CN116577499A - 一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法 - Google Patents
一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116577499A CN116577499A CN202310863500.7A CN202310863500A CN116577499A CN 116577499 A CN116577499 A CN 116577499A CN 202310863500 A CN202310863500 A CN 202310863500A CN 116577499 A CN116577499 A CN 116577499A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- donor
- probe
- acceptor
- luminescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 238000007172 homogeneous catalysis Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 28
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 67
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims abstract description 63
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 42
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 117
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 18
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 14
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 14
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 14
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- -1 sulfydryl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 claims description 8
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 8
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 8
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- AMWRITDGCCNYAT-UHFFFAOYSA-L hydroxy(oxo)manganese;manganese Chemical compound [Mn].O[Mn]=O.O[Mn]=O AMWRITDGCCNYAT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 claims description 4
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 claims description 4
- SADFJQHXQCWOGE-UHFFFAOYSA-N 2-[[5-[4-(N-phenylanilino)phenyl]thiophen-2-yl]methylidene]propanedinitrile Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N(C1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(S1)C=C(C#N)C#N)C1=CC=CC=C1 SADFJQHXQCWOGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QDAYJHVWIRGGJM-UHFFFAOYSA-B [Mo+4].[Mo+4].[Mo+4].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [Mo+4].[Mo+4].[Mo+4].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QDAYJHVWIRGGJM-UHFFFAOYSA-B 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 claims description 3
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 claims description 3
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 claims description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 claims description 2
- VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N glutaric anhydride Chemical compound O=C1CCCC(=O)O1 VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- CWQXQMHSOZUFJS-UHFFFAOYSA-N molybdenum disulfide Chemical compound S=[Mo]=S CWQXQMHSOZUFJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KMYNOLMHFFIADC-UHFFFAOYSA-J molybdenum(4+) octadecanoate Chemical compound C(CCCCCCCCCCCCCCCCC)(=O)[O-].[Mo+4].C(CCCCCCCCCCCCCCCCC)(=O)[O-].C(CCCCCCCCCCCCCCCCC)(=O)[O-].C(CCCCCCCCCCCCCCCCC)(=O)[O-] KMYNOLMHFFIADC-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 10
- 230000005284 excitation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 3
- 238000012815 AlphaLISA Methods 0.000 abstract description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003239 susceptibility assay Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 60
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 102400001263 NT-proBNP Human genes 0.000 description 18
- 108010008064 pro-brain natriuretic peptide (1-76) Proteins 0.000 description 18
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 15
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 14
- 108091006197 SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Proteins 0.000 description 13
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 12
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 12
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 12
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 12
