CN116554330A - 一种抗人cd24工程抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗人CD24工程抗体及应用，该工程抗体包括重链可变区与轻链可变区；所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述的抗人CD24工程抗体具有生物学活性好的特点，可用于诊断自身免疫性疾病、CD24表达异常，也可用于治疗或预防卵巢癌和乳腺癌。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，尤其是涉及一种抗人CD24工程抗体及应用。
背景技术
卵巢癌和乳腺癌是引起女性癌症患者死亡的两大疾病，这两种癌症具有高转移率，且对抗PD-L1/PD-1免疫治疗的反应都比其他癌症弱，因此其靶向治疗对策较少。我们已经知道癌细胞通过“don't eat me”信号（包括CD47、PD-L1、B2M等）的高表达能够逃脱巨噬细胞的吞噬。而单克隆抗体可以结合它们表面这种抗吞噬信号，从而避免其逃脱巨噬细胞的吞噬。
在生理情况下，CD24分子仅在未成熟的B细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经细胞上低水平表达，当机体处于病理状态时，多数恶性肿瘤细胞的表面能检测到显著高水平表达的CD24分子，其表达水平与肿瘤发生密切相关，研究发现，CD24是卵巢癌和乳腺癌细胞表达的另一种“don't eat me”信号蛋白，能够与肿瘤相关的巨噬细胞上表达的抑制性受体Siglec-10相互作用，激活SHP-1/SHP-2介导的抑制性信号通路，抑制肿瘤细胞吞噬，从而发挥免疫逃逸作用，因此CD24抗体是开发卵巢癌或乳腺癌免疫疗法一个非常有前途的靶点。然而目前，CD24靶点药物的研究还存在很多不足，尚处于临床研究或药物发现阶段，对CD24工程抗体的研究越多，对未来医学的发展有深远意义。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种抗人CD24工程抗体及应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种抗人CD24工程抗体，该工程抗体包括重链可变区与轻链可变区；
所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的轻链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述的重链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的重链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示；所述的重链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述的重链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的轻链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的轻链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的轻链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述的轻链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的轻链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步，所述的工程抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明还提供了一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码所述的抗人CD24工程抗体。
进一步，所述的核苷酸分子编码所述的抗人CD24工程抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明还提供了一种表达载体，该表达载体包含所述的核苷酸分子。所述的表达载体为pcDNA3.4或Simple-T。
本发明还提供了所述的抗人CD24工程抗体的应用，所述的抗人CD24工程抗体在制备诊断自身免疫性疾病的试剂中的应用或在制备检测CD24的表达异常的试剂中的应用或在制备治疗卵巢癌、乳腺癌的药物中的应用。
进一步，所述的自身免疫性疾病为阵发性血红蛋白尿。
本发明还提供了所述的表达载体的应用，所述的表达载体在制备诊断自身免疫性疾病的试剂中的应用或在制备检测CD24的表达异常的试剂中的应用或在制备治疗卵巢癌、乳腺癌的药物中的应用；所述的自身免疫性疾病为阵发性血红蛋白尿。
本发明还提供了一种免疫检测试剂盒，该试剂盒含有所述的抗人CD24工程抗体和/或所述的表达载体。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
通过对抗人CD24-PE工抗体的活性测定，在0.125μg-0.5μg添加量下，发现CD24-PE在淋巴细胞和粒细胞活性仍然正常，表明本发明所述的抗人CD24工程抗体具有生物学活性好的特点，可用于诊断阵发性血红蛋白尿、CD24表达异常，也可用于治疗或预防卵巢癌和乳腺癌。
附图说明
图1为本发明实施例3所述的纯化产物的电泳图；
图2为本发明实施例5所述的CD24抗体的活性检测图：其中A图为粒细胞，B图为淋巴细胞；
图3为本发明实施例5所述的未封闭CD24抗体与鼠源CD24-PE抗体的竞争性免疫荧光抑制检测图：其中A图为粒细胞，B图为单核细胞；
图4为本发明实施例5所述的200μg封闭CD24抗体与鼠源CD24-PE抗体的竞争性免疫荧光抑制检测图：其中A图为粒细胞，B图为单核细胞；
图5为本发明实施例5所述的50μg封闭CD24抗体与鼠源CD24-PE抗体的竞争性免疫荧光抑制检测图：其中A图为粒细胞，B图为单核细胞；
图6为本发明实施例5所述的10μg封闭CD24抗体与鼠源CD24-PE抗体的竞争性免疫荧光抑制检测图：其中A图为粒细胞，B图为单核细胞；
图7为本发明实施例5所述的2.0μg封闭CD24抗体与鼠源CD24-PE抗体的竞争性免疫荧光抑制检测图：其中A图为粒细胞，B图为单核细胞；
图8为本发明实施例5所述的0.4μg封闭CD24抗体与鼠源CD24-PE抗体的竞争性免疫荧光抑制检测图：其中A图为粒细胞，B图为单核细胞；
图9为本发明实施例6所述的CD24-PE抗体的PNH检测结果：其中A图为使用量0.5μg/T， B图为使用量0.25μg/T， C图为使用量0.125μg/T。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 小鼠抗人CD24抗体的轻重链可变区基因克隆
1、RNA提取
采用Trizol一步法：（1）取杂交瘤细胞约1×106个，加入1ml Trizol，吹打混匀，室温静置 10 分钟；（2）加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温静置 2-3 分钟；（3）12000rpm，4℃，离心 15 分钟；（4）取上清，加入 0.5ml 异丙醇室温静置 15 分钟；（5）12000rpm，4℃，离心15 分钟；（6）弃上清，加入 1ml 75％的乙醇洗，7500rpm，4℃，离心 5分钟；（7）弃上清，沉淀晾干，加入 30μLDEPC 水溶解；
