CN116554321A - 一种znf165特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物与医药技术领域，特别涉及一种ZNF165特异性抗体。本发明的ZNF165特异性抗体对ZNF165具有极高的亲和力，其亲和力达到了市售抗体的2倍左右，并且对其他抗原具有较低的交叉反应性，具备优异的特异性和灵敏度，因而特别适合用于检测受试者中ZNF165的表达以及用于以ZNF165为靶点诊断或治疗ZNF165相关的癌症。

Description

一种ZNF165特异性抗体
技术领域
本发明涉及生物与医药技术领域，特别涉及一种ZNF165特异性抗体及其应用。
背景技术
ZNF165是含锌指转录因子的kruppel家族成员之一，其首先在睾丸中被发现。据报道，ZNF165与一系列癌症相关，例如肝癌(参考例如X-Y Dong等人，Zinc-finger proteinZNF165 is a novel cancer-testis antigen capable of eliciting antibodyresponse in hepatocellular carcinoma patients，British Journal of Cancer(2004)91,1566–1570)、三阴性乳腺癌(参考例如Zane A Gibbs等人，The testis protein ZNF165is a SMAD3 cofactor that coordinates oncogenic TGFb signaling in triple-negative breast cancer，eLife 2020；9:e57679.DOI:https://doi.org/10.7554/eLife.57679)以及膀胱移行细胞癌(P.K.Singh等人,“Frequent expression of zinc-finger protein ZNF165 in human urinary bladder transitional cell carcinoma,”Immunobiology,vol.220,no.1,pp.68–73,2015.)等等。这些研究的结果表明，ZNF165显著促进了相关肿瘤的生长。此外，ZNF165与SMAD3相关以调节转化生长因子β-(TGF-β-)依赖基因的转录。
然而，目前对于用于检测ZNF165的表达以及用于以ZNF165为靶点治疗ZNF165相关的癌症的诊断性或治疗性抗体的研究仍然相对匮乏。本领域对于对ZNF165具有高亲和力的抗体存在未满足的需求。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种对ZNF165具有高亲和力的抗体，其对ZNF165的亲和力达到了市售抗体的2倍左右，并且对其他抗原具有较低的交叉反应性。
在一个方面，本发明提供了一种ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一个实施方案中，所述重链可变区具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv或di-scFv。
在一个实施方案中，所述ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段为scFv。
在一个实施方案中，所述ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头。
在一个实施方案中，所述接头具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如本文所述的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如本文所述的表达载体。
在另一个方面，本发明提供了一种缀合物，其包含如本文所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段以及偶联部分。
在一个实施方案中，所述偶联部分选自选自蛋白标签，例如His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP；可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素；治疗剂，例如抗炎药物或免疫抑制剂；或，另外的生物活性多肽。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、宿主细胞或缀合物以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一个方面，本发明提供了如本文所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、宿主细胞或缀合物在制备用于检测样品中ZNF165的表达的试剂或预防和/或治疗与ZNF165相关的癌症的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述与ZNF165相关的癌症选自肝癌、三阴性乳腺癌或膀胱移行细胞癌。
定义
如本文中所使用的，术语“抗体”指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体，而且包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv片段、单链(例如scFv，di-scFv，(scFv)2)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)、以及包括抗体的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。本发明的抗体不受任何特定的产生抗体的方法限制。