- ARXJGSRGQADJSQ-UHFFFAOYSA-N 1-methoxypropan-2-ol Chemical compound COCC(C)O ARXJGSRGQADJSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 229910016978 MnOx Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000002135 nanosheet Substances 0.000 description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 7
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 6
- 101000962461 Homo sapiens Transcription factor Maf Proteins 0.000 description 6
- 101000613608 Rattus norvegicus Monocyte to macrophage differentiation factor Proteins 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 6
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 239000012621 metal-organic framework Substances 0.000 description 6
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 6
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 6
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 6
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 6
- MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N (aminomethyl)phosphonic acid Chemical compound NCP(O)(O)=O MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 4
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- JKQOBWVOAYFWKG-UHFFFAOYSA-N molybdenum trioxide Chemical compound O=[Mo](=O)=O JKQOBWVOAYFWKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M tetramethylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)C WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 3
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000476 molybdenum oxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- PQQKPALAQIIWST-UHFFFAOYSA-N oxomolybdenum Chemical compound [Mo]=O PQQKPALAQIIWST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000001443 photoexcitation Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101800000407 Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 description 2
- 102400000667 Brain natriuretic peptide 32 Human genes 0.000 description 2
- 101800002247 Brain natriuretic peptide 45 Proteins 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 2
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N nesiritide Chemical group C([C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- PTISTKLWEJDJID-UHFFFAOYSA-N sulfanylidenemolybdenum Chemical compound [Mo]=S PTISTKLWEJDJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012440 amplified luminescent proximity homogeneous assay Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 238000007037 hydroformylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 239000008235 industrial water Substances 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002064 nanoplatelet Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- YYMBJDOZVAITBP-UHFFFAOYSA-N rubrene Chemical compound C1=CC=CC=C1C(C1=C(C=2C=CC=CC=2)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=C11)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=CC=CC=C1 YYMBJDOZVAITBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明属于免疫分析技术领域,具体涉及一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法。所述试剂盒包括连接第一识别分子的供体材料、连接第二识别分子的受体材料和催化底物过氧化氢(H2O2),所述供体材料可以催化H2O2产生单线态氧(1O2);所述受体材料具有1O2触发发光特性。本发明的试剂盒采用均相免疫技术,可配合现有发光检测仪使用,用于测定待测样本中目标分子含量,与光激化学发光(AlphaLISA)技术相比,无需光激发、无需特殊检测仪器、灵敏度高,与酶联免疫吸附(ELISA)技术等非均相免疫分析相比,无洗涤步骤、操作简单、检测线性范围宽、检测流程所需时间短、灵敏度高、准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及均相免疫分析领域,特别涉及一种均相催化化学发光免疫检测试剂盒,还涉及其制备方法和使用方法。
背景技术
均相免疫分析是抗原和抗体在同一介质中进行免疫反应的分析方法,而非均相免疫分析则将抗体或抗原固定在固相载体表面,通过特异性免疫反应,将所需的抗原或抗体结合在固相表面形成抗原-抗体免疫复合物的分析方法。目前免疫分析技术主要是基于微孔板的非均相反应模式。这一类技术方法不仅需要抗体或抗原的包埋,而且免疫反应过程缓慢,需要多次洗涤不利于自动化。而均相免疫分析技术无需抗体或抗原的包埋、反应迅速、无需洗涤、易于实现高通量和自动化,因此目前越来越受到大家的关注和推崇。
光激化学发光免疫分析(amplified luminescent proximity homogeneousassay linked immunosorbent assay,AlphaLISA)技术是一新型的均相免疫分析技术,其是化学和生物两个学科的有机结合:在化学方面,该技术采用了含有感光材料(如酞菁类物质)的供体纳米材料和含有发光物质(如红荧烯、铕螯合物等)的受体纳米材料。在 680 nm的激发光照射下,供体纳米材料中的感光材料激发周围的氧分子转化为高能态的1O2。1O2的半衰期约为4 µs,这决定了它的扩散直径约为200 nm,如果超过了这一范围1O2就会回落到基态。产生的1O2向外扩散,免疫夹心复合物中的受体纳米材料则能接收到1O2,与内部的1O2触发光试剂发生反应产生能量,这一能量迅速转移至受体纳米材料中的发光试剂,发光试剂接收到能量后继而产生发射光,供仪器检测,因此光激化学发光免疫分析技术本底很低,显著提高了信噪比。