2、逆转录为 cDNA(40μl)
使用TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix forqPCR试剂盒进行逆转录反应，取总RNA 1.0 μg，TransScript All-in-one SuperMix forqPCR 4μl，gDNA remover 4μl，DEPC水补充至20μl，反应42℃，15min后，85℃孵育5min，于20℃保存；
3、PCR 扩增CD24抗体的轻重链可变区基因
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：设计通用简并引物：上游引物5’-GACATT GTG CTC ACC CAG WCT SMH-3’（SEQ ID NO:19），下游引物5’-CCG TTAGAT CTC CARBTT KGT SCS-3’（SEQ ID NO:20）；以cDNA 为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，55℃ 30秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
重链可变区基因 PCR 扩增反应体系 (50μl) ：上游引物 5’-CAG GTS MARCTGCAGSAG TCW GG-3’（SEQ ID NO:21）；下游引物 5’-TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC-3’（SEQ ID NO:22）；以 cDNA 为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5分钟 ；94℃，30 秒，55℃，30 秒，72℃，30 秒，共 35 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
4、测序载体的构建 ：pClone007 Blunt Simple Vector Kit购自擎科生物；将轻重链可变区基因PCR 产物回收，与 pClone007 Blunt Simple Vector载体连接后，按常规方法氯化钙转化，以 100μg/ml 氨苄浓度筛选阳性克隆，送测序，该基因完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列为抗体基因序列。分别命名为pClone007-VH及pClone007-VL。
实施例2 工程抗体表达载体pcDNA3.4-H和pcDNA3.4-L的构建
根据轻、重链可变区序列及构建载体pcDNA3.4的序列，设计并合成了用于扩增重链可变区的引物（PDH-F和PDH-R）、用于扩增轻链可变区的引物（PDL-F和PDL-R）、用于扩增重链载体的引物（ZTH-F和ZTH-R）和用于扩增轻链载体的引物（ZTL-F和ZTL-R）。
PDH-F：
5’-TTCCAGGTTCCACTGGTGACCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCA-3’（SEQ ID NO:23）；
PDH-R：
5’-GATGGGGGTGTCGTTTTGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC-3’ （SEQ ID NO:24）；
PDL-F：
5’-TTCCAGGTTCCACTGGTGACCAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCA-3’ （SEQ ID NO:25）；
PDL-R：
5’-ACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG-3’（SEQ ID NO:26）；
ZTH-F：
5’-GCCAAAACGACACCCCCA-3’（SEQ ID NO:27）；
ZTH-R：
5’-GTCACCAGTGGAACCTGGAACC-3’（SEQ ID NO:28）；
ZTL-F：
5’-GCTGATGCTGCACCAACTGTAT-3’（SEQ ID NO:29）；
ZTL-R：
5’-GTCACCAGTGGAACCTGGAACC-3’（SEQ ID NO:30）；
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：上游引物PDL-F；下游引物PDL-R；以pClone007-VL为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，58℃ 60秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟。
重链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：上游引物PDH-F；下游引物PDH-R；以pClone007-VH为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，58℃ 60秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟。
轻链线性化载体的扩增：上游引物ZTL-F；下游引物ZTL-R；以pcDNA-CD15-L(合成序列，含鼠IgG1恒定区核苷酸序列)为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，58℃ 60秒，72℃ 4 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10分钟；
将PCR产物分别回收，将回收轻链可变区PCR产物和重链可变区PCR产物分别与回收线性化载体产物使用重组酶进行重组，重组后转化DH5α克隆菌株，并挑取单菌落扩大培养，送样测序，测序正确的克隆用于转染CHO细胞。
重链线性化载体的扩增：上游引物ZTH-F；下游引物ZTH-R；以pcDNA-CD15-H(合成序列，含鼠IgG1恒定区核苷酸序列)为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为94℃ 5 分钟 ；94℃ 30 秒，58℃ 60秒，72℃ 4 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10分钟；
将PCR产物分别回收，将回收轻链可变区PCR产物和重链可变区PCR产物分别与回收线性化载体产物使用重组酶进行重组，重组后转化DH5α克隆菌株，并挑取单菌落扩大培养，送样测序，测序正确的克隆用于转染CHO细胞。
实施例3 抗人CD24工程抗体的表达、纯化
1、工程抗体 CD24抗体的表达
