CN116589580A - 特异性靶向b7-h4的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性靶向B7‑H4的抗体及其制备方法和应用。本发明基于噬菌体展示技术筛选靶向B7‑H4的抗体可变区，再将其改造成全长抗体，通过构建表达载体、真核表达、纯化获得特异性靶向B7‑H4的抗体。该抗体具有强亲和力和高特异性，靶向B7‑H4的IgV结构域，可有效阻断B7‑H4分子对T细胞增殖及杀伤功能的抑制作用，并呈现剂量依赖效应。能够抑制B7‑H4阳性肿瘤生长并延长小鼠的生存期，在肿瘤诊断与治疗中发挥潜在的医学和药学价值。

Description

特异性靶向B7-H4的抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种特异性靶向B7-H4(B7 Homolog 4，B7同源体4)的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤已成为威胁人类健康，降低预期寿命的首要因素。每年新增肿瘤患者达到数千万。传统的肿瘤治疗手段如化疗、放疗和手术治疗效果局限，且毒副作用大，肿瘤免疫治疗的建立及蓬勃发展改变了恶性肿瘤的常规治疗方式。在利用阻断CTLA-4(CytotoxicT lymphocyte-associated antigen-4,细胞毒T淋巴细胞相关抗原4)和PD-1(Programedcell death-1,程序性死亡受体1)这两个首先检测到的免疫检查点在肿瘤治疗方面取得显著成果后，出现了基于免疫检查点配体和受体阻断的肿瘤治疗新探索浪潮。到目前为止，FDA(Food and Drug Administration，食品药品监督管理局)批准了近50种用于肿瘤治疗的单克隆抗体药物，然而这些批准的针对免疫检查点单克隆抗体或小分子抑制剂的临床反应率仍然很低，仅有部分肿瘤患者从中受益，且单独使用的疗效也有限。因此，深入研究肿瘤免疫的调控机制，探索其他靶向药物和抑制途径是肿瘤免疫领域的重点。
过去几年，越来越多的研究表明B7-H4是***的潜在靶点。B7分子是一个跨膜蛋白家族，与CD28受体家族相互作用，调节刺激或抑制性免疫信号。B7-H4是B7家族中的一员，于2003年被三个实验室通过与B7家族其他分子的DNA序列同源性进行鉴定。在健康个体中，许多非淋巴组织(如胎盘、肺、肝、卵巢和脾脏)中检测到较低的B7-H4 mRNA水平；而在各种类型的癌症组织中均可观察到B7-H4的异常高表达，如乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、***癌、黑色素瘤和肾细胞癌等，且表达水平与患者预后和总生存期呈负相关。作为B7家族中与PD-L1(Programmed cell death 1ligand 1，细胞程序性死亡-配体1)的共同抑制免疫检查点，B7-H4与PD-L1表达的重叠最小。Chen,Di等人基于从TCGA和CGGA中获得的两个已发表的胶质瘤患者RNA-seq数据集分析了PD-L1和B7-H4的mRNA表达水平观察到PD-L1和B7-H4之间存在显著的负相关。在肺腺癌、肺癌、***等肿瘤中也观察到类似的结果。此外，在临床或临床前试验中被证实为治疗靶点的大多数其他与PD-L1密切相关的靶向免疫调控分子同时表现出与B7-H4的互斥表达。因此，B7-H4有望成为与PD-L1相互补偿的免疫检查点分子，在PD-L1低表达或者PD-L1疗法耐药的病人中起到抑制免疫抗肿瘤的功能。另外，B7-H4在乳腺癌细胞上高表达，并且在三阴性乳腺癌细胞中的表达有升高的趋势，B7-H4有可能成为治疗原发和复发乳腺癌的新的替代靶点，包括对HER2靶向治疗无效的三阴性乳腺癌。Iizuka,Akira等人利用抗B7-H4 BsAb(bispecific antibody，双特异性抗体)在体内对B7-H4阳性的乳腺癌细胞株(HCC-1954和HCC-1569)显示出很强的抗肿瘤作用，而这两株细胞已被证实是HER2阳性，曲妥珠单抗耐药。研究表明，B7-H4可以通过抑制T细胞介导的免疫应答反应参与肿瘤的免疫逃逸，肿瘤细胞中的B7-H4是CD8 T细胞活化、扩增和细胞毒性的负调控因子，提示肿瘤细胞相关的B7-H4可能是基于T细胞的癌症免疫治疗的靶点。因此，如果抑制B7-H4蛋白的功能，就可以阻断其与T细胞上假定的B7-H4受体或配体接触，影响信号传递，从而抑制肿瘤细胞的增殖或逃逸。
尽管B7-H4作为抗肿瘤靶点前景广阔，然而迄今为止，仍没有靶向B7-H4的抗体药物上市，也没有针对人B7-H4的有效全人源中和型抗体。已有一些关于靶向B7-H4抗体的体内外抗肿瘤活性研究的报道。Prasad,Durbaka V.R.等人的研究表明，在B7-H4抗体存在的情况下，IL-2分泌增加，T细胞增殖和活化水平提高。Sica,Gabriel L.等人开发了一种抗小鼠B7-H4单克隆抗体，在与B7-H4转染的细胞孵育后显示出部分中和对T细胞增殖的抑制作用。另一种抗小鼠B7-H4抗体(3E8)显示逆转B7-H4介导的小鼠T细胞激活后细胞因子分泌减少。此外，抗小鼠B7-H4抗体能够增加T细胞体内抗肿瘤反应并减少表达同基因B7-H4的小鼠肺癌模型中的肿瘤负荷。Xue,Qun等人利用一种抗人B7-H4抗体，可显著减弱人骨髓源性间充质干细胞(hBMSCs)表达的B7-H4的T细胞抑制作用，但在异种移植模型中对抗B7-H4单抗减轻人类肿瘤负担的能力的体内分析尚未得到评估。然而，小鼠单抗与人类Fc受体的结合较差，这将导致一系列间接保护机制的缺失，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性，补体依赖细胞毒性，吞噬作用和调理素作用。此外，小鼠单抗对新生受体(FcRn)的亲和力较差，导致这些IgG分子循环不良，导致半衰期较短(小鼠抗体1.5天、人鼠嵌合抗体10天、人源化抗体12-20天、全人源抗体15-20天)。因此，在治疗过程中需要更多的小鼠单抗，才能达到理想的治疗效果。更重要的是，鼠源抗体具有较强的免疫原性，限制了它们的临床应用。综上分析，全人源化抗体是最适合用于治疗的。目前在国外仅有1个由人源化小鼠获得的B7-H4抗体即FPA150及经过人源化改造的B7-H4抗体NC762分别进入临床I期和临床Ⅱ期进行评估，这种将人类抗体恒定区及鼠可变区结合的人源化抗体其鼠源成分仍占10％。而国内的研究仍是一片空白。还有7个鼠源抗体进入Ⅰ期临床试验，其中3个抗体与其他靶点抗体药物联合制备成双特异性抗体(BsAb)，即HBM7008(B7-H4×4-1BB BsAb)、GEN-1047(B7-H4×CD3 BsAb)、PF-07260437(B7-H4×CD3 BsAb)，另外4个抗体(AZD-8205、HS-20089、XMT-1660、SGN-B7H4V)与小分子药物偶联制备成抗体偶联药物(ADC)。这些联用方案的策略是利用B7-H4抗体的靶向性，同时借助另一个联用抗体或小分子药物的抗肿瘤功能“双管齐下”，发挥二者的协同作用，然而如何能实现双特异性抗体“1+1>2”的升级是近几十年来科研及药企研发人员需要克服的困难与挑战，因此产生一种高度特异性的抗人B7-H4中和型抗体将强有力打开临床前研究的大门。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请实施例的目的包括提供一种特异性靶向B7-H4的抗体及其制备方法和应用。
在本申请的第一方面，提供一种特异性靶向B7-H4的抗体，所述抗体的重链CDR1如SEQ ID NO.6所示、重链CDR2如SEQ ID NO.7所示以及重链CDR3如SEQ ID NO.8所示；
所述抗体的轻链CDR1如SEQ ID NO.9所示、轻链CDR2如SEQ ID NO.10所示以及轻链CDR3如SEQ ID NO.11所示。
在本申请的一些实施方式中，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO.4所示。
在本申请的一些实施方式中，所述中和抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.5所示。
在本申请的一些实施方式中，所述抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区。