但AlphaLISA模式下,供体材料仍需要外部光源激发和精密的光源控制***,这对仪器设备等硬件有很高的要求,也提升了检测成本;另一方面光源的穿透能力有限,产生1O2的效率不高。因此,提供一种不用外界光激发,利用化学催化反应原位产生 1O2 来激发受体体材料发光,实现高效、灵敏的均相检测是非常有必要的。
发明内容
本发明针对非均相检测以及AlphaLISA技术的不足,提供了一种均相催化化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法,所述方法利用催化触发发光原理,使得所述方法同时具有无需外界光激发、无需洗涤步骤、仪器要求低、灵敏度高等优势。
为实现以上技术目的,本发明采用以下技术方案:
本发明第一方面提供一种均相催化化学发光试剂盒,其包括:供体探针、受体探针和过氧化氢(H2O2);所述供体探针包括相连的供体材料和第一识别分子,所述受体探针包括相连的受体材料和第二识别分子;其中,所述供体材料用于催化过氧化氢产生单线态氧(1O2);所述第一识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、DNA或RNA中的一种或多种;所述受体材料具有单线态氧触发循环发光特性;所述受体材料包括单线态氧触发发光的试剂;所述单线态氧触发发光的试剂包括作为化学发光物质的N,N-二甲基-4-(6-苯基-2,3-二氢-1,4-氧硫杂环丁-5-基)苯胺,以及作为发光增强剂的2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基) 丙二腈;所述第二识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、DNA或RNA中的一种或多种;所述第一识别分子和第二识别分子用于特异性结合目标分子。
进一步的,其还包括:所述目标分子的标准品;所述目标分子是抗原、肽、抗体、氨基酸、DNA、RNA、病毒、激素、药物或代谢物。
进一步的,所述供体材料为钼酸钠、次氯酸钠、硬脂酸钼、硫化钼、磷酸钼、氧化锰基材料及其衍生物中的一种;所述供体材料的表面还连接有化学基团,所述化学基团为环氧基、氯甲基、巯基、氨基、羟基、马来胺基、磺酸基、羧基和醛基中的至少一种。
进一步的,所述受体材料还包括球状载体,所述单线态氧触发发光的试剂包埋于所述球状载体内;其中,所述球状载体为介孔二氧化硅、树状大分子聚合物、聚苯乙烯微球、金属有机框架、共价有机框架或脂质体;所述受体材料的表面还连接有化学基团,所述化学基团为环氧基、氯甲基、巯基、氨基、羟基、马来胺基、磺酸基、羧基和醛基中的至少一种。
进一步的,所述供体材料的平均粒径为5 nm~1000 nm,即所述供体材料的平均粒径可为5 nm、10 nm、50 nm、100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800nm、900 nm或1000 nm。所述受体材料的平均粒径为5 nm~1000 nm,即所述受体材料的平均粒径可为5 nm、10 nm、50 nm、100 nm、200 nm、300 nm、400 nm、500 nm、600 nm、700 nm、800nm、900 nm或1000 nm。
本发明第二方面提供上述的均相催化化学发光试剂盒的制备方法,该制备方法包括如下步骤:采用化学偶联方法将第一识别分子连接至供体材料表面,制得供体探针;采用化学偶联方法将第二识别分子连接至受体材料表面,制得受体探针;将过氧化氢以5 μM~5M的浓度溶解于超纯水中,用于催化反应,得到所述均相催化化学发光试剂盒。
进一步的,所述化学偶联方法包括重氮法,戊二醛法,戊二酸酐法或碳化二亚胺法;所述第一识别分子与供体材料的摩尔比例为(10~1000):1;所述第二识别分子与受体材料的摩尔比例为(10~1000):1。
本发明第三方面提供上述的均相催化化学发光试剂盒的使用方法,其特征在于:该使用方法包括如下步骤:(1)将所述供体探针和受体探针分别加入到待测样品溶液中,形成待测混合物;当待测样品中含有目标分子,将形成供体探针-目标分子-受体探针免疫复合物;当待测样品中不含有目标分子,则供体探针和受体探针将处于分离状态,不会形成免疫复合物;(2)向所述待测混合物中加入过氧化氢,供体材料将过氧化氢分解为单线态氧和H2O;当形成免疫复合物,则单线态氧扩散至受体探针,产生化学发光;当待测混合物中没有免疫复合物存在,则不会产生化学发光;(3)使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号,即可实现对待测样品中目标分子浓度的定量检测。
进一步的,所述步骤(1)中的反应温度为20℃~50℃,时间为3~30分钟;所述步骤(3)中使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号的时间为1~5分钟;所述步骤(3)中化学发光的发射波长为400 nm~2000 nm。
本发明的有益效果是:
本发明提供一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法。试剂盒包括连接第一识别分子的供体材料形成供体探针,连接第二识别分子的受体材料形成受体探针,以及催化底物过氧化氢,供体材料可以催化H2O2产生单线态氧;受体材料具有1O2触发发光特性。本发明的试剂盒采用均相免疫技术,可配合现有发光检测仪使用,用于测定待测样本中目标分子含量。与光激化学发光技术相比,无需光激发、无需特殊检测仪器、灵敏度高;与酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术等非均相免疫分析相比,无洗涤步骤、操作简单、检测线性范围宽、检测流程所需时间短、灵敏度高、准确度高。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明,这些示例性说明并不构成对实施例的限定,除非有特别申明,附图中的图不构成比例限制。
图1为一种均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的原理图;
图2为循环增强化学发光的原理图;
图3为用于检测人血清中甲胎蛋白(AFP)的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线;
图4为用于检测人血清中氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线;
图5为用于检测人鼻/咽拭子中SARS-CoV-2核衣壳蛋白(SARS-CoV-2 NP)的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线;
图6为用于检测牛奶样本中乳铁蛋白(LF)的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线;
图7为用于检测人血清中肺腺癌患者突变DNA的均相催化化学发光试剂盒及其检测方法的标准曲线;
图8为本发明实施例1的发光时间曲线图。
具体实施方式
本发明第一方面提供一种均相催化化学发光试剂盒,如图1所示,所述试剂盒包括:供体探针、受体探针和过氧化氢(H2O2);所述供体探针包括相连的供体材料和第一识别分子,所述受体探针包括相连的受体材料和第二识别分子;其中,所述供体材料用于催化过氧化氢产生单线态氧(1O2);所述第一识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、DNA或RNA中的一种或多种;所述受体材料具有单线态氧触发发光特性;所述第二识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、DNA或RNA中的一种或多种。需要说明的是,第一识别分子和第二识别分子为同类别中的不同物质。例如:第一识别分子和第二识别分子均为抗体,但是却为不同的抗体。另外,过氧化氢在此处为催化底物。
本发明第二方面提供上述的均相催化化学发光试剂盒的制备方法,该制备方法包括如下步骤:
采用化学偶联方法将第一识别分子连接至供体材料表面,制得供体探针;
采用化学偶联方法将第二识别分子连接至受体材料表面,制得受体探针;
将过氧化氢以5 μM~5 M的浓度溶解于超纯水中,用于催化反应,得到所述均相催化化学发光试剂盒。即在实际使用的过程中,本发明的试剂盒包括供体探针溶液、受体探针溶液以及过氧化氢溶液,共三种单独存放的溶液。
本发明第三方面提供上述的均相催化化学发光试剂盒的使用方法,其特征在于:该使用方法包括如下步骤:
(1)将所述供体探针和受体探针分别加入到待测样品溶液中,形成待测混合物;
如果待测样品中含有目标分子,将形成供体探针-目标分子-受体探针免疫复合物;若待测样品中不含有目标分子,则供体探针和受体探针将处于分离状态,不会形成免疫复合物;