将准备好的CHO细胞从培养箱中取出，准备两支 15ml 无菌离心管，在其中一支中加入 5ml SPM培养基 和 100μg 无菌质粒 DNA(含轻链表达载体和重链表达载体)，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入 5ml SPM 和 320μl转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置5分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中震荡培养；第1天和第5天补加辅料，第12天收获细胞上清；
2、抗人CD24工程抗体的纯化
将上步收集的细胞上清使用Protein A亲和柱进行纯化，PBS平衡柱子后，上样，使用pH值为3.0的甘氨酸进行洗脱，洗脱纯抗使用G25柱置换溶液，将溶液置换为PBS，取样进行电泳测试，结果如图1所示，左侧为非还原电泳的测试结果，右侧为还原电泳的测试结果，SDS-PAGE鉴定显示在纯化产物中的重链和轻链条带的分子量大小和理论值符合。然后分装后于-20℃冻存。
实施例 4 抗人CD24工程抗体的PE标记
将抗人CD24工程抗体使用还原剂进行还原，将其与经过活化的PE混合均匀，25℃搅拌，反应1小时；再使用S200 increase纯化柱纯化，得到PE标记CD24工程抗体。
实施例 5 抗人CD24工程抗体的活性测定
1、正常人外周血检测
每管加入正常人抗凝外周血 100μl，分别加入不同量的工程抗体CD24和鼠源抗体CD24，室温避光孵育 30分钟；加入 2ml 溶血素室温避光反应 10 分钟后 1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；再加入 0.5μg APC 标记的鼠二抗，室温避光孵育 30 分钟；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入配套抗体CD45-PerCP和CD3-FITC，反应20分钟，加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 250μl PBS缓冲液，流式细胞仪检测。
2、竞争性免疫荧光抑制试验：
每管加入正常人抗凝外周血 100μl，加入不同量的抗人CD24工程抗体（200μg-0.4μg），室温避光孵育30分钟；加入 2ml 溶血素室温避光反应 10 分钟后 1000 转/分钟离心5 分钟，弃上清；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；再加入 0.2μg 鼠源CD24-PE，室温避光孵育 20 分钟；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 250μl PBS 缓冲液，流式细胞仪检测。
如图3-图8所示，经抗人CD24工程抗体竞争后，在抗体用量大于等于2μg时，鼠源CD24-PE与粒细胞结合的阳性率基本降低为0，与单核细胞、粒细胞反应时荧光强度明显下降，证明抗人CD24工程抗体可竞争性抑制鼠源CD24-PE与粒细胞的结合。
实施例6 PNH检测
每管加入PNH病人抗凝外周血 100μl，加入不同量的抗人CD24-PE工程抗体（0.5μg，0.25μg和0.125μg），再加入配套抗体CD45-PerCP，CD3-FITC室温避光孵育 20 分钟；加入2ml 溶血素室温避光反应 10 分钟后 1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 2ml 冷PBS 缓冲液，重悬，1000 转/分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 250μl PBS 缓冲液，流式细胞仪检测。
结果如图9所示，CD24-PE使用量在0.5μg/T，0.25μg/T和0.125μg/T时，PNH外周血中粒细胞分为明显的两群，符合PNH病人的指标。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗人CD24工程抗体，其特征在于：该工程抗体包括重链可变区与轻链可变区；
所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的轻链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的抗人CD24工程抗体，其特征在于：所述的重链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的重链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述的重链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述的重链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的轻链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的轻链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的轻链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述的轻链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的轻链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
3.根据权利要求1所述的抗人CD24工程抗体，其特征在于：所述的工程抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
4.一种核苷酸分子，其特征在于：该核苷酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗人CD24工程抗体。
5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于：所述的核苷酸分子编码所述的抗人CD24工程抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
6.一种表达载体，其特征在于：该表达载体包含权利要求4或5所述的核苷酸分子。
7.权利要求1-3中任一项所述的抗人CD24工程抗体的应用，其特征在于：所述的抗人CD24工程抗体在制备诊断自身免疫性疾病的试剂中的应用或在制备检测CD24的表达异常的试剂中的应用或在制备治疗卵巢癌、乳腺癌的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的抗人CD24工程抗体的应用，其特征在于：所述的自身免疫性疾病为阵发性血红蛋白尿。
9.权利要求6所述的表达载体的应用，其特征在于：所述的表达载体在制备诊断自身免疫性疾病的试剂中的应用或在制备检测CD24的表达异常的试剂中的应用或在制备治疗卵巢癌、乳腺癌的药物中的应用；所述的自身免疫性疾病为阵发性血红蛋白尿。
10.一种免疫检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1-3中任一项所述的抗人CD24工程抗体和/或权利要求6所述的表达载体。
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