(I)取代缬氨酸(V)且反之亦然；赖氨酸(K)取代谷氨酰胺(Q)且反之亦然；异亮氨酸(I)取代甲硫氨酸(M)且反之亦然；丝氨酸(S)取代天冬酰胺(N)且反之亦然；亮氨酸(L)取代甲硫氨酸(M)且反之亦然；赖氨酸(L)取代谷氨酸(E)且反之亦然；丙氨酸(A)取代丝氨酸(S)且反之亦然；酪氨酸(Y)取代苯丙氨酸(F)且反之亦然；谷氨酸(E)取代天冬氨酸(D)且反之亦然；亮氨酸(L)取代异亮氨酸(I)且反之亦然；赖氨酸(K)取代精氨酸(R)且反之亦然。
还可以引入氨基酸取代，以具有特别优选的特性来取代氨基酸。例如，Cys可以引入与另一个Cys的二硫桥的潜在位点。His可以引入作为特别的“催化”位点(即，His可以充当酸或碱，并且是生物化学催化中最常见的氨基酸)。Pro可能由于其特别的平面结构而引入，所述平面结构诱导蛋白质的结构中的β转角。
如本文所述的多肽或表位可以用于生成抗体，并且还可以用于检测与溶素或识别溶素蛋白的分子的结合。另一个实施方案是分子，例如抗体或其它特异性结合剂，所述结合剂可以通过使用表位，例如通过常规免疫或通过相展示方法来产生，其中如果存在潜在的结合剂，则表位可以用于筛选文库。此类分子识别溶素蛋白或编码溶素蛋白的核酸的一个或多个表位。识别表位的抗体可以是单克隆抗体、人源化抗体或抗体蛋白的一部分。期望地，识别表位的分子具有对于该表位的特异性结合，其是该分子对于血清白蛋白具有的结合力的至少10倍。特异性结合可以测量为亲和力(Km)。更期望地，在相同条件下，与对于血清白蛋白的那种相比，特异性结合为至少102、103、104、105、106、107、108或甚至更高。
在一个期望的实施方案中，抗体或抗体片段的形式可用于检测溶素蛋白的存在，或者可替代地，检测对溶素蛋白敏感的细菌的存在。在一个进一步的实施方案中，抗体可以例如在嵌合蛋白或融合蛋白中与本发明的溶素多肽附着或以其它方式结合，并且可以作用于将溶素引导至目的细菌细胞或菌株或靶。可替代地，溶素多肽可以作用于引导抗体，或例如在完全或部***解细菌细胞壁中与抗体结合起作用，使得抗体可以特异性结合其在细菌上或细菌中的表面上或表面下的表位。例如，本发明的溶素可以附着至抗链球菌抗体，并且将抗体引导至其表位。
如技术人员将了解的，用于抗体合成的各种形式和方法是已知的。抗体可以与报道分子或原子例如氟、产生光信号的酶、化学发光体(chemilumiphore)、微粒或放射性原子缀合(共价复合)。抗体或抗体片段可以在动物免疫后在体内合成，例如，抗体或抗体片段可在基因重组后经由细胞培养合成。抗体或抗体片段可以通过细胞合成和化学修饰的组合来制备。
“抗体”是结合特异性表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语涵盖多克隆、单克隆和嵌合抗体，最后提及的在美国专利号4,816,397和4,816,567中进一步详细描述。术语“抗体”描述了无论是天然还是部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语还覆盖了具有结合结构域的任何多肽或蛋白质，所述结合结构域是抗体结合结构域或与其同源。该术语还考虑了CDR移植抗体。“抗体”是结合特异性表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语涵盖多克隆、单克隆和嵌合抗体，最后提及的在美国专利号4,816,397和4,816,567中进一步详细描述。术语“抗体”包括野生型免疫球蛋白(Ig)分子，其一般包含四条全长多肽链：两条重(H)链和两条轻(L)链，或其等价Ig同源物(例如，仅包含一条重链的骆驼科动物纳米抗体)；包括保留Ig分子的基本表位结合特点的全长功能性突变体、变体或衍生物，并且包括双重特异性、双特异性、多特异性和双重可变结构域抗体；免疫球蛋白分子可以是任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。在术语“抗体”的含义内还包括的是任何“抗体片段”。
“抗体片段”意指包含并非全长的至少一条多肽链的分子，包括(i)Fab片段，其是由可变轻(VL)、可变重(VH)、恒定轻(CL)和恒定重1(CH1)结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其是包含在铰链区处通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fab(Fd)片段的重链部分，其由VH和CH1结构域组成；(iv)可变片段(Fv)片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(v)结构域抗体(dAb)片段，其包含单个可结构变域(Ward，E.S.等人，Nature 341，544-546(1989))；(vi)骆驼科动物抗体；(vii)分离的互补决定区(CDR)；(viii)单链Fv片段，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域结合以形成抗原结合位点(Bird等人，Science，242，423-426，1988；Huston等人，PNASUSA，85，5879-5883，1988)；(ix)双抗体，其是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许在相同链上的两个结构域之间的配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点(WO94/13804；P.Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，(1993))；以及(x)线性抗体，其包含一对串联的Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)，其连同互补性轻链多肽一起形成一对抗原结合区；(xi)多价抗体片段(scFv二聚体、三聚体和/或四聚体(Power和Hudson，J Immunol.Methods242：193-2049(2000))；以及(xii)单独或以任何组合的重链和/或轻链的其它非全长部分，或者其突变体、变体或衍生物。
由于抗体可以以多种方式进行修饰，因此术语“抗体”应该解释为覆盖含有具有所需特异性的结合结构域的任何特异性结合成员或物质。因此，该术语覆盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等价物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是全部或部分合成的。因此包括的是与包含另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023以及美国专利号4,816,397和4,816,567中。
“抗体组合位点”是由特异性结合抗原的轻链或重链和轻链可变区和高变区组成的抗体分子的结构部分。
如本文使用的，以其各种语法形式的短语“抗体分子”考虑了完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分两者。示例性抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和含有对位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域中称为Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)的那些部分，所述部分优选用于本文所述的治疗方法中。
以其各种语法形式的短语“单克隆抗体”指仅具有一种能够与特定抗原免疫反应的抗体组合位点的抗体。因此，单克隆抗体通常展示对于它与之免疫反应的任何抗原的单一结合亲和力。因此，单克隆抗体可以含有具有多个抗体组合位点的抗体分子，每个结合位点对于不同的抗原是免疫特异性的；例如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。
术语“特异性”可以用于指这样的情况，其中特异性结合对的一个成员不显示与除其特异性结合配偶体外的分子的显著结合。当例如抗原结合结构域对于由许多抗原携带的特定表位特异性时，该术语也是适用的，在这种情况下，携带抗原结合结构域的特异性结合成员能够与携带表位的各种抗原结合。
术语“包含”一般以包括的意义使用，即允许存在一个或多个特征或组分。
术语“基本上由……组成”指具有限定数目的残基的产物，特别是肽序列，其并不共价附着至较大的产物。在本发明的其肽的情况下，本领域技术人员将了解，然而，可以考虑对肽的N末端或C末端的较小修饰，例如末端的化学修饰，以添加保护基团等等，例如C末端的酰胺化。
术语“分离的”指其中本发明的溶素多肽或编码此类多肽的核酸根据本发明的状态。多肽和核酸不含或基本上不含它们与之天然结合的材料，例如在其天然环境或它们在其中制备的环境(例如细胞培养物)中它们与之一起发现的其它多肽或核酸，当此类制备通过在体外或体内实践的重组DNA技术时。多肽和核酸可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且对于实践目的仍是分离的-例如，多肽通常与聚合物或粘膜粘附剂或其它载体混合，或当用于诊断或疗法中时，与药学上可接受的载体或稀释剂混合。
核酸
能够编码本发明的溶素多肽的核酸在本文中提及或提供，或者构成本发明的一个方面。在这个上下文中代表性的核酸序列是编码本文提供或提及的任何溶素的多肽的多核苷酸序列，以及在严格条件下与编码序列的DNA的互补序列杂交的序列。这些序列的进一步变体以及与那些序列杂交的核酸序列也考虑用于生产根据本公开内容的裂解酶，包括可以获得的天然变体。编码噬菌体相关的裂解酶的大量各种分离的核酸序列或cDNA序列，以及与此类基因序列杂交的部分序列可用于本发明的溶素酶或多肽的重组产生。
“复制子”是充当体内DNA复制的自主单位的任何遗传元件(例如，质粒、染色体、病毒)；即，能够在其自身的控制下复制。
“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一个DNA区段可以与之附着，以便达到所附着区段的复制。
“DNA分子”指以其单链形式或双链螺旋的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，而不是将其限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括尤其是在线性DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA的结构时，分子可以在本文中根据通常的惯例进行描述，仅给出沿着DNA的非转录链(即，具有与mRNA同源的序列的链)在5′至3′方向上的序列。
“复制起点”指参与DNA合成的那些DNA序列。
DNA“编码序列”是双链DNA序列，当置于适当调节序列的控制下时，所述双链DNA序列在体内被转录并翻译成多肽。编码序列的边界由在5′(氨基)末端处的起始密码子和在3′(羧基)末端处的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列且甚至是合成DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3′末端。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等等，其提供用于编码序列在宿主细胞中的表达。
“启动子序列”是DNA调节区，其能够结合细胞中的RNA聚合酶，并且起始下游(3′方向)编码序列的转录。为了定义本发明的目的，启动子序列在其3′末端处由转录起始位点结合，并且向上游(5′方向)延伸，以包括在高于背景的可检测水平下起始转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点(方便地通过用核酸酶S1作图来定义)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核启动子经常但并非总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。除-10和-35共有序列之外，原核启动子还含有夏因-达尔加诺序列(Shine-Dalgarno sequence)。
“表达控制序列”是控制且调节另一个DNA序列的转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，所述mRNA随后翻译成由编码序列编码的蛋白质时，编码序列处于细胞中的转录和翻译控制序列的“控制下”。
在编码序列之前可以包括“信号序列”。这个序列编码位于多肽的N末端的信号肽，其与宿主细胞通讯以将多肽引导至细胞表面或将多肽分泌到培养基内，并且这个信号肽在蛋白质离开细胞之前被宿主细胞剪切。可以发现信号序列与对原核生物和真核生物天然的各种蛋白质结合。
如本文在提到本发明的探针中使用的，术语“寡核苷酸”定义为由两个或更多个，优选多于三个核糖核苷酸组成的分子。它的确切大小取决于许多因素，所述因素依次又取决于寡核苷酸的最终功能和用途。
如本文使用的，术语“引物”指寡核苷酸，无论是如纯化的限制性消化中天然存在的还是合成产生的，当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下以及在合适的温度和pH下时，所述寡核苷酸能够充当合成的起始点。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长，以在诱导剂的存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多个核苷酸，尽管它可以含有更少的核苷酸。
引物在本文中选择为与特定靶DNA序列的不同链“基本上”互补。这意指引物必须足够互补以与其分别的链杂交。因此，引物序列无需反映模板的确切序列。例如，非互补核苷酸片段可以附着至引物的5′末端，而引物序列的剩余部分与链互补。可替代地，可以将非互补碱基或更长的序列散布到引物中，条件是引物序列与链的序列具有足够的互补性以与其杂交，且从而形成用于合成延伸产物的模板。
如本文使用的，术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”指细菌酶，其各自在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。
当外源或异源DNA已引入细胞内部时，该细胞已通过此类DNA进行“转化”。转化DNA可以整合或不整合(共价连接)到构成细胞的基因组的染色体DNA内。例如，在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可以维持在附加型元件如质粒上。关于真核细胞，稳定转化的细胞是这样的细胞，其中转化DNA已变得整合到染色体内，使得它通过染色体复制由子细胞遗传。这种稳定性通过真核细胞建立细胞系或克隆的能力得到证实，所述细胞系或克隆由含有转化DNA的子细胞群体组成。“克隆”是通过有丝***从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群体。“细胞系”是能够在体外稳定生长多代的原代细胞的克隆。
当至少约75％(优选至少约80％，且最优选至少约90或95％)的核苷酸在DNA序列的限定长度上匹配时，两个DNA序列是“基本上同源的”。可以使用序列数据库中可用的标准软件比较序列，或在例如如对于该特定***定义的严格条件下的DNA杂交实验中，通过比较序列来鉴定基本上同源的序列。定义适当的杂交条件在本领域的技术内。参见例如，Maniatis等人，同上；DNA Cloning，第I&II卷，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
许多本文考虑的变体DNA分子包括通过标准DNA诱变技术，例如M13引物诱变产生的那些。这些技术的细节在Sambrook等人(1989)In Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.(引入本文作为参考)中提供。通过使用此类技术，可以产生与所公开的变体稍有不同的变体。本公开内容考虑了DNA分子和核苷酸序列，其是本文具体公开的那些的衍生物，并且通过核苷酸的缺失、添加或取代而与公开的那些不同，同时仍编码具有溶素多肽的功能特征的蛋白质。还包括的是衍生自公开的DNA分子的小DNA分子。此类小DNA分子包括适合用作杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物的寡核苷酸。像这样，这些小DNA分子至少包含由猪链球菌的噬菌体遗传编码的裂解酶的区段，并且为了PCR的目的，至少包含基因的10-15核苷酸的序列，并且更优选地，15-30核苷酸的序列。如上所述，衍生自公开的DNA分子的DNA分子和核苷酸序列也可以定义为在严格条件下与公开的DNA序列或其片段杂交的DNA序列。
对应于特定严格性程度的杂交条件根据选择的杂交方法的性质，以及所使用的杂交DNA的组成和长度而变。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是钠离子浓度)决定杂交的严格性。关于达到特定严格性程度所需的杂交条件的计算由Sambrook等人在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9和11章(引入本文作为参考)中讨论。
此类计算的实例如下。可以通过DNA分子(例如，由对于炭疽芽孢杆菌特异性的噬菌体遗传编码的裂解酶的自然变异)与靶DNA分子的杂交来执行杂交实验。靶DNA可以是例如相应的cDNA，其已在琼脂糖凝胶中电泳并且通过DNA印迹(Southern(1975).J.Mol.Biol.98：503)转移到硝酸纤维素膜，所述DNA印迹是本领域众所周知的技术，并且在Sambrook等人(1989)In Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，N.Y.(引入本文作为参考)中描述。与用同位素P32标记的dCTP标记的靶探针的杂交在高离子强度(例如6倍SSC)的溶液中，在比解链温度Tm(下文描述)低20-25摄氏度的温度下进行。对于此类DNA杂交实验，其中DNA印迹上的靶DNA分子含有10ng或更多的DNA，杂交使用1-2ng/ml放射性标记的探针(具有等于109CPM/杯或更大的的比活性)进行6-8小时。杂交后，洗涤硝酸纤维素滤器，以去除背景杂交。洗涤条件尽可能严格，以去除背景杂交，同时保留特定的杂交信号。术语“Tm”表示高于其，在普遍的离子条件下，放射性标记的探针分子不与其靶DNA分子杂交的温度。此类杂交分子的Tm可以由下述方程式进行估计：Tm＝81.5℃-16.6(钠离子浓度的log10)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/1)，其中1＝以碱基对计的杂合体长度。该方程式对于在0.01M至0.4M范围内的钠离子浓度有效，并且它对于计算较高钠离子浓度的溶液中的Tm较不准确(Bolton和McCarthy(1962).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：1390)(引入本文作为参考)。方程式还对于G+C含量在30％至75％内的DNA有效，并且也适用于长度大于100个核苷酸的杂交体。寡核苷酸探针的行为在Sambrook等人(1989)，In Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，N.Y.(引入本文作为参考)的第11章中详细描述。此处描述的优选的示例性条件特别考虑用于选择裂解基因的变异中。
在本公开内容的优选实施方案中，严格条件可以定义为在其下具有多于25％序列变异(也称为“错配”)的DNA分子不杂交的那些条件。在一个更优选的实施方案中，严格条件是在其下具有多于15％错配的DNA分子不杂交的那些条件，且再更优选地，严格条件是在其下具有多于10％错配的DNA序列不杂交的那些条件。优选地，严格条件是在其下具有多于6％错配的DNA序列不杂交的那些条件。
遗传密码的简并性进一步拓宽了实施方案的范围，因为它使DNA分子的核苷酸序列中的主要变化成为可能，同时维持编码蛋白质的氨基酸序列。例如，代表性的氨基酸残基是丙氨酸。这可以通过核苷酸密码子三联体GCT在cDNA中编码。由于遗传密码的简并性，其它三个核苷酸密码子三联体--GCT、GCC和GCA--也编码丙氨酸。因此，该基因的核苷酸序列可以在该位置处改变为这三个密码子中的任一个，而不影响所编码蛋白质的氨基酸组成或蛋白质的特征。关于特定氨基酸的遗传密码和核苷酸密码子中的变异是技术人员众所周知的。基于遗传密码的简并性，可以使用如上所述的标准DNA诱变技术，或通过DNA序列的合成，从本文公开的cDNA分子衍生变体DNA分子。由于基于遗传密码的简并性的序列变异，在严格条件下不与所公开的cDNA序列杂交的DNA序列在本文中由本公开内容包含。
因此，应该了解，还在本发明的范围内的是编码本发明的溶素包括PlySs2的DNA序列，所述序列编码这样的多肽，所述多肽具有与本文提供或提及的相同氨基酸序列，但对其是简并的或者对所提供或提及的示例性核酸序列是简并的。“简并”意指不同的三字母密码子用于指定特定的氨基酸。本领域众所周知的是，下述密码子可以互换使用，以编码每种特定的氨基酸：
苯丙氨酸(Phe或F) UUU或UUC
亮氨酸(Leu或L) UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG
异亮氨酸(Ile或I) AUU或AUC或AUA
甲硫氨酸(Met或M) AUG
缬氨酸(Val或V) GUU或GUC ofGUA或GUG
丝氨酸(Ser或S) UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC
脯氨酸(Pro或P) CCU或CCC或CCA或CCG
苏氨酸(Thr或T) ACU或ACC或ACA或ACG
丙氨酸(Ala或A) GCU或GCG或GCA或GCG
酪氨酸(Tyr或Y) UAU或UAC
组氨酸(His或H) CAU或CAC
谷氨酰胺(Gln或Q) CAA或CAG
天冬酰胺(Asn或N) AAU或AAC
赖氨酸(Lys或K) AAA或AAG
天冬氨酸(Asp或D) GAU或GAC
谷氨酸(Glu或E) GAA或GAG
半胱氨酸(Cys或C) UGU或UGC
精氨酸(Arg或R) CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG
甘氨酸(Gly或G) GGU或GGC或GGA或GGG
色氨酸(Trp或W) UGG
终止密码子 UAA(ochre)或UAG(amber)或UGA(opal)。
应该理解，上文指定的密码子用于RNA序列。关于DNA的相应密码子具有T取代U。
本领域技术人员将认识到，此处描述和本领域已知的DNA诱变技术可以产生广泛多样的DNA分子，其编码作为实例的链球菌属的噬菌体溶素，但仍维持本文描述且提供的裂解多肽的基本特征。也可以选择新近衍生的蛋白质，以便获得关于裂解多肽特征的变异，如在下文更全面地描述的。此类衍生物包括在氨基酸序列中具有变异的那些，所述变异包括较小的缺失、添加和取代。
虽然用于引入氨基酸序列变异的位点可以是预定的，但突变本身无需是预定的。例如，为了优化中给定位点处的突变的性能，可以在靶密码子或区域处进行随机诱变，并且在表达的蛋白质变体中筛选所需活性的最佳组合。如上所述，用于在具有已知序列的DNA的预定位点处制备取代突变的技术是众所周知的。
氨基酸取代通常是单个残基，或者可以是一个或多个、一个或儿个、一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个残基；***通常在1至10个氨基酸残基的级别上；且缺失范围为约1至30个残基。缺失或***可以是单一形式，但优选在相邻对中制备，即2个残基的缺失或2个残基的***。取代、缺失、***或其任何组合可以组合，以获得最终的构建体。显而易见的是，在编码蛋白质的DNA中制备的突变一定不能将序列置于读码框外，并且优选不产生可能产生二级mRNA结构的互补区域。
取代变体是其中氨基酸序列中的至少一个残基已去除并且在其位置中***不同残基的那些。可以制备此类取代，以便对蛋白质特征不生成显著作用，或者当需要精细调节蛋白质的特征时。可以取代蛋白质中的原始氨基酸并且被视为保守取代的氨基酸，在上文描述并且由本领域技术人员认识到。
可以通过选择较不保守的取代，例如通过选择在其维持以下的作用方面更显著不同的残基，来制备在功能或免疫同一性中的基本改变：(a)取代区域中的多肽主链的结构，例如，作为片层或螺旋构象；(b)该分子在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。一般而言预期在蛋白质特性中产生最大变化的取代是这样的，其中：(a)亲水性残基例如丝氨酰基或苏氨酰基取代(或被其取代)疏水性残基例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或被其取代)任何其它残基；(c)具有正电侧链的残基例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基取代(或被其取代)负电残基例如谷氨酰基或天冬氨酰基；或(d)具有庞大的侧链的残基例如苯丙氨酸取代(或被其取代)没有侧链的氨基酸例如甘氨酸。
可以通过分析衍生物或变体蛋白裂解或杀死敏感细菌、或补充由噬菌体在受感染的细菌宿主中显示出的对DNA交联剂的敏感性的能力，来评价这些氨基酸取代或缺失或添加对于裂解多肽的衍生物或变体的作用。可以通过如上所述将编码衍生物或变体蛋白的DNA分子转染到细菌内，或者通过使细菌与来自宿主的表达蛋白一起温育来执行这些测定，所述宿主用编码衍生物或变体蛋白的DNA分子转染。
虽然用于引入氨基酸序列变异的位点可以是预定的，但突变本身无需是预定的。例如，为了优化中给定位点处的突变的性能，可以在靶密码子或区域处进行随机诱变，并且在表达的蛋白质变体中筛选所需活性的最佳组合。如上所述，用于在具有已知序列的DNA的预定位点处制备取代突变的技术是众所周知的。
本发明的另一个特点是本文公开的DNA序列的表达。如本领域中众所周知的，可以通过将DNA序列可操作地连接至适当的表达载体中的表达控制序列，并且采用该表达载体来转化适当的单细胞宿主来表达DNA序列。当然，本发明的DNA序列与表达控制序列(如果并非已经是DNA序列的部分)的此类可操作连接，包括在DNA序列上游的正确读码框中的起始密码子ATG的提供。在表达本发明的DNA序列时可以采用广泛多样的宿主/表达载体组合。例如，有用的表达载体可以由染色体、非染色体和合成DNA序列的区段组成。合适的载体包括SV40的衍生物和已知的细菌质粒，例如大肠杆菌质粒colEl、pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物，质粒例如RP4；噬菌体DNAS，例如噬菌体λ的众多衍生物，例如NM989，以及其它噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒，例如2质粒或其衍生物；在真核细胞中有用的载体，例如在昆虫或哺乳动物细胞中有用的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，例如已进行修饰以采用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；等等。
广泛多样的表达控制序列中的任一种--控制与其可操作地连接的DNA序列的表达的序列--可以用于这些载体中以表达本发明的DNA序列。此类有用的表达控制序列包括例如SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒的早期或晚期启动子，lac***，trp***，TAC***，TRC***，LTR***，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd外壳蛋白的控制区，关于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子(例如Pho5)，酵母-交配因子的启动子，以及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列及其各种组合。
广泛多样的单细胞宿主细胞也可用于表达本发明的DNA序列。这些宿主可以包括众所周知的真核和原核宿主，例如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、真菌(例如酵母)和动物细胞(例如CHO、Rl.l、B-W和L-M细胞)、非洲绿猴肾细胞(例如COS 1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(例如Sf9)以及组织培养中的人细胞和植物细胞。
应理解，并非所有的载体、表达控制序列和宿主都同样良好地起作用，以表达本发明的DNA序列。所有宿主也并非同样良好地对相同的表达***起作用。然而，本领域技术人员能够选择适当的载体、表达控制序列和宿主，而无需过度实验来完成所需的表达，而不背离本发明的范围。
多肽的编码序列片段的文库可以用于生成多变的多肽群体，用于变体的筛选和随后选择。例如，编码序列片段的文库可以通过以下生成：在其中切口仅发生约一次/分子的条件下，用核酸酶处理目的编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性，以形成可以包括来自不同切口产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶的处理从改造的双链体中去除单链部分，并且将所得到的片段文库连接到表达载体内。通过这种方法，可以衍生出表达文库，其编码目的蛋白质的各种大小的N末端片段和内部片段。
几种技术在本领域中已知用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物，以及用于在cDNA文库中筛选具有选择特性的基因产物。用于筛选大基因文库，可顺应高流通量分析的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体内，用所得到的载体文库转化适当的细胞，并且在其中所需活性的检测促进分离编码检测到其产物的基因的载体的条件下，表达组合基因。递归总体诱变(REM)，增强文库中的功能性突变体的频率的技术，可以与筛选测定组合使用，以鉴定蛋白质的变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。
组合物
根据本发明提供了包含本发明的裂解酶/多肽的治疗或药物组合物，以及相关的使用方法和制造方法。治疗或药物组合物可以包含一种或多种裂解多肽，并且任选地包括天然、截短、嵌合或改组的裂解酶，任选地与其它组分例如载体、媒介物、多肽、多核苷酸、holin蛋白、一种或多种抗生素或合适的赋形剂、载体或媒介物组合。本发明提供了本发明的溶素的治疗组合物或药物组合物，所述溶素特别是具有SH3型结合结构域的溶素，包括PlySs2(CF-301)、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，其用于革兰氏阳性菌，特别包括葡萄球菌属细菌，包括细菌感染或相关状况的杀死、减轻、去定殖、预防或治疗。本发明提供了本发明的溶素的治疗组合物或药物组合物，所述溶素特别是具有SH3型结合结构域的溶素，包括PlySs2(CF-301)、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，其用于治疗、减少或控制通过革兰氏阳性菌特别包括链球菌属的污染和/或感染，包括外表面例如皮肤的污染或感染或者经由外表面例如皮肤的污染或感染。从而考虑并提供用于局部或皮肤病学应用，以及对外部包括皮肤或其它外表面的一般施用的组合物。包含具有SH3型结合结构域的溶素的组合物，所述溶素包括PlySs2(CF-301)、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，特别是PlySs2(CF-301)，包括其结构域、截短或变体，在本文中提供用于杀死、减轻、去定殖、预防或治疗革兰氏阳性菌，包括特别是链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属或李斯特菌属(包括化脓性链球菌和抗生素抗性金黄色葡萄球菌)的细菌感染或相关状况。
治疗组合物中包括的酶或多肽可以是未改变的噬菌体相关裂解酶、截短的裂解多肽、变体裂解多肽、以及嵌合的和/或改组的裂解酶中的一种或多种或任何组合。另外，可以使用由不同噬菌体遗传编码的不同裂解多肽用于治疗相同细菌。这些裂解酶也可以是“未改变的”裂解酶或多肽、截短的裂解多肽、变体裂解多肽、以及嵌合的和改组的裂解酶的任何组合。用于革兰氏阳性菌(包括链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属)的治疗或药物组合物中的裂解酶/多肽，可以单独使用或与抗生素组合使用，或者如果存在待治疗的其它侵入性细菌生物，则与对于待靶向的其它细菌特异性的其它噬菌体相关的裂解酶组合使用。裂解酶、截短的酶、变体酶、嵌合酶、嵌合多肽、融合多肽、含有SH-3结合结构域的肽或构建体、和/或改组的裂解酶可以与另一种治疗或抗菌肽结合使用。另一种治疗或抗菌肽的量也可以是不同的。各种抗生素可以任选地与酶或多肽一起包括在治疗组合物中，并且连同或不连同另一种治疗或抗菌肽的存在。多于一种裂解酶或多肽可以包括在治疗组合物中。
药物组合物还可以包括通过化学合成或DNA重组技术产生的一种或多种改变的裂解酶，包括其同工酶、类似物或变体。特别地，改变的裂解蛋白可以通过氨基酸取代、缺失、截短、嵌合、融合、改组或其组合来产生。药物组合物可以含有一种或多种天然裂解蛋白和一种或多种截短的、变体、嵌合的或改组的裂解蛋白的组合。药物组合物还可以含有衍生自相同或不同细菌物种的至少一种裂解蛋白的肽或肽片段，连同一种或多种补充试剂的任选添加，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明提供了细菌溶素，其包含裂解多肽变体，例如PlySs2(CF-301)、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGHl5溶素和ALE-1溶素的变体，特别是具有细菌杀死活性的PlySs2(CF-301)溶素多肽变体。在一个方面，变体具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含本文提供的溶素多肽氨基酸序列或与之具有至少80％、85％、90％、95％或99％的氨基酸同一性，所述本文提供的溶素多肽氨基酸序列包括与SEQ IDNO：3-7中的任一个或之一或者本文提及或本文提供作为参考的任何溶素多肽序列，特别是具有SH-3型结合结构域的参考溶素。本发明包括SH-3型溶素多肽截短突变体，包括PlySs2(CF-301)溶素截短突变体，其仅含有结合结构域，或仅含有一个催化或酶促结构域，并且保留细菌结合活性或革兰氏阳性抗菌活性。本发明包括例如示例性的溶素截短突变体，其仅含有选自结合结构域、酰胺酶结构域和氨基葡糖苷酶结构域的一个结构域。例如，在截短突变体中，酶促结构域例如氨基葡糖苷酶结构域是缺失的，使得截短的溶素包含且含有替换或可替代的N末端酶促结构域和细胞壁结合结构域，特别是SH3B型结合结构域。
药物组合物可以含有补充试剂，包括一种或多种抗微生物剂和/或一种或多种常规抗生素。为了加速感染的治疗，治疗试剂可以进一步包括至少一种补充试剂，其也可以加强裂解酶的杀菌活性。抗微生物药在很大程度上通过抑制细胞壁合成、抑制细胞膜功能和/或抑制代谢功能(包括蛋白质和DNA合成)，通过干扰细菌细胞的结构或功能来起作用。抗生素可以广泛地分成以下亚组：影响细胞壁肽聚糖生物合成的那些、以及影响革兰氏阳性菌中的DNA或蛋白质合成的那些。细胞壁合成抑制剂，包括青霉素和类似它的抗生素，破坏刚性的外部细胞壁，使得相对不受支持的细胞肿胀并最终破裂。影响细胞壁肽聚糖生物合成的抗生素包括：糖肽，其通过防止N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)肽亚基掺入肽聚糖基质内，来抑制肽聚糖的合成。可用的糖肽包括万古霉素和替考拉宁；青霉素，其通过抑制肽聚糖交联的形成起作用。青霉素的功能基团，β-内酰胺部分，结合并抑制连接细菌中的肽聚糖分子的DD-转肽酶。水解酶继续分解细胞壁，由于渗透压引起细胞裂解或死亡。常见的青霉素包括苯唑西林、氨苄青霉素和氯唑西林；和多肽，其干扰C55-异戊二烯基焦磷酸的去磷酸化，所述C5s-异戊二烯基焦磷酸是在质膜外携有肽聚糖构件块的分子。影响细胞壁的多肽是杆菌肽。
补充试剂可以是抗生素，例如红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、大环内酯家族的其它成员、青霉素、头孢菌素及其任何组合，其量有效地协同增强裂解酶的疗效。实际上，任何其它抗生素都可以与改变的和/或未改变的裂解酶一起使用。类似地，其它裂解酶可以包括在载体中，以治疗其它细菌感染。当治疗不同的疾病时，抗生素补充剂可以用于酶的实际上所有用途中。
还提供的是含有核酸分子的组合物，所述核酸分子单独或与其它核酸分子组合，能够在体内表达有效量的裂解多肽或裂解多肽的肽片段。还提供的是含有这些核酸分子、多核苷酸、以及在体外或体内携带且表达这些分子的载体的细胞培养物。
治疗或药物组合物可以包含与各种载体组合的裂解多肽，以治疗由敏感的革兰氏阳性菌引起的病。载体适当地含有少量的添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类材料在采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，包括缓冲剂、例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸或其盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；甘氨酸；氨基酸，例如谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、海藻糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；抗衡离子，例如钠；非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或聚乙二醇(PEG)；和/或中性盐，例如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2及其它。用于制药用途的丙三醇或甘油(1，2，3-丙三醇)是商购可得的。它可以在无菌注射用水、或氯化钠注射液、或其它药学上可接受的水性注射流体中稀释，并且以0.1至100％(v/v)，优选1.0至50％、更优选约20％的浓度使用。DMSO是非质子溶剂，具有增强许多局部应用的药物的渗透性的显著能力。DMSO可以在无菌注射用水、或氯化钠注射液、或其它药学上可接受的水性注射流体中稀释，并且以0.1至100％(v/v)的浓度使用。载体媒介物还可以包括林格氏溶液、缓冲溶液和右旋糖溶液，特别是在制备静脉内溶液时。
用于裂解多肽的任何载体都可以通过常规手段制造。然而，优选任何漱口水或类似类型的产品都不包含醇，以防止多肽/酶的变性。类似地，当在制造过程期间，将裂解多肽置于咳嗽药、口香糖、糖果或锭剂中时，应该在锭剂或糖果硬化之前，但在咳嗽药或糖果已略微冷却后，进行此类放置，以避免酶的热变性。
一种或多种裂解多肽可以以液体形式或冻干状态加入这些物质中，随后当它遇到体液如唾液时被溶解。多肽/酶也可以在胶束或脂质体中。
治疗感染的改变的或未改变的裂解酶/多肽的有效剂量率或量部分取决于裂解酶/多肽是在治疗上还是在预防上使用，受体对感染细菌的暴露持续时间、个体的大小和重量等。关于含有酶/多肽的组合物的使用持续时间也取决于使用是否用于预防目的，其中所述使用可以是对于短时间段每小时一次、每天一次或每周一次，或者使用是否用于治疗目的，其中可能需要更密集的组合物使用方案，使得使用可以持续数小时、数天或数周，和/或在每天的基础上或以在一天期间的定时间隔。所采用的任何剂型都应该提供用于最短时间量的最小单位数目。在鼻和口腔通道的湿润或潮湿环境中，认为提供酶的有效量或剂量的酶活性单位的浓度可以在约100单位/ml至约500,000单位/ml流体的范围内，并且可能在约100单位/ml至约50,000单位/ml的范围内。更具体地，暴露于活性酶/多肽单位的时间可以影响活性酶单位的所需浓度/ml。被分类为“长”或“慢”释放载体的载体(例如某些鼻喷雾剂或锭剂)可能具有或提供较低浓度的活性(酶)单位/ml，但在更长的时间段内，而“短”或“快”释放载体(例如含漱液)可以具有或提供高浓度的活性(酶)单位/ml，但在更短的时间段内。活性单位/ml的量和暴露时间的持续时间取决于感染的性质，治疗是预防性还是治疗性的，以及其它变量。存在其中可能必需具有高得多的单位/ml剂量或更低的单位/ml剂量的情况。
裂解酶/多肽应该处于具有允许裂解酶/多肽活性的pH的环境中。例如，如果人个体已暴露于患有细菌性上呼吸道病症的另一个人，则裂解酶/多肽位于粘膜衬里中，并且防止感染细菌的任何定殖。在改变的裂解酶处于载体***或经口递送模式之前或之时，优选该酶在稳定的缓冲液环境中，用于维持在约4.0至约9.0之间，更优选在约45.5至约7.5之间的pH范围。
稳定缓冲液可以允许溶素酶/多肽的最佳活性。缓冲液可以含有还原剂，例如二硫苏糖醇。稳定缓冲液也可以是或包括金属螯合剂，例如乙二胺四乙酸二钠盐，或者它还可以含有磷酸盐或柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液或任何其它缓冲液。可以改变这些噬菌体和其它噬菌体的DNA编码，以允许重组酶在多于两个位处置攻击一个细胞壁，以允许重组酶切割多于一个细菌物种的细胞壁，以允许重组酶攻击其它细菌，或其任何组合。对重组噬菌体产生的酶的改变类型和数目是无法计算的。
温和表面活性剂可以包括在治疗或药物组合物中，其量有效加强组合物中可以使用的裂解酶/多肽的疗效。合适的温和表面活性剂尤其包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇和脂肪酸的酯(Tween系列)、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton-X系列)、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷和生物学存在的表面活性剂，例如脂肪酸、甘油酯、甘油单酸酯、脱氧胆酸盐和脱氧胆酸酯。
防腐剂也可以用于本发明中，并且优选包含按总组合物的重量计约0.05％至0.5％。防腐剂的使用确保如果产物被微生物污染，则该制剂预防或减少微生物的生长。可用于本发明中的一些防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯二甲苯酚、苯甲酸钠、DMDM乙内酰脲、3-碘-2-丙基丁基氨基甲酸酯、山梨酸钾、氯己定二葡萄糖酸盐或其组合。
用于在本发明的所有实施方案中使用的药物包括抗微生物剂、抗炎剂、抗病毒剂、局部麻醉剂、皮质类固醇、破坏性疗法试剂、抗真菌剂和抗雄激素。在痤疮的治疗中，可以使用的活性药物包括抗微生物剂，尤其是具有抗炎特性的那些，例如氨苯砜、红霉素、米诺环素、四环素、克林霉素和其它抗微生物剂。关于抗菌剂的优选重量百分比为0.5％至10％。
局部麻醉剂包括丁卡因、盐酸丁卡因、利多卡因、盐酸利多卡因、达克罗宁、盐酸达克罗宁、盐酸二甲异喹、地布卡因、盐酸地布卡因、苦味酸氨苯丁酯和盐酸普莫卡因。关于局部麻醉剂的优选浓度为按总组合物的重量计约0.025％至5％。麻醉剂例如苯佐卡因也可以以按重量计约2％至25％的优选浓度使用。
可以使用的皮质类固醇包括二丙酸倍他米松、乙酸氟轻松(fluocinoloneactinide)、戊酸倍他米松、曲安奈德、丙酸氯倍他索、去羟米松、二乙酸二氟拉松、安西奈德、氟氢缩松、戊酸氢化可的松、丁酸氢化可的松和***推荐以按重量计0.1％至1.0％的浓度使用。关于皮质类固醇例如氢化可的松或乙酸甲泼尼的优选浓度为按重量计约0.2％至约5.0％。
另外，治疗性组合物可以进一步包含其它酶，例如用于治疗连同敏感的革兰氏阳性菌一起存在的任何金黄色葡萄球菌细菌的酶溶葡萄球菌。粘液裂解肽，例如溶葡萄球菌素，已提出在人的金黄色葡萄球菌感染的治疗中是有效的(Schaffner等人，Yale J.Biol.&Med.，39：230(1967)。溶葡萄球菌素，模拟葡萄球菌的基因产物，通过酶促降解细胞壁的聚甘氨酸交联，对金黄色葡萄球菌发挥抑菌和杀菌效应(Browder等人，Res.Comm.，19：393-400(1965))。美国专利号3,278,378描述了用于从S.staphylolyticus，后来更名为模拟葡萄球菌的培养基中生产溶葡萄球菌素的发酵方法。用于产生溶葡萄球菌素的其它方法在美国专利号3,398,056和3,594,284中进一步描述。关于溶葡萄球菌素的基因已得到克隆且测序(Recsei等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：1127-1131(1987))。重组粘液溶解性杀菌蛋白，例如r-溶葡萄球菌素，由于其靶向特异性、低毒性和生物活性残渣的可能减少，可以潜在地避开与当前抗生素疗法相关的问题。此外，溶葡萄球菌素还针对非***细胞是活性的，而大多数抗生素需要活跃***的细胞来介导其效应(Dixon等人，Yale J.Biology和Medicine，41：62-68(1968))。与改变的裂解酶组合的溶葡萄球菌素可以在抗生素的存在或不存在下使用。存在在相同治疗试剂中使用溶葡萄球菌素和溶素酶两者方面添加重要性的程度。通常，当人具有细菌感染时，通过一个细菌属的感染削弱人体或改变机体的细菌菌群，允许其它潜在的致病细菌感染机体。有时共感染机体的细菌之一是金黄色葡萄球菌。许多金黄色葡萄球菌菌株产生青霉素酶，使得葡萄球菌属、链球菌属和其它革兰氏阳性菌菌株不被标准抗生素杀死。因而，可能与抗生素组合的溶素和溶葡萄球菌素的使用，可以充当细菌感染的最快速且有效的治疗。治疗组合物还可以包括变溶菌素和溶菌酶。
包含裂解酶/多肽的治疗组合物的应用手段包括但不限于直接、间接、载体和特殊手段或手段的任何组合。裂解酶/多肽的直接应用可以通过任何合适的手段，以直接使多肽与感染或细菌定殖的部位接触，例如鼻区域(例如鼻喷雾剂)、真皮或皮肤应用(例如局部软膏或制剂)、栓剂、棉塞应用等。鼻腔应用包括例如鼻喷雾剂、滴鼻剂、鼻软膏、鼻洗剂、鼻注射剂、鼻填塞、支气管喷雾剂和吸入剂，或者间接地通过润喉片、漱口水或含漱液的使用，或通过应用于鼻孔或面部的软膏的使用，或者这些和类似的应用方法的任何组合。可以施用裂解酶的形式包括但不限于锭剂、含片、糖果、注射剂、口香糖、片剂、粉末、喷雾剂、液体、软膏和气溶胶。
当通过使用喷雾剂，滴剂，软膏，洗涤剂，注射剂，填塞和吸入剂，直接引入天然和/或改变的裂解酶/多肽时，该酶优选在液体或凝胶环境中，其中液体充当载体。可以通过吸入器和支气管喷雾剂来施用改变的酶的干燥无水形式，尽管液体形式的递送是优选的。
用于治疗局部感染或污染的组合物包含有效量的至少一种裂解酶，包括根据本发明的PlySs2(CF-301)、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，特别包括PlySs2(CF-301)，以及用于将至少一种裂解酶递送至哺乳动物、人、伴侣动物或牲畜的受感染或受污染的皮肤、皮毛或外表面的载体。用于裂解酶的应用模式包括载体的多种不同类型和组合，所述载体包括但不限于水性液体、醇基液体、水溶性凝胶、洗剂、软膏、非水性液体基质、矿物油基质、矿物油和凡士林的共混物、羊毛脂、脂质体、蛋白质载体例如血清白蛋白或明胶、粉状纤维素卡梅尔及其组合。含有治疗试剂的载体的递送模式包括但不限于涂片、喷雾剂、定时释放贴剂、吸收液体的擦拭剂及其组合。裂解酶可以直接或在其它载体之一中应用于绷带。绷带可以潮湿或干燥出售，其中酶在绷带上为冻干形式。这种应用方法对于治疗受感染的皮肤最有效。局部组合物的载体可以包含半固体和凝胶样媒介物，其包括聚合物增稠剂、水、防腐剂、活性表面活性剂或乳化剂、抗氧化剂、防晒剂和溶剂或混合溶剂***。美国专利号5,863,560(Osborne)讨论了许多不同的载体组合，其可以帮助皮肤暴露于药剂。可以使用的聚合物增稠剂包括本领域技术人员已知的那些，例如化妆品和制药工业中频繁使用的亲水性和水醇性胶凝剂。CARBOPOLR TM是给予一般采用名称卡波姆的众多交联丙烯酸聚合物之一。这些聚合物溶解在水中，并且在用苛性材料(例如氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺或其它胺碱)中和后，形成透明或轻微混浊的凝胶。KLUCELR TM是纤维素聚合物，其分散在水中，并且在完全水合后形成均匀的凝胶。其它优选的胶凝聚合物包括羟乙基纤维素、纤维素胶、MVE/MA癸二烯交联聚合物、PVM/MA共聚物或其组合。
包含裂解酶/多肽的组合物可以以糖果、口香糖、锭剂、含片、片剂、粉末、气溶胶、液体、液体喷雾剂或牙膏的形式施用，用于防止或治疗与上呼吸道病相关的细菌感染。其中加入裂解酶/多肽的锭剂、片剂或口香糖可以含有糖、玉米糖浆、各种染料、非糖甜味剂、调味剂、任何结合剂或其组合。类似地，任何基于口香糖的产品都可以含有***胶、巴西棕榈蜡、柠檬酸、玉米淀粉、食用色素、调味料、非糖甜味剂、明胶、葡萄糖、丙三醇、胶基、虫胶、糖精钠、糖、水、白蜡、纤维素、其它结合剂及其组合。锭剂可以进一步含有蔗糖、玉米淀粉、***胶、黄蓍胶、茴香脑、亚麻籽、油树脂、矿物油和纤维素、其它结合剂及其组合。还可以使用糖替代品代替右旋糖、蔗糖或其它糖。
包含裂解酶或其肽片段的组合物可以被引导至粘膜衬里，当位于其中时，它们杀死定殖的病菌。如本文公开且描述的，粘膜衬里包括例如上呼吸道和下呼吸道、眼、颊、鼻、直肠、***、牙周袋、肠和结肠。由于粘膜组织的天然消除或清洁机制，常规剂型在应用部位处不保留任何显著的时间长度。
具有显示出对粘膜组织的粘附的材料，在一段时间内与一种或多种噬菌体酶和其它补充试剂一起施用可能是有利的。具有控制释放能力的材料是特别期望的，并且持续释放粘膜粘附剂的使用已受到显著程度的关注。J.R.Robinson(美国专利号4,615,697，引入本文作为参考)提供了用于粘膜药物递送中的各种控制释放聚合物组合物的良好综述。该专利描述了控制释放治疗组合物，其包括生物粘附剂和有效量的治疗试剂。该生物粘附剂是水可溶胀的，但不溶于水的纤维状、交联的羧基官能聚合物，其含有(a)多个重复单元，其中至少约80百分比含有至少一种羧基功能性，和(b)约0.05至约1.5百分比的基本上不含聚烯基聚醚的交联剂。尽管Robinson的聚合物是水可溶胀的但不溶的，但它们是交联的而不是热塑性的，并且不像本申请的共聚物***那样容易用活性剂配制成各种剂型。胶束和多层胶束也可以用于控制酶的释放。
涉及其为亲水和疏水材料的组合的粘膜粘附剂的其它方法是已知的。来自E.R.Squibb&Co的Orahesive.RTM.是粘附剂，其为果胶、明胶和羧甲基纤维素钠在粘性烃聚合物中的组合，用于粘附至口腔粘膜。然而，亲水和疏水组分的此类物理混合物最终散开。相比之下，在本申请中的亲水和疏水结构域产生不溶性共聚物。也引入作为参考的美国专利4,948,580描述了生物粘附性经口药物递送***。该组合物包括由共聚物聚(甲基乙烯基醚/马来酸酐)和明胶形成的冷冻干燥的聚合物混合物，其分散在软膏基质例如含有分散的聚乙烯的矿物油中。美国专利号5,413,792(引入本文作为参考)公开了包含以下的糊状制剂：(A)包含优选以按重量计3：6至6：3的比率存在的聚有机硅氧烷和水溶性聚合材料的糊状基质，以及(B)有效成分。美国专利号5,554,380请求保护固体或半固体生物粘附性经口可摄入药物递送***，其含有具有至少两个相的油包水***。一个相包含按体积计约25％至约75％的内部亲水相，且另一个相包含按体积计约23％至约75％的外部疏水相，其中所述外部疏水相由三种组分组成：(a)乳化剂，(b)甘油酯和(c)蜡材料。美国专利号5,942,243描述了可用于施用抗菌剂的一些代表性释放材料，所述美国专利引入作为参考。
治疗或药物组合物还可以含有聚合物粘膜粘附剂，包括用于生物活性剂的控制释放的接枝共聚物，所述接枝共聚物包含亲水性主链和疏水性接枝链。接枝共聚物是以下的反应产物：(1)具有烯键式不饱和官能团的聚苯乙烯大分子单体，以及(2)具有烯键式不饱和官能团的至少一种亲水性酸性单体。接枝链主要由聚苯乙烯和亲水性单体部分的主要聚合物链组成，其中一些具有酸性官能团。接枝共聚物中的聚苯乙烯大分子单体的重量百分比为约1至约20％，并且接枝共聚物中的总亲水单体的重量百分比为80至99％，并且其中所述总亲水单体的至少10％是酸性的，当完全水合时，所述接枝共聚物具有至少90％的平衡含水量。含有共聚物的组合物在应用部位处通过组织液的吸收逐渐水合，以产生非常软的胶冻状团块，其显示出对粘膜表面的粘附。在一段时间内，该组合物粘附至粘膜表面，它提供了药理学活性剂的持续释放，所述药理学活性剂被粘膜组织吸收。
本申请的组合物可以任选地含有其它聚合物材料，例如聚(丙烯酸)、聚(乙烯基吡咯烷酮)和羧甲基纤维素钠增塑剂、以及其它药学上可接受的赋形剂，其量不引起对组合物的粘膜粘附性的有害效应。
本发明的组合物的剂型可以通过常规方法制备。在其中肌内注射是选择的施用模式的情况下，优选使用等渗制剂。一般地，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液，例如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。可以将血管收缩剂加入制剂中。提供了无菌且无热原的根据本申请的药物制剂。
本发明的裂解酶/多肽也可以通过任何药学上适用或可接受的手段，包括局部、经口或胃肠外施用。例如，裂解酶/多肽可以肌内、鞘内、真皮下、皮下或静脉内施用，以治疗通过革兰氏阳性菌的感染。在其中肠胃外注射是选择的施用模式的情况下，优选使用等渗制剂。一般地，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液，例如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。可以将血管收缩剂加入制剂中。提供了无菌且无热原的根据本申请的药物制剂。
对于任何化合物，可以最初在细胞培养测定或动物模型中估计治疗有效剂量，所述动物模型通常为小鼠、兔、犬或猪。动物模型也用于达到期望的浓度范围和施用途径。此类信息然后可以用于确定用于在人中施用的有用剂量和途径。确切的剂量由各个医生根据待治疗的患者来选择。调节剂量和施用，以提供足够水平的活性部分或维持所需效应。可以加以考虑的另外因素包括疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别；饮食、所需的治疗持续时间、施用方法、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性、以及对疗法的耐受性/应答。长效药物组合物可以每3至4天、每周或每两周施用一次，取决于特定制剂的半衰期和清除率。
肠胃外施用的裂解酶/多肽的有效剂量率或量以及治疗的持续时间，部分取决于感染的严重性，患者特别是人的重量，受体对感染细菌的暴露持续时间，被感染的皮肤或组织的平方厘米数，感染深度，感染的严重性以及各种许多其它变量。该组合物可以一天一次至几次应用于任何地方，并且可以应用短时间段或长时间段。使用可以持续数天或数周。采用的任何剂量形式应该在最短时间量内提供最少数目的单位。可以适当地选择被认为提供酶的有效量或剂量的酶活性单元的浓度。活性单位/ml的量和暴露时间的持续时间取决于感染的性质，载体允许裂解酶/多肽具有的接触量。
方法与测定
由本发明的溶素多肽显示出的细菌杀死能力，以及实际上细菌杀死的显著广泛范围，提供了基于本发明的多肽的抗菌有效性的各种方法。因此，本发明考虑了抗菌方法，包括用于杀死革兰氏阳性菌、减少革兰氏阳性菌群体、治疗或减轻细菌感染、治疗暴露于致病菌的人受试者、以及治疗处于这种暴露风险中的人受试者的方法。敏感细菌包括本发明的噬菌体酶最初由其衍生的细菌，并且还可以包括各种其它链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属细菌菌株。还提供了治疗各种状况的方法，包括预防性治疗链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属感染，治疗链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属感染，减少链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属群体或携带，治疗下呼吸道感染，治疗耳部感染，治疗中耳炎，治疗心内膜炎，以及治疗或防止其它局部或全身感染或状况的方法。
本发明的溶素显示出杀死以下的能力和针对以下的有效性：来自各个物种例如多重链球菌属或葡萄球菌属物种的细菌，跨越不同物种组的细菌，例如来自链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属各自的细菌，以及来自不同目的细菌。特别地，本发明的溶素显示出杀死链球菌属和葡萄球菌属细菌的能力以及针对其的有效性。特别地，本发明的溶素显示出杀死葡萄球菌属细菌的能力以及针对其的有效性。PlySs2(CF-301)溶素显示出在体外和体内杀死来自两个不同目，特别是芽孢杆菌目和乳杆菌目的细菌。因此，本发明考虑了细菌、培养物或感染或者在其中怀疑或存在多于一克阳性细菌的情况下的处理、去定殖和/或去污。特别地，本发明考虑了细菌、培养物或感染或者在其中怀疑、存在或可能存在多于一个类型的杆菌目细菌、多于一个类型的乳杆菌目细菌、或至少一个类型的杆菌目和一个类型的乳杆菌目细菌的情况下的处理、去定殖和/或去污。
本发明还可以用于治疗特别是在人中的败血病。对于败血症感染的治疗，例如肺炎或细菌性脑膜炎，应该存在治疗试剂的连续静脉内流动到血流内。用于治疗败血病的酶的浓度取决于血液中细菌计数和血容量。
还提供的是用于治疗链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属感染、携带或群体的方法，其包括用治疗试剂治疗感染，所述治疗试剂包含有效量的本发明的至少一种裂解酶/多肽，特别是包含SH3型结合结构域的溶素，特别是PlySs2。还提供的是用于治疗链球菌属感染或治疗链球菌属和/或葡萄球菌属细菌感染、携带或群体的方法，其包括用治疗试剂治疗感染，所述治疗试剂包含有效量的本发明的至少一种裂解酶/多肽，特别是包含SH3型结合结构域的溶素，特别是PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素或ALE-1溶素，特别是PlySs2(CF-301)。在一个方面，生产或提供了能够裂解链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属菌株的细胞壁的裂解酶/多肽。在本发明的方法中，本发明的溶素多肽，特别是包含SH3型结合结构域的溶素，包括特别是PlySs2(CF-301)，在针对革兰氏阳性菌的预防和治疗方法中有用且有能力，所述革兰氏阳性菌特别选自链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属和/或李斯特菌属感染，特别是链球菌属和/或葡萄球菌属感染或细菌定殖。在本发明的方法中作为靶敏感和相关的细菌菌株包括以下并且可以选自以下：金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、模拟葡萄球菌、猪链球菌、表皮葡萄球菌、马链球菌、马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌(GBS)、化脓性链球菌(GAS)、血链球菌、戈登链球菌、停乳链球菌、G组链球菌、E组链球菌、粪肠球菌和肺炎链球菌。在一个特定方面，细菌菌株选自金黄色葡萄球菌、模拟葡萄球菌、猪链球菌、表皮葡萄球菌、马链球菌、马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌(GBS)、化脓性链球菌(GAS)、血链球菌、戈登链球菌、停乳链球菌、G组链球菌、E组链球菌和肺炎链球菌。
本发明包括治疗或减轻链球菌属(包括化脓性链球菌)和/或葡萄球菌属(包括金黄色葡萄球菌)的相关感染或状况的方法，所述感染或状况包括抗生素抗性金黄色葡萄球菌，特别包括MRSA，其中所述细菌或者被特定细菌感染或暴露于特定细菌、或怀疑暴露或处于危险中的人受试者，与一定量的有效杀死特定细菌的本发明分离的溶素多肽接触、或施用一定量的有效杀死特定细菌的本发明分离的溶素多肽。因此，接触或施用特别是包含SH3型结合结构域的溶素，特别选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，特别是PlySs2(CF-301)，包括其截短或变体，包括如本文提供和提及的此类多肽中的一种或多种，以便有效杀死有关细菌或者以其它方式减轻或治疗细菌感染。
术语‘试剂’意指任何分子，包括多肽、抗体、多核苷酸、化合物和小分子。特别地，术语“试剂”包括化合物，例如测试化合物，添加的另外化合物或溶素酶化合物。
术语‘激动剂’指在最广泛的意义上刺激配体与之结合的受体的配体。
术语‘测定’意指用于测量化合物的特定特性的任何过程。‘筛选测定’意指基于其活性从化合物的集合中表征或选择化合物的过程。
术语‘防止(preventing)’或‘防止(prevention)’指在受试者中减少获得或发展疾病或病症的风险(即，促使疾病的至少一种临床症状不发展)，所述受试者可以暴露于致病因素或在疾病发作之前易患该疾病。
术语‘预防’与术语‘防止’有关并且涵盖在术语‘防止’中，并且指其目的是防止而不是治疗或治愈疾病的措施或程序。预防措施的非限制性实例可以包括疫苗的施用；向由于例如固定而处于血栓风险中的住院患者施用低分子量肝素；以及在访问其中疟疾地方性流行或接触疟疾的风险很高的地理区域之前，施用抗疟药例如氯喹。
‘治疗有效量’意指将引起由医生或其它临床医生所寻求的受试者的生物学或医学应答的药物、化合物、抗微生物剂、抗体、多肽或药学试剂的量。特别地，关于革兰氏阳性菌感染和革兰氏阳性菌的生长，术语“有效量”预期包括化合物或试剂的有效量，其造成革兰氏阳性菌感染的量或程度中的生物学意义上的减少，包括具有杀菌和/或抑菌效应。短语“治疗有效量”在本文中用于意指足以防止并且优选减少至少约30百分比、更优选至少50百分比、最优选至少90百分比的感染细菌的生长或量中的临床上显著变化，或如可能伴随其存在和活性的病理学的其它特点，例如高烧或白细胞计数升高。
在一个实施方案中，术语任何疾病或感染的‘治疗(treating)’或‘治疗(treatment)’指改善疾病或感染(即，阻止疾病或者传染原或细菌的生长，或者减少其至少其中一种临床症状的表现、程度或严重性)。在另一个实施方案中，‘治疗(treating)’或‘治疗(treatment)’指改善可能无法由受试者辨别的至少一个身体参数。在又一个实施方案中，‘治疗(treating)’或‘治疗(treatment)’指在身体上(例如，可辨别症状的稳定)、生理学上(例如，身体参数的稳定)或这两个方面调节疾病或感染。在一个进一步实施方案中，‘治疗(treating)’或‘治疗(treatment)’涉及减慢疾病的进展或减少感染。
短语“药学上可接受的”指这样的分子实体和组合物，当施用于人时，所述子实体和组合物是生理学上耐受的，并且通常不产生***反应或类似的不良反应，例如胃不适、头昏等等。
应注意，根据本申请和权利要求，在体内或医学和临床治疗方法中进行的治疗方法的上下文中，术语受试者、患者或个体预期指人。
术语“革兰氏阳性菌(gram-positive bacteria)”、“革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)”、“革兰氏阳性”和未特别列出的任何变体，可以在本文中互换使用，并且如本申请和权利要求书自始至终使用的，指这样的革兰氏阳性菌，其是已知的和/或可以通过某些细胞壁和/或细胞膜特征的存在和/或通过革兰氏染色法染色来鉴定。革兰氏阳性菌是已知的并且可以容易地鉴定，并且可以选自但不限于李斯特菌属、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属和梭菌属，并且包括其任何和所有识别的或未识别的物种或菌株。在本发明的一个方面，PlySs2(CF-301)溶素敏感的革兰氏阳性菌包括选自以下中的一种或多种的细菌：李斯特菌属、葡萄球菌属、链球菌属和肠球菌属，特别是链球菌属和葡萄球菌属细菌。LysK和Sal1溶素敏感细菌包括葡萄球菌属细菌。
术语“杀菌”指能够杀死细菌细胞。
术语“抑菌”指能够抑制细菌生长，包括抑制生长的细菌细胞。
短语“药学上可接受的”指这样的分子实体和组合物，当施用于人时，所述子实体和组合物是生理学上耐受的，并且通常不产生***反应或类似的不良反应，例如胃不适、头昏等等。
短语“治疗有效量”在本文中用于意指足以防止并且优选减少至少约30百分比、更优选至少50百分比、最优选至少90百分比的靶细胞团块的S期活性中的临床上显著变化，或如可能伴随其存在和活性的病理学的其它特点，例如血压升高、发烧或白细胞计数升高。
用于治疗由链球菌属或葡萄球菌属细菌引起的全身或组织细菌感染的一种方法包括用治疗试剂肠胃外治疗感染，所述治疗试剂包含有效量的一种或多种本发明的溶素多肽，特别是包含SH3型结合结构域的溶素，选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，特别是PlySs2(CF-301)，包括融合物、嵌合体、截短或其变体，包括如本文提供的此类多肽作为适当的载体。许多其它不同的方法可以用于引入裂解酶/多肽。这些方法包括静脉内、肌内、皮下、鞘内和真皮下引入裂解酶/多肽。鉴于细菌状况的性质和程度以及所涉及或怀疑的细菌的菌株或类型，本领域的技术人员，包括医务人员，能够评估且识别最适当的施用模式或手段。例如，一种或多种裂解多肽的鞘内使用和施用对于细菌性脑膜炎的治疗是最有益的。
还可以通过将治疗试剂注射到人患者的受感染组织内来治疗感染，所述治疗剂包括适当的裂解酶/多肽和关于酶的载体。载体可以由蒸馏水、盐水溶液、白蛋白、血清或其任何组合组成。更具体地，用于输注或注射的溶液可以以常规方式制备，例如伴随防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)或稳定剂(例如乙二胺四乙酸的碱金属盐)的加入，其随后可以转移到融合容器、注射小瓶或安瓿内。可替代地，用于注射的化合物可以连同或不连同其它成分一起冻干，并且适当时，在使用时，溶解在缓冲溶液或蒸馏水中。非水性媒介物，例如不挥发性油、脂质体和油酸乙酯也可用于本发明中。组合物中可以包括其它噬菌体相关的裂解酶(连同holin蛋白)。
提供了关于使用裂解酶/多肽的各种治疗方法，特别是包含SH3型结合结构域的溶素，特别选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素，例如如本文例证的PlySs2(CF-301)，作为用于消除或减少敏感细菌的携带的预防性处理，防止已暴露于因生病而具有感染症状的其它人的那些人，或作为用于已经因感染而变得生病的那些人的治疗性处理。类似地，裂解酶/多肽可以用于治疗例如下呼吸道病，特别是通过使用该酶的支气管喷雾剂或静脉内施用。例如，裂解酶可以用于眼部感染如结膜炎的预防和治疗性处理。该治疗方法包括施用滴眼剂或洗眼剂，所述滴眼剂或洗眼剂包含有效量的本发明的至少一种裂解多肽、以及能够安全地应用于眼的载体，其中所述载体含有裂解酶。滴眼剂或洗眼剂优选为等渗溶液的形式。应该调节溶液的pH，使得不存在眼的刺激，所述刺激依次又导致通过其它生物的可能感染和可能的对眼的损害。尽管pH范围应该在与其它裂解酶相同的范围内，但最佳pH在如本文中证实且提供的范围内。类似地，还应该使用上文所述用于其它裂解酶描述的缓冲液。可以将适用于滴眼剂的其它抗生素加入含有酶的组合物中。也可以添加杀菌剂和抑菌化合物。溶液中的酶浓度可以在约100单位/ml至约500,000单位/ml的范围内，具有100至约5,000单位/ml，以及约100至约50,000单位/mi的更优选范围。浓度可以高于或低于所提供的范围。
本发明的裂解多肽还可以用于隐形眼镜溶液中，用于隐形眼镜的浸泡和清洁。除酶之外，通常为等渗溶液的这种溶液还可以含有氯化钠、甘露醇和其它糖醇、硼酸盐、防腐剂等等。本发明的裂解酶/多肽也可以施用于患者的耳。因此，例如本发明的裂解多肽可以用于治疗例如由肺炎链球菌引起的耳部感染。中耳炎是中耳的炎症，其特征在于症状如耳痛、听力丧失和发烧。这些症状的主要原因之一是中耳中的流体积累(积液)。并发症包括永久性听力丧失，鼓膜穿孔，获得性胆脂瘤，乳突炎和粘连性中耳炎。在生命的第一年中发展中耳炎的儿童处于复发的急性或慢性疾病的风险中。中耳炎的主要原因之一是肺炎链球菌。可以通过将适当载体中的酶递送到耳道，将裂解酶/多肽应用于受感染的耳。载体可以包含无菌的水性或油性溶液或悬浮液。可以将裂解酶加入载体中，所述载体还可以含有合适的防腐剂，且优选表面活性试剂。滴剂中优选包括的杀菌剂和杀真菌剂是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和乙酸氯己定(0.01％)。用于制备油性溶液的合适溶剂包括甘油、稀释的醇和丙二醇。另外，可以使用任何数目的其它滴耳剂载体。用于治疗中耳炎和其它类似的耳部感染的浓度和防腐剂与对于眼部感染所讨论的相同，并且酶进入其内的载体与用于治疗眼部感染的载体相似或等同。另外，载体通常可以包括维生素、矿物质、碳水化合物、糖、氨基酸、蛋白质材料、脂肪酸、磷脂、抗氧化剂、酚类化合物、等渗溶液、油基溶液、油基悬浮液及其组合。
通过识别和分离本发明的溶素多肽而产生的诊断、预防和治疗可能性和应用衍生自以下事实：本发明的多肽引起敏感细菌中的直接和特异性效应(例如杀死)。因此，本发明的多肽可以用于消除、表征或鉴定相关的和敏感的细菌。
因此，本发明的诊断方法可以包括借助于包括有效量的一种或多种溶素多肽的测定，以及用于表征样品中的一种或多种细胞、或用于确定细胞裂解是已发生还是正在发生的手段，检查细胞样品或培养基，用于确定它是否含有敏感细菌、或者样品或培养基中的细菌是否是敏感的目的。能够从这种方法中受益的患者包括患有未确定感染、公认的细菌感染、或者怀疑暴露于或携带特定细菌的那些患者。与受试者或患者接触的流体、食品、医疗装置、组合物或其它此类样品可以就敏感细菌进行检查，或可以消除有关细菌。在一个此类方面，可以通过与本发明的一种或多种裂解多肽一起温育或暴露于本发明的一种或多种裂解多肽，来灭菌或以其它方式处理对流体、食品、医疗装置、组合物或其它此类样品，以消除或去除任何潜在的有关细菌。
该程序及其应用对于本领域技术人员是熟悉的，并且相应地可以在本发明的范围内利用。在一种情况下，本发明的裂解多肽与样品中的有关或敏感细菌结合或以其它方式相关，并且该复合物的一个成员由可检测标记进行标记。可以通过适用于标记物检测的已知方法来确定复合物已形成的事实以及需要时其量。对于这些研究最常采用的标记是放射性元素、酶、当暴露于紫外线时发荧光的化学制品及其它。许多荧光材料是已知的，且可以用作标记。这些包括例如荧光素、罗丹明、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和荧光黄。放射性标记可以通过当前可用的计数程序中的任一种进行检测。优选的同位素可以选自3H、14C、32p、3sS、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。酶标记同样是有用的，并且可以通过目前利用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、安培法或气体容量法技术中的任一种来检测。通过与桥接分子如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等等反应，使酶与选择的颗粒缀合。可以用于这些程序中的许多酶是已知的并且可以被利用。优选的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加上过氧化物酶和碱性磷酸酶。因其可替代的标记材料和方法的公开内容，提及美国专利号3,654,090；3,850,752；和4,016,043作为实例。
PlySs2(CF-301)溶素展示杀死革兰氏阳性菌(包括葡萄球菌属、链球菌属、李斯特菌属或肠球菌属细菌)的众多不同菌株和物种的活性和能力。特别且有意义的是，P1ySs2(CF-301)在杀死葡萄球菌属菌株方面是活性的，所述葡萄球菌属菌株包括金黄色葡萄球菌，特别是抗生素敏感和不同的抗生素抗性菌株两者。PlySs2(CF-301)在杀死链球菌属菌株方面也是活性的，并且显示针对A组和B组链球菌属菌株的特别有效的杀死。基于在体外使用分离菌株的对数杀死评价，PlySs2(CF-301)溶素针对细菌的能力在下表1中描绘。本文提供的敏感细菌可以用于本发明的修改的BMD方法中，用于确定且比较MIC值。
表1
PlySs2减少不同细菌的生长(部分列出)
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本发明通过参考下述非限制性实施例可以得到更好地理解，所述实施例作为本发明的示例提供。呈现下述实施例以便更充分地示出本发明的优选实施方案，然而，决不应该解释为限制本发明的广泛范围。
实施例1
噬菌体衍生的溶素是细胞壁水解酶，其提供了新出现的治疗选项，以应对药物抗性细菌性病原体的出现和传播。作为纯化的重组蛋白，溶素显示出快速的物种特异性溶菌效应、抗生物膜活性、关于抗性的低倾向以及与抗生素的明显协同作用。在研究溶素的治疗潜力的努力中，我们已发现了由人血液基质对溶素PlySs2(CF-301)的抗葡萄球菌活性发挥的有力的“增强剂效应”。跨越一系列金黄色葡萄球菌菌株，与在常规培养基(阳离子调节的Mueller Hinton液体培养基(caMHB))中的活性比较，PlySs2(CF-301)在全血、血清和血浆中的活性导致最低灭菌浓度的≥100倍减少(时间-杀死测定)、以及最低抑菌浓度的≥32倍减少(液体培养基微量稀释测定)。通过PlySs2(CF-301)与达托霉素或万古霉素的协同组合，增强效应得到进一步增加。因此，在标准微生物学测试形式(例如MIC、棋盘和时间-杀死测定)中，与caMHB相比，PlySs2(CF-301)显示出在人血液中显著更大的效力(32-≥100倍)。
使用其它抗葡萄球菌溶素也注意到增强剂活性。人、兔、马和犬血清对PlySs2(CF-301)活性发挥等价的增强剂效应，而该效应在大鼠和小牛中为中等的，且在小鼠血清中不存在。我们另外提供了增强机制涉及与至少两种血液组分(溶菌酶和血清白蛋白)的协同作用的证据，所述至少两种血液组分可以以多重分析形式添加，以概括重现血液效应。最后，基于离体发现的预测通过研究在体内得到确认，所述研究显示与大鼠相比，PlySs2(CF-301)(加上达托霉素)在兔中的感染性心内膜炎治疗中的优良功效。通过在兔相对于大鼠模型中显示出在低111倍的剂量下可比较的疗效，充分建立的金黄色葡萄球菌感染性心内膜炎(IE)的兔和大鼠模型用于在体内验证这些发现。总之，这些发现提示PlySs2(CF-301)与血清蛋白之间有利的协同相互作用可用于促进杀菌活性，并且预期具有重要的治疗意义。
药物抗性和多药抗性细菌的出现和传播已产生关于常规抗生素的新型替代或辅助疗法的需要。目前处于开发中的一种有希望的方法是基于使用重组生产的噬菌体衍生的溶素(细胞壁水解酶)来杀死革兰氏阳性菌病原体(1、2)。溶素是抗微生物酶，其提供了常规抗生素的新型替代物。溶素是由噬菌体编码的蛋白质，并且用于在天然环境中杀死细菌。生物圈中存在约1031种噬菌体，并且噬菌体每天用而溶素蛋白家族(杀死宿主细菌的主要手段)杀死所有细菌的大约三分之一(Hatful GF(2015)J Virol 89(16)：8107-8110)。纯化的溶素显示出称为“自外裂解(lysis from without)”的现象(Fischetti VA等人(20016)Nature Biotechnology 24：1508-1511)，并且顺应合成重组体的制造。纯化的溶素经由细胞壁水解显示出在接触时有力的溶菌效应。溶素多肽通常是20-30kDa的蛋白质。
PlySs2溶素，也称为CF-301、PlySs2(CF-301)，是抗葡萄球菌溶素，并且是溶素类别进入美国临床开发的阶段2的首个试剂，用于治疗菌血症包括由于金黄色葡萄球菌的心内膜炎(3)。PlySs2(CF-301)最初衍生自在猪中由猪链球菌携带的原噬菌体。PlySs2(CF-301)溶素已显示出杀死具有临床意义的革兰氏阳性菌的各种菌株，包括金黄色葡萄球菌的抗生素抗性菌株例如甲氧西林和万古霉素抗性和敏感菌株(MRSA、MSSA、VRSA、VISA)、达托霉素抗性金黄色葡萄球菌(DRSA)和利奈唑胺抗性金黄色葡萄球菌(LRSA)。PlySs2(CF-301)具有相对较宽但明确的物种杀死活性，并且可以杀死细菌，特别是革兰氏阳性菌的多重物种，包括葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属和李斯特菌属菌株，同时针对天然肠道菌群中的细菌无活性。
临床级PlySs2/CF-301已在大肠杆菌中重组生产，并且在广泛的pH(pH 6-9.7)和温度(16-55℃)范围内是活性的(Gilmer等人(2013)Antimicrob Agems Chemother 57：2743-2750；Scuch等人(2014)J Infect Dis 209：1469-78)。它在各种人基质中是活性的，所述人基质包括血液、血清、血浆、唾液、滑液、肺表面活性剂和支气管灌洗液。本文上文提供了PlySs2(CF-301)的氨基酸序列和结构。
PlySs2(CF-301)靶向敏感细菌包括金黄色葡萄球菌的细胞壁。它是半胱氨酸-组氨酸氨基肽酶，其靶向细胞壁肽聚糖中的D-Ala-L-Gly键，并且在细胞壁的D-丙氨酸(茎肽)和L-甘氨酸(横桥)之间切割。细菌裂解是快速的。PlySs2(CF-301)具有明确的物种特异性，并且杀死抗生素抗性细菌包括MSSA、MRSA、VRSA、DRSA和LRSA，对甲氧西林、万古霉素、达托霉素、利奈唑胺抗生素抗性的细菌(Schuch R等人(2014)J Infect Dis 209：1469-1478)。杀死是快速且有力的，并且可见对裂解肽的低抗性概况。PlySs2(CF-301)消除生物膜并杀死持久性细菌。在引入本文作为参考的WO 2013/170022和美国专利9,499,594中描述了针对生物膜的有效性。已观察到与抗生素的协同作用，包括如引入本文作为参考的WO 2013/170015中所述。
PlySs2(CF-301)的标志性特点包括：(i)针对广泛范围的金黄色葡萄球菌分离株的有力、靶向和快速的溶细效应，(ii)抗生物膜活性，(iii)对抗性的低倾向，以及(iv)与常规抗生素的协同作用(4、5)。尽管PlySs2(CF-301)以及事实上在文献中描述的许多另外的溶素在标准体外测试培养基中是高度有效的细菌裂解剂，并且在侵袭性和局部感染的各种动物模型中是非常有效的，基本上不理解在复杂的人生理流体(例如全血、血浆和血清)中的溶素活性。
在抗微生物药开发的临床前阶段期间，治疗潜力的初步评估是基于使用实验室培养基执行的测定，以确定最低抑菌浓度(MIC)，并且以时间-杀死测定形式评价时间依赖性杀死(6)。然而，还已知体内功效(尤其是对于全身递送的药物)受与人体组分，特别是血液组分的多因素相互作用影响。对于许多抗生素类别，包括β-内酰胺、喹诺酮和环状脂肽，给药方案中必须考虑的血浆蛋白结合与功效减少(高达10倍)(7-11)之间的关联性已得到非常良好的研究。例如，与血液组分如白蛋白，α1-酸性糖蛋白，脂蛋白，α-、β-和γ-球蛋白以及红细胞的结合可以降低游离的活性药物的量。相反，存在越来越多的研究，其也显示出人血液基质加强抗生素(12、13)和抗菌肽(13-17)两者的抗菌活性(高达16倍)的能力。血清增强抗菌活性的能力已例如归于多重因素，范围从对生长速率的影响(7、18)到与先天性和适应性免疫***的体液效应物的协同相互作用(13、15、16、19)。具有有力的(和固有的)抗微生物活性和增强人血液环境中预存的抗微生物活性的能力两者的试剂的开发，呈现了作为独立试剂或与抗生素组合的非常有吸引力的治疗选项。
考虑到关于PlySs2(CF-301)的全身使用的临床计划，人血液是关于PlySs2(CF-301)活性的最有关的测试基质。在当前的调查中，我们在人血液基质的背景下，使用针对一系列金黄色葡萄球菌分离株的溶素PlySs2(CF-301)活性的离体筛选。与人工培养基相比，发现PlySs2(CF-301)作为单一试剂以及与抗生素组合两者的抗葡萄球菌活性在血液基质中一致地更有效。此外，人溶菌酶和血清白蛋白各自显示出与PlySs2(CF-301)的强协同效应，并且解释了在体外观察到的许多血液增强剂效应的原因。作为体内的概念证明，在使用兔(具有与人等价的血液效应)和大鼠(具有中等血液效应)两者的感染性心内膜炎模型中测试了PlySs2(CF-301)的功效。体内研究证实，与兔相比，对于在大鼠中的杀菌效应需要高～50倍的剂量。总之，我们的结果证实PlySs2(CF-301)的抗微生物活性通过与至少两种血液组分的协同作用而在人血中得到增强。PlySs2(CF-301)与复杂人流体中的血液因子和抗生素协同作用的能力，代表了关于目前处于临床开发的新型抗微生物药的非常重要的属性。
结果
人血液基质中的时间依赖性杀死
时间-杀死测定用于评价PlySs2(CF-301)在一定浓度范围内针对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株MW2的时间依赖性杀菌活性。使用由美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute)(CLSI)(CLSI文件M07-A9(Methodsfor dilutional antimicrobial sensitivity tests for bacteria that growaerobically.第32卷(Wayne[PA]：Clinical and Laboratory Standards Institute[US]，2012))公布的方法的变化，由此标准测试介质(即Mueller Hinton液体培养基[MHB])替换为人全(肝素化)血、血清或血浆。在复合时间-杀死曲线中，PlySs2(CF-301)在所有人血液基质中都在低至3.2μg/mL的浓度下快速杀菌(≥3-log10CFU/mL的减少)并灭菌(到处理后24小时)(图1A、1B且数据未显示)。相比之下，MHB中PlySs2(CF-301)的最低灭菌浓度为320μg/mL(图1C)。对于另外3种MRSA菌株、3种甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌菌株(MSSA)和1种化脓性链球菌菌株，类似地观察到对于MW2观察到的灭菌活性中的100倍差异(图2)。除P1ySs2(CF-301)之外，还测试了第二种溶素样酶，溶葡萄球菌素(20)，并且与PlySs2(CF-301)一样，证实与MHB相比在血液中的杀菌所需的浓度的100倍降低(图3A和3B)。作为对照，还检查了万古霉素，并且证实在血液中比在MHB中略微降低的效力(图3C和3D)。
还用PlySs 2(CF-301)执行时间-杀死实验，以检查不同物种(与人基质和MHB相比)中的血液效应程度。小鼠血清中的PlySs2(CF-301)活性与MHB中的活性最相似，具有＞320μg/mL的灭菌浓度(图1D)。在小牛和大鼠血清中，观察到中等效应，由此灭菌浓度为32μg/mL(图4A和4B)。在兔和犬血清中，用3.2μg/mL的灭菌浓度观察到类似人的血液效应(图4C和4D)。时间-杀死结果与关于血液相关增强的下述层次一致：人＝兔＝犬＞大鼠＝小牛＞MHB＞小鼠。较早的研究已指示，马血清在时间-杀死测定中取代人血清，特别是伴随添加的还原剂例如DTT。这些在引入本文作为参考的基于2016年5月12日提交的US 62/335,129的，2017年5月12日提交的PCT US2017/32344中进行描述。马血清也证实类似的增强，因此人＝大鼠＝犬＝马。
人血液基质中的最低抑菌浓度
最低抑菌浓度(MIC)提供了在固定的18小时终点，在静态***中的抗微生物活性的定量测量。通过液体培养基微量稀释用于测定MIC的CLSI方法用于评估在标准测试培养基(即MHB)或人血清中，针对一系列171种临床金黄色葡萄球菌分离株的PlySs2(CF-301)活性。对于所有测试菌株，包括74种MSSA，75种MSSA，以及另外的万古霉素抗性、利奈唑胺抗性和达托霉素抗性菌株，PlySs2(CF-301)证实与MHB相比在人血清中增强的效力(表1)。总之，存在抑制每组中90％的测试分离株(MIC90)生长所需的PlySs2(CF-301)浓度的32倍降低。有趣的是，当在血液基质中进行测试时，抗葡萄球菌溶素Sall和溶素样蛋白溶葡萄球菌素两者也显示出MIC中的显著的32倍降低(表2)。然而，溶素ClyS仅证实适度的2倍变化。
表1
使用CAMHB和人血清获得的MIC值的比较
*测试的金黄色葡萄球菌类型包括12种万古霉素抗性菌株、5种利奈唑胺抗性菌株和5种达托霉素抗性菌株。
表2
MHB和人血清中的各种溶素和抗生素的MIC分析
为了理解人血液衍生的基质的来源中的变化是否可以影响活性，使用一系列来自不同商业来源的全血、血清和血浆的62种不同的合并和个别人供体样品确定了PlySs2(CF-301)MIC，所述样品具有年龄、性别、血型和使用的抗凝剂类型中的变化。对于测试的全血(n＝13)、血清(n＝33)和血浆(n＝15)样品，观察到1μg/mL的PlySs2(CF-301)MIC90值，其范围为0.5-2μg/mL(表3)。显示了关于每种不同基质的MIC频率的直方图指示全血和血清中的活性是等价的，而血浆中的活性相差～1-log2稀释度(图5)。总之，增强剂效应不受个别或合并供体的年龄、性别和血型中的变化，或者作为抗凝剂使用的柠檬酸钠或肝素钠的影响(表3)。在补体失活的培养基、补体保存的培养基中也观察到该效应，并且在人血液、血清和血浆级分的至少3不同的匹配集合中是等价的，而脱脂血清不是等价的。
表3
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1抗凝剂显示在括号中。
2MIC通过在连续日时以一式三份的液体培养基微量稀释进行确定。
还检查了样品变化对不同动物物种的血清中的PlySs2(CF-301)活性的影响。关于小鼠样品(n＝10)的MIC范围是32-64ug/mL，而关于大鼠(n＝5)的范围是8-16ug/ml，关于犬(n＝8)的范围是0.5-1ug/ml，且关于兔(n＝2)的范围是1ug/mL(表4)。在此处观察到的层次，兔和犬优于大鼠和小鼠，与上文的时间-杀死研究中观察到的等同。
表4
关于来自一系列动物物种的血清中的金黄色葡萄球菌菌株MW2的PlySs2(CF-301)MIC值
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使用指示的血液基质(未稀释的)作为生长培养基，通过在连续两天时以一式三份的液体培养基微量稀释确定所有MIC值。
P1ySs2(CF-301)与人血液基质中的抗生素协同作用使用两种不同的方法评价了在人血清的背景下，PlySs2(CF-301)与溶葡萄球菌素、达托霉素或万古霉素之间的协同作用。第一种方法是时间-杀死测定，用于在体外检查协同抗微生物活性的优选技术。亚MIC量的达托霉素和PlySs2(CF-301)个别进行测试，并且发现对金黄色葡萄球菌菌株MW2的最低杀菌作用(图6A-6C)。然而，当组合相同量的每种试剂时，观察到基本上更多的杀死(≥2-l0g10CFU/mL减少)，与协同作用一致。对于亚MICPlySs2(CF-301)与溶葡萄球菌素(图6D)或万古霉素的组合，类似地观察到高度协同的相互作用(数据未显示)。
在时间-杀死形式中，PlySs2(CF-301)显示出跨越一系列亚MIC浓度(0.25-0.025ug/mL)与恒定量的DAP(2.5ug/mL)的协同作用。协同作用定义为在24小时点的CFU/mL中的≥2-log10降低。这表示在人血清中执行的时间-杀死测定所需的PlySs2(CF-301)(作为单一试剂)的最低灭菌浓度的64倍降低。类似地，在PlySs2(CF-301)与另一种抗微生物剂溶葡萄球菌素之间的时间-杀死中观察到有力的协同作用。在此处，每种试剂的组合(以0.005mcg/mL)在24小时内灭菌。值得注意的是，在人血清中证实与达托霉素的协同作用的最低PlySs2(CF-301)浓度(即0.025μg/mL)比在CAMHB中与达托霉素的协同作用所需的最低4μg/mL浓度低160x(Schuch R.等人(2014)J Infect Dis 209(9)：1469-1478)，提示人血液中宿主因子与PlySs2(CF-301)的杀菌活性之间的潜在联系。
确认协同作用的第二种方法是棋盘测定(Verma P(2007)Methods forDetermining Bactericidal Activity and Antimicrobial Interactions：SynergyTesting，Time-Kill Curves，and Population Analysis.Antimicrobial SusceptibilityTesting Protocols，编辑chwalbe R，Steele-Moore L，&Goodwin AC(CRC Press，BocaRaton，FL)，第275-298页)。使用亚MICPlySs2(CF-301)与亚MIC溶葡萄球菌素、达托霉素或万古霉素针对MHB或人血清中的MRSA菌株MW2的组合来生成棋盘。协同作用定义为大于通过将两种药物加在一起预测的那种的抑制活性(即，最低或平均分级抑菌浓度[FICMIN或FICAVG]≤0.5)。与MHB相比，PlySs2(CF-301)证实在人血清中与溶葡萄球菌素、达托霉素和万古霉素非常有力的协同作用(表5)。考虑到与MHB相比，关于在血清中的PlySs2(CF-301)的MIC值中的32x差异，因此FIC值的减少甚至更显著。在另外8种MRSA菌株的扩展分析中，FICMIN和FICAVG值始终低于0.5(即协同作用)，并且优于MHB中测定的值(表6)。
表5
a∑FICMIN＝分级抑菌浓度的总和(在所有组合中观察到的最低值)
b∑FICAVG＝分级抑菌浓度的总和(具有最低值的三个连续组合的平均值)。
表6
∑FICmin是在每种配对试剂的所有组合中观察到的最低总和值。∑FICavg是关于每种配对试剂的至少三个连续组合的平均总和值。
PlySs2(CF-301)与人溶菌酶和人血清白蛋白协同作用
为了理解人血液效应的基础，一系列测定用于检查增强剂的某些物理特点。基于比色的MIC测定用于证实人血清的增强剂效应既对蛋白酶K敏感(图7A)，又在高于75℃的温度下完全失活(图7B)。此外，在6.25-1.5％的血清浓度下稀释了增强剂效应(图7C)。这些发现与既热稳定又丰富的蛋白质增强剂一致。基于这些发现以及描述关于抗生素和AMP与宿主血液组分协同作用的潜力的文献两者，我们接下来在使用热失活的人血清作为基础培养基的棋盘测定中，测试了一系列潜在的抗菌血液蛋白与PlySs2(CF-301)组合的抗葡萄球菌活性(表7)。虽然PlySs2(CF-301)与大多数测试试剂并不协同作用(基于＞0.5的FICAVG值)，但用纯化和重组表达形式的人溶菌酶(HuLYZ)或人血清白蛋白两者均检测到显著的协同相互作用(HSA)。观察到≤0.1的FICAVG值，与血清中非常强的协同作用相一致。显著地，兔血清白蛋白(RabSA)与PlySs2(CF-301)协同作用(FICAVG≤0.1)，而大鼠血清白蛋白(RatSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)则没有(FICAVG＞1.16)。
表7
在热失活的人血清中PlySs2/CF-301与AMP、抗菌蛋白和白蛋白的棋盘分析
a∑FICAVG＝分级抑菌浓度的总和(具有最低值的三个连续组合的平均值)。
使用另外的形式检查HuLYZ和HSA对PlySs2(CF-301)活性的作用。首先，时间-杀死测定用于将亚MIC量的PlySs2(CF-301)与1-35μg/mL的一系列HuLYZ浓度组合(图8A)。尽管单独的HuLYZ不具有抗葡萄球菌活性(21)，但据报道在人血液中的浓度为1至35μg/mL不等(22)。在高于5μg/mL的HuLYZ浓度下，与单独的PlySs2(CF-301)相比，基于对于组合在24小时的≥2-log10CFU/mL减少，检测到协同相互作用。在基于处理的培养物中的光密度丧失的第二体外测定中，跨越一系列浓度加入HuLYZ(图8B)和HSA(图8C)两者刺激高水平的PlySs2(CF-301)活性。在所有测试浓度下，单独的人溶菌酶针对金黄色葡萄球菌完全无活性。类似地，在PlySs2(CF-301)的不存在下，单独的HAS不具有抗菌活性。对于在血液中以～40mg/mL的浓度存在的HSA(7)，在20至40mg/mL的HSA浓度下观察到PlySs2(CF-301)活性的最大增强。裂解测定还充当用于确定PlySs2(CF-301)比活性的基础(4)。虽然通常在约～2500单位/mg蛋白质下观察到PlySs2(CF-301)的活性，但HuLYZ或HAS的添加分别导致活性中的9.8或17.8倍增加(表8)。如果HuLYZ和HSA一起添加，则PlySs2(CF-301)活性中的增加倍数为25％。
表8
测定补充物 比活性(单位/mg) 增加倍数
无 2419 n.a.
rHSA，4％ 43067 17.8
HuLYZ，10μg/mL 32066 9.8
rHSA，HuLYZ， 18711 25
a测定使用在磷酸盐缓冲液中的固定浓度的CF-301(4μg/mL)针对金黄色葡萄球菌菌株MW2执行，伴随所示补充物。
如下表9中所制表的，利用且测试了各种商购可得的溶菌酶和HSA试剂，伴随相似的结果。
表9
使用HuLYZ和HAS概括重现人血液效应
人血液效应的基础是与MHB相比，在人血清中测定的MIC值中的32倍降低。使用MIC格式，我们寻求通过将HuLYZ和/或HSA加入缺乏血液效应的两种不同的培养基类型(即，MHB和补充有50％热失活的人血清的MHB)，来概括重现人血液效应。对于HuLYZ和HAS连同PlySs2(CF-301)一起的组合观察到最有力的裂解活性。在MHB中，HuLYZ(以10μg/mL的浓度)或HSA(以40mg/mL的浓度)的添加分别导致PlySs2(CF-301)MIC中的2倍和8倍降低；HuLYZ和HAS两者的添加导致16倍降低(表10)。在补充有50％热失活的人血清的MHB中的效应是相似的(表11)。显著地，RabSA的添加导致与对于HSA观察到的那种相似的效应(即8倍降低)，而RatSA或MSA的添加具有很少的效应或没有效应。
表10
MHB的补充 MIC中的降低倍数
HuLYZ，10μg/mL 2
HAS，40mg/mL 8
HuLYZ，10μg/mL+HAS，40mg/mL 16
RabSA，40mg/mL 8
RatSA，40mg/mL 2
MouseSA，40mg/mL 1
。
表11
50％MHB/50％人血清(热失活的)的补充 MIC中的降低倍数
HuLYZ，10μg/mL 2
HAS，40mg/Ml 4
HuLYZ，10μg/mL+HAS，40mg/mL 16
RabSA，40mg/mL 4
RatSA，40mg/mL 2
MouseSA，40mg/mL 1
。
PlySs2(CF-301)与人血清中的HAS的相互作用
用抗PlySs2(CF-301)抗体执行蛋白质印迹分析，以检测具有血液效应(即，人血清)、以及不具有血液效应(即，MHB和补充有50％热失活的人血清的MHB[MHB/HiHuS])的MIC条件孔中的PlySs2(CF-301)。在细菌细胞的存在下，PlySs2(CF-301)在人血清中形成以高分子量(～150kDA)的条带，但在MHB和MHB/HiHuS中则没有(图9A)。～150kDA条带不同于通常检测到的PlySs2(CF-301)单体和二聚体(和三聚体)。有趣的是，当PlySs2(CF-301)在没有细菌细胞的人血清中温育时，未观察到～150kDA条带(数据未显示)。
检查了向MHB中添加HSA或RabSA(以40mg/mL)的效应。HSA或RabSA的添加在MHB中部分地建立了血液效应(参见上文)，并且在细菌细胞的存在下的确导致～150kDa条带的出现(图9B)。HuLYZ(以10μg/mL)的添加与～150kDA条带的形成无关(图9C)。
通过质谱法检查了在人血清中形成的～150kDa条带的性质。除通常在150kDa处发现的其它蛋白质之外，检测到的最丰富的片段信号来自人血清白蛋白(数据未显示)。
血清脂质是PlySs2(CF-301)的强化效应所需的。
我们的脱脂人血清不能与PlySs2(CF-301)协同作用(表3)的观察提示，脂肪酸(FA)是PlySs2(CF-301)通过其与血清中的HSA协同作用的机制的部分。循环中的大多数游离FA都与HSA结合(24)，并且脱脂过程虽然不改变HSA水平，但的确将游离FA水平减少大约三分之一(Sacks FM等人(2009)J Lipid Res 50(5)：894-907)。为了确认低FA水平负责PlySs2(CF-301)无法在脱脂血清中协同作用，我们确定了在循环中引入两种较常见的FA，油酸和棕榈酸((Richieri GV&Kleinfeld AM(1995)J Lipid Res 36(2)：229-240)，对脱脂血清在MIC测定形式中的性能的作用。以0.625mg/mL的生理浓度的油酸或棕榈酸添加分别导致PlySs2(CF-301)MIC中的8倍和16倍降低，不存在与两种脂质的同时添加相关的进一步降低(表12)。考虑到单独的FAs(在血清背景之外)对PlySs2(CF-301)活性没有影响(数据未显示)，很可能该效应通过HSA介导了。该效应还可能反映了基于以下理解的HSA与PlySs2(CF-301)之间的直接相互作用：与HSA上的高亲和力位点结合的FA作用于促进与药物和其它化合物的另外结合活性((Yang F等人(2014)Int J Mol Sci 15(3)：3580-3595)。
表12
补充有脂肪酸的脱脂的人血清中PlySs2(CF-301)MIC值的增强
使用HuLYZ和PlySs2(CF-301)的细胞表面结合研究
我们使用共焦显微镜检查，以测试罗丹明标记的PlySs2(CF-301)(CF-301RHD)与金黄色葡萄球菌菌株ATCC 700699的表面的结合，所述菌株已用以40mg/mL的HAS进行预处理(图10)。在对应于0.25x MIC的量下，CF-301RHD构建体在用HSA预处理的细胞中显示葡萄球菌细胞壁的广泛标记。在HSA预处理的不存在下，未观察到标记。HSA预处理并不致使加上荧光团标签的溶素PlyG和PlyC(分别对炭疽芽孢杆菌和化脓性链球菌的表面特异性)与葡萄球菌的结合，确认了HSA活性的特异性(数据未显示)。
还通过荧光显微镜检查，来检查葡萄球菌与多重不同的血清类型和MHB一起的预温育对用0.25x MIC量的CF-301RHD的随后标记的作用(图11)。仅与人血清或兔血清一起的预温育导致金黄色葡萄球菌菌株MW2的广泛标记。与单独的大鼠血清、小鼠血清或MHB一起的预温育导致弱标记的细胞，仅伴随较长的暴露时间观察到。用HSA补充小鼠血清的确恢复了高水平的结合和荧光。
基于HuLYZ与PlySs2(CF-301)协同作用的能力，我们接下来使用共焦显微镜检查，来测试Alexa Fluor标记的HuLYZ(HuLYZAF)与用亚MIC范围的CF-301预处理的葡萄球菌的结合(图12)。HuLYZAF广泛标记了用0.5X或0.25X MIC量的PlySs2(CF-301)预处理的细菌的细胞壁。在用PlySs2(CF-301)预处理的不存在下，未观察到标记。此外，PlySs2(CF-301)预处理不促进PlyG或PlyC溶素的结合(数据未显示)。
人血清中的PlySs2(CF-301)裂解活性的显现
在通过透射电子显微镜检查(TEM)分析之前，葡萄球菌在人血清或MHB中用一定范围的PlySs2(CF-301)浓度处理10分钟。虽然仅在MHB中的最高浓度的PlySs2(CF-301)(即5μg/mL)下观察到溶菌活性，但在100倍范围内的所有浓度下，在人血清中观察到广泛的裂解证据(图13)。除在血清中更快速的溶菌之外，与MHB中的裂解相比，裂解事件在视觉上不同。在人血清中，所有细菌被包裹在蛋白鞘中，所述蛋白鞘很可能由宿主蛋白包括HSA组成。在鞘内，裂解细菌通过电子致密细胞壁材料的周向溶解加以区别，并且有趣的是，细菌碎片看起来仍被包裹。相比之下，MHB中的裂解事件表现为紧在裂解之前的典型细胞质膜起泡和挤出。
对PlySs2(CF-301)活性的强血液效应的体内证据
使用由于MRSA菌株MW2的感染性心内膜炎的大鼠和兔模型，调查了PlySs2(CF-301)加上DAP的功效。体内研究指示，与大鼠模型相比，PlySs2(CF-301)加上DAP在兔模型中的IE治疗中更有效(图14)。在大鼠模型中，除DAP的人治疗剂量(HTD)当量之外，施用10mg/kg PlySs2(CF-301)的总剂量导致心脏瓣膜植被(heart valve vegetation)中的CFU/g中的～3log10下降。除低于HTD当量的DAP之外，在≥0.09mg/kg PlySs2(CF-301)的总剂量的施用后，在兔模型中达到与单独的DAP处理相比，细菌密度中的相同的3log10降低。考虑到大鼠模型使用DAP的人当量剂量，而在兔模型中，PlySs2(CF-301)与低于DAP的HTD当量的剂量组合，两种模型中的PlySs2(CF-301)功效的差异甚至更显著。
在实验性大鼠IE模型中，除DAP之外，还需要在10mg/kg PlySs2(CF-301)剂量水平下达到的AUC/MIC估计比≥0.87，以实现最大功效(相对于单独的DAP，心脏瓣膜植被中的CFU/g中的3log10下降(表13和图15)。相反，在以0.18mg/kg剂量的PlySs2(CF-301)后，在兔模型中获得相似的AUC/MIC值。总之，体内研究证实，与兔(0.18mg/kg)相比，关于在大鼠(10mg/kg)中的相似杀菌效应所需的高～50倍的剂量。
表13
关于在大鼠和兔中的各种PlySs2(CF-301)剂量的模拟的PlySs2(CF-301)AUC和AUC/MIC值
下表14中提供了本文研究中使用的细菌菌株列表。
表14
缩写：ATCC，美国典型培养物保藏中心；CAIRD，抗感染研究与发展中心(Centerfor Anti-Infective Research and Development)；LRSA，利奈唑胺抗性金黄色葡萄球菌；MSSA，甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌；MRSA，甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌；NARSA，金黄色葡萄球菌中的抗微生物抗性网络(Network on Antimicrobial Resistance inS.aureus)(现在的BEI Resources)；VISA，万古霉素中间产物金黄色葡萄球菌。
讨论
在这项研究中，将Mueller Hinton液体培养基(标准测试培养基)中PlySs2(CF-301)和各种其它抗菌溶素的活性与生物学相关培养基类型包括人全血、血浆和血清中测定的活性进行比较。
在本文描述且证实了PlySs2(CF-301)活化人血液的元素并与其协同作用的基本能力，以加强抗葡萄球菌活性的增强水平超过使用CAMHB参考液体培养基，遵循标准程序(例如，CLSI)，从AST预测的那种。我们的发现最初基于体外时间-杀死测定，证实与CAMHB相比，PlySs2(CF-301)针对来自高达34个不同来源的血液基质中的11种葡萄球菌菌株的最低灭菌浓度的≥100倍减少。我们进一步证实，针对在人血清中测试的171种金黄色葡萄球菌分离株的MIC90中的≥32倍减少，以及来自61个不同人来源的血液、血清和血浆中的一致低水平的MIC变化性。与达托霉素或万古霉素以时间-杀死和/或棋盘形式组合时，我们观察到在人血清中在低于CAMHB中高达160倍的PlySs2(CF-301)浓度下的协同活性。总之，这些结果支持PlySs2(CF-301)作为静脉内施用的抗微生物试剂用于治疗金黄色葡萄球菌菌血症和心内膜炎的潜在有效性。
此外，我们的发现暗示PlySs2(CF-301)与人血液的两种特定组分(即，溶菌酶和白蛋白)之间的协同作用，没有明显的(单一剂)固有的抗葡萄球菌活性，作为与增强的活性和功效相关的关键因素。PlySs2(CF-301)活化否则潜伏的旁观者并与其协同作用(关于杀死葡萄球菌)的独特能力，对于PlySs2(CF-301)的医学用途及其抗微生物活性的测量具有重要意义。此外，我们的发现与以下一般理解形成鲜明对比：对于许多***递送的常规小分子抗生素，循环中的蛋白质结合(主要与白蛋白结合)作用于减少药物活性(Zeitlinger MA等人(2011)Antimicrob Agents Chemother 55(7)：3067-3074；Schmidt S等人(2008)Antimicrob Agents Chemother 52(11)：3994-4000；Burian A等人(2011)J AntimicrobChemother 66(1)：134-137：Stratton CW&Weeks LS(1990)Diagn Microbiol Infect Dis13(3)：245-252；Beer J，Wagner CC，&Zeitlinger M(2009)AAPS J 11(1)：1-12；Hegde SS等人(2004)Antimicrob Agents Chemother 48(8)：3043-3050；Garonzik SM等人(2016)PLoS One 11(6)：eo156131)。
根据本文的研究和结果，血清中收集的MIC数据可能更适合于预测关于溶素多肽，特别是溶素多肽，例如PlySs2(CF-301)溶素的体内活性以及用于在临床试验之前的体内研究中的用途。特别地，基于本研究，在血清中或伴随添加的血清组分收集的数据可能更适合于如本文提供的PlySs2(CF-301)、Sal溶素、溶葡萄球菌素等，所述溶素具有SH3型结合结构域，或具有SH3结合结构域的其它溶素、嵌合体、构建体。事实上，关于体内治疗所需的某些肽和肽抗生素(abx)的浓度可能低于传统上根据实验室培养基中确定的MIC推导的浓度。测试抗菌活性的一种改进方法是使用生物学相关浓度的血液基质。
不存在关于HSA在以对于PlySs2(CF-301)描述的协同方式促进抗菌活性中的作用的先前描述。我们关于HSA的假设主要基于下述观察：(i)在多重测定形式包括棋盘、时间-杀死和裂解测定中，与PlySs2(CF-301)协同作用；(ii)在培养基如CAMHB/HiHuS和CAMHB中，用PlySs2(CF-301)在很大程度上重构血清效应的能力；(iii)通过蛋白质印迹分析检测到的与PlySs2(CF-301)的假定相互作用；以及(iv)通过显微镜检查检测到的PlySs2(CF-301)与葡萄球菌细胞表面的结合的促进。另外的支持来自在重构实验中使用来自不同物种的白蛋白替换HSA。特别地，当兔SA以40mg/mL的生理浓度使用时，它可以模仿HSA的活性。大鼠SA和小鼠SA两者均只能在40mg/mL的超生理浓度下重构HSA效应。啮齿类动物中20mg/mL的相对较低的生理SA浓度(其是兔和人中的40mg/mL正常生理浓度的一半)，至少可以部分解释小鼠和大鼠血清无法充当关于高水平的PlySs2(CF-301)活性的底物的原因。
我们用脱脂血清，特别是伴随油酸或棕榈酸的添加以重构协同效应的实验，还提示PlySs2(CF-301)和HSA之间的直接相互作用作为用于增强活性的机制的部分。循环HSA单体通常与脂质复合，并且存在至少7个高亲和力和中等亲和力的FA结合位点，当与FA结合时，所述FA结合位点可以修饰且改变与抗生素和其它分子的相互作用(Yang F，Zhang Y，&Liang H(2014)Int J Mol Sci 15(3)：3580-3595)。伴随PlySs2(CF-301)发生的此类相互作用还得到我们的蛋白质印迹数据支持，所述蛋白质印迹数据显示在与1μg/mL的PlySs2(CF-301)MIC相关的条件下，仅在HAS的存在下形成SDS抗性高分子量聚集物(即，～95kDA和～150kDA)。与PlySs2(CF-301)MIC为1μg/mL相关的条件。在与32μg/mL的PlySs2(CF-301)MIC相关的条件下，在HSA的不存在下，不形成PlySs2(CF-301)聚集物。聚集物形成、HSA结合和高水平PlySs2(CF-301)活性之间的潜在关系再次与抗生素形成对比，对于所述抗生素，与血清蛋白的结合导致活性减少。
金黄色葡萄球菌在其表面上表达大的白蛋白结合蛋白Ebh，其促成血液中的存活和葡萄球菌感染的总体发病机制(Cheng AG，Missiakas D，&Schneewind O(2014)JBacteriol 196(5)：971-981)。事实上，白蛋白结合蛋白在一系列致病微生物上发现，所述致病微生物理论上吸附HSA作为宿主组织中的存活策略的部分(Egesten A等人(2011)JBiol Chem 286(4)：2469-2476)。这些发现与我们基于电子显微镜检查的观察一致，显示在人血清中在金黄色葡萄球菌上的致密蛋白质表面层的快速累积，可能由白蛋白和/或其它血液组分组成。该层在葡萄球菌周围形成可见的鞘，所述鞘修饰PlySs2(CF-301)介导的溶菌作用的视觉表现(与CAMHB中的事件相比)，并且最终导致细菌菌蜕样结构(Wu X等人(2017)Foodbome Pathog Dis 14(1)：1-7)，其中经常完整的细胞包膜包裹在可能宿主衍生的材料的基质中。细菌碎片和片段(裂解后形成)的包裹也可能在减轻与这些片段自由释放到宿主的血流内相关的促炎应答的潜在风险中起重要作用。此外，细菌和PlySs2(CF-301)在人HSA基质中的包裹也可以减少潜在有害的免疫反应的风险。总之，我们的发现支持以下假说：葡萄球菌在血液中用HAS包被自身，且因此逃避人免疫监视的天然能力，可能是它们关于HAS对于PlySs2(CF-301)的结合能力的致命弱点，其导致增强的溶菌。换言之，PlySs2(CF-301)和HSA之间的协同作用机制基于关于PlySs2(CF-301)由HSA介导的在细菌细胞表面处的改进的累积动力学，并且导致通过PlySs2(CF-301)的更快速高效的细菌杀死。
此处呈现的结果还允许得出关于PlySs2(CF-301)活化人血清中针对金黄色葡萄球菌的溶菌酶的能力的结论。首先，存在以下一般认识：由于在细胞壁N-乙酰胞壁酸的C-6位置处的O-乙酰化，成熟的金黄色葡萄球菌肽聚糖对HuLYZ活性是抗性的(Bera A等人(2005)Mol Microbiol 55(3)：778-787；Bera A等人(2006)Infect Immun 74(8)：4598-4604)。相应地，我们观察到在多重不同的AST形式中，在广泛范围的浓度下关于单独测试的HuLYZ无论如何不存在抗葡萄球菌活性。然而，我们的确观察到在时间-杀死、棋盘测定和裂解测定中，在生理浓度下与PlySs2(CF-301)组合测试时，HuLYZ的独特的协同抗微生物活性。虽然基于体外重构实验，HSA对协同效应的贡献更显著，但HuLYZ对于完全重构效应一致地需要，并且通过反卷积显微镜检查，观察到急剧增加PlySs2(CF-301)介导的葡萄球菌表面标记的程度。考虑到所提议的HSA活性，我们的模型认为PlySs2(CF-301)通过与HSA的相互作用，并且不依赖于此，经由HuLYZ的活化，以优先方式在细胞表面处累积。尽管这种HuLYZ活性的确切性质是未知的，但一种可能的解释认为，PlySs2(CF-301)介导的肽聚糖裂解起始HuLYZ进入O-乙酰化之前形成的新生肽聚糖，并且随着溶菌进展，随后的HuLYZ水解活性促进更多的PlySs2(CF-301)结合。
为了理解PlySs2(CF-301)在葡萄球菌菌血症和心内膜炎的预期临床适应症中的体内功效概况，我们选择在两个物种(兔和大鼠)中进行实验，其中观察到PlySs2(CF-301)在此处报道的离体形式中与分别的血清类型协同作用的能力中的差异。IE模型在兔和大鼠两者中均已充分建立(Abdelhady W等人(2017)Antimicrob Agents Chemother 61(2)；Hady WA，Bayer AS，&Xiong YQ(2012)J Vis Exp(64)：e3863)，并且具有显著的生物膜组分，其与关于PlySs2(CF-301)的预期临床适应症高度有关。根据我们在兔血清而不是大鼠血清中的有力PlySs2(CF-301)协同作用的离体观察，我们观察到与兔(0.18mg/kg)相比，需要高＞50倍剂量的PlySs2(CF-301)和高＞20倍的AUC暴露，以在大鼠(10mg/kg)中获得相似的杀菌效应。这些模型提供了关于PlySs2(CF-301)活化HSA和HuLYZ并与其协同作用的能力的潜在治疗意义的进一步证据，并且支持在就金黄色葡萄球菌菌血症包括心内膜炎的治疗评估PlySs2(CF-301)的临床试验中，在选择用于治疗用途的剂量下PlySs2(CF-301)的预料功效。
一些先前的研究已评估了在血清和血浆中的抗菌效应，然而，结果和结论是各种各样的。人血浆的存在据报道增加抗菌肽模拟物(AMP)，例如α-肽/β-类肽肽模拟物相对于大肠杆菌的活性(Hein Kristiansen等人2013，Citterio等人2016)，导致可能涉及与血液组分的协同作用的假说，然而，这一点尚未进行全面评估。拟肽和PMB将血浆中的MIC降低2-16倍的发现导致以下提示：通过血浆的强化可能由内源性血液组分(例如补体)引起，因为热失活的确消除协同作用。热失活引起MIC中的急剧增加。提出血浆的其它组分可能在强化中起作用，包括补体级联的蛋白质，其可以解释为何血浆对某些AMP产生的强化多于血清。与血清不同，血浆含有可能响应细菌的存在的活性凝血因子。
血浆增强了PMB而不是庆大霉素和氨苄青霉素的活性。其它研究已报道，补体蛋白可以与抗微生物化合物如PMB和AMP协同起作用。强化效应取决于试剂的作用模式，因为看起来仅加强对细胞膜或包膜有活性的化合物。得出结论凝血蛋白与补体一起作用，以加强活性。
Vaara等人1984年评估了外膜破坏肽PBMN，并且发现小的阳离子外膜破坏肽PMBN使大肠杆菌对血清杀菌作用敏感，促进正常血清中存在的抗体或其它因子的***或结合，伴随所得的补体级联活化。通过加热消除了PMBN介导的血清杀菌活性。在人、豚鼠和兔中注意到该效应，在大鼠中具有中等效应，而在小鼠血清中无效应。小鼠已被列举为在哺乳动物中是独特的，因为它们的正常或超免疫血清或腹膜液也缺乏在其它动物的血清中容易杀死的杀菌作用。
Pruul和McDonald 1992年评价了阿奇霉素的抗菌活性通过正常人血清的强化。在他们的研究中，MIC测定中的40％血清引起相对于细菌金黄色葡萄球菌的MIC中的15倍降低。然而，这种增强没有被热失活抑制，显示它不是热敏感的。他们还发现关于补体失活的血清或抗体耗尽的血清没有差异。另外，向TSB测试液体培养基中添加白蛋白(CohnFraction V)(至70mg/m1)不恢复活性。该效应限于革兰氏阴性物种，并且对葡萄球菌未观察到。
人血清的血清增强因素可以包括血清脂蛋白，pH中的变化，抗菌肽。由血清因素造成的细菌生长速率和细菌表面组成中的变化可以修改细菌膜通透性，改变抗生素累积动力学或增强抗生素结合。
鉴于动物宿主中的先天性免疫分子的基本多样性，PlySs2(CF-301)活性可以与许多其它肽协同作用并改善其总体有效性是可能的。
基于本研究，我们提出下述模型以生物学方式解释活性增强。在血液中，金黄色葡萄球菌细菌被血清蛋白包括HSA包被，以便逃避免疫***(金黄色葡萄球菌上的HSA结合蛋白是已知的，并且先前已得到描述)。HAS结合是有代价的，包括降低的交联。借助于在细菌的存在下PlySs2(CF-301)(和其它SH3结合型溶素)与HSA的相互作用，溶素在细菌表面处集中。这个浓度与通过HSA结合施加的交联降低组合，增强了PlySs2(CF-301)的抗菌活性。在通常针对金黄色葡萄球菌细菌无效的人溶菌酶(HuLYZ)的情况下，增强的PlySs2(CF-301)活性与降低的交联组合，促进针对新生肽聚糖的HuLYZ结合和活性，所述新生肽聚糖保持对HuLYZ敏感。HAS、HuLYZ和PlySs2(CF-301)的组合活性使血液效应成为可能。
金黄色葡萄球菌对HuLYZ的敏化是新近认识到的且先前未观察到的。金黄色葡萄球菌的标志是对溶菌酶的抗性，这对其用于免疫逃避的策略是关键的。PlySs2(CF-301)处理避免这一点，并且致使溶菌酶针对金黄色葡萄球菌活性。
因此，本实验证实，基于其固有的水解活性及其加强溶菌酶的抗菌活性的能力，PlySs2(CF-301)是非常高效的抗葡萄球菌试剂。另外，PlySs2(CF-301)与HSA协同作用且加强HAS，和/或利用HSA与细菌细胞的结合将PlySs2(CF-301)带入细菌，和/或有效地使PlySs2(CF-301)在细菌感染部位处集中。
我们的数据证实，由于与先天性免疫效应物溶菌酶和最丰富的血清蛋白白蛋白两者的协同相互作用，人血液环境可以与抗葡萄球菌溶素PlySs2(CF-301)、以及其它示例性的含有SH3型结合结构域的溶素协同作用，并且极大地增强或加强其抗微生物活性。这项研究突出显示了这个酶类别适应广泛不同的肽聚糖底物的惊人适应性。这个观察强调了微生物响应抗生素攻击的适应性，并且证实长期以来被认为免于抗性的已确认抗生素的敏感性。
材料和方法
细菌、培养基和生长条件。表S8中描述了本研究中使用的细菌菌株子集。先前描述了表1中使用的171种金黄色葡萄球菌菌株(4)，包括来自2011年的74种MSSA和75种MRSA临床分离株，其得自JMI Laboratories(North Libery，IA)。除非另有说明，否则在含有5％绵羊血的BBLTM TrypticaseTM大豆琼脂(TSAB；Becton，Dickinson&Company[BD])、阳离子调节的BBLTM Mueller Hinton II液体培养基(CAMHB；BD)、或脑心浸液液体培养基(BHI；BD)上培养细菌。除了HyCloneTM胎牛血清(0.1微米过滤的；GE Healthcare Lifesciences)之外，所有测试的人和动物血液基质的来源、描述和批号都在表S1和表S2中进行描述。除非另有说明，否则葡萄球菌在37℃下伴随通风生长。
试剂。如先前所述表达、纯化且贮存溶素PlySs2(CF-301)(4)。人抗PlySs2(CF-301)IgG3单克隆抗体(在ContraFect Corporation处表达且纯化)和小鼠抗人IgG3重链抗体，AP缀合物(ThermoFisher 05-3622)，以1∶1,000的稀释度用作一抗和二抗用于蛋白质印迹。与PlySs2(CF-301)组合测试的所有试剂(和供应商来源)如下：β-防御素3，人(Anaspec)；Leap-1，人(Anaspec)；Leap-2，人(GenScript)；LL-37，人(Anaspec)；LL-18-37(Anaspec)；histatin-5，人(Anaspec)；HNP-1，人(Anaspec)；HNP-2，人(Anaspec)；人血小板因子IV 18(Anaspec)；乳铁蛋白，人乳(Sigma-Aldrich)；乳铁蛋白，牛初乳(Sigma-Aldrich)；乳铁蛋白H，人(Anaspec)；人溶菌酶，在水稻中重组表达的(Sigma-Aldrich)；溶菌酶，鸡蛋(Sigma-Aldrich)；溶菌酶，人嗜中性粒细胞衍生的(AVIVA Biosciences)；溶菌酶，人嗜中性粒细胞衍生的(RayBiotech)；人血清白蛋白，在水稻中重组表达的(Sigma-Aldrich)；人血清白蛋白，级分V(Sigma-Aldrich)；人血清白蛋白，级分V，无脂肪酸，无球蛋白(Sigma-Aldrich)；人血清白蛋白，在酵母中重组表达的(Albumin Bioscience)；小鼠血清白蛋白，在酵母中重组表达的(Albumin Biosciences)；兔血清白蛋白(Sigma-Aldrich)；和大鼠血清白蛋白(Sigma-Aldrich)。油酸钠、棕榈酸钠、盐酸万古霉素、达托霉素、来自Tritirachiumalbum的蛋白酶K-琼脂糖购自Sigma-Aldrich。对于显微镜检查，DAPI、Alexa488和NHS-罗丹明得自Thermo Fisher Scientific。如通过制造商的方案描述的，执行与NHS-罗丹明缀合的PlySs2(CF-301)、以及与Alexa Fluor488缀合的HuLYZ的标记和纯化。使用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)去除未反应的荧光团，并且在每种情况下，标记效率确定为＞80％。使用标准MIC测定，PlySs2(CF-301)-罗丹明(CF-301RHOD)的活性确认为与PlySs2(CF-301)等价。在浸有来自藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的1mg/ml肽聚糖(Sigma-Aldrich)的1％琼脂糖表面上，使用滴稀释测定，确认HuLYZ-Alexa Fluor 488(HuLYZAF)的活性与HuLYZ等价。先前描述了GFP标记的PlyG(PlyGGFP)和Alexa Fluor488标记的PlyC(PlyCAF)的生产、纯化和用途(38、39)。
时间-杀死测定。根据CLSI方法测试杀菌活性(52)。在CAMHB或指示的(未稀释)血液基质中，使用在125-mL玻璃锥形瓶中的5x105CFU/mL细菌接种物，伴随搅拌执行测定。跨越10倍的浓度范围测试了所指示的试剂。对于达托霉素，CAMHB培养物补充有50μg/mL Ca2+。始终包括具有单独的缓冲液的生长对照。紧在处理前以及在其后直至24小时的指示时间间隔，取出培养物等分试样，并且在活性炭中稀释(以阻止或停止药物活性)。然后将失活培养物的一系列10倍稀释物在TSAB上铺平板，并且在菌落计数之前在37℃下温育24小时。杀菌活性定义为相对于初始接种物≥3log10CFU/mL的降低。
MIC测定。MIC值使用CLSI参考方法(62)，在CAMHB或指示的血液基质中通过液体培养基微量稀释进行确定。CAMHB/HiHuS通过以下进行制备：向CAMHB补充50％的人血清，然后在70℃下温育20分钟以使负责与PlySs2(CF-301)协同作用的组分完全失活之前，通过具有50kDa截断的Microcon Centrifugal Filter Unit(Amicon Ultra-15；Millipore)过滤。为了用脂肪酸补充脱脂的血清，制备了在H2O中的油酸或在100％乙醇中的棕榈酸的50mg/mL储备溶液，并且加入血清中以达到0.625mg/mL的最终浓度；然后在用于促进脂肪酸与HSA结合之前，使补充的血清在37℃下温育1小时。确切地根据制造商的方案，使用(Thermo Fisher Scientific)执行PlySs2(CF-301)MIC值的比色测定。根据制造商的方案(Sigma-Aldrich)，执行用蛋白酶K-琼脂糖珠预处理3小时的人血清中的PlySs2(CF-301)活性的分析。作为关于在蛋白酶K-琼脂糖珠去除后的蛋白酶携带污染的对照，在MIC测定之前，将处理的血清以3：4稀释到未处理的血清内；仅当不存在未结合的蛋白酶K或蛋白酶K-琼脂糖珠的携带污染时，未处理血清的添加预期恢复协同效应。
裂解测定。MRSA菌株MW2的过夜培养物在BHI中进行1∶100稀释，并且在37℃下伴随通风生长2.5小时。将指数期细胞洗涤，在20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中浓缩10倍，并且以等分试样拆分，向其中加入在一定浓度范围内的HSA(Albumin Biosciences)、或人嗜中性粒细胞衍生的溶菌酶(AVIVA Bioscience)。对于每种浓度的HSA或溶菌酶，将0.1mL混合物一式两份地等分到96孔、平底、非组织培养处理的微量滴定板(BD)中。然后通过向所有孔中加入0.1mL PlySs2(CF-301)(在磷酸盐中)至4μg/mL的最终浓度，开始裂解反应。包括具有以适当浓度的单独的PlySs2(CF-301)、HSA或HuLYZ的对照孔。将样品混合，并且在SpectraMax M5 Microplate Reader(Molecular Devices)中，在室温下追踪在600nm处的光密度(OD600)15分钟。
执行裂解测定的变化，以确定PlySs2(CF-301)的比活性。指数期MW2细胞如上所述制备，并且分成4mL等分试样，其含有磷酸盐缓冲液(不添加试剂的反应，具有单独的细胞)、或HSA(Albumin Biosciences)和/或人溶菌酶(AVIVA Bioscience)。PlySs2(CF-301)(以0.5mg/mL开始)以0.1mL的体积跨越具有20mM磷酸盐pH 7.4的96孔板的第1至11列系列稀释2倍。第12列不包含酶，仅包含缓冲液，并且用作测定对照孔。与缓冲液、HAS、溶菌酶或与HuLYZ组合的HAS混合的细菌细胞作为0.1mL等分试样加入三行系列稀释的PlySs2(CF-301)的每个孔中。每块板使用如上的微板阅读器在室温下在600nm处读取15分钟(在读取之间振荡3秒)。基于PlySs2(CF-301)稀释度确定以PlySs2(CF-301)的单位/mg的比活度，所述稀释度在15分钟时展示刚好高于和低于其为缓冲液对照的50％的光密度的曲线。
棋盘测定。如所述的执行棋盘测定(66)，并且由用于液体培养基微量稀释的CLSI方法修改(62)。通过首先在96孔聚苯乙烯微量滴定板的各列中等分相同量的沿着X轴稀释2倍的PlySs2(CF-301)来制备棋盘。在分开的板中，准备对应的行，其中每个孔具有相同量的沿着y轴稀释2倍的另一种试剂。然后组合稀释物，使得每列具有恒定量的PlySs2(CF-301)和第二试剂的两倍稀释物，而每行具有恒定量的第二试剂和PlySs2(CF-301)的两倍稀释物。因此，每个孔具有PlySs2(CF-301)和第二试剂的独特组合。细菌以在CAMHB或人血清(合并的男性，AB型，无菌过滤的，美国血统；Sigma-Aldrich)中的～5x105CFU/mL浓度加入每个孔中。在37℃在环境空气中18小时后，记录单独或组合的每种药物的MIC。结果依据等于关于每种药物的FIC总和的∑FIC指数表示；关于药物的FIC定义为以组合的药物的MIC除以单独使用的药物的MIC。对于每种配对试剂报告了∑FICmin(所有组合中获得的最低∑FIC值)和∑FICAvG(三个连续药物组合的平均∑FIC值)两者。如果∑FIC指数≤0.5，则该组合被解释为协同的；＞0.5至≤2解释为相加的；且＞2解释为拮抗的(16)。根据制造商的方案，还使用(Thermo Fisher Scientific)执行PlySs2(CF-301)MIC值的比色测定。
协同作用时间-杀死测定。协同作用时间-杀死曲线根据由CLSI描述的方法执行(52)。菌株MW2以5x105菌落形成单位(CFU)/mL的浓度悬浮于具有50％HiHuS的CAMHB中，并且在35℃下在环境空气中伴随搅动，暴露于PlySs2(CF-301)和/或达托霉素、HSA(AlbuminBiosciences)和HuLYZ(AVIVA Bioscience)24小时。在定时间隔时，取出培养物样品，系列稀释并且铺平板，以确定CFU/mL。通过将log10CFU/mL相对于时间标绘，以图形方式显示了所得到的杀死动力学测定。协同作用定义为组合及其活性最高的组成成分之间≥2-log10的CFU/mL降低，其中活性最低的组成成分在无效浓度下测试。
荧光显微镜检查：在不同血清环境中PlySs2(CF-301)与细菌细胞表面的结合。将对数中期MRSA菌株MW2以1x107CFU/mL悬浮于CAMHB或者来自人(Sigma-Aldrich)、兔(Gibco)、大鼠(BioreclamationIVT)或小鼠(BioreclamationIVT)的100％血清中，并且在37℃下温育30分钟。还测试了另外的小鼠血清样品，其含有40mg/mL HSA(AlbuminBiosciences)。在预温育后，将细菌用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并且重悬浮于50μlPBS中，并且附着至聚L-赖氨酸包被的盖玻片的表面。将细胞洗涤并用CF-301RHOD(在PBS中2μg/mL)处理10分钟，然后洗涤并用DAPI复染色。载玻片在PBS，pH 8中的50％甘油和0.1％对苯二胺中固定。使用配备有Nikon 100×/1.25油浸镜头和Retiga EXi fast 1394相机的Nikon Eclipse E400显微镜(QImaging)，执行荧光显微镜检查。QCapture Pro版本5.1.1.14软件(QImaging)用于图像捕获和加工。
荧光显微镜检查：在HAS的存在下PlySs2(CF-301)结合的增强。VISA菌株ATCC700699的过夜培养物在CAMHB中1∶100稀释，生长至0.6的OD600，并且附着至聚L-赖氨酸包被的盖玻片的表面。细胞用PBS进行洗涤，并且在室温下用10μl含有HSA(AlbuminBiosciences)的PBS或单独的PBS处理30分钟。然后将一式两份的样品补充有PBS或含有NHS-罗丹明标记的PlySs2(CF-301)的PBS的原始体积的1/10，至4μg/mL(0.25x MIC)的最终浓度。使细胞在室温下进一步温育30分钟，用PBS洗涤，并且在室温下用2.6％多聚甲醛的PBS溶液固定45分钟。然后将载玻片用PBS洗涤，并且在含有50％甘油和0.1％对苯二胺的PBS pH 8.0中固定。DAPI在所有测定条件下都用作复染剂。使用配备有CoolSnap QE冷却CCD相机(Photometrics)的DeltaVision图像复原显微镜(Applied Precision/Olympus)执行反卷积显微镜检查。使用1.5×optovar组合的Olympus100×/1.40N.A.，UPLS Apo油浸物镜完成成像。Z堆叠以0.15-μm的间隔获取。图像使用SoftWoRx软件(Applied Precision/DeltaVision)进行反卷积，校正色差，并且呈现为组合所有有关z截面的最大强度投影。在类似于上述那种的补充分析中，将NHS-罗丹明标记的PlySs2(CF-301)替换为25μg/mLPlyGGFP或PlyCAF。在处理后，使用配备有Nikon 100×/1.25油浸透镜的Nikon Eclipse E400显微镜，通过荧光显微镜检查来显现样品。
荧光显微镜检查：在PlySs 2(CF-301)的存在下HuLYZ结合的增强。VISA菌株ATCC700699的过夜培养物在CAMHB中1∶100稀释，生长至0.6的OD600，并且附着至聚L-赖氨酸包被的盖玻片的表面。细胞用PBS进行洗涤，并且在室温下用50μl含有以不同浓度的PlySs2(CF-301)的PBS或单独的PBS处理30分钟。然后将一式两份的样品补充有PBS或含有Alexa Fluor488标记的HuLYZ的PBS的原始体积的1/10，至10μg/mL的最终浓度。使细胞在室温下进一步温育30分钟，用PBS洗涤，并且在室温下用2.6％多聚甲醛的PBS溶液固定45分钟。然后将载玻片用PBS洗涤，并且在20mM Tris pH 8.0、90％甘油、0.5％没食子酸正内酯中固定。DAPI在所有测定条件下都用作复染剂。如上所述，使用配备有CoolSnap QE冷却CCD相机(Photometrics)的DeltaVision图像复原显微镜(Applied Precision/Olympus)执行反卷积显微镜检查。在补充分析中，将Alexa Fluor488标记的CF-301替换为25μg/mL PlyGGFP或PlyCAF。在处理后，使用配备有Nikon 100×/1.25油浸透镜的Nikon Eclipse E400显微镜，通过荧光显微镜检查来显现样品。
电子显微镜检查。在CAMHB或人血清(Sigma-Aldrich)中生长的对数中期菌株MW2，用指示浓度的PlySs2(CF-301)或单独的缓冲液(对照)在37℃下处理15分钟。细胞然后用1X磷酸盐缓冲液(PB)进行洗涤，并且重悬浮于4％多聚甲醛和2％戊二醛在0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH 7.4)中的溶液中。样品在1％四氧化锇中后固定，用乙酸双氧铀进行块染色，并且根据通过The Rockefeller University Electron Microscopy Service的标准程序进行加工。使用TecnaiTM Spirit BT Transmission Electron Microscope(FEI)显现样品。人血清进行无菌过滤，并且得自具有AB血型的美国血统的合并男性群体(～70个受试者)。
蛋白质印迹分析。通过蛋白质印迹分析从所示培养基类型中获取的PlySs2(CF-301)MIC孔样品。各10μl的样品等分试样在4-12％Tris-Glycine Mini Gels(NovexTM)上运行，然后经由电印迹转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。使PVDF膜与抗PlySs2(CF-301)特异蛋白G亲和纯化的人IgG3重组单克隆抗体，随后为第二单克隆鼠抗IgG3-碱性磷酸酶缀合物检测抗体一起温育。一抗和二抗两者均以1∶1,000的稀释度使用。膜用硝基蓝四唑和5溴4氯3′吲哚磷酸酯(NBT/BCIP)生色底物染色。通过与在相同凝胶中运行的分子量标准的条带的比较，确定可见条带的分子量。
大鼠感染性心内膜炎模型。Sprague-Dawley大鼠(250-275g)经由腹膜内注射(IP)用***87mg/kg和甲苯噻嗪13mg/kg混合物进行麻醉，经历标准的留置经颈动脉经主动脉瓣至左心室导管***术。在48小时后，用金黄色葡萄球菌菌株MW2(～1x105菌落形成单位[CFU]/大鼠；IV)攻击动物，以诱导心内膜炎。在感染后24小时，对大鼠群组实施安乐死，并且收集心脏瓣膜植被，以确定初始组织负荷(对照组)。剩余大鼠用媒介物(盐水；IV单一剂量)、或单独的DAP(40mg/kg；皮下注射(SQ)；qd x4天)、或DAP加上PlySs2(CF-301)进行处理。仅在处理的第一天时，刚好在初始DAP剂量后，以四个给药方案(1、2.5、5和10mg/kg)，PlySs2(CF-301)作为单次缓慢推注(在5-10分钟内注射)进行IV施用。在最后一次DAP处理后24小时(感染后5天)，对处理的动物实施安乐死(通过快速IP推入以200mg/kg的戊巴比妥钠)，并且取出心脏瓣膜植被，称重，匀浆化并且在无菌PBS中系列稀释，用于在TSAB上的定量培养。使所有培养板在37℃下温育24小时，计数所得到的菌落并且表示为log10CFU/g组织。关于不同处理组的每个器官的数据计算为中值log10CFU/g组织±95％CI。
PlySs2(CF-301)的群体PK建模。药代动力学(PK)数据从先前的非临床毒理学研究中收集，所述研究包括用以不同剂量的PlySs2(CF-301)处理的大鼠和犬(41、42)。在时间过程内收集剂量后血浆，并且使用验证的PlySs2(CF-301)ELISA进行分析。关于作为10分钟静脉内输注，以1、2.5、5和10mg/kg剂量的PlySs2(CF-301)的预测AUC值，衍生自基于非临床大鼠和犬PK实验的群体PK建模。对于当前研究，将先前报告的AUC值除以关于MRSA分离株MW2在大鼠血清中测定的MIC值(即，16μg/mL)，以得到表13中报告的计算的AUC/MIC比率值。
兔传染性心内膜炎模型。新西兰白兔(2.2-2.5kg)经由肌内注射(IM)用***35mg/kg和甲苯噻嗪5mg/kg混合物进行麻醉，经历标准的留置经颈动脉经主动脉瓣至左心室导管***术(43)。在导管放置后48小时，动物用～2x105CFU的金黄色葡萄球菌MW2菌株接种物进行IV攻击，以诱导感染性心内膜炎(IE)。根据先前的研究，这种接种物已显示在＞95％的***导管的动物中诱导IE。在感染后24小时，对兔群组实施安乐死，并且收集心脏瓣膜植被，以确定初始组织负荷(对照组)。剩余兔用媒介物(盐水；IV单一剂量)、或单独的DAP(4mg/kg IV；qd x4天)、单独的PlySs2(CF-301)、或DAP加上PlySs2(CF-301)进行处理。仅在处理的第一天时，刚好在初始DAP剂量后，以四个给药方案(0.09、0.18、0.35、0.70和1.4mg/kg)，PlySs2(CF-301)作为单次缓慢推注(在5-10分钟内注射)进行IV施用。在最后一次DAP处理后24小时(感染后5天)，对处理的动物实施安乐死(通过快速IP推入以200mg/kg的戊巴比妥钠)，并且取出心脏瓣膜植被，称重，匀浆化并且在无菌PBS中系列稀释，用于在TSAB上的定量培养。使所有培养板在37℃下温育24小时，计数所得到的菌落并且表示为log10CFU/g组织。关于不同处理组的每个器官的数据计算为中值log10CFU/g组织±95％CI。
兔药代动力学。新西兰白兔用以0.18、0.35、0.07或1.4mg/kg的PlySs2(CF-301)(IV，缓慢推注)进行给药。在剂量后渐增量的时间后，以所述方式(63、64)，使用验证的PlySs2(CF-301)ELISA收集血浆并进行分析。使用WinNonLin衍生关于作为10分钟静脉输注，以1、2.5、5和10mg/kg剂量的PlySs2(CF-301)的预测AUC值(数据未显示)。这些值除以MRSA分离株MW2的MIC值(兔血清中的1μg/mL)导致表8中报告的计算的AUC/MIC比率值。
在兔中的达托霉素剂量原理。在由金黄色葡萄球菌菌株MW2引起的兔IE模型中，达托霉素剂量应答实验以范围为1mg/kg至10mg/kg IV的剂量执行，每天一次，共4天。选择以4mg/kg的达托霉素(代表低于人治疗剂量当量的剂量)，以探索除达托霉素之外的PlySs2(CF-301)疗法的益处。在兔IE模型中，与媒介物处理的对照组相比，4mg/kg IV的达托霉素剂量提供了细菌负荷中的～2-3log10减少。处理的动物仍具有～5-7log10的显著负荷，提供了显著的动态范围以观察PlySs2(CF-301)对这个治疗方案的附加效应。
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实施例2
值得注意的是，特别是经由血清白蛋白和溶菌酶，证实血清组分效应的溶素多肽PlySs2(CF-301)、溶葡萄球菌素(LSP)和Sal溶素，在所有具有SH3型结合结构域的细胞中是相似的。为了进一步评估结合结构域与血清组分效应的相关性，通过将一个结合结构域替换或交换为另一个结合结构域，构建了各种嵌合体。使用MHB相对于人血清，就MIC测定了具有Sal1 CHAP催化结构域与ClyS结合结构域、PlySs2(CF-301)结合结构域、或溶葡萄球菌素结合结构域的嵌合溶素。结果在下表14中描绘。ClyS的结合结构域不支持血液效应，而其为SH3型结合结构域的PlySs2(CF-301)的结合结构域则支持。类似地，溶葡萄球菌素的SH3型结合结构域也证实血清组分效应，当融合到Sall催化结构域作为嵌合溶素时，仍保留血清效应。
表14
本发明可以以其它形式体现或以其它方式进行，而不脱离其精神或基本特征。因此，本公开内容在所有方面被视为示例性的而不是限制性的，本发明的范围由所附权利要求指示，并且预期在其中包含在等价含义和范围内的所有改变。
在这个说明书自始至终引用了各种参考文献，所述参考文献各自整体引入本文作为参考。

Claims (10)

1.一种用于增强或协同杀死革兰氏阳性菌的组合物或组合产品，其包含具有SH3型结合结构域的分离的溶素多肽、以及选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分蛋白或肽或其片段，其中所述肽或其片段显示出全长白蛋白或溶菌酶蛋白关于溶素多肽活性增强效应的活性。
2.权利要求1的组合物或组合产品，其中所述具有SH3型结合结构域的溶素多肽选自PlySs2(CF-301)溶素、Sal溶素、LysK溶素、溶葡萄球菌素、phill溶素、LysH5溶素、MV-L溶素、LysGH15溶素和ALE-1溶素。
3.权利要求1的组合物或组合产品，其中所述具有SH3型结合结构域的溶素多肽是PlySs2(CF-301)溶素，并且包含SEQ ID NO：3中提供的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO：3的多肽具有至少80％的同一性并且有效杀死葡萄球菌属和链球菌属细菌。
4.权利要求1的组合物或组合产品，其中所述血清白蛋白选自人血清白蛋白、马血清白蛋白、犬血清白蛋白、兔血清白蛋白、大鼠血清白蛋白或小牛(母牛/牛)血清白蛋白。
5.权利要求1的组合物或组合产品，其中所述溶菌酶是人溶菌酶。
6.权利要求1的组合物或组合产品，其中在不存在所述溶素多肽时，所述血液组分血清白蛋白和/或溶菌酶不具有或具有有限的固有抗菌活性，特别是抗葡萄球菌活性。
7.权利要求1的组合物或组合产品，其进一步包含一种或多种血清脂肪酸。
8.权利要求7的组合物或组合产品，其中所述血清脂肪酸选自油酸和棕榈酸。
9.一种杀死或减少革兰氏阳性菌群体的方法，其包括使所述细菌与组合物接触，所述组合物包含一定量的有效杀死所述革兰氏阳性菌的分离的溶素多肽，所述分离的溶素多肽具有SH3型结合结构域，以及选自血清白蛋白和溶菌酶的一种或多种血液组分。
10.权利要求9的方法，其中所述血清白蛋白选自人血清白蛋白、马血清白蛋白、犬血清白蛋白、兔血清白蛋白、大鼠血清白蛋白和小牛(母牛/牛)血清白蛋白。
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