(2)向所述待测混合物中加入过氧化氢,供体材料将过氧化氢分解为单线态氧和H2O;
如果形成免疫复合物,则单线态氧扩散至受体探针,产生化学发光;如果待测混合物中没有免疫复合物存在,则不会产生化学发光;
(3)使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号,即可实现对待测样品中目标分子浓度的定量检测。
为了使本发明更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
需要说明的是,本发明所述用语“待测样品”是指待测的含有或疑似含有目标分子的一种混合物。可以被用在本发明的待测样品包括体液,如血液(可以是在收集的血液样品中通常看到的抗凝血)、血浆、血清、尿、***、唾液、汗液、细胞培养物、组织提取物等。其他类型的待测样品包括溶剂、海水、工业水样、食品样品、环境样本诸如土或水、植物材料、真核细胞、细菌、质粒、病毒、真菌、及来自于原核的细胞。待测样品可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如,为了避免HOOK效应,可以在上机检测前使用稀释液对待测样品进行稀释后再在检测仪器上进行检测。
本发明所述用语“目标分子”是指检测时待测样本中的物质。与目标分子具有特异性结合亲合力的识别分子会被用于检测该目标分子。目标分子可以是抗原、肽、抗体、氨基酸、DNA、RNA、病毒、激素、药物、代谢物等。
实施例1
供体材料为钼硫化合物—蛋白质纳米复合物,蛋白质为卵清蛋白(ovalbumin,OVA),平均粒径为5 nm;受体材料为聚苯乙烯微球包埋可1O2触发发光的试剂,聚苯乙烯微球表面连接有羧基,平均粒径为200 nm;可1O2触发发光的试剂由化学发光物质 N,N-二甲基-4-(6-苯基-2,3-二氢-1,4-氧硫杂环丁-5-基)苯胺(SO)和发光增强剂 2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基) 丙二腈(TTMN)组成;检测原理为:1O2可以攻击SO,形成SO的不稳定中间体,该中间体从激发态回到基态会释放波长为470 nm的光,此发光可以作为光源,该波段的光再激发邻近的发光增强剂TTMN,使TTMN发出650 nm的发光,并进一步产生1O2,攻击SO,由此形成循环增强的化学发光,该发射光可作为光学信号被发光检测仪探测和采集,用于目标分子定量检测,见图2;目标分子为甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP);第一识别分子为抗AFP抗体1;第二识别分子为抗AFP抗体2;待测样本为人血清。
使用经典的单线态氧产生方法即钼酸钠+过氧化氢使溶液中产生大量的单线态氧,进而使聚苯乙烯微球包埋SO和TTMN (STPS)产生循环增强化学发光,可以看到发光可持续1200秒(20分钟),如图8所示。
具体实施步骤:
1. 钼硫化合物—OVA纳米复合物(MoO)的制备
称取OVA 60 mg 于 30 mL 加入到超纯水中,磁力搅拌溶解成澄清透明水溶液,然后加入 Na2MoO4•2H2O(66.9 mg)和Na2S•9H2O(66.6 mg)进行搅拌混合,得到混合液。该条件下 Mo 与 S 的摩尔比为 1:1。随后,加入 NaOH(1 M)的水溶液调节混合液 pH 至 11(约消耗 NaOH 400 μL),磁力搅拌下缓慢滴加盐酸水溶液(1 M)调节 pH 至 6.5(约消耗 800 μL),滴加过程中可观察到溶液颜色缓慢变黄。调节pH 后避光反应 1 h,将反应液转移至透析袋(截留分子量 3200)中透析 15 h,以除去反应产生的盐小分子杂质。透析液冻干得到淡黄色固体粉末,-20℃储存备用。
2. 抗AFP抗体1连接MoO制备供体探针
(1)称取 10 mg MoO溶解 1 mL 超纯水中,加入 0.2 mL 新配的 0.1 M NaIO4溶液,室温下避光反应 20 分钟。
(2)将上述溶液装入透析袋中,用 1 mM、pH 4.4 的醋酸钠缓冲液透析,4 ℃过夜。
(3)加20 μL、0.2 M、pH 9.5的碳酸盐缓冲液,使以上醛化过桯的pH升高到9.0~9.5,然后立即加 5 mg 抗AFP抗体1 在 1mL 0.01M 碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌 2小时。
(4)加 0.1 mL 新配的 4 mg/mL NaBH4溶液,充分混匀,在 4 ℃下避光放置两小时,于 0.15 M(pH 7.4)PBS 中 4℃透析过夜。
(5)透析完成后,加入等体积的饱和硫酸铵溶液,4 ℃条件下放置 2 小时,3000r/min 离心30 min,取沉淀,用半饱和硫酸铵溶液再次洗涤 2 次后,将沉淀溶于 0.15 M(pH 7.4)的 PBS 中。
(6)透析除盐,保存于4 ℃备用。
3. 聚苯乙烯微球包埋SO和TTMN (STPS)的制备
通过溶胀法合成STPS。首先将5 mg TTMN和3 mg SO溶解在3 mL 丙二醇甲醚溶液中,并预热至70 ℃。随后,加入1 mL 羧基化聚苯乙烯微球(200 nm,100mg/mL),反应30分钟。然后立即停止加热,并将溶液冷却到室温,制得STPS。将合成的STPS用去离子水洗涤三次,在13500 rpm下离心15分钟,并将残余物重新分散在4 mL去离子水中。准备好的STPS溶液在4 ℃的黑暗环境中保存,以备将来使用。
4. 抗AFP抗体2连接STPS制备受体探针
采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)一步法在STPS表面连接AFP抗体2。
(1)移取10 μL的STPS溶于1 mL 磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)(0.01 M,pH =7.4),加入10 μg 抗AFP抗体2,静电吸附30 min,随后加入5 μg EDC搅拌反应30 min,重复3次,观察有/无STPS的聚集现象;
(2)随后加入100 μL mg 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)(10 mg/mL),静电吸附30 min后加入5 μg EDC反应30 min;
(3)再次加入5 μg EDC反应30 min,离心,沉淀复溶至100 μL复溶液中。
复溶液成分:0.01 M PBS缓冲液(pH =7.4)中含25% 蔗糖与0.1% 叠氮钠,1% BSA,1% 吐温20。
5. 用于检测AFP抗原的标准曲线的绘制
将AFP标准品用PBS(0.01M, pH 7.4)缓冲液分别稀释至不同的浓度梯度,具体为:500 ng/mL、250 ng/mL、125 ng/mL、62.5 ng/mL、31.3 ng/mL、15.6 ng/mL、7.8 ng/mL、3.9ng/mL、1.95 ng/mL、0.98 ng/mL、0.49 ng/mL、0.245 ng/mL、0.12 ng/mL、0.06 ng/mL和0ng/mL。分别取200 μL上述不同浓度的AFP标准品,同时加入6 μL供体探针和6 μL受体探针,37 ℃反应10 min后,加入10 μL、0.1 M的H2O2,2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。通过计算平均值后代入到标准曲线获得待检样品中AFP的浓度,以所得到的发光强度为纵坐标,以AFP浓度 (ng/mL)为横坐标绘制标准曲线,计算出线性方程。具体实验结果如下:线性标准曲线为y = 4.693ln(x) + 3.2038,R² = 0.991,见图3。该方法的最低检测限被定义检测20个AFP浓度为0时所得到结果的平均发光强度+3倍标准偏差,通过该标准曲线计算得最低检测线为0.12ng/mL。
6. 检测血清样本中AFP的含量
本发明均相催化化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法用于检测人血清样本中AFP含量时,通过以下步骤实施:
首先将血清样本稀释10倍,随后同时将6 μL供体探针和6 μL受体探针加入到稀释后的样本中,37 ℃反应10 min后,加入10 μL、0.1 M的H2O2,H2O2和MoO反应,原位产生1O2,产生的1O2可以攻击受体探针,使其内部发光增强剂TTMN发出650 nm的光,2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。将结果发光强度代入按照实施例1中5的标准曲线中,计算出所对应样本的浓度,即为血清样本中AFP的实际浓度。
实施例2
供体材料为氧化锰基材料MnOx纳米片,平均粒径为1000 nm;受体材料为聚苯乙烯微球包埋可1O2触发发光的试剂,聚苯乙烯微球表面连接有羧基,平均粒径为100 nm;可1O2触发发光的试剂由化学发光物质SO和发光增强剂(1-10-菲咯啉)三[4,4,4-三氟-1-(2-噻吩基)-1,3-丁二酮]铕(Ⅲ)(EuⅢ)组成;EuⅢ的发射波长为615 nm;目标分子为氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP);第一识别分子为NT-proBNP适配体1;第二识别分子为NT-proBNP适配体2;待测样本为人血清。