如本文中所使用的，“抗原结合片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等，优选地为scFv。
术语“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子，其保留结合抗原的能力。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。如本文中所使用的，在scFv中使用的接头不受限制，其可以是本领域熟知用于在scFv中连接VH和VL的任何接头。作为一个实例，跨膜结构域可以具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号***进行定义，例如可按照Kabat编号***、Chothia编号***或IMGT编号***中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号***所定义的CDR。并且，不同编号***之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见MalmqvistM,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,AnnualRev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
在一些实施方案中，本发明还提供了如本文所述的ZNF165特异性抗体的变体，其与如本文所述的ZNF165特异性抗体的氨基酸序列的具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且基本保留了其所源自的抗体的生物学功能(例如特异性结合ZNF165的生物活性)。
更具体地，所述变体与如本文所述的ZNF165特异性抗体相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、至多5个或至多1个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或其他人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。宿主细胞可以包括免疫细胞。免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞或其任意组合。
将载体导入宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，与ZNF165高表达有关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有与ZNF165高表达有关的疾病。
如本文中使用的，术语“过表达ZNF165的癌症”和“ZNF165高表达有关的疾病”意指受试者的患病细胞例如癌细胞中ZNF165的表达量高于同一受试者的正常健康细胞中ZNF165的表达量。在一些情况下，“过表达ZNF165的癌症”和“ZNF165高表达有关的疾病”可以互换使用。在具体的实施方案中，例如，过表达ZNF165的癌症可以选自肝癌、三阴性乳腺癌或膀胱移行细胞癌。
发明的有益效果
如上文所述，Dong等人、Zane AGibbs等人和P.K.Singh等人,各自报道了ZNF165与一系列癌症相关，例如肝癌、三阴性乳腺癌以及膀胱移行细胞癌，这些研究的结果表明，ZNF165显著促进了相关肿瘤的生长。然而，目前市面上可获得的ZNF165抗体的亲和力以及特异性和灵敏度均较差，不能满足用于检测ZNF165的表达以及用于以ZNF165为靶点诊断或治疗ZNF165相关的癌症的应用。
本发明提供的ZNF165特异性抗体对ZNF165具有极高的亲和力，其亲和力达到了市售抗体的2倍左右，并且对其他抗原具有较低的交叉反应性，具备优异的特异性和灵敏度，因而特别适合用于检测受试者中ZNF165的表达以及用于以ZNF165为靶点诊断或治疗ZNF165相关的癌症。
附图说明
图1显示了实施例1中制备的ZNF165全长重组蛋白的SDS-PAGE鉴定结果。
图2显示了实施例1中免疫30天小鼠的血样的ELISA检测结果。
图3显示了实施例1中筛选得到的四种ZNF165特异性抗体的ELISA检测检测结果。图A：抗体亲和力验证；图B：抗体与其它抗原识别验证。PC＝阳性对照；NC＝阴性对照。
图4显示了ZNF165特异性抗体的蛋白质免疫印迹验证结果。PC＝阳性对照；NC＝阴性对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：ZNF165特异性抗体的筛选
ZNF165重组蛋白表达及纯化：从由吉凯基因定制的人源ZNF165基因CDS序列模板(SEQ ID NO：14)扩增全长ZNF165基因CDS序列(正向引物：GGTGGACAGCAAATGGGTCGCATGGCTACAGAACCAAAGAAA；反向引物：TGGTGCTCGAGTGCGGCCGCATTACATTAATAGGTTTTCCCT)，克隆至pET-28a载体(由兰州大学第二医院孙辉教授提供)，获得重组质粒pET-28a-ZNF165(全长)。将重组质粒转化至BL21感受态细胞，培养至OD600≈0.6-0.8后IPTG诱导蛋白表达。超声破碎菌体，收集包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、透析复性以及Ni-NTA蛋白纯化，获得ZNF165重组蛋白，对其进行SDS-PAGE鉴定，结果显示成功获得了ZNF165全长重组蛋白(图1)。
小鼠免疫：取200μg纯化的经BCA定量的ZNF165重组蛋白(加入适量天然免疫佐剂，终浓度为1mg/mL)，通过腹腔注射进行第一次小鼠免疫。14天后用100μg ZNF165全长重组蛋白进行二次免疫，免疫28天后用50μg ZNF165全长重组蛋白进行第三次免疫，免疫总时间42天，免疫方法同前。取免疫30天小鼠血样进行ELISA检测以测定血清抗体效价。如图2所示，腹腔免疫有效刺激小鼠产生抗体。
微流控分选构建阳性B细胞库：将免疫完成后的小鼠处死后取小鼠脾脏，利用磁珠分选技术富集分离B淋巴细胞，基于微流体技术富集及分离表达高亲和力抗体的阳性B细胞。
筛选高亲和力和高特异性ZNF165 scFv：基于自主优化的单细胞反转录技术对富集的阳性B细胞的mRNA进行反转录，结合巢式PCR、温度梯度PCR及降落PCR技术扩增B细胞的抗体可变区序列，并将抗体序列克隆至Lenti-cmv-DP3展示载体，完成scFv文库的制备。采用慢病毒包装体系将上述ZNF165抗体序列质粒包装进293T细胞中，从而获得ZNF165单链抗体细胞展示库。基于流式细胞术检测手段及酶联免疫吸附测定法，分别筛选出ZNF165的高亲和力、高特异性抗体序列4个，根据亲和力从大到小依次克隆号为A6、C4、D8、F9。其中克隆A6的亲和力最高，其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
实施例2：ZNF165特异性抗体的制备
(1)细胞复苏：从液氮中取出冻存的293F细胞后立刻放入37℃水浴锅中待其快速解冻，离心(1000rpm、4℃、5min)后弃去上清用1mL SMM 293-TII重悬细胞，将细胞悬液移至T125mL培养瓶并加入适量的新鲜SMM 293-TII培养基，置于37℃，8％ CO2，110rpm转速的恒温摇床中培养。
(2)细胞传代：依据细胞生长情况及时换液，计数调整细胞密度并观察细胞活率，将细胞以8.0×105个细胞/mL的密度接种到含有新鲜SMM 293-TII培养基的T125mL培养瓶中，将培养瓶置于37℃，8％CO2，110rpm转速的恒温摇床中培养，待细胞传代至P3代后，用新鲜培养基调整细胞密度约为1-2×106个细胞/mL，准备进行瞬时转染；
(3)瞬时转染：将实施例1中鉴定的抗体A6的核苷酸序列克隆至HZ002表达载体(由兰州大学第二医院孙辉教授提供)，瞬时转染至293F细胞中；
(4)在转染后第20小时逐滴加入VPA，第24小时逐滴加入SMS 293-SUPI加料液，滴加的同时轻轻摇动培养瓶使其充分混匀；
(5)收获上清：转染后第5天收取细胞表达上清液，上清液4500rmp离心15min，后经0.45μm滤膜过滤，4℃保存下滤液并准备进行纯化；
(6)抗体纯化：
①将1mL Protein A HP柱子连接至纯化泵并设置流速约1mL/min；
②用20mL洗脱缓冲液洗涤纯化柱，弃去洗涤液；
③用20mL结合缓冲液洗涤纯化柱，弃去洗涤液；
④将进液管放在(5)中收集的下滤液中,流经纯化柱后收集滤液，重复此步骤将收集到的滤液过第二遍纯化柱；
⑤用20mL结合缓冲液洗涤纯化柱，并用考马斯亮蓝检测洗涤液中是否存在杂蛋白(确保非特异性结合的蛋白在此步骤中完全洗脱)，弃去洗涤液；
⑥用洗脱缓冲液以1mL/min流速缓慢流过纯化柱并收集洗脱液，在洗脱过程中，使用考马斯亮蓝试剂监测洗脱液中的蛋白浓度，确保将目的抗体蛋白质完全洗脱，最后将收集到的所有洗脱液按10：1添加中和缓冲液并进行超滤浓缩，测浓缩液浓度，标记后取部分抗体浓缩液行验证，其余-20℃冰箱保存。
实施例2：ELISA检测ZNF165特异性抗体与ZNF165重组蛋白的结合
(1)抗原包被：用1×碳酸盐包被缓冲液(Na2CO3(1.59g)+NaHCO3(2.93g)，调节pH值后定容至50mL)稀释抗原(实施例1制备的ZNF165重组蛋白)至10μg/mL，取50μL稀释后的抗原以0.5μg/200μL包被96孔板(设置阳性对照组、阴性对照组及实验组，每组3个复孔)；
(2)封闭：吸弃孔中液体，洗涤缓冲液(1×PBS中加入Tween-20配成0.05％溶液)洗涤3次，每孔加入100μL封闭液(脱脂奶粉(1g)+1×TBST(20mL))，37℃孵育1h；
(3)待测抗体孵育：96孔板置于洗板机中洗涤5次，按不同分组加入待测抗体，37℃放置1h，弃去孔中液体，使用洗涤缓冲液摇床洗涤3min，重复洗涤三次；
(6)酶标二抗孵育：96孔板每孔加入100μL稀释好的酶标二抗(1：5000稀释)，37℃避光孵育30min；
(7)显色：96孔板置于洗板机中洗涤6-7次，每孔加入100TMB显色液，此时孔中液体变为蓝色，37℃避光显色5-15min；
(8)检测吸光值：每孔加入50μL终止液(孔中液体变为黄色)，酶标仪450nm检测吸光值。
结果如图3A所示，结果显示实施例1筛选得到的抗体A6、C4、D8、F9均具有较高的亲和力(C4、D8、F9的制备与验证同A6)，达到了市售ZNF165单克隆抗体的亲和力的2倍左右，其中抗体A6的亲和力最高。还通过ELISA检测了抗体能否对其它抗原进行识别，结果显示抗体A6、C4、D8、F9均不能识别其他的抗原，具有良好的特异性，其中抗体A6的特异性最高(图3B)。
实施例3：蛋白质免疫印迹验证ZNF165特异性抗体与ZNF165蛋白的结合
(1)过表达ZNF165蛋白细胞获取：使用引物(正向：CCAGATTACGCTGCTCAGCGCATGGCTACAGAACCAAAGAAA；反向：TAGAAGACTTCCTCTGCCCTCCATTAATAGGTTTTCCCTCAT)扩增ZNF165全长序列，克隆至PRK5载体(由兰州大学第二医院孙辉教授提供)中，瞬时转染293T细胞，10％FBS DMEM培养基维持培养。
(2)细胞总蛋白提取：
①将转染后处于生长对数期的细胞从培养箱取出，弃去皿中培养基，加入1ml预冷的1×PBS清洗2遍；
②小心吸干清洗液后加入RIPA裂解液(购自北京索莱宝公司)，不断晃动培养皿使其均匀覆盖细胞表面，4℃放置30min使其充***解；
③裂解完成后用细胞刮刀收集细胞裂解物并转移至新EP管中；
④反复抽吸EP管中裂解产物使蛋白析出，后离心(4℃，14000rpm，5min)，将上清移至新1.5mL EP管中(以上操作均需在冰上完成)；
⑤将所提蛋白按体积加入5×蛋白上样缓冲液(购自北京索莱宝公司)，混匀后100℃，5min金属浴制样后置于-80℃冰箱冻存。
(2)蛋白质免疫印迹(Western-blot，WB)：
①组装制胶板中，加超纯水检测密封性；
②配制分离胶及浓缩胶后***梳子，室温放置30min后将胶板置于4℃冰箱过夜；
③将胶板安装至电泳仪中并添加配置好的电泳液，在孔中加入蛋白标记(购自Bioshirp)和(1)中提取的蛋白；
④打开电泳仪，80V 30min后转120V恒压60min，期间预估条带大小并剪接相应大小的PVDF膜，放入甲醇中活化30s后放入纯水中备用；
⑤电泳结束后从胶板中将胶取出，依据目的蛋白和内参蛋白的分子量条带裁胶，将裁剪的胶条置于电转夹滤纸上，其上覆盖已活化的PVDF膜，尽量排尽空气后夹紧电转夹，按正负极将电转夹放入转膜盒子中，加入电转液后盖上盖子，并在转膜盒周围覆盖适当冰袋；
⑥250mA转膜70分钟；
⑦电转结束将PVDF膜置于封闭液中，室温摇床封闭1小时，1×TBST(购自北京索莱宝公司)洗1次，5min；
⑧将PVDF膜取出放入已纯化的ZNF165特异性抗体A6中，充分浸没，4℃摇床过夜；
⑨取出孵育完抗体的PVDF膜，1×TBST洗涤3次，每次6min
⑩洗涤结束后将PVDF膜转入二抗中，室温摇床孵育1h，1×TBST洗涤3次，每次6min。使用ECL化学发光液(购自Pierce)对PVDF膜进行显色，使用化学发光荧光成像仪对PVDF膜进行成像。
结果如图4所示，结果显示本发明的ZNF165抗体可以以很高的特异性及敏感度结合ZNF165蛋白，而不结合293T细胞中表达的其他蛋白。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施方案”、“具体实施方案”、“实例”等的描述意指结合该实施方案或实例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施方案或实例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方案或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施实施方案或实例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施方案做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：1、2和3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，和所述轻链可变区具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv或di-scFv，
优选地，所述ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段为scFv。
4.根据权利要求3所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段，其还包含连接所述重链可变区和所述轻链可变区的接头，
优选地，所述接头具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，
优选地，所述ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
5.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
6.一种表达载体，其包含根据权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其包含根据权利要求6所述的表达载体。
8.一种缀合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段以及偶联部分，
优选地，所述偶联部分选自选自蛋白标签，例如His、Flag、GST、MBP、HA、Myc、GFP；可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素；治疗剂，例如抗炎药物或免疫抑制剂；或，另外的生物活性多肽。
9.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求5所述的核酸分子、根据权利要求6所述的表达载体、根据权利要求7所述的宿主细胞或根据权利要求8所述的缀合物以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的ZNF165特异性抗体或其抗原结合片段、根据权利要求5所述的核酸分子、根据权利要求6所述的表达载体、根据权利要求7所述的宿主细胞或根据权利要求8所述的缀合物在制备用于检测样品中ZNF165的表达的试剂或预防和/或治疗与ZNF165相关的癌症的药物中的用途，
优选地，所述与ZNF165相关的癌症选自肝癌、三阴性乳腺癌或膀胱移行细胞癌。
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