在本申请的一些实施方式中，所述的重链恒定区和轻链恒定区的独立地选自人、鼠、兔、羊、牛、马、猪、狗、猫、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭和鹅任何其中之一的种属来源。
在本申请的一些实施方式中，所述重链恒定区和所述轻链恒定区独立地具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD任何其中之一恒定区的序列。
在本申请的第二方面，提供一种重组蛋白，所述重组蛋白包括第一方面中定义的所述重链CDR1、所述重链CDR2、所述重链CDR3、所述轻链CDR1、所述轻链CDR2、所述轻链CDR3、所述重链可变区和所述轻链可变区中的一个或者多个。
在本申请的第三方面，提供一种检测试剂、检测试剂盒或者药物，包含第一方面中所述的抗体或者第二方面中所述的重组蛋白。
在本申请的第四方面，提供一种核酸，含有用于编码如第一方面中所述的抗体或者第二方面中所述的重组蛋白的核酸片段。
在本申请的第五方面，提供一种重组表达载体，包含第四方面中所述的核酸。
在本申请的一些实施方式中，所述重组表达载体为抗体表达载体。
在本申请的一些实施方式中，所述重组表达载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其组合。
在本申请的一些实施方式中，所述重组表达载体为PCDNA3.1表达载体。
在本申请的第六方面，提供一种宿主细胞，包含第四方面中所述的核酸或者第五方面中任一项所述的重组表达载体。
在本申请的一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞或者HEK293细胞。
在本申请的第七方面，提供第一方面中所述的抗体或者第二方面中所述的重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
培养第六方面中所述的宿主细胞，从所得培养物中分离抗体或者重组蛋白。
在本申请的第八方面，提供第一方面中所述的抗体或者第二方面中所述的重组蛋白在制备***的药物中的应用。
在本申请的一些实施方式中，所述肿瘤为B7-H4表达阳性的结直肠癌。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请基于噬菌体展示技术筛选靶向B7-H4的抗体可变区，再将其改造成全长抗体，通过构建表达载体、真核表达、纯化获得特异性靶向B7-H4的抗体。该抗体具有良好的靶向性：能与内源性表达及过表达B7-H4的人肿瘤细胞结合且能与过表达B7-H4的小鼠肿瘤细胞结合。其结合表位位于B7-H4的IgV功能结构域。Npsc-A8以剂量依赖的方式阻断B7-H4分子对T细胞增殖及杀伤功能的抑制作用。Npsc-A8在体内能够抑制B7-H4阳性肿瘤生长并延长小鼠的生存期，提示其具有逆转B7-H4的免疫抑制效应。总之，Npsc-A8有望成为靶向B7-H4治疗癌症的极具前途的潜在候选抗体药物。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中的噬菌体展示人源天然单链抗体文库构建结果；
图2为实施例3中的阳性单克隆筛选结果；
图3为实施例4中的候选单链抗体特异性及亲和力结果图；
图4为实施例5中的Npsc-A8全长抗体表达载体构建结果图；
图5为实施例5中的Npsc-A8全长抗体表达及纯化结果图；
图6为实施例6中的Npsc-A8抗体特异性鉴定结果图；
图7为实施例7中的Npsc-A8抗体结合位点分析结果图；
图8为实施例8中的Npsc-A8抗体逆转B7-H4对T细胞的抑制促进T细胞增殖结果图；
图9为实施例9中的Npsc-A8抗体促进T细胞杀伤B7-H4阳性肿瘤细胞结果图；
图10为实施例10中的抗B7-H4阻断抗体的治疗功效图。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本申请所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值范围，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
如本文所用，术语“B7-H4”是指哺乳动物B7-H4多肽，包括但不限于天然B7-H4多肽和B7-H4多肽的同工型。“B7-H4”涵盖全长、未加工的B7-H4多肽以及由细胞内的加工产生的B7-H4多肽的形式。如本文所用，术语“人B7-H4”是指包含上文所述的氨基酸序列的多肽。“B7-H4多核苷酸”、“B7-H4核苷酸”或“B7-H4核酸”是指编码B7-H4的多核苷酸。
术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合至靶标(诸如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或它们的组合)的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的融合蛋白以及任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体表现出所需的生物活性即可。抗体可具有以下五种主要类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)，基于它们的重链恒定结构的特性分别被称为α，δ，ε，γ和μ。不同种类的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或与其他分子(诸如毒素、放射性同位素等)缀合。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”或“抗原结合区”是指完整抗体的与抗原特异性地结合的一部分。抗原结合片段可含有完整抗体的抗原识别位点(例如，足以特异性地结合抗原的CDR区(complementarity-determiningregion，互补决定区)。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'.F(ab')2和Fv片段、线性抗体和单链抗体。抗体的抗原结合片段可源自任何动物物种，如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人，或者可人工产生。
术语“抗B7-H4抗体”、“B7-H4抗体”和“结合至B7-H4的抗体”是指能够以足够的亲和力特异性地结合B7-H4，以使得抗体在靶向B7-H4中可用作诊断剂和/或治疗剂的抗体。如本文所用，术语“特异性地结合”、“免疫特异性地结合”、“免疫特异性地识别”和“特异性地识别”在抗体或其抗原结合片段的背景下是类似术语。这些术语表明，抗体或其抗原结合片段经由其抗原结合结构域结合至表位，并且结合需要在抗原结合结构域与表位之间具有一定的互补性。因此，“特异性地结合”至人B7-H4(SEQ ID NO:1)的抗体也可结合至来自其他物种的B7-H4(例如，食蟹猴、小鼠和/或大鼠B7-H4)和/或由其他人等位基因产生的B7-H4蛋白，但抗B7-H4抗体与不相关的非B7-H4蛋白(例如，其他B7蛋白家族成员，如PD-L1)结合的程度小于所述抗体与B7-H4的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定所测量。
“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同质性抗体或抗原结合片段群体。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体形成对照。术语“单克隆抗体”或其抗原结合片段涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指以任何数量的方式制备的此类抗体及其抗原结合片段，所述方式包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般而言是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中的约氨基末端110至120个氨基酸或110至125个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸﹐其在抗体之间的序列方面不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为CDR的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域被称为FR区(Framework region，框架区)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施方案中，可变区是人可变区。在某些实施方案中，可变区是啮齿动物或鼠类可变区。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用来指抗体的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用来指抗体的重链可变区。
术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是公认的，并且是指对抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的***。在某些方面，可根据Kabat编号***来确定CDR(参见例如，Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190：382-391以及Kabat EA等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生和公共服务部，NIH出版号91-3242)。使用Kabat编号***，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35(其任选地可在35之后包含一个或两个另外氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B))(CDR1)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号***，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。在一个具体实施方案中，已经根据Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。
如本文所用，术语“恒定区”和“恒定结构域”是可互换的，并且具有它们在本领域中的常见含义。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合、但可表现出多种效应子功能，如与Fc受体的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。在某些方面，抗体或抗原结合片段包含足以用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的恒定区或其部分。
如本文所用，基于恒定结构域的氨基酸序列，术语“重链”在关于抗体使用时可指任何不同的类型，例如，α，δ，ε，γ和μ分别产生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别的抗体，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链氨基酸序列是本领域中众所周知的。在具体实施方案中，所述重链是人重链。在具体实施方案中，所述重链是啮齿动物或鼠类重链。
如本文所用，基于恒定结构域的氨基酸序列，术语“轻链”在关于抗体使用时可指任何不同的类型﹐例如κ或λ。轻链氨基酸序列是本领域中熟知的。在具体实施方案中，所述轻链是人轻链。在具体实施方案中，所述轻链是啮齿动物或鼠类轻链。
术语“嵌合”抗体或其抗原结合片段是指其中氨基酸序列源自两种或更多种物种的抗体或其抗原结合片段。通常，轻链和重链的可变区对应于源自一种哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗体或其抗原结合片段的具有所需特异性、亲和力和能力可变区，而恒定区与源自另一物种(通常为人)的抗体或其抗原结合片段中的序列同源，以避免在所述物种中引发免疫应答。
术语“人”抗体或其抗原结合片段是指具有源自人免疫球蛋白基因座的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段，其中使用本领域中已知的任何技术来制备这种抗体或其抗原结合片段。人抗体或其抗原结合片段的此定义包括完整或全长抗体及其片段。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体或其抗原结合片段)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体或其抗原结合片段与抗原)之间的1：1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力可通常由解离常数(K)表示。亲和力可以本领域中已知的多种方式来测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指抗体或其抗原结合片段可与其特异性地结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可例如来自一种或多种多肽的两个或更多个非连续区域(构象性、非线性、不连续或非连续的表位)。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段所特异性地结合的表位可通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、结合质谱法的氢/氛交换(例如，液相色谱电喷雾质谱法)﹑基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)来确定。对于X射线晶体学，可使用本领域中任何已知的方法来完成结晶(例如，GiegéR等人，(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303)。抗体/其抗原结合片段：抗原晶体可使用众所周知的X射线衍射技术进行研究﹐并且可使用计算机软件如X-PLOR(Yale University，1992，由Molecular Simulations，Inc.分售；参见例如，Meth Enzymo1(1985)第114和115卷，Wyckoff HW等人编辑；U.S.2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)ActaCrystallogrD Biol Crystallogr49(Pt1)：37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A：361-423，Carter CW编辑；Roversi P等人，(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr56(Pt10)：1316-1323)进行改善。诱变作图研究可使用本领域技术人员已知的任何方法来完成。关于诱变技术的描述，包括丙氨酸扫描诱变技术，参见例如Champe M等人，(1995)JBiol Chem 270：1388-1394以及Cunningham BC和Wells JA(1989)Science 244：1081-108。
与参考B7-H4抗体“结合至相同表位”的B7-H4抗体是指与参考B7-H4抗体结合至相同B7-H4氨基酸残基的抗体。B7-H4抗体与参考B7-H4抗体结合至相同表位的能力通过氢/氛交换测定来确定(参见Coales等人Rapid Commun.Mass Spectrom.2009；23:639-647)。
如果抗体结合至参考抗体的给定表位或重叠表位，以使得它在某种程度上阻断所述参考抗体与所述表位的结合，那么可以说所述抗体“竞争性地抑制”所述参考抗体与所述表位的结合。竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法来确定，例如，竞争性ELISA测定。可以说抗体竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
术语B7-H4在特定肿瘤、组织或细胞样品中的“过表达”是指B7-H4(B7-H4多肽或编码这种多肽的核酸)以高于存在于未患病的组织或肿瘤或癌症附近的相同类型或起源的细胞或其他细胞中的水平存在。这种过表达可例如由突变、基因扩增、增加的转录或增加的翻译引起。
本发明的“样品”具有生物起源。在优选实施方案中，所述样品是人样品，但是动物样品也可用于本发明的实践中。用于在本发明中使用的样品的非限制性来源例如包括实体组织、活检物、腹水、抽吸物、流体浸出物、血液(包括循环肿瘤细胞)、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部切片、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、肿瘤、器官，细胞培养物和/或细胞培养物成分。
词语“标记”当在本文使用时是指直接地或间接地与抗体缀合以便产生“标记的”抗体的可检测化合物或组合物.所述标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
诸如“治疗”、“治疗”、“治疗”、“减轻”和“减轻”的术语是指能够治愈、减缓、减轻病理性疾患或病症的症状和/或阻止其进展的治疗措施。因此，需要治疗的那些包括已经诊断患有或疑似患有所述病症的那些。在某些实施方案中，如果患者显示出一种或多种以下情况，则受试者的癌症被成功地根据本发明的方法“治疗”：癌细胞的数量减少或完全不存在；肿瘤尺寸减小；抑制或未出现癌细胞浸润至周围器官中，包括例如癌症扩散到软组织和骨中；抑制或未出现肿瘤转移；抑制或未出现肿瘤生长；与特定癌症相关的一种或多种症状减轻；发病率和死亡率降低；生活品质改善；致瘤性、致瘤性频率或肿瘤的致瘤能力降低；肿瘤中癌症干细胞的数量或频率降低；致瘤性细胞分化成非致瘤性状态；无进展存活(PFS)、无疾病存活(DFS)、总体存活(OS)、完全应答(CR)﹑部分应答(PR)增加，稳定疾病(SD)，进行性疾病(PD)减少，进展时间(TTP)减少或它们的任何组合。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中的生理疾患，其中细胞群体以不受调控的细胞生长为特征。癌症的实例包括但不限于妇科癌症(例如，乳腺癌(包括三阴性乳腺癌、导管癌、卵巢癌和子宫内膜癌)﹑非小细胞肺癌﹑胰腺癌、甲状腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)和膀胱癌(例如，尿路上皮细胞癌)。癌症可以是“表达B7-H4的癌症(cancer thatexpresses B7-H4)”。此类术语是指包含表达B7-H4的细胞的癌症。癌症可以是表达B7-H4的实体瘤。癌症可以是原发性肿瘤，或者可以是晚期或转移性癌症。
除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所使用，术语“或”被理解为包括在内。如在本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意图包括“A和B”两者、“A或B”、“A”以及“B”。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所使用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
如本文所用，术语“约”和“大约”在用于修饰数值或数字范围时表示所述值或范围之上5％至10％和之下5％至10％的偏差仍在所叙述值或范围的预期含义范围内。
传统的制备抗体的方法包括杂交瘤技术、重组DNA技术、转基因动物技术、单个B细胞抗体制备技术、核糖体展示技术等。(1)杂交瘤技术是分离单抗的传统方法，最早由乔治·科勒和塞萨尔·米尔斯坦于1975年发明。然而，相当数量患者对小鼠杂交瘤细胞分离出的单抗出现抗药物抗体反应。即蛋白质药物具有潜在的免疫原性，可能诱导人体产生抗药物抗体(Anti-Drug Antibodies，ADAs)。ADAs可能降低药物疗效，或者引起过敏反应，甚至威胁生命。此外，鼠源单抗与自然杀伤细胞等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，人血循环中的半衰期短，它发挥细胞毒作用作用的时间较短；另外，应用杂交瘤技的先决条件是，需要用疾病免疫宿主动物，以诱导特定的单抗，而从伦理上讲，这在人类身上是不可行的，这导致了后来人类单抗的产生。(2)重组DNA技术可以在小鼠中生产包含人类起源的恒定区域和可变区域基因的嵌合抗体。这种嵌合抗体降低了患者发生人类抗小鼠抗体反应(HAMA)的风险。通过将小鼠来源的CDR区移植到人的可变域中而开发的人源抗体，则进一步降低嵌合抗体中针对小鼠可变区域基因产生ADA反应的风险。然而，人源化可以在更大程度上降低ADA反应的概率，但并不能完全消除ADA反应的概率，它仍保留了30％的鼠源性，可诱发人抗鼠反应。此外，小鼠单抗与人类Fc受体的结合较差，较差的结合会导致一系列间接保护机制的缺失，如抗体依赖细胞介导的细胞毒性，补体依赖细胞毒性，吞噬作用和调理素作用。(3)构建转基因小鼠需要通过转基因技术生产出缺乏原有抗体基因的小鼠胚胎，再将人源抗体基因移植入小鼠体内，使小鼠表达人源抗体，进而通过传统的杂交瘤技术分离出全人源抗体，由此获得的抗体比传统的嵌合抗体更具免疫多样性，但是需要从胚胎阶段开始培育小鼠，相比于其它抗体生产技术耗时更长，技术更复杂，且需要植入的基因序列极长，难以确保准确表达。(4)单个B细胞抗体制备技术是一种新发展的体外克隆和表达单个抗原特异性B细胞抗体基因技术，区别于传统的杂交瘤技术，不需要进行淋巴B细胞和骨髓瘤细胞融合，自然没有融合筛选阳性细胞的问题，这种方法保留了轻重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全人源、需要的细胞量少等优势。然而采用这种高通量技术的困难在于，它需要非常高端的仪器和专业知识(如流式细胞分选仪、下一代测序仪(NGS)和用于筛选培养的记忆B细胞的机器人筛选***)。因此，在资源有限的国家和小型生物技术初创公司采用这些方法是具有挑战性和困难的，因为这需要大量的财政支持，另外，某些目标抗原难以制备、人源合适的供体需求量较多等。(5)核糖体展示技术，由于其完全属于体外操作***，无需依赖细胞技术和毒性蛋白对宿主菌生长的影响，不受体内环境的限制，扩大了展示文库的库容量和分子多样性。此外，核糖体展示技术无需进行体内外***转化，全程只需通过PCR技术复制、扩增，使得其建库时间缩短，筛选简便。PCR技术还可引入突变，增加分子多样性，从而获得高亲和力抗体。而核糖体展示技术的最大缺点就是mRNA易降解，“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物的稳定性也较差。
噬菌体展示技术由George P.Smith于1985年初次提出。George P.Smith已经证明外源基因可以***到丝状噬菌体p III基因上，这样***基因所编码的肽段就能和噬菌体pIII基因编码的蛋白形成融合表达，融合蛋白可以随着子代噬菌体的重新组装展示在噬菌体表面。即使含有外源肽段，噬菌体衣壳末端蛋白III仍能维持原有的生理功能，噬菌体也可在体外稳定生存。同时，外源蛋白仍然可以保持相对稳定及独立的空间结构和生物活性，这种融合还允许重组肽与靶标或者外部配体相互作用。1985年噬菌体表面展示技术被提出后，抗体分子是噬菌体表面表达的第一个具有天然蛋白质功能的分子，从而噬菌体抗体文库的建立得以发展。噬菌体抗体库可由不同的抗体种类构成，包含人重链抗体片段、鲨鱼或骆驼抗体、scFv(single chain Fv，单链抗体)、Fab片段等。普通抗体通常对靶点具有高亲和力，但免疫原性高；多肽分子量小且易于合成，但多肽在体循环中易于酶解，不适合在体内应用；小分子化合物，例如叶酸分子量小，稳定性好，但对肿瘤靶向性不高。scFv是由抗体重链的可变区与轻链的可变区在一段肽链的连接下构成的小分子，是具有抗体活性的最小功能结构单位。由于其相对分子质量较小、免疫原性弱、穿透力强，更易透过细胞间隙到达靶细胞，加上该技术制备抗体具有周期短、操作简便、价格低廉等优点，因此，越来越多的研究者采用噬菌体展示技术高效筛选、快速分离肿瘤特异抗体。
本申请的第一方面
本申请提供一种特异性靶向B7-H4的抗体，所述抗体的重链CDR1如SEQ ID NO.6所示、重链CDR2如SEQ ID NO.7所示以及重链CDR3如SEQ ID NO.8所示；
所述抗体的轻链CDR1如SEQ ID NO.9所示、轻链CDR2如SEQ ID NO.10所示以及轻链CDR3如SEQ ID NO.11所示。
在其中一个示例中，所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO.4所示。
在其中一个示例中，所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.5所示。
本申请对抗体的种类不做特别限定，可以是，包括但不限于单克隆抗体，所述抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区。本申请对重链恒定区和轻链恒定区的种属来源不做特别限定，可以是，包括但不限于人、鼠、兔、羊、牛、马、猪、狗、猫、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭和鹅任何其中之一的种属来源。
本申请对抗体的重链恒定区和所述轻链恒定区的种类不做特别限定，可以是，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD。
本申请的第二方面
本申请提供一种重组蛋白，所述重组蛋白包括第一方面中定义的所述重链CDR1、所述重链CDR2、所述重链CDR3、所述轻链CDR1、所述轻链CDR2、所述轻链CDR3、所述重链可变区和所述轻链可变区中的一个或者多个。
本申请的第三方面
本申请提供一种检测试剂、检测试剂盒或者药物，包含第一方面中所述的抗体或者第二方面中所述的重组蛋白。
本申请的第四方面
本申请提供一种核酸，含有用于编码如第一方面中所述的抗体或者第二方面中所述的重组蛋白的核酸片段。
本申请的第五方面
本申请提供一种重组表达载体，包含第四方面中所述的核酸。
本申请对重组表达载体的种类不做特别限定，可以是，包括但不限于抗体表达载体。本申请对抗体表达载体不做特别限定，可以是，包括但不限于，细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其组合。例如为，PCDNA3.1表达载体。
本申请的第六方面
本申请提供一种宿主细胞，包含第四方面中所述的核酸或者第五方面中任一项所述的重组表达载体。
本申请对宿主细胞的种类不做特别限定，包括但不限于CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞或者HEK293细胞。
本申请的第七方面
本申请提供第一方面中所述的抗体或者第二方面中所述的重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
培养第六方面中所述的宿主细胞，从所得培养物中分离抗体或者重组蛋白。
本申请的第八方面
本申请提供第一方面中所述的抗体或者第二方面中所述的重组蛋白在制备***的药物中的应用。
可以理解的是，本申请对肿瘤的种类不做特别限定，可以是B7-H4表达阳性的任意种类的肿瘤，例如为B7-H4表达阳性的结直肠癌。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1、噬菌体展示人源天然单链抗体文库构建
(1)分离398份的健康成人外周血单个核细胞(外周血来自福建医科大学附属第一医院检验科，所有外周血样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者签署了知情同意书，所有血清样本采用匿名化处理)。
(2)按照文献(DOI:10.1016/0022-2836(91)90498-u)中的步骤构建单链抗体原始文库。
(3)连接产物电击转化入TG1感受态后稀释菌液涂布培养于培养板。
(4)通过计算培养平板上稀释后的阳性单克隆数推测文库的库容量。
(5)随机挑取的单克隆菌落送至生工生物(上海)股份有限公司进行DNA测序。根据测序结果分析文库的多样性；培养板中的阳性单克隆如图1中A所示，稀释至10-8平板上经恒温培养箱37℃培养过夜计算单菌落数为8个，10-7平板上约为76个，电转后菌液总量为8mL，则可估算库容量约为6.0×109(计算公式：76×107×8)。利用辅助噬菌体VCSM13对该文库进行包装后获得1.8×1013cfu/mL的噬菌体人源天然单链抗体文库。24个随机挑取的单克隆DNA测序结果如图1中B所示，图中深色区域为抗体的保守序列，即抗体的骨架区，所有单链抗体的CDR区完全不同，尤其是重链抗体CDR3区域，其为最主要的抗原结合区，24个随机单克隆重链CDR-H3区域的氨基酸长度范围在7-19个，体现了抗体高变区的多样性。
综上所述，构建的文库具有较大的库容量和良好的多样性。大容量且具有良好多样性的抗体文库是提高筛选的成功率及获得理想抗体最重要的前提。
实施例2、B7-H4单链抗体筛选
(1)本发明使用的人B7-H4蛋白(Sinobiological，目录号10738-HO8H-100)购于北京义翘神州生物技术有限公司，由234个氨基酸构成，纯度>95％，人B7-H4的氨基酸序列是本领域中已知的，并且也在本文中提供，含有IgC胞外结构域和IgV胞外结构域。
人B7-H4:>sp|Q7Z7D3|VTCN1_HUMAN|25-259OS＝Homo sapiens OX＝9606GN＝VTCN1 PE＝1SV＝1(SEQ ID NO:1)
LIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKAS
(2)将用于包被蛋白的酶标条在紫外照射下活化30min，用PBS将人B7-H4蛋白稀释成100μg/mL，4℃过夜包被。次日，弃上清，PBS洗板3次，孔内注满含5wt％脱脂牛奶的PBS，室温封闭2h。弃去封闭液，PBS洗板3次。
(3)加入适量的噬菌体原始文库(滴度1012-1013tu)，37℃孵育2h。吸去噬菌体上清，孔内注满PBST(含0.05wt％Tween-20的PBS)，于微量振荡器上洗涤若干次，每次5min。洗涤的次数依据固相亲和筛选的轮数而定，第一轮5次，第二轮10次，第三轮13次，第四轮15次。PBS再洗涤3次，每次5min。
(4)向孔内加入100μL pH2.2噬菌体洗脱液，在微量振荡器上高速洗涤10min，吸尽孔内溶液，立即加入5μL pH 9.1噬菌体中和液将pH值调至近中性。准备一瓶处于对数生长期的ER2738菌液，吸取少量的洗脱噬菌体用于梯度稀释和滴度测定，其余所有噬菌体加入对数生长期的ER2738菌液中侵染，并进行噬菌体扩增。
(5)输出噬菌体的滴度测定方法同步骤(1)，由于不同轮次洗脱噬菌体的数量存在很大差异，应根据上一轮输出结果合理设计梯度稀释范围，首轮稀释范围建议10-3-10-7。其他被侵染用于扩增噬菌体的菌液，涂布于LB大型固体培养基平皿(含有100μg/mL氨苄青霉素，20μg/mL四环素和1wt％葡萄糖)上，30℃培养过夜直至平皿表面长出菌膜。
(6)通过梯度稀释平板上的菌落数计算输出噬菌体滴度。在大型平皿表面加入5-8mL LB液体培养基，将菌膜轻轻刮下。取少量菌液加入至100mL LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素，20μg/mL四环素和1wt％葡萄糖)中，要求初始OD600≤0.1。其余的菌体悬液以甘油菌形式-80℃保存。
(7)菌液37℃，250rpm振荡培养至对数期，加入辅助噬菌体VCS-M13，感染比例：细菌数：辅助噬菌体＝1：20(5×108cells/OD600 unit)，常温侵染30min。4℃，3300g离心10min，菌体沉淀重悬于500mL LB液体培养基中(含有100μg mL氨苄青霉素和25μg/mL卡那霉素)，30℃培养过夜。
(8)过夜培养的菌液4℃，10800g离心10min，倒出上清，加入20％体积的PEG/NaCl溶液(20wt％PEG，2.5M NaCl)，混匀后4℃静置至少1h。随后再次4℃，10800g离心10min，噬菌体沉淀重悬于10mL PBS中。洗涤一遍，4℃，13000g离心10min除去菌体碎片，收集上清做梯度稀释和滴度测定。首轮稀释范围建议10-9-10-13。将扩增后的噬菌体稀释到1012-1013tu/mL的工作液浓度，用于下一轮的亲和筛选，其余噬菌体可短期保存于4℃。
(9)如图2，重复(1)-(7)步骤，共进行4轮亲和筛选，并计算每一轮输入和输出噬菌体的滴度，结果如表1所示。
表1、NpSc21四轮筛选滴度
Round Input(tu) Output(tu) Recovery ratio(output/input) Enrichment factor(ratio n/ratio n-1)
1 2.00×1012 5.00×104 2.78×10-8 -
2 2.00×1012 4.40×106 2.20×10-6 79.14
3 2.00×1012 9.70×107 4.85×10-5 22.05
4 2.00×1012 8.80×108 4.40×10-4 9.07
实施例3、噬菌体可溶抗体片段的制备以及ELISA检测
(1)第一天，从第3轮、第4轮筛选后的洗脱下来的噬菌体，取大约105个噬菌体侵染200μL处于对数生长期的HB2151细菌。37℃静置水浴30min。6000rpm，4℃离心10min，10倍倍比稀释，取10-1、10-2、10-3铺SOB平板(含有100μg/mL氨苄青霉素、2wt％葡萄糖和100μg/mL萘啶酮酸)，30℃培养过夜；
(2)第二天，随机挑取单克隆到一块96深孔细菌培养板中，每孔已经添加500μL 2×YT培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素和2wt％葡萄糖)。30℃摇床(250r/min)培养过夜；
(3)第三天，取一块一次性96孔板，现在孔中加入50μL 80wt％甘油，再向每孔中加入150μL菌液，胶布封存，放-80℃保存；
(4)另取一块96深孔细菌培养板，每孔已经添加500μL 2×YT培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素和2wt％葡萄糖)。每孔取出5μL菌液，加入到新的96孔细菌培养板中，37℃摇床培养至对数期；
(5)对步骤(3)和步骤(4)的96孔板，用平板离心机3000rpm离心20min，小心倒出上清，残余上清用灭过菌的卫生纸倒扣吸干(本步骤需避免弃去上清时，将菌体沉淀一并倒出，不可叩击板子)。然后向两块96深孔细菌培养板的各个孔中加入500μL 2×YT培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素和1mM IPTG)，30℃，250rpm摇床培养16-24h；
(6)装配一块96孔酶标板，放在超净台中紫外活化30min以上，将需要包被的抗原蛋白溶液用PBS缓冲液稀释至1-10μg/mL，每孔100μL。用保鲜膜封好，4℃包被过夜；
(7)第四天，回收前一日包被在酶标条中的蛋白溶液(如果蛋白不值钱可直接弃去)，以PBS洗板3次，每次5min，每孔200μL，每次洗完后，将板中溶液用力甩出，并在桌上拍打。用含5wt％脱脂牛奶的PBS，37℃封闭2h，每孔300μL；
(8)封闭结束后，将牛奶甩出，用PBS洗板3次，每次5min，每孔200μL。将昨日过夜培养的两块96深孔板3000rpm，4℃离心20min。取每孔150μL上清加入到酶标条中，用保鲜膜封好，4℃孵育过夜；
(9)第五天，弃去上清，用PBST(含0.1wt％吐温20的PBS)洗板3次，每次5min，每孔200μL，再用PBS洗板3次，每次5min，每孔200μL。用含2wt％脱脂牛奶的PBS稀释抗HA-tag抗体，稀释比参考抗体说明书，每孔100μL孵育，37℃孵育2h(或4℃孵育过夜)。
(10)弃去抗体，用PBST(含0.1wt％吐温20的PBS)洗板3次，每次5min，每孔200μL，再用PBS洗板3次，每次5min，每孔200μL。用含2wt％脱脂牛奶的PBS稀释二抗(二抗种属依据一抗决定，带HRP标签)，稀释比参考抗体说明书，每孔100μL孵育，37℃孵育1.5h；
(11)弃去抗体，用PBST(含0.1wt％吐温20的PBS)洗板3次，每次5min，每孔200μL，再用PBS洗板3次，每次5min，每孔200μL；
(12)每孔加入100μL显色液，室温避光孵育10-20min，直至孔中溶液多数显示为蓝色为止，每隔2-3min观察显色情况；
(13)每孔加入50μL稀硫酸终止反应；
(14)测定OD630和OD450，并以OD450值减去OD630值，作为最终检测结果，结果如图2所示，一共有16个阳性单克隆(Npsc-A8、A11、B9、B10、B12、C3、C7、C11、D2、D4、D6、E2、E7、E12、F11、G10)；
(15)从ELISA结果中挑选吸光值较高的16株阳性NpSc单克隆菌株，扩大培养后以甘油菌的形式保存和测序。测序引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。测序结果显示16个阳性单克隆中有三种不同scFv的序列，其中14个克隆的scFv的序列完全相同，选取其中一个单克隆Npsc-A8用于后续实验，另外两种scFv序列各有1个单克隆，即Npsc-E7和Npsc-G10。
表2、Npsc21测序引物
引物名 序列(5’→3’)
Npsc-21测序引物(SEQ ID NO:2) AAGACAGCTATCGCGATTGCAG
Npsc-21测序引物(SEQ ID NO:3) GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC
实施例4、候选单链抗体特异性鉴定
1、候选单链抗体与B7-H4阳性细胞结合活性
(1)细胞重悬：细胞经胰酶消化处理后离心，弃上清，用含1％(v/v)FBS的PBS重悬细胞并计数，将细胞浓度调整为2×106/mL；
(2)对照设置：空白对照、同型对照、待测样本每管取100μL上述重悬的细胞，使每管细胞数达到2×105/管；
(3)一抗孵育：空白对照管不加抗体，阴性对照管加入50μL阴性单链抗体(实施例3中ELISA阴性的单链抗体单克隆)，待测管分别加入50μL候选抗体(Npsc-A8、Npsc-E7、Npsc-G10)，充分混匀，至4℃孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应；
(4)细胞清洗：加入适量含1％(v/v)FBS的PBS，2000rpm离心3min，弃上清；
(5)细胞重悬：使用100μL含1％ FBS的PBS重悬细胞；
(6)二抗孵育：同型对照管和待测管分别加入适量的荧光标记的二抗，充分混匀，至4℃避光孵育30min，孵育期间每隔10min晃动一下反应管；
(7)细胞清洗：加入2mLPBS，反复洗2次，2000rpm离心3min，弃上清
(8)上机检测：使用200μL PBS重悬细胞，先测空白管和同型对照管，再测待测管。
三个候选单链抗体与SK-BR-3(内源性表达B7-H4的人乳腺腺癌细胞)、A549-hH4(B7-H4过表达的人腺癌人类肺泡基底上皮细胞)、及MC38-mH4(B7-H4过表达的小鼠结肠癌细胞)流式结果如图3中A所示，Npsc-E7和Npsc-G10与表达B7-H4的细胞结合活性较弱，相比之下，Npsc-A8单链抗体与表达B7-H4的细胞结合活性强于Npsc-E7和Npsc-G10。故将其作为优选单克隆用于后续实验，Npsc-A8单链抗体序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，利用http://bioinf.org.uk/abs/对其序列进行分析，其CDR区序列见SEQ ID NO:6-11：
SEQ ID NO:4：Npsc-A8单链抗体重链氨基酸序列
SEQ ID NO:5：Npsc-A8单链抗体轻链氨基酸序列
SEQ ID NO:6：重链可变结构域的CDR1氨基酸序列
SEQ ID NO:7：重链可变结构域的CDR2氨基酸序列
SEQ ID NO:8：重链可变结构域的CDR3氨基酸序列
SEQ ID NO:9：轻链可变结构域的CDR1氨基酸序列
SEQ ID NO:10：轻链可变结构域的CDR2氨基酸序列
SEQ ID NO:11：轻链可变结构域的CDR3氨基酸序列
2、Npsc-A8 scFv亲和力检测
(1)将酶标板放在超净台中紫外活化30min以上，准备人B7-H4蛋白(Sinobiological,目录号10738-HO8H-100)，以2μg/mL 4℃包被过夜。准备Npsc-A8单链抗体蛋白，用PBS缓冲液将其稀释为20μg/mL、10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL，每孔100μL；
(2)剩余步骤参考实施例3中步骤(7)～(14)；
(3)读取OD450 nm值后绘制标准曲线并计算EC50值。
Npsc-A8单链抗体亲和力ELISA检测结果如图3中B所示，EC50(concentration for50％of maximal effect，半最大效应浓度)＝2.020μg/mL。
实施例5、优选单克隆制备全长抗体
1、表达载体构建
(1)由于单链抗体亲和力较弱，为了提高Npsc-A8抗体的亲和力，将Npsc-A8单链抗体改造为全长抗体，对Npsc-A8 scFv基因进行PCR扩增，将轻、重链可变区基因分别***到含人IgG1轻链恒定区、IgG1重链恒定区及信号肽的表达载体PCDNA3.1中，PCR反应体系为50μL，详见表3，反应条件为98℃，10sec，71℃5sec，72℃5sec，35个循环，4℃保存。终产物在1wt％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定。重链表达载体选用NheⅠ和Kpn I作为上下游酶切位点，轻链表达载体选用NheⅠ和BamHⅠ作为上下游酶切位点进行酶切，酶连后的产物通过化学转化入DH5α感受态。利用Snapgene软件进行引物设计，其中重链H-F(上游引物)、H-R(下游引物)及轻链L-F(上游引物)、L-R(下游引物)序列为:
H-F(SEQ ID NO:12):CTATCGATTGAATTCCACCATGGACTGGACCTGGAGCAT
H-R(SEQ ID NO:13):CAAGCTTGGGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAG
L-F(SEQ ID NO:14):CTATCGATTGAATTCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGC
L-R(SEQ ID NO:15):CAAGCTTGGGAGCGGCCGCTTAACACTCTCCCCTGTT
PCR扩增结果如图4所示，获得746bp的Npsc-A8轻链可变区及恒定区基因以及1439bp的Npsc-A8重链可变区及恒定区基因。将转化后平板上的单克隆送由生工生物(上海)股份有限公司进行DNA测序。测序对的克隆按照MACHEREY-NAGEL的XtraMaxi Plus EF质粒大提说明书进行操作。
表3、Npsc-A8轻重链表达载体构建PCR反应体系
2、Npsc-A8全长抗体表达与纯化
(1)HEK293T细胞复苏与培养
1)从液氮容器中取出冻存的HEK293T细胞于37℃水浴锅中不时摇动令其在1-2min内快速融化，注意水浴锅中的水不要没过管口，擦干冻存管并用75％(v/v)酒精擦拭，细胞加入15mL离心管，加入5mL已提前预热的DMEM培养基，1000rpm离心5min。
2)弃上清，加入DMEM培养基重悬细胞，取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数，调整细胞密度(2-5×104个细胞/cm2)，放于37℃、5％的CO2培养箱中培养。
3)24h后观察细胞状态，待细胞长到80％-90％时进行下一次传代培养。
(2)转染
1)细胞分盘：用胰酶消化并收集HEK293T细胞，计数，将1×107个细胞平铺于15cm的细胞培养皿上，共需10个皿，置于含5％CO2的37℃温箱中孵育8-24h，当细胞贴壁完全后即可开始转染。待细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的80-90％时方可转染。
2)制备PEI-DNA混合物：以一个皿为例，准备两支1.5mL EP管，一管加入质粒DNA(总量30μg为佳，其中重链-PCDNA3.1质粒为15μg，轻链-PCDNA3.1质粒为15μg)，用OPTI MEM培养基将其稀释至总体积500μL，混匀。另一管则用OPTI MEM培养基将100μM的PEI储存液稀释成10μM，充分混合。然后将500μL 10μM PEI溶液加入到500μL OPTI MEM培养基稀释的质粒DNA中，充分混匀后室温静置10-20min。最后将这1mL的PEI-DNA混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5％CO2的37℃温箱孵育。其余9个皿操作方法相同。
3)培养8h后更换为37℃预热的含有1％(v/v)血清和终浓度为4μM的丙戊酸的DMEM培养基，继续培养5天左右，观察细胞状态，收集培养基上清，4000rpm离心30min除掉细胞及细胞碎片，用0.22μm的滤头过滤并收集上清待纯化。
(3)抗体纯化
1)连接层析柱和过滤***，流速设置为1mL/min；
2)15mL Elution Buffer(pH 2.0)清洗层析柱；
3)25mL PBS平衡层析柱；
4)将吸入管放在上清中，上样品；
5)上样完毕后，用25mL PBS洗去结合在层析柱上的培养液；
6)标记10个干净的1.5mL EP管，每管加入100L 1M Tris Buffer(pH 9.0)；
7)用10mL注射器吸8-10mL Elution Buffe(pH 3.5)洗脱层析柱上的目的蛋白到EP管中(加至1mL)；
8)Nanodrop仪测浓度；
9)用SDS-PAGE及Western-blot分析收集的样品，结果如图5所示，图5中A和B显示了在非还原和还原条件下，用考马斯色染色凝胶对表达纯化后的Npsc-A8全长抗体SDS-PAGE电泳的结果。结果表明，这Npsc-A8抗体在非还原条件下蛋白分子量为180KDa左右，在还原条件下的蛋白分子量为25KDa和55KDa，与抗体序列的理论值相符。Western blot结果也显示在分子量为180KDa左右有颜色较深的条带(C图)。
实施例6、Npsc-A8全长抗体特异性分析
抗体特异性鉴定，步骤同实施例4中第1部分。结果示于图6，结果显示Npsc-A8抗体与内源性表达B7-H4的SK-BR-3、过表达B7-H4的SKOV3-hH4、MC38-mH4、E.G7-OVA-mH4细胞结合且不与B7-H4基因敲除的SK-BR-3-hH4-KO以及不表达B7-H4的SKOV3-WT、MC38-WT、E.G7-OVA-WT细胞结合。总体而言，相同浓度下，Npsc-A8与人肿瘤细胞结合亲和力高于其与小鼠肿瘤细胞结合亲和力。
实施例7、Npsc-A8全长抗体结合位点分析
(1)装配96孔酶标板，放在超净台中紫外活化30min以上，准备人B7-H4蛋白(Sinobiological，目录号10738-HO8H-100)、鼠B7-H4蛋白(来自本实验室)、鼠B7-H4 IgV样结构域蛋白(来自本实验室)、鼠B7-H4 IgC样结构域蛋白(来自本实验室)分别以2μg/mL 4℃包被过夜，准备Npsc-A8抗体蛋白，用PBS缓冲液稀释为10μg/mL，每孔100μL；
(2)剩余步骤参考实施例3中步骤(6)～(13)(注：以6H3和8H4为对照抗体，6H3为鼠抗人B7-H4IgC结构域抗体(见专利申请公布号：CN 104955475 A)，8H4为仓鼠抗人B7-H4IgV结构域抗体(DOI:10.1016/s1074-7613(03)00152-3)；
(3)读取OD450 nm值。
结果如图7所示，Npsc-A8与人B7-H4蛋白、鼠B7-H4蛋白结合，且Npsc-A8与鼠B7-H4IgV结构域蛋白结合，而不与鼠B7-H4 IgC结构域蛋白结合。
实施例8、Npsc-A8抗体对B7-H4抑制T细胞增殖的影响
(1)将鼠B7-H4蛋白(20μg/mL，来自本实验室)及Anti-CD3(1μg/mL)包被在96well细胞培养板，4℃过夜；
(2)次日用PBS洗掉未结合的B7-H4蛋白及Anti-CD3，加入3％BSA 37℃封闭2h；
(3)弃掉封闭液，加入Npsc-A8/8H4/6H3(设置10μg/mL及20μg/mL两个不同浓度组)及Anti-CD28(1μg/mL)37℃孵育1h；
(4)T细胞分离与预染CFSE
1)无菌分离野生型小鼠腹股沟***；
2)用载玻片磨砂片研磨***，用70μm细胞筛过滤***；
3)500g离心5min，用PBS将细胞重悬为1×107/mL，加入终浓度为3μM的CFSE，37℃孵育8min；
4)加入预冷的含1％(v/v)血清的PBS 10mL，4℃静置10min。500g离心5min，弃上清；
5)用含10IU/mL IL-2的RPMI-1640培养基重悬淋巴细胞，调整浓度为2×106个/mL，每孔加入2×105个T细胞，共孵育三天，显微镜下观察T细胞增殖情况。
(5)流式分析法检测Npsc-A8介导的T细胞体外增殖作用，结果如图8所示，CFSE增殖峰(次级峰)能很好地反映T细胞的增殖情况，T细胞增殖越多，次级峰占比(与原始峰相比)越多。如图所示，加mB7-H4蛋白但不加任何抗体组的T细胞增殖明显弱于未加B7-H4组，验证了B7-H4对T细胞增殖的抑制作用。在Npsc-A8组、6H3以及8H4组中，Npsc-A8组的增殖峰占比最高，T细胞增殖最显著，说明Npsc-A8有效逆转B7-H4对T细胞增殖的抑制作用恢复并增强T细胞的增殖能力。而6H3和8H4不具备此功能。
实施例9、Npsc-A8抗体对T细胞杀伤B7-H4阳性肿瘤细胞的影响
(1)小鼠脾脏T细胞分离
1)取1只OT-Ⅰ/Rag1小鼠，CO2窒息处死，在其腹部剪一小口，缓慢撕开。取小鼠脾脏，放入装有2-3mL washing buffer(RPMI-1640完全培养基：PBS＝1：9)的6cm小培养皿中；
2)用玻片糙面进行研磨，脾脏需依次分成小部分研磨；
3)将小培养皿中的细胞置于50mL离心管中，用washing buffer冲洗玻片和小培养皿中残余的细胞，使终体积约30mL；
4)500g离心5min，弃上清，轻弹细胞使细胞团分散；
5)加入3mL红细胞裂解液，轻轻吹打，混匀脾细胞，静置1-2min；
6)加入30mL washing buffer终止裂解反应；
7)用滤网将上述细胞混合物过滤至新的50mL离心管中；
8)500g/min离心5min，弃上清，轻弹细胞使细胞团分散；
9)加入30mL washing buffer溶液，过滤至新的50mL离心管中；
10)500g/min离心5min，弃上清，轻弹细胞使细胞团分散；
11)用6mL RPMI-1640完全培养基重悬，计数；
12)根据细胞计数结果，调整细胞密度为1×107/mL，加入0.3μL的IL-2(IL-2原始浓度为1000IU/mL；终浓度为100IU/mL)，促进OT-Ⅰ细胞增殖。
(2)CFSE标记靶细胞(肿瘤细胞)
1)取对数生长期的靶细胞小鼠T淋巴瘤细胞(E.G7-OVA-WT)和B7-H4过表达的小鼠T淋巴瘤细胞(E.G7-OVA-mH4)悬液，离心、加PBS重悬计数；
2)各取2×105个细胞到15mL离心管中，1500rpm离心3min；
3)加1mL PBS重悬并加入0.6μL CFSE(CFSE原始浓度为5mM，终浓度为3μM)，37℃孵育8min；
4)加入预冷的10mL含1％(v/v)血清的PBS，4℃静置10min；
5)800g离心5min，弃上清；
6)加入10mL 1％血清的PBS，重悬细胞，再洗一遍；
7)加入1mL RPMI-1640完全培养基，计数，将浓度稀释至1×105个/mL，每孔需靶细胞1×104/100μL/well。
(3)靶细胞和T细胞共孵育
1)按T细胞：靶细胞＝100：1，将1×106个OT-Ⅰ细胞加入靶细胞中共培养24h，观察细胞死亡情况；
2)共孵育24h后，将每孔混合细胞用death marker(near-IR波长633-635)标记，每管0.02μL，室温静置8-10min(或者4℃30min)；
3)每管加1mLl PBS，500g离心5min；
4)流式上机检测，结果如图9所示，当没有添加任何抗体时，由于B7-H4的抑制作用，T细胞对E.G7-OVA-mH4细胞杀伤效果不如对E.G7-OVA-WT细胞杀伤效果。然而添加Npsc-A8之后，T细胞对E.G7-OVA-mH4细胞的杀伤能力增强，且呈剂量依赖型增强。说明Npsc-A8抗体可以有效逆转B7-H4对T细胞的免疫抑制作用。而8H4和6H3抗体不具备此功能。
实施例10、抗B7-H4阻断抗体的治疗功效
(1)构建MC38-mH4皮下荷瘤模型：8周龄的C57BL/6雌鼠，准备对数生长期的MC38-mH4细胞，分别以0.8×106/100μL/mice进行右侧皮下接种，每组各5只。
在MC38-mH4小鼠结肠癌肿瘤模型中测试了Npsc-A8对B7-H4功能的阻断作用。MC38-mH4细胞由福建医科大学免疫治疗研究院提供。MC38-mH4培养于含有10％(v/v)胎牛血清、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、10mM HEPES和1.0mM丙酮酸钠的RPMI-1640培养基中。
将重悬于1.5mL PBS中的1.2×107MC38-mH4细胞皮下注射到8周龄的野生型C57/BL6雌鼠中。为测试抗B7-H4阻断抗体的治疗效果，对MC38-mH4模型，在第5天进行腹膜内注射1mg/kgNpsc-A8抗体和对照抗B7-H4抗体6H3。
(2)荷瘤第5天开始，每2天测量小鼠肿瘤平均直径[(长径+短径)/2]，绘制生长曲线。
(3)当小鼠肿瘤平均直径超过15mm时或出现消瘦、驼背体征、停止进食、不能行走、昏睡等症状，CO2麻醉处死小鼠并记录小鼠死亡时间并绘制生存曲线。
(4)观察Npsc-A8抗体在MC38-mH4荷瘤模型中治疗情况
结果如图10中A所示，与6H3单药治疗组和PBS对照组相比，Npsc-A8单药治疗具有明显的抗肿瘤作用(P<0.05)(n＝5)。不同药物治疗后小鼠生存曲线如图10中B所示，PBS组和6H3单药治疗组小鼠生存期均低于Npsc-A8单药治疗组，P<0.01。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种特异性靶向B7-H4的抗体，其特征在于，
所述抗体的重链CDR1如SEQ ID NO.6所示、重链CDR2如SEQ ID NO.7所示以及重链CDR3如SEQ ID NO.8所示；
所述抗体的轻链CDR1如SEQ ID NO.9所示、轻链CDR2如SEQ ID NO.10所示以及轻链CDR3如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的特异性靶向B7-H4的抗体，其特征在于，所述抗体满足如下(1)和(2)所示条件中的一个或者多个：
(1)所述抗体的重链可变区如SEQ ID NO.4所示；以及，
(2)所述抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的特异性靶向B7-H4的抗体，其特征在于，所述抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区；
可选地，所述抗体满足如下1)和2)所示条件中的一个或者多个：
1)所述抗体独立地具有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD任何其中之一恒定区的序列；以及，
2)所述的重链恒定区和轻链恒定区的独立地选自人、鼠、兔、羊、牛、马、猪、狗、猫、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭和鹅任何其中之一的种属来源。
4.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括权利要求1中定义的所述重链CDR1、所述重链CDR2、所述重链CDR3、所述轻链CDR1、所述轻链CDR2、所述轻链CDR3、权利要求2中定义的所述重链可变区和轻链可变区中的一个或者多个。
5.一种检测试剂、检测试剂盒或者药物，其特征在于，包含权利要求1至3任一项所述的抗体或者权利要求4所述的重组蛋白。
6.一种核酸，其特征在于，含有用于编码如权利要求1至3中任一项所述的抗体或者如权利要求4所述的重组蛋白的核酸片段。
7.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求6所述的核酸或者权利要求7中所述的重组表达载体。
9.权利要求1至3任一项所述的抗体或者权利要求4所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
培养权利要求8所述的宿主细胞，从所得培养物中分离抗体或者重组蛋白。
10.权利要求1至3任一项所述的抗体或者权利要求4所述的重组蛋白在制备***的药物中的应用。
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