具体实施步骤:
1. 金属氧化物纳米片MnOx的制备
在制备MnOx纳米片时,将NaBH4(6 mg/mL,150 mL)水溶液加入到KMnO4溶液(0.5mg/mL,15 mL)中,在强力超声处理1小时后,11000 rpm离心15 min,沉淀复溶于10 mL超纯水中。
2. NT-proBNP适配体1连接MnOx纳米片制备供体探针
(1)称取 10 mg SH-PEG2000-COOH溶解于1 mL MnOx (1 mg/mL)中,室温下反应过夜。10000 rpm离心15 min,沉淀复溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4)。
采用EDC一步法在MnOx纳米片表面连接NT-proBNP适配体1。
(2)移取10 μL的MnOx纳米片溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4),加入10 μMNT-proBNP适配体1,静电吸附30 min,随后加入5 μg EDC搅拌反应30 min,重复3次,观察有/无MnOx纳米片的聚集现象;
(3)随后加入100 μL mg BSA(10 mg/mL),静电吸附30 min后加入5 μg EDC反应30min;
(4)再次加入5 μg EDC反应30 min,13500 rpm离心15 min,沉淀复溶至100 μL复溶液中。
复溶液成分:0.01M PBS缓冲液(pH =7.4)中含25%蔗糖与0.1% 叠氮钠,1% BSA,1%吐温20。
3. 聚苯乙烯微球包埋SO和EuⅢ (SEuPS)的制备
通过溶胀法合成SEuPS。首先将5 mg EuⅢ和3 mg SO溶解在3 mL 丙二醇甲醚溶液中,并预热至70 ℃。随后,加入1 mL 羧基化聚苯乙烯微球(100 nm,100mg/mL),反应30分钟。然后立即停止加热,并将溶液冷却到室温。将合成的SEuPS用去离子水洗涤三次,在13500 rpm下离心15分钟,并将残余物重新分散在4 mL去离子水中。准备好的SEuPS溶液在4℃的黑暗环境中保存,以备将来使用。
4. NT-proBNP适配体2连接SEuPS制备受体探针
采用EDC一步法在SEuPS表面连接NT-proBNP适配体2。
(1)移取10 μL的SEuPS溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4),加入10 μM NT-proBNP适配体2,静电吸附30 min,随后加入5 μg EDC搅拌反应30 min,重复3次,观察有/无\ SEuPS的聚集现象;
(2)随后加入100 μL mg BSA(10 mg/mL),静电吸附30 min后加入5 μg EDC反应30min;
(3)再次加入5 μg EDC反应30 min,离心,沉淀复溶至100 μL复溶液中。
复溶液成分:0.01M PBS缓冲液(pH =7.4)中含25%蔗糖与0.1%叠氮钠,1% BSA,1%吐温20。
5. 用于检测NT-proBNP抗原的标准曲线的绘制
将NT-proBNP标准品用PBS(0.01M,pH 7.4)缓冲液分别稀释至不同的浓度梯度,具体为:10000、5000、2500、1250、625、313、156、78、39、19.5、9.8和0 fg/mL。分别取200 μL上述不同浓度的NT-proBNP标准品,同时加入6 μL包被抗体1的供体纳米材料和6 μL包被抗体2的受体纳米材料,37℃反应10 min后,加入10μL 0.1M的H2O2,2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。以所得到的光强度为纵坐标,以NT-proBNP浓度 (pg/ mL)为横坐标绘制标准曲线,计算出线性方程。具体实验结果如下:线性标准曲线为y = 5.6953ln(x) -17.131,R² = 0.9849,见图4。该方法的最低检测限被定义检测20个NT-proBNP浓度为0时所得到结果的平均发光强度+3倍标准偏差,通过该标准曲线计算得最低检测线为10fg/mL。
6. 检测血清样本中NT-proBNP的含量
本发明催化均相化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法用于检测血清样本中NT-proBNP含量时,通过以下步骤实施:
首先将血清样本稀释10倍,随后同时将6 μL供体探针和6 μL受体探针加入到稀释后的样本中,37 ℃反应10 min后,加入10 μL 0.1M的H2O2,H2O2和MnOx反应原位产生1O2,产生的1O2可以攻击受体材料,使其发出615 nm化学发光。2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。将结果发光强度代入实施例2中5的标准曲线中,计算出所对应样本的浓度,即为血清样本中NT-proBNP的实际浓度。
实施例3
供体材料为多孔磷酸钼纳米粒子(MoPO),平均粒径为500 nm;受体材料为介孔二氧化硅微球(MSN)包埋可1O2触发发光的试剂;MSN表面连接有羧基,平均粒径为100 nm;可1O2触发发光的试剂由化学发光物质叠氮-甲基 丙烯酸甲酯-苯氧乙烯-金刚烷烯(azide-methyl acrylate-phenoxyl-adamantylidene,AMPA)和发光增强剂半导体量子点Ag2S组成;
Ag2S的发射波长为2000 nm;目标分子为新型冠状病毒核衣壳蛋白(SARS-CoV-2NP)抗原;第一识别分子为抗SARS-CoV-2 NP抗体1;第二识别分子为抗SARS-CoV-2 NP抗体2;待测样本为人鼻/咽拭子样本。
具体实施步骤:
1. MoPO纳米粒子的制备
以三氧化钼、四甲基氢氧化铵、磷酸和水为原料,在水热条件下合成。首先将0.5mL的水和0.5 mL (2 mg/mL)三氧化钼加入到聚四氟乙烯内衬中混合均匀,然后加入0.1 mL(10 mg/mL)的磷酸,充分搅拌均匀,再加入1 mL的四甲基氢氧化铵,进一步搅拌均匀,密封后将反应釜放入烘箱中,在 220 ℃下晶化 3 天。反应完成后取出反应釜冷却,得到的固体产物通过离心,过滤,用蒸馏水洗涤至中性,然后在室温下干燥,即得到 MoPO纳米粒子。
2. 抗SARS-CoV-2 NP抗体1连接MoPO制备供体探针
(1)称取 10 mg SH-PEG2000-COOH溶解 1mL MoPO (1 mg/mL)中,室温下反应过夜。10000 rpm离心15 min,沉淀复溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4)。
采用EDC一步法在MoPO纳米片表面连接抗SARS-CoV-2 NP抗体1。
(2)移取10 μL的MoPO纳米片溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4),加入10 μM抗SARS-CoV-2 NP抗体1,静电吸附30 min,随后加入5 μg EDC搅拌反应30 min,重复3次,观察有/无MoPO纳米片的聚集现象;
(3)随后加入100 μL mg BSA(10mg/mL),静电吸附30 min后加入5 μg EDC反应30min;
(4)再次加入5 μg EDC反应30 min,13500 rpm离心15 min,沉淀复溶至100 μL复溶液中。
复溶液成分:0.01M PBS缓冲液(pH =7.4)中含25%蔗糖与0.1% 叠氮钠,1% BSA,1%吐温20。
3. MSN微球包埋AMPA 和Ag2S (MAA)的制备
首先,将5 mg Ag2S和3 mg SO 溶解在3 mL丙二醇甲醚溶液中,并预热至70 ℃。随后,加入1 mL 羧基化MSN(100 nm,100 mg/mL),反应30 min。然后立即停止加热,并将溶液冷却到室温。将合成的MSA用去离子水洗涤三次,在13500 rpm下离心15 min,并将残余物重新分散在4 mL去离子水中。准备好的MSA溶液在4 ℃的黑暗环境中保存,以备将来使用。
4. 抗SARS-CoV-2 NP 抗体2连接MAA制备受体探针
采用EDC一步法在MAA表面连接SARS-CoV-2 NP抗体2。
(1)移取10 μL的MAA溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4),加入10 μg 抗SARS-CoV-2 NP抗体2,静电吸附30 min,随后加入5 μg EDC搅拌反应30 min,重复3次,观察有/无MAA的聚集现象;
(2)随后加入100 μL mg BSA(10mg/mL),静电吸附30 min后加入5 μg EDC反应30min;
(3)再次加入5 μg EDC反应30 min,离心,沉淀复溶至100 μL复溶液中。
复溶液成分:0.01 M PBS缓冲液(pH =7.4)中含25% 蔗糖与0.1% 叠氮钠,1% BSA,1% 吐温20。
5. 用于检测SARS-CoV-2 NP抗原的标准曲线的绘制
将SARS-CoV-2 NP标准品用PBS(0.01 M,pH 7.4)缓冲液分别稀释至不同的浓度梯度,具体为:100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.13 ng/mL、1.56ng/mL、0.78 ng/mL、0.39 ng/mL、0.195 ng/mL、0.098 ng/mL、0.049 ng/mL和0 ng/mL。分别取200 μL上述不同浓度的SARS-CoV-2 NP标准品,同时加入6 μL供体探针和6 μL受体探针,37 ℃反应10 min后,加入10 μL、0.1 M的H2O2,2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。以所得到的发光强度为纵坐标,以SARS-CoV-2 NP浓度 (ng/mL)为横坐标绘制标准曲线,计算出线性方程。具体实验结果如下:线性标准曲线为y = 1.4917x + 1.3295,R² = 0.9908,见图5。该方法的最低检测限被定义检测20个SARS-CoV-2 NP浓度为0时所得到结果的平均发光强度+3倍标准偏差,通过该标准曲线计算得最低检测线为0.195ng/mL。
6. 检测鼻/咽拭子样本中SARS-CoV-2 NP的含量
本发明均相催化化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法用于检测人鼻/咽拭子样本中SARS-CoV-2 NP含量时,通过以下步骤实施:
首先将鼻/咽拭子样本稀释10倍,随后同时将6 μL供体探针和6 μL受体探针加入到稀释后的样本中,37 ℃反应10 min后,加入10 μL 0.1 M的H2O2,H2O2和MoPO反应,原位产生1O2,产生的1O2可以攻击受体探针,使其内部Ag2S发出2000 nm的光,2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。将结果发光强度代入实施例3中5的标准曲线中,计算出所对应样本的浓度,即为鼻/咽拭子样本中SARS-CoV-2 NP的实际浓度。
实施例4
供体材料为聚苯乙烯微球表面包裹硫酸钼—BSA纳米复合物(PS-MoB),平均粒径为800 nm;受体材料为脂质体(LPO)包埋可1O2触发发光的试剂;LPO表面连接有羧基,平均粒径为1000 nm;可1O2触发发光的试剂由化学发光物质SO和发光增强剂碳量子点(CDs)组成;CDs的发射波长为980 nm;目标分子乳铁蛋白(LF);第一识别分子为抗LF抗体1;第二识别分子为抗LF抗体2;待测样本牛奶样本。
具体实施步骤:
1. 抗LF抗体1连接PS-MoB纳米复合物制备供体探针
(1) 称取BSA 60 mg 于 30 mL 加入到超纯水中,磁力搅拌溶解成澄清透明水溶液,然后加入 Na2MoO4•2H2O(66.9 mg)和Na2S•9H2O(66.6 mg)进行搅拌混合,得到混合液。该条件下 Mo 与 S 的摩尔比为 1:1。随后,加入 NaOH(1 M)的水溶液调节混合液 pH 至 11(约消耗 NaOH 400 μL),磁力搅拌下缓慢滴加盐酸水溶液(1 M)调节 pH 至 6.5(约消耗800 μL),滴加过程中可观察到溶液颜色缓慢变黄。调节pH 后避光反应 1 h,将反应液转移至透析袋(截留分子量 3200)中透析 15 h,以除去反应产生的盐小分子杂质。透析液冻干得到淡黄色固体粉末MoB,-20℃储存备用。
(2)移取10 μL的聚苯乙烯微球(800 nm,100 mg/mL)溶于1 mL PBS缓冲液(0.01M, pH =7.4),加入10 μg 抗LF抗体2,静电吸附30 min,随后加入5 μg EDC搅拌反应30min,重复3次,观察有/无PS的聚集现象;
(3)随后加入100 μL mg MoB(10 mg/mL),静电吸附30 min后加入5 μg EDC反应30min;
(4)再次加入5 μg EDC反应30 min,离心,沉淀复溶至100 μL复溶液中。
复溶液成分:0.01M PBS缓冲液(pH =7.4)中含25%蔗糖与0.1%叠氮钠,1% BSA,1%吐温20。
2. 脂质体(LPO)包埋SO和CDs (LSC)的制备
首先将5 mg CDs和3 mg SO溶解在3 mL 丙二醇甲醚溶液中。随后,加入1 mL 羧基LPO(1000 nm,100 mg/mL),反应30分钟。然后立即停止加热,并将溶液冷却到室温。将合成的LSC用去离子水洗涤三次,在13500 rpm下离心15分钟,并将残余物重新分散在4 mL去离子水中。准备好的LSC溶液在4 ℃的黑暗环境中保存,以备将来使用。
3. 抗LF抗体2连接LSC制备受体探针
(1)移取10 μL的LSC溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4),加入10 μg 抗LF抗体2,静电吸附30 min,随后加入5 μg EDC搅拌反应30 min,重复3次,观察有/无LSC的聚集现象;
(2)随后加入100 μL mg BSA(10 mg/mL),静电吸附30 min后加入5 μg EDC反应30min;
(3)再次加入5 μg EDC反应30 min,离心,沉淀复溶至100 μL复溶液中。
复溶液成分:0.01M PBS缓冲液(pH =7.4)中含25%蔗糖与0.1%叠氮钠,1% BSA,1%吐温20。
4. 用于检测LF的标准曲线的绘制
将LF标准品用PBS(0.01M,pH 7.4)缓冲液分别稀释至不同的浓度梯度,具体为:1000 ng/mL、500 ng/mL、250 ng/mL、125 ng/mL、62.5 ng/mL、31.3 ng/mL、15.6 ng/mL、7.8ng/mL、3.9 ng/mL、1.95 ng/mL、0.98 ng/mL和0 ng/mL。分别取200 μL上述不同浓度的LF标准品,同时加入6 μL供体探针和6 μL受体探针,37 ℃反应10 min后,加入10 μL、0.1 M的H2O2,2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。以所得到的发光强度为纵坐标,以LF浓度(ng/mL)为横坐标绘制标准曲线,计算出线性方程。具体实验结果如下:线性标准曲线为y =0.0793x + 4.2983,R² = 0.9956,见图6。该方法的最低检测限被定义检测20个LF浓度为0时所得到结果的平均发光强度+3倍标准偏差,通过该标准曲线计算得最低检测线为3.9ng/mL。
5. 检测牛奶样本中LF的含量
本发明均相催化化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法用于检测牛奶样本中LF含量时,通过以下步骤实施:
首先将牛奶样本稀释10倍,随后同时将6 μL供体探针和6 μL受体探针加入到稀释后的样本中,37 ℃反应10 min后,加入10 μL 0.1 M的H2O2,H2O2和MoO反应,原位产生1O2,产生的1O2可以攻击受体探针,使其内部CDs分子被氧化发出980 nm的光。2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。将结果发光强度代入实施例4中4的标准曲线中,计算出所对应样本的浓度,即为牛奶样本中LF的实际浓度。
实施例5
供体材料为氧化钼纳米粒子(MoO3),平均粒径为50 nm;受体材料为金属有机框架(MOF)包埋可1O2触发发光的试剂;MOF表面连接有羧基,平均粒径为50 nm;可1O2触发发光的试剂由化学发光物质AMPA和发光增强剂异硫氰酸荧光素(FITC)组成;FITC的发射波长为520 nm;目标分子肺腺癌患者突变DNA;第一识别分子为与突变DNA配对的DNA1;第二识别分子为与突变DNA配对的DNA2;待测样本为人血清。
具体实施步骤:
1. 氧化钼纳米粒子(MoO3)的制备
取 2.5 g 二水钼酸钠于三口烧瓶中,加入 50 mL蒸馏水并搅拌使之溶化,并超声30 min 后,在超声中逐滴加入硼氢化钾溶液,待反应 30 min 后过滤,经冷冻干燥,得到氧化钼纳米粒子。
2. 突变DNA序列
GTTGGAGCTAGTGGCGTAG
3. DNA1序列
AGCTCCAAC-COOH
3. DNA2序列
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTT CTACGCCACT-NH2
4. DNA1连接MoO3制备供体探针
(1)称取 10 mg SH-PEG2000-NH2溶解 1mL MoO3 (1 mg/mL)中,室温下反应过夜。10000 rpm离心15 min,沉淀复溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4),
(2)将DNA1溶解在0.5 mL超纯水中,随后取35 μM DNA1加入到含有1 mL PBS(pH7.4)溶液中。
(2)加入0.1 mM的EDC和0.4 mM的N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxy succinimide,NHS)反应4 h。
(3)继续加入20 mg MoO,反应4 h,于 0.15 M(pH 7.4)PBS 中 4℃透析过夜。
(5)透析完成后,保存于4 ℃备用。
5. 金属有机框架(MOF)包埋AMPA和FITC (MAF)的制备
首先将5 mg FITC和3 mg AMPA溶解在3 mL 丙二醇甲醚溶液中。随后,加入1 mL羧基化MOF(50 nm,100 mg/mL),反应30分钟。然后立即停止加热,并将溶液冷却到室温。将合成的MAF用去离子水洗涤三次,在13500 rpm下离心15分钟,并将残余物重新分散在4 mL去离子水中。准备好的MAF溶液在4 ℃的黑暗环境中保存,以备将来使用。
6. DNA2连接MAF制备受体探针
(1)移取10 μL的MAF溶于1 mL PBS缓冲液(0.01 M,pH =7.4),加入35 μM DNA2,静电吸附30 min,随后加入5 μg EDC搅拌反应30 min,重复3次,观察有/无MAF的聚集现象;
(2)随后加入100 μL mg 氨基葡萄糖(10 mg/mL),静电吸附30 min后加入5 μgEDC反应30 min;
(3)再次加入5 μg EDC反应30 min,离心,沉淀复溶至100 μL复溶液中。
复溶液成分:0.01M PBS缓冲液(pH =7.4)中含25%蔗糖与0.1%叠氮钠,1% BSA,1%吐温20。
7. 用于检测肺腺癌患者突变DNA的标准曲线的绘制
将突变DNA标准品用PBS(0.01M, pH 7.4)缓冲液分别稀释至不同的浓度梯度,具体为:25000 pg/mL、5000 pg/mL、1000 pg/mL、200 pg/mL、40 pg/mL、8 pg/mL、1.6 pg/mL、0.32 pg/mL、0.064 pg/mL、0 pg/mL。分别取200 μL上述不同浓度的突变DNA标准品,同时加入6 μL供体探针和6 μL受体探针,37 ℃反应10 min后,加入10 μL 0.1 M的H2O2,2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。以所得到的发光强度为纵坐标,以突变DNA浓度 (pg/mL)为横坐标绘制标准曲线,计算出线性方程。具体实验结果如下:线性标准曲线为y =4.3221ln(x) + 4.1995,R² = 0.9929,见图7。该方法的最低检测限被定义检测20个突变DNA浓度为0时所得到结果的平均发光强度+3倍标准偏差,通过该标准曲线计算得最低检测线为0.16pg/mL。
8. 检测人血清样本中肺腺癌患者突变DNA的含量
本发明均相催化化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和使用方法用于检测人血清样本中肺腺癌患者突变DNA含量时,通过以下步骤实施:
首先将人血清样本稀释10倍,随后同时将6 μL供体探针和6 μL受体探针加入到稀释后的样本中,37 ℃反应10 min后,加入10 μL、0.1 M的H2O2,H2O2和MoO反应,原位产生1O2,产生的1O2可以攻击受体探针,使其内部FITC分子发出520 nm的光。 2 min后用发光检测仪测定溶液的发光强度。将结果发光强度代入按照实施例5中7的标准曲线中,计算出所对应样本的浓度,即为人血清样本中肺腺癌患者突变DNA的实际浓度。
本领域的普通技术人员可以理解,上述各实施方式是实现本申请的具体实施例,而在实际应用中,可以在形式上和细节上对其作各种改变,而不偏离本申请的精神和范围。任何本领域技术人员,在不脱离本申请的精神和范围内,均可作各自更动与修改,因此本申请的保护范围应当以权利要求限定的范围为准。
Claims (9)
1.一种均相催化化学发光试剂盒,其特征在于,其包括:供体探针、受体探针和过氧化氢;所述供体探针包括相连的供体材料和第一识别分子,所述受体探针包括相连的受体材料和第二识别分子;
其中,所述供体材料用于催化过氧化氢产生单线态氧;
所述第一识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、DNA或RNA中的一种或多种;
所述受体材料具有单线态氧触发循环发光特性;所述受体材料包括单线态氧触发发光的试剂;
所述单线态氧触发发光的试剂包括作为化学发光物质的N,N-二甲基-4-(6-苯基-2,3-二氢-1,4-氧硫杂环丁-5-基)苯胺,以及作为发光增强剂的2-((5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-基)亚甲基) 丙二腈;
所述第二识别分子为抗体、纳米抗体、抗原、识别肽、适配体、DNA或RNA中的一种或多种;
所述第一识别分子和第二识别分子用于特异性结合目标分子。
2.根据权利要求1所述的均相催化化学发光试剂盒,其特征在于,其还包括:所述目标分子的标准品;
所述目标分子是抗原、肽、抗体、氨基酸、DNA、RNA、病毒、激素、药物或代谢物。
3.根据权利要求1所述的均相催化化学发光试剂盒,其特征在于,所述供体材料为钼酸钠、次氯酸钠、硬脂酸钼、硫化钼、磷酸钼、氧化锰基材料及其衍生物中的一种;
所述供体材料的表面还连接有化学基团,所述化学基团为环氧基、氯甲基、巯基、氨基、羟基、马来胺基、磺酸基、羧基和醛基中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的均相催化化学发光试剂盒,其特征在于,所述受体材料还包括球状载体,所述单线态氧触发发光的试剂包埋于所述球状载体内;
其中,所述球状载体为介孔二氧化硅、树状大分子聚合物、聚苯乙烯微球、金属有机框架、共价有机框架或脂质体;
所述受体材料的表面还连接有化学基团,所述化学基团为环氧基、氯甲基、巯基、氨基、羟基、马来胺基、磺酸基、羧基和醛基中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的均相催化化学发光试剂盒,其特征在于,所述供体材料的平均粒径为5 nm~1000 nm;所述受体材料的平均粒径为5 nm~1000 nm。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的均相催化化学发光试剂盒的制备方法,其特征在于,该制备方法包括如下步骤:
采用化学偶联方法将第一识别分子连接至供体材料表面,制得供体探针;
采用化学偶联方法将第二识别分子连接至受体材料表面,制得受体探针;
将过氧化氢以5 μM~5 M的浓度溶解于超纯水中,用于催化反应,得到所述均相催化化学发光试剂盒。
7.根据权利要求6所述的均相催化化学发光试剂盒的制备方法,其特征在于,所述化学偶联方法包括重氮法,戊二醛法,戊二酸酐法或碳化二亚胺法;
所述第一识别分子与供体材料的摩尔比例为(10~1000):1;
所述第二识别分子与受体材料的摩尔比例为(10~1000):1。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的均相催化化学发光试剂盒的使用方法,其特征在于,该使用方法包括如下步骤:
(1)将所述供体探针和受体探针分别加入到待测样品溶液中,形成待测混合物;
当待测样品中含有目标分子,将形成供体探针-目标分子-受体探针免疫复合物;当待测样品中不含有目标分子,则供体探针和受体探针将处于分离状态,不会形成免疫复合物;
(2)向所述待测混合物中加入过氧化氢,供体材料将过氧化氢分解为单线态氧和H2O;
当形成免疫复合物,则单线态氧扩散至受体探针,产生化学循环发光;当待测混合物中没有免疫复合物存在,则不会产生化学发光;
(3)使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号,即可实现对待测样品中目标分子浓度的定量检测。
9.根据权利要求8所述的均相催化化学发光试剂盒的使用方法,其特征在于,所述步骤(1)中的反应温度为20℃~50℃,时间为3~30分钟;
所述步骤(3)中使用发光检测仪读取所述化学发光的发光信号的时间为1~5分钟;
所述步骤(3)中化学发光的发射波长为400 nm~2000 nm。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310863500.7A CN116577499B (zh) | 2023-07-14 | 2023-07-14 | 一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310863500.7A CN116577499B (zh) | 2023-07-14 | 2023-07-14 | 一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116577499A true CN116577499A (zh) | 2023-08-11 |
CN116577499B CN116577499B (zh) | 2023-09-19 |
Family
ID=87540037
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310863500.7A Active CN116577499B (zh) | 2023-07-14 | 2023-07-14 | 一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116577499B (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5340716A (en) * | 1991-06-20 | 1994-08-23 | Snytex (U.S.A.) Inc. | Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label |
US20050272108A1 (en) * | 2004-05-21 | 2005-12-08 | Bhanu Kalra | Stabilized two component system for chemiluminescent assay in immunodiagnostics |
US20160047816A1 (en) * | 2014-07-25 | 2016-02-18 | SeLux Diagnostics, Inc. | Assay methods involving dissociable nanoparticles |
CN108169497A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-06-15 | 北京科美生物技术有限公司 | 人泌乳素检测试剂盒及其制备方法与应用 |
CN112114130A (zh) * | 2019-06-21 | 2020-12-22 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 一种用于均相化学发光检测的受体试剂及其应用 |
-
2023
- 2023-07-14 CN CN202310863500.7A patent/CN116577499B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5340716A (en) * | 1991-06-20 | 1994-08-23 | Snytex (U.S.A.) Inc. | Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label |
US20050272108A1 (en) * | 2004-05-21 | 2005-12-08 | Bhanu Kalra | Stabilized two component system for chemiluminescent assay in immunodiagnostics |
US20160047816A1 (en) * | 2014-07-25 | 2016-02-18 | SeLux Diagnostics, Inc. | Assay methods involving dissociable nanoparticles |
CN108169497A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-06-15 | 北京科美生物技术有限公司 | 人泌乳素检测试剂盒及其制备方法与应用 |
CN112114130A (zh) * | 2019-06-21 | 2020-12-22 | 博阳生物科技(上海)有限公司 | 一种用于均相化学发光检测的受体试剂及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116577499B (zh) | 2023-09-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110220888B (zh) | 一种三联吡啶钌功能化mof的电化学发光传感器的制备方法 | |
Tiwari et al. | Recent advances and developments on integrating nanotechnology with chemiluminescence assays | |
Cheng et al. | Highly sensitive luminol electrochemiluminescence immunosensor based on ZnO nanoparticles and glucose oxidase decorated graphene for cancer biomarker detection | |
Ehsani et al. | Comparison of CuO nanoparticle and CuO/MWCNT nanocomposite for amplification of chemiluminescence immunoassay for detection of the hepatitis B surface antigen in biological samples | |
WO2019223692A1 (zh) | 一种化学发光分析测定方法及使用该方法的***、试剂盒 | |
Wang et al. | Highly sensitive rapid chemiluminescent immunoassay using the DNAzyme label for signal amplification | |
Liu et al. | A novel aptamer-mediated CuInS 2 quantum dots@ graphene oxide nanocomposites-based fluorescence “turn off–on” nanosensor for highly sensitive and selective detection of kanamycin | |
Huang et al. | A metal–organic framework nanomaterial as an ideal loading platform for ultrasensitive electrochemiluminescence immunoassays | |
CN116183901A (zh) | 一种基于环糊精-金刚烷化铱络合物主客体组装标记的蛋白标记物荧光检测方法 | |
CN116577499B (zh) | 一种均相催化化学发光试剂盒及其制备方法和使用方法 | |
CN112730338B (zh) | 一种基于Ag@Au的多孔结构的双信号纳米放大探针及其SPR免疫检测的方法 | |
CN113777297A (zh) | 一种基于磁性纳米颗粒的荧光差分快速检测方法 | |
CN111693721A (zh) | 基于普鲁士蓝纳米酶标记物的酶联免疫吸附实验的制备方法及应用 | |
CN113504371A (zh) | 基于环糊精包合的免分离化学发光免疫分析的方法 | |
CN105181956B (zh) | 基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用 | |
Syamila et al. | Bio-nanogate manipulation on electrode surface as an electrochemical immunosensing strategy for detecting anti-hepatitis B surface antigen | |
CN113109558A (zh) | 一种定量检测cyfra21-1的磁微粒化学发光试剂盒及其制作方法 | |
Lou et al. | Biocompatible protein nanogels as robust signal labels for persistent chemiluminescence immunoassays | |
WO2020252871A1 (zh) | 一种用于均相化学发光检测的受体试剂及其应用 | |
CN110514646B (zh) | 一种化学发光分析测定方法及使用该方法的***、试剂盒 | |
CN113125700B (zh) | 一种肌酸激酶同工酶的均相检测试剂盒及其应用 | |
CN112114131A (zh) | 一种均相化学发光检测方法及其应用 | |
CN113125703B (zh) | 一种肌红蛋白的均相检测试剂盒及其应用 | |
CN110514647B (zh) | 一种化学发光分析测定方法及使用该方法的***、试剂盒 | |
CN113125721B (zh) | 一种肌酸激酶同工酶的均相检测试剂盒及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |