CN116554046B - 一种可离子化脂质化合物及其脂质纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新的可离子化脂质化合物，丰富了可离子化脂质化合物种类，为提供新的疫苗或药物，如溶瘤病毒药物、新型冠状病毒疫苗或药物、细胞转染试剂提供了更多的选择，其形成的脂质纳米颗粒大小均匀、稳定性好、包封效率高、递送效率高且毒性低，对溶瘤病毒药物、新型冠状病毒疫苗或药物、细胞转染试剂及抗肿瘤药物等领域的发展和应用具有重要的意义。

Description

一种可离子化脂质化合物及其脂质纳米颗粒
技术领域
本发明属于生物医药和生物技术领域，特别涉及一种可离子化脂质化合物及其脂质纳米颗粒。
背景技术
外源生物分子和一些药物分子很难穿透细胞膜到达细胞质达到治疗效果，如mRNA是一类高负电荷的生物分子，必须克服细胞膜的屏障，才能翻译成蛋白发挥生物功能，因此，这类生物分子的治疗应用在体内高效递送是一重要挑战。
脂质纳米颗粒(LNP)是一新型的核酸生物分子递送技术，LNP为核酸生物分子提供了保护外壳，以mRNA为例，LNP既可以保护mRNA不被RNA酶分解，又可保护mRNA分子不被TLRs识别，避免先天免疫***的过度激活的作用；LNP因作为COVID-19mRNA疫苗递送平台的巨大成功而备受关注。
可离子化脂质化合物能够影响LNP的整体配方和生物学特性，是LNP中的关键组分，可与mRNA自组装成病毒大小的颗粒，并可将mRNA从内涵体释放到细胞质中，达到治疗或免疫效果。
在过去的50年里，大量的***性研究致力于设计理想的可离子化脂质化合物，其中一些可离子化脂质化合物已被FDA批准用于核酸分子的递送，如可离子化脂质化合物DLin-MC3-DMA、SM-102与ALC-0315。
然而，还需要大量的研究设计能够高效递送不同类型核酸分子的低毒可离子化脂质化合物。
发明内容
为了解决上述技术问题，发现新颖的、高递送效率和低毒的可离子化脂质化合物，第一方面，本发明提供了一种可离子化脂质化合物，包括乙醇胺头基、一条溴代酸酯分叉尾链与另一条溴代酸酯直尾链或分叉尾链，所述的可离子化脂质化合物为如下结构式所示化合物中的一种或多种：
第二方面，本发明提供了第一方面可离子化脂质化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、第一条溴代酸酯分叉尾链的制备：溴代酸与醇在催化剂的作用下发生缩合反应形成酯键得到第一条溴代酸酯分叉尾链；
S2、取代的((2-羟乙基)氨基)酸酯的制备：乙醇胺头基与S1中得到的第一条溴代酸酯分叉尾链在高温常压下发生SN2亲核取代，将乙醇胺头基与第一条溴代酸酯分叉尾链连接起来得到取代的((2-羟乙基)氨基)酸酯；
S3、第二条溴代酸酯直尾链或分叉尾链的制备：溴代酸与醇在催化剂的作用下发生缩合反应形成酯键得到第二条溴代酸酯直尾链或分叉尾链；
S4、将S2中制备的取代的((2-羟乙基)氨基)酸酯与S3中制备的第二条溴代酸酯直尾链或分叉尾链在高温常压下发生SN2亲核取代反应得到所述的可离子化脂质化合物。
第三方面，本发明在第一方面可离子化脂质化合物的基础上，提供了一种脂质纳米颗粒，所述的脂质纳米颗粒包括第一方面所述的可离子化脂质化合物。
所述的脂质纳米颗粒还包括核酸分子与辅助分子；所述核酸分子包括RNA、mRNA、siRNA、DNA中的一种或多种；所述辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇及1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000的至少一种或多种；
在一些实施例中，所述核酸分子为RNA病毒全基因组RNA正链或RNA病毒全基因组RNA负链或Fluc-mRNA或新型冠状病毒刺突蛋白mRNA或DNA病毒全基因组核酸DNA或II型单纯疱疹病毒gD包膜糖蛋白mRNA中的一种；
在一些实施例中，所述可离子化脂质化合物和辅助分子的摩尔比例是可离子化脂质化合物：二硬脂酰磷脂酰胆碱：胆固醇：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000为50：10：38.5：1.5；
优选的，所述脂质纳米颗粒的粒径为60～100nm。
所述脂质纳米颗粒能够将核酸分子递送至肝脏或脾脏。
第四方面，本发明提供了一种具有溶瘤活性的脂质纳米颗粒，包括第一方面所述的可离子化脂质化合物与第三方面所述的RNA病毒全基因组RNA正链或RNA病毒全基因组RNA负链或DNA病毒全基因组核酸DNA或II型单纯疱疹病毒gD包膜糖蛋白mRNA，形成具有溶瘤活性的脂质纳米颗粒。
第五方面，本发明提供了一种脂质纳米颗粒的制备方法，用于制备第三方面所述的脂质纳米颗粒，包括如下步骤：
S5、脂质体原料溶液的制备：将可离子化脂质化合物与辅助分子按照可离子化脂质化合物：二硬脂酰磷脂酰胆碱：胆固醇：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000为50：10：38.5：1.5的摩尔比例进行溶解混合；
S6、核酸制剂的制备：将第三方面所述的核酸分子溶解在pH4.0～6.0的20～30mM的醋酸钠缓冲液中，核酸分子的浓度约为0.06mg/mL～0.15mg/mL；
S7、脂质纳米颗粒的制备：将S5中制备的脂质体原料溶液和S6中制备的核酸制剂快速混匀，形成均一稳定的脂质纳米颗粒；脂质体原料溶液与核酸制剂的体积比为2：1～6：1；脂质体原料溶液与核酸制剂的混匀总速率为8～20mL/min；
S8、脂质纳米颗粒pH环境的转变：快速地将脂质纳米颗粒的溶液环境从S6中pH4.0～6.0转变成pH7.0～7.4；将转变成pH7.0～7.4的脂质纳米颗粒浓缩至200～400mM。
优选的，在一些实施例中，S6核酸制剂的制备中pH值为5.0；醋酸钠缓冲液的浓度为25mM；核酸分子的浓度为0.1mg/ml。
优选的，在一些实施中，S7中脂质体原料溶液与核酸制剂的体积比为4：1；脂质体原料溶液与核酸制剂的混匀总速率为12mL/min。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的可离子化脂质化合物在制备细胞转染试剂、新型冠状病毒疫苗或药物、溶瘤病毒药物或抗肿瘤药物中的应用。
第七方面，本发明提供了第三方面所述的脂质纳米颗粒在制备细胞转染试剂、新型冠状病毒疫苗或药物、溶瘤病毒药物或抗肿瘤药物中的应用。
第八方面，本发明提供了一种疫苗或药物，所述疫苗或药物包括第一方面所述的可离子化脂质化合物。
所述疫苗或药物为注射剂；通过局部肌肉、皮下、内皮、瘤内注射、灌注方式或静脉注射方式给药。
在一些实施例中，优选的，所述的给药方式为通过局部肌肉或静脉注射方式给药。
第九方面，本发明提供了一种溶瘤病毒药物，包括第四方面所述的具有溶瘤活性的脂质纳米颗粒。
第十方面，本发明提供了一种新型冠状病毒疫苗或药物，包括第一方面所述的可离子化脂质化合物与新型冠状病毒刺突蛋白mRNA；所述可离子化脂质化合物与辅助分子包封新型冠状病毒刺突蛋白mRNA。
第十一方面，本发明提供了一种细胞转染试剂，所述细胞转染试剂包括第一方面所述的可离子化脂质化合物与Fluc-mRNA；所述可离子化脂质化合物与辅助分子包Fluc-mRNA。
本发明提供了一种新的可离子化脂质化合物，丰富了可离子化脂质化合物种类，为提供新的疫苗或药物，如溶瘤病毒药物、新型冠状病毒疫苗或药物、细胞转染试剂提供了更多的选择，其形成的脂质纳米颗粒大小均匀、稳定性好、包封效率高、递送效率高且毒性低，对溶瘤病毒药物、新型冠状病毒疫苗或药物、细胞转染试剂及抗肿瘤药物等领域的发展和应用具有重要的意义。
本发明提供的包括所述可离子化脂质化合物的脂质纳米颗粒，可通过局部肌肉、皮下、内皮、瘤内以及灌注等多种给药方式，还可通过静脉注射等全身给药方式，将核酸分子如Fluc-mRNA或新型冠状病毒刺突蛋白mRNA或II型单纯疱疹病毒gD包膜糖蛋白mRNA递送到体内，甚至可以靶向肝脏或脾脏，在体内细胞中有效表达治疗性蛋白药物或抗原，起到预防或治疗疾病的作用。此外，本发明的脂质纳米颗粒适合于递送核酸分子如新型冠状病毒刺突蛋白mRNA进入体内行使预防性或治疗性疫苗的功能。
附图说明
以下将结合附图和优选实施例来对本公开进行进一步详细描述，但是本领域技术人员将领会的是，这些附图仅是出于解释优选实施例的目的而绘制的，并且因此不应当作为对本公开范围的限制。此外，除非特别指出，附图仅示意在概念性地表示所描述对象的组成或构造并可能包含夸张性显示，并且附图也并非一定按比例绘制。
图1化合物十七烷-9-基8-((2-羟乙基)6-(((9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基)氧)6-氧乙基)氨基)辛酸酯的氢谱图；
图2化合物十七烷-9-基8-((2-羟乙基)6-(((9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基)氧)6-氧乙基)氨基)辛酸酯的碳谱图；
图3化合物十七烷-9-基8-((2-羟乙基)6-(((9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基)氧)6-氧乙基)氨基)辛酸酯的质谱图；
图4化合物十七烷-9-基8-((3-((6-(庚酰氧基)己基)氧基)-3-氧代丙基)(2-羟乙基)氨基)辛酸酯的氢谱图；
图5化合物十七烷-9-基8-((3-((6-(庚酰氧基)己基)氧基)-3-氧代丙基)(2-羟乙基)氨基)辛酸酯的碳谱图；
图6化合物十七烷-9-基8-((3-((6-(庚酰氧基)己基)氧基)-3-氧代丙基)(2-羟乙基)氨基)辛酸酯的质谱图；
图7化合物十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(8-((2-辛基十二烷基)氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸酯的氢谱；
图8化合物十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(8-((2-辛基十二烷基)氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸酯的碳谱；
图9体内转染实验活体成像图；
图10体内分布实验荧光表达图；
图11荧光表达持续性实验图；
图12脂质纳米颗粒免疫C57BL/6小鼠酶联免疫吸附实验ELISA检测图；
图13脂质纳米颗粒免疫C57BL/6小鼠中和抗体滴度检测结果图；
图14脂质纳米颗粒免疫C57BL/6小鼠酶联免疫斑点实验ELIspot斑点图；
图15Lipid-VI-SδT-mRNA免疫C57BL/6小鼠ELISA检测IgG抗体图；
图16Lipid-VI-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠ELISA检测IgG抗体图；
图17Lipid-VI-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠ELISpot斑点检测图；
图18Lipid-12-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠ELISA检测IgG抗体图；
图19Lipid-12-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠ELISpot斑点检测图；
图20脂质纳米颗粒LNP-SδT-mRNA的毒性实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图1至20，对本公开作详细的说明。
为了使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本公开进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本公开，并不用于限定本公开。
实施例1可离子化脂质化合物Lipid-VI的制备
首先8-溴辛酸与十七烷-9-醇在催化剂的作用下发生缩合反应形成酯键得到第一条分叉尾链十七烷-9-基8-溴辛酸酯。其次，头基乙醇胺与十七烷-9-基8-溴辛酸酯在高温常压下发生SN2亲核取代，将头基与分叉尾链连接起来得到十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯，与此同时，6-溴己酸与亚麻醇发生缩合反应形成酯键得到第二条直尾链[(9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基]6-溴己酸酯。最后将连有头基的分叉尾链与直尾链在高温常压下发生SN2亲核取代反应得到Lipid-VI。
可离子化脂质化合物Lipid-VI的合成路线：
步骤1：十七烷-9-基8-溴辛酸酯的合成
将8-溴辛酸(1eq.)与十七烷-9-醇(1.3eq.)加入25ml圆底烧瓶中，加入5ml二氯甲烷(DCM)，并依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)(1.3eq.)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.2eq.)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(4eq.)，室温反应42h。反应结束后真空减压蒸发溶剂，用乙酸乙酯稀释后，将有机相用饱和碳酸氢钠萃取2～3遍，再用饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相用无水Na2SO4干燥，真空减压蒸发得到粗产物，石油醚：乙酸乙酯＝10:1TLC板检测，Rf＝0.7。石油醚：乙酸乙酯＝150:1过硅胶柱分离纯化，得到无色油状物，收率50～65％。化合物十七烷-9-基8-溴辛酸酯的氢谱、碳谱和质谱数据如下所示：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.87(dd,J＝6.3Hz,1H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H),1.90–1.80(m,2H),1.62(dd,J＝9.7,4.7Hz,2H),1.51(d,J＝5.6Hz,4H),1.46–1.39(m,2H),1.38–1.18(m,30H),0.88(t,J＝6.8Hz,6H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.50,74.17,34.63,34.16,33.73,32.73,31.85,29.53,29.49,29.22,28.95,28.42,28.00,25.32,25.01,22.64,14.06.
MS(ESI):483.3(C25H49BrO2,M+Na+)
步骤2：十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯的合成
将十七烷-9-基8-溴辛酸酯(1eq.)与乙醇胺(20eq.)加入10ml圆底烧瓶中，加入2ml乙醇，62℃反应48h。反应结束后冷却至室温，真空减压蒸发溶剂，用乙酸乙酯稀释后，将有机相用水萃取2～3遍，再用饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相用无水Na2SO4干燥，真空减压蒸发得到粗产物，二氯甲烷：甲醇＝10:1TLC板检测，Rf＝0.5。硅胶柱分离纯化，甲醇：二氯甲烷＝1～10％梯度洗脱，得到淡黄色油状物，收率30～40％。化合物十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯的氢谱、碳谱和质谱数据如下所示：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.82–0.93(t,J＝6.7Hz,6H),1.21–1.29(m,30H),1.33–1.36(d,J＝3.7Hz,4H),1.45–1.56(d,J＝6.1Hz,4H),2.22–2.34(t,J＝7.5Hz,2H),2.78–2.89(m,2H),2.93–3.03(t,J＝5.0Hz,2H),3.78–3.89(t,J＝5.0Hz,2H),4.81–4.91(m,1H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.55,74.20,58.75,58.20,50.57,48.74,34.58,34.10,31.82,29.65,29.49,29.45,29.19,28.98,28.87,27.52,26.74,25.28,24.95,22.61,18.33,14.03。
MS(ESI):442.4(C27H55NO3,M+H+)。
步骤3：[(9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基]6-溴己酸酯的合成
将6-溴己酸(1eq.)与亚麻醇(1.3eq.)加入25ml圆底烧瓶中，加入5ml二氯甲烷(DCM)，并依次加入EDCI(1.3eq.)、DMAP(0.2eq.)、DIPEA(4eq.)，室温反应42h。反应结束后真空减压蒸发溶剂，用乙酸乙酯稀释后，将有机相用饱和碳酸氢钠萃取2～3遍，再用饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相用无水Na2SO4干燥，真空减压蒸发得到粗产物，石油醚：乙酸乙酯＝10:1TLC板检测，Rf＝0.7。石油醚：乙酸乙酯＝150:1过硅胶柱分离纯化，得到无色油状物，收率50～60％。
化合物[(9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基]6-溴己酸酯的合成氢谱、碳谱、质谱数据如下所示：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.85–0.93(t,J＝6.7Hz,3H),1.26–1.39(m,16H),1.43–1.53(m,2H),1.59–1.69(dd,J＝7.9,15.5Hz,4H),1.73–1.94(dt,J＝7.4,34.3Hz,2H),1.95–2.13(d,J＝6.9Hz,4H),2.24–2.38(t,J＝7.4Hz,2H),2.72–2.83(t,J＝6.4Hz,2H),3.35–3.45(t,J＝6.7Hz,1H),3.49–3.59(t,J＝6.7Hz,1H),4.01–4.12(t,J＝6.7Hz,2H),5.31–5.43(m,4H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.49,130.06,127.93,64.50,44.70,34.10,33.36,32.41,31.52,29.63,29.40,29.34,29.21,28.65,27.67,27.21,26.40,25.93,25.64,24.13,22.55,14.03。
MS(ESI):465.2(C24H43BrO2,M+Na+)。
步骤4：可离子化脂质化合物Lipid-VI—十七烷-9-基8-((2-羟乙基)6-(((9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基)氧)6-氧乙基)氨基)辛酸酯的合成
将十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯(1eq.)与[(9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基]6-溴己酸酯(1.2eq.)加入10ml圆底烧瓶中，加入DIPEA(1.2eq.)和2ml乙醇，65℃反应48h。反应结束后冷却至室温，真空减压蒸发溶剂，用乙酸乙酯稀释后，将有机相用水萃取2～3遍，再用饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相用无水Na2SO4干燥，真空减压蒸发得到粗产物，二氯甲烷：甲醇＝10:1TLC板检测，Rf＝0.6。硅胶柱分离纯化，甲醇：二氯甲烷＝1～10％梯度洗脱，得到淡黄色油状物，收率25～30％。化合物十七烷-9-基8-((2-羟乙基)6-(((9顺,12顺)-十八碳二烯-1-基)氧)6-氧乙基)氨基)辛酸酯的合成氢谱见图1，碳谱见图2，质谱见图3。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.82–0.94(t,J＝6.2Hz,9H),1.16–1.40(m,50H),1.44–1.53(m,7H),1.56–1.69(dd,J＝4.8,11.1Hz,6H),2.00–2.10(q,J＝6.8Hz,4H),2.24–2.35(dt,J＝7.5,9.3Hz,4H),2.43–2.52(dt,J＝5.1,8.1Hz,4H),2.57–2.66(t,J＝5.3Hz,2H),2.72–2.83(t,J＝6.4Hz,2H),3.49–3.59(t,J＝5.3Hz,2H),4.01–4.09(t,J＝6.8Hz,2H),4.82–4.91(m,1H),5.31–5.42(tt,J＝6.2,11.3Hz,4H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ173.56,130.19,128.03,74.12,64.44,58.31,55.70,53.93,53.75,34.67,34.25,34.14,31.84,31.52,29.63,29.52,29.48,29.40,29.33,29.21,28.66,27.20,26.92,25.92,25.63,25.30,25.09,24.84,22.64,22.55,14.06。
MS(ESI):804.7(C51H97NO5,M+H+)。
实施例2可离子化脂质化合物Lipid-12的制备
首先8-溴辛酸与十七烷-9-醇在催化剂的作用下发生缩合反应形成酯键得到第一条分叉尾链十七烷-9-基8-溴辛酸酯。其次，头基乙醇胺与十七烷-9-基8-溴辛酸酯在高温常压下发生SN2亲核取代，将头基与分叉尾链连接起来得到十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯，与此同时，6-溴己酸与油醇发生缩合反应形成酯键得到第二条直尾链[(9顺)-十九碳烯-1-基]6-溴己酸酯。最后将连有头基的分叉尾链与直尾链在高温常压下发生SN2亲核取代反应得到Lipid-12。
步骤1：十七烷-9-基8-溴辛酸酯的合成
十七烷-9-基8-溴辛酸酯的合成参见实施例1Lipid-VI的步骤1。
步骤2：十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯的合成
十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯的合成参见实施例1Lipid-VI的步骤2。
步骤3：[(9顺)-十九碳烯-1-基]6-溴己酸酯的合成
将6-溴己酸(1eq.)与油醇(1.3eq.)加入25ml圆底烧瓶中，加入5ml二氯甲烷(DCM)，并依次加入EDCI(1.3eq.)、DMAP(0.2eq.)、DIPEA(4eq.)，室温反应42h。反应结束后真空减压蒸发溶剂，用乙酸乙酯稀释后，将有机相用饱和碳酸氢钠萃取2～3遍，再用饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相用无水Na2SO4干燥，真空减压蒸发得到粗产物，石油醚：乙酸乙酯＝10:1TLC板检测，Rf＝0.7。石油醚：乙酸乙酯＝150:1过硅胶柱分离纯化，得到无色油状物，收率50～65％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.89～0.96(t,3H),1.26～1.38(m,26H),1.541.57(d,2H),1.66～1.69(d,2H),1.78～1.80(d,2H),1.94～1.97(dd,4H),2.23～2.25(d,2H),3.30～3.31(d,2H),4.06～4.08(d,2H),5.42(s,1H),5.44(s,1H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.11,131.65,131.57,66.81,33.82,33.71,33.02,32.54,30.48,30.46,30.42,30.41,30.33,30.32,30.31,30.05,30.03,29.89,28.13,27.33,27.29,26.52,24.41,23.17,14.02。
MS(ESI):482.5(C25H47BrO2，M+Na+)。
步骤4：Lipid-12-(十七烷-9-基)顺-8-((2-羟乙基)(6-(十九碳烯-1-基)氧)-6-氧乙基)氨基)辛酸酯的合成
将十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯(1eq.)与[(9顺)-十九碳烯-1-基]6-溴己酸酯的合成(1.2eq.)加入10ml圆底烧瓶中，加入DIPEA(1.2eq.)和2ml乙醇，65℃反应48h。反应结束后冷却至室温，真空减压蒸发溶剂，用乙酸乙酯稀释后，将有机相用水萃取2～3遍，再用饱和氯化钠溶液洗涤，收集有机相用无水Na2SO4干燥，真空减压蒸发得到粗产物，二氯甲烷：甲醇＝10:1TLC板检测，Rf＝0.5。硅胶柱分离纯化，甲醇：二氯甲烷＝1～10％梯度洗脱，得到淡黄色油状物，收率25～30％。Lipid-12-(十七烷-9-基)顺-8-((2-羟乙基)(6-(十九碳烯-1-基)氧)-6-氧乙基)氨基)辛酸酯的氢谱、碳谱、质谱数据如下所述：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.90～0.98(ddd,9H),1.26～1.40(m,60H),1.53～1.58(m,6H),1.66～1.70(dd,4H),1.96～1.98(dd,4H),2.14(s,1H),2.24～2.25(dd,4H),2.35～2.38(dt,4H),2.55～2.56(d,2H),3.62～3.64(d,2H),3.94(s,1H),4.07～4.10(d,2H),5.40(s,1H),5.42(s,1H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.06,172.04,131.73,131.71,75.58,66.70,62.71,57.12,54.21,54.20,34.61,34.60,33.91,33.61,32.52,32.50,32.49,30.42,30.41,30.40,30.38,30.34,30.33,30.32,30.31,30.30,30.28,30.27,30.05,30.04,30.02,30.01,29.99,29.93,29.72,29.71,29.70,28.02,27.41,27.31,27.29,26.51,25.40,25.11,24.31,24.29,23.10,23.09,23.11,14.02,14.01,14.00。
MS(ESI)：843.4(C52H101NO5，M+Na+)。
实施例3可离子化脂质化合物Lipid-13的制备
首先，8-溴辛酸与十七烷-9-醇在催化剂的作用下发生缩合反应形成酯键得到第一条分叉尾链十七烷-9-基8-溴辛酸酯；
其次，头基乙醇胺与十七烷-9-基8-溴辛酸酯在高温常压下发生SN2亲核取代，将头基与分叉尾链连接起来得到十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯；
接着，1,6-己二醇与庚酸发生缩合反应形成酯键得到6-羟基庚酸己酯；6-羟基庚酸己酯与3-溴丙酸发生缩合反应形成酯键得到第二条直尾链6-((3-溴丙酰)氧)-庚酸己酯；
最后，将连有头基的分叉尾链与直尾链在高温常压下发生SN2亲核取代反应得到Lipid-13。
步骤1：十七烷-9-基8-溴辛酸酯的合成
十七烷-9-基8-溴辛酸酯的合成参见实施例1Lipid-VI的步骤1。
步骤2：十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯的合成
十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯的合成参见实施例1Lipid-VI的步骤2。
步骤3：6-羟基庚酸己酯的合成
采用1,6-己二醇与庚酸合成6-羟基庚酸己酯，合成方法参见实施例1可离子化脂质化合物Lipid-VI的制备中的步骤1。化合物6-羟基庚酸己酯的氢谱和碳谱数据如下所示：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.83–0.94(m,3H),1.23–1.44(m,10H),1.53–1.69(m,6H),1.69–1.78(s,1H),2.24–2.35(t,J＝7.5Hz,2H),3.59–3.68(t,J＝6.6Hz,2H),4.02–4.11(t,J＝6.7Hz,2H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ13.85–14.08,22.34–22.55,24.85–25.04,25.27–25.47,25.61–25.83,28.51–28.71,28.71–28.89,31.32–31.52,32.47–32.68,34.27–34.47,62.58–62.84,64.09–64.30,173.93–174.13。
步骤4：6-((3-溴丙酰)氧)-庚酸己酯的合成
采用6-羟基庚酸己酯与3-溴丙酸合成6-((3-溴丙酰)氧)-庚酸己酯，合成方法参见实施例2可离子化脂质化合物Lipid-12的制备中的步骤3。化合物6-((3-溴丙酰)氧)-庚酸己酯的氢谱和碳谱数据如下所示：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.84–0.94(m,3H),1.23–1.36(m,7H),1.36–1.45(p,J＝3.8Hz,4H),1.57–1.74(dq,J＝7.4,15.6Hz,6H),2.25–2.33(t,J＝7.5Hz,2H),2.88–2.95(t,J＝6.8Hz,1H),3.55–3.62(t,J＝6.8Hz,1H),4.02–4.18(dt,J＝6.6,27.5Hz,4H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ13.85–14.05,22.35–22.52,24.86–25.03,25.41–25.64,25.47–25.65,25.77–25.96,28.36–28.55,28.43–28.64,28.69–28.88,31.32–31.52,34.23–34.48,37.68–37.87,63.94–64.15,64.79–64.97,76.55–76.87,76.87–77.19,77.19–77.50,173.76–173.95。
步骤5：十七烷-9-基8-((3-((6-(庚酰氧基)己基)氧基)-3-氧代丙基)(2-羟乙基)氨基)辛酸酯的和合成
采用十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯与6-((3-溴丙酰)氧)-庚酸己酯合成十七烷-9-基8-((3-((6-(庚酰氧基)己基)氧基)-3-氧代丙基)(2-羟乙基)氨基)辛酸酯，合成方法参见实施例2可离子化脂质化合物Lipid-12的制备中的步骤4。化合物十七烷-9-基8-((3-((6-(庚酰氧基)己基)氧基)-3-氧代丙基)(2-羟乙基)氨基)辛酸酯的氢谱见图4，碳谱见图5，质谱见图6。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.86–0.90(m,9H),1.21–1.34(d,J＝14.8Hz,40H),1.37–1.41(dt,J＝3.5,7.6Hz,6H),1.49–1.53(d,J＝6.0Hz,3H),1.59–1.65(m,8H),2.25–2.32(q,J＝7.3Hz,5H),2.42–2.48(m,4H),2.55–2.61(t,J＝5.2Hz,2H),2.77–2.83(t,J＝6.8Hz,2H),3.52–3.59(t,J＝5.2Hz,2H),3.61–3.69(t,J＝6.5Hz,1H),4.03–4.11(m,5H),4.82–4.91(m,1H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ13.87–14.09,13.96–14.18,22.36–22.55,22.55–22.74,24.85–25.03,25.03–25.20,25.20–25.41,25.28–25.48,25.48–25.70,25.51–25.69,25.70–25.83,26.93–27.13,27.13–27.32,28.39–28.58,28.45–28.65,28.58–28.72,28.72–28.91,29.07–29.28,29.11–29.32,29.39–29.58,29.40–29.64,31.34–31.53,31.73–31.96,32.53–32.69,32.69–32.95,34.01–34.25,34.25–34.50,34.55–34.78,49.16–49.44,53.74–54.00,55.58–55.86,58.64–58.92,62.65–62.89,63.99–64.23,64.08–64.27,64.38–64.66,74.00–74.25,172.69–172.92,173.47–173.68,173.82–174.04。
MS(ESI):726.6230(C43H83NO7,M+H+)。
实施例4可离子化脂质化合物Lipid-14的制备
首先8-溴辛酸与十七烷-9-醇在催化剂的作用下发生缩合反应形成酯键得到第一条分叉尾链十七烷-9-基8-溴辛酸酯；
其次，头基乙醇胺与十七烷-9-基8-溴辛酸酯在高温常压下发生SN2亲核取代，将头基与分叉尾链连接起来得到十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯；
接着，8-溴辛酸与2-辛基十二醇发生缩合反应形成酯键得到第二条支尾链2-辛基十二烷基8-溴辛酸酯；
最后，将连有头基的分叉尾链与支尾链在高温常压下发生SN2亲核取代反应得到Lipid-14。
步骤1：十七烷-9-基8-溴辛酸酯的合成
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十七烷-9-基8-溴辛酸酯的合成参见实施例1Lipid-VI的步骤1。
步骤2：十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯的合成
十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯的合成参见实施例1Lipid-VI的步骤2。
步骤3：2-辛基十二烷基8-溴辛酸酯的合成
采用8-溴辛酸与2-辛基十二醇合成2-辛基十二烷基8-溴辛酸酯，合成方法参见实施例2Lipid-12的步骤3。化合物2-辛基十二烷基8-溴辛酸酯的氢谱和碳谱数据如下所示：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.82–0.94(t,J＝6.7Hz,6H),1.19–1.38(m,36H),1.39–1.49(dd,J＝5.8,9.6Hz,2H),1.58–1.67(td,J＝5.6,8.6,10.0Hz,3H),1.71–1.91(dt,J＝7.3,34.5Hz,2H),2.25–2.35(t,J＝7.5Hz,2H),3.34–3.43(t,J＝6.8Hz,1H),3.49–3.56(t,J＝6.7Hz,1H),3.93–4.01(d,J＝5.8Hz,2H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ13.96–14.16,22.54–22.78,24.82–25.00,26.61–26.81,27.89–28.08,28.32–28.48,28.48–28.63,28.85–29.04,28.90–29.04,29.20–29.39,29.24–29.42,29.44–29.64,29.48–29.69,29.47–29.80,29.84–30.06,31.20–31.44,31.73–32.06,32.48–32.63,32.66–32.80,33.59–33.78,34.23–34.48,37.23–37.45,44.82–45.08,67.01–67.24,76.53–76.83,76.85–77.10,77.10–77.33,77.17–77.46,173.73–174.01。
步骤4：十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(8-((2-辛基十二烷基)氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸酯的合成
采用十七烷-9-基8-((2-羟乙基)氨基)辛酸酯与2-辛基十二烷基8-溴辛酸酯合成十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(8-((2-辛基十二烷基)氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸酯，合成方法参见实施例2Lipid-12的步骤4。化合物十七烷-9-基8-((2-羟乙基)(8-((2-辛基十二烷基)氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸酯的氢谱见图7，碳谱见图8。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.83–0.93(t,J＝6.6Hz,12H),1.22–1.35(d,J＝8.8Hz,68H),1.40–1.54(dt,J＝6.7,23.0Hz,8H),1.56–1.69(t,J＝7.2Hz,5H),2.23–2.34(q,J＝7.6Hz,4H),2.39–2.50(t,J＝7.5Hz,4H),2.54–2.63(t,J＝5.4Hz,2H),3.49–3.58(t,J＝5.4Hz,2H),3.92–4.00(d,J＝5.7Hz,2H),4.81–4.92(m,1H)。
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ13.94–14.23,22.50–22.82,24.88–25.05,25.05–25.21,25.21–25.42,26.58–26.82,26.83–27.16,27.16–27.41,29.02–29.31,29.12–29.29,29.20–29.36,29.31–29.43,29.43–29.53,29.36–29.75,29.53–29.67,29.53–29.79,29.86–30.05,31.15–31.42,31.77–31.94,31.74–32.07,34.04–34.25,34.30–34.50,34.56–34.80,37.18–37.44,53.74–54.04,55.45–55.73,58.16–58.44,66.98–67.21,74.01–74.24,173.46–173.73,173.90–174.11。
实施例5脂质纳米颗粒的制备
S5、脂质体原料溶液的制备：使用无水乙醇作为溶剂，将实施例1～实施例4任一种或多种可离子化脂质化合物分别与二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)及胆固醇按照摩尔比为50:10:1.5:38.5溶解混合得到脂质体原料溶液，控制各组分浓度之和为12.5mM，完全溶解混匀后放置-4℃避光保存；
S6、核酸制剂的制备：将mRNA溶解在pH为5.0的25mM的醋酸钠缓冲液中，制得终浓度约为0.1mg/mL的核酸制剂；
mRNA为Fluc-mRNA(萤火虫荧光素酶mRNA)或gDED-mRNA(II型单纯疱疹病毒包膜糖蛋白gD的mRNA)或SδT-mRNA(新型冠状病毒刺突蛋白的mRNA)中的一种。
S7、脂质纳米颗粒的制备(包封)：将上述制备的脂质体原料溶液和核酸制剂以两相体积比约为4:1，两相溶液总速率为12mL/min条件下，通过分体式直射泵或涡旋的方法快速地将两相溶液混匀，形成均一稳定的脂质纳米颗粒；
所述的脂质纳米颗粒为Fluc-mRNA脂质纳米颗粒(LNP-Fluc-mRNA)或gDED-mRNA脂质纳米颗粒(LNP-gDED-mRNA)或SδT-mRNA脂质纳米颗粒(LNP-SδT-mRNA)；
S8、脂质纳米颗粒pH环境的转变：快速地将脂质纳米颗粒环境从pH为5.0转变成pH7.0～7.4；具体操作为，用pH为7.2的PBS缓冲液或pH为7.4～7.6左右的Tris-HCl缓冲液将S3制备的脂质纳米颗粒溶液稀释10倍体积后，利用10KD的超滤管进行浓缩，离心机的转速为4000rpm，经过2～3次换液之后，脂质纳米颗粒的溶液环境的pH在7.2～7.4左右，放置在-20℃环境下备用。
利用Zetasizer Pro(Malvern,Worcestershire,UK)检测Fluc-mRNA脂质纳米颗粒(LNP-Fluc-mRNA)的粒径、多分散指数(PDI)。粒径的测量是将脂质纳米颗粒溶液用0.9％氯化钠溶液稀释50倍之后测量；包封率的测定利用Qubit RNABR定量检测试剂盒在Qubit 4荧光计上进行；粒径、PDI、包封率及电位的检测结果如表1所示。
表1脂质纳米颗粒的物理参数
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由表1可知，Lipid-VI-Fluc-mRNA脂质纳米颗粒、Lipid-12-Fluc-mRNA脂质纳米颗粒、Lipid-13-Fluc-mRNA脂质纳米颗粒、Lipid-14-Fluc-mRNA脂质纳米颗粒粒径在70～150nm范围内，粒径分别均匀，包封率均在90％以上，电位为-26.48～-2.094。
实施例6体内转染实验
将换液后pH在7.2～7.4的LNP-Fluc-mRNA溶液以肌肉注射的方式接种到6～8周的雌性Babl/c小鼠腿部肌肉中，控制左右后肢分别注射量为30μg mRNA的LNP-Fluc-mRNA溶液，注射4h后，小鼠腹腔注射200μL(15mg/mL)的D-荧光素钾盐底物，6～10分钟后通过小动物活体成像***(PerkinElmer)观察小鼠体内荧光表达情况，结果如图9所示。
由图9可知，除去脂质体Lipid-13之外，Lipid-VI、Lipid-12以及Lipid-14在小鼠体内转染均能达到1×108以上，说明在小鼠体内转染效果良好。
实施例7体内分布实验
向6～8周的雌性Balb/c小鼠每条后腿肌肉注射LNP-Fluc-mRNA溶液，注射量以达到30μg mRNA计算；或通过小鼠尾静脉注射LNP-Fluc-mRNA溶液，注射量以达到30μg mRNA计算。注射4h后，解剖小鼠，检测心、肝、脾、肺、肾各器官的荧光表达情况，结果如图10所示，无论是肌肉注射(IM)还是静脉注射(IV)，脂质纳米颗粒的荧光表达主要集中在肝脏和脾脏中；在表达强度上，静脉注射(IV)的荧光表达量高于肌肉注射(IM)。
实施例8荧光表达持续性实验
向6～8周的雌性Balb/c小鼠每条后腿肌肉注射LNP-Fluc-mRNA溶液，注射量以达到30μg mRNA计算。检测在不同时间点4h、8h、24h、48h、72h及96h时mRNA在小鼠体内的荧光表达情况，并对圈内部的荧光强度进行积分并得到荧光强度数值，用于定量表征荧光素酶的表达量并绘制柱形图。荧光强度与脂质体的递送效率密切相关，荧光越强，代表可离子化脂质化合物的递送效率越高。
小鼠肌肉注射LNP-Fluc-mRNA溶液后，在不同时间点的mRNA的荧光表达情况如图11所示，与Moderna公司的SM-102包封的Fluc-mRNA脂质纳米颗粒相比，24h后Lipid-VI和Lipid-14包封的Fluc-mRNA脂质纳米颗粒的荧光表达比SM102强，且能够持续至96h，说明Lipid-VI脂质体和Lipid-14脂质体对mRNA的保护效果好。
实施例9脂质纳米颗粒LNP-gDED-mRNA免疫C57BL/6小鼠
参考Fluc-mRNA脂质纳米颗粒的表征数据，选择Lipid-VI、Lipid-12、Lipid-14以及SM102作为阳性对照进行脂质体包封递送单纯疱疹病毒2型(HSV-2)包膜糖蛋白gD的mRNA(LNP-gDED-mRNA)免疫C57BL/6小鼠实验。
LNP-gDED-mRNA为Lipid-VI-gDED-mRNA或Lipid-12-gDED-mRNA或Lipid-14-gDED-mRNA或SM102-gDED-mRNA。
酶联免疫吸附实验(ELISA)
于第0天、第14天和第28天免疫C57BL/6小鼠三针后，第0、21、35、63天眼眶取血，分离血清，通过ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平。将100μL的gD蛋白(1ng/μL)包被在96孔平板，4℃过夜备用。用洗涤液PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤平板1次，用1％BSA在37℃中封闭2小时。洗板3次后，板与稀释1000、10000、100000、1000000倍的小鼠血清在37℃中孵育1小时。洗板3次，添加HRP标记的羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小时。洗板5次，避光条件下加入TMB显色，随后加入2M硫酸终止显色，在450nm吸光度下读板。
如图12所示，与SM102-gDED-mRNA相比，Lipid-VI-gDED-mRNA的IgG抗体水平最高，说明Lipid-VI能刺激机体较快产生IgG抗体，并持续高表达。随着时间推移，在63天时Lipid-12-gDED-mRNA和Lipid-14-gDED-mRNA的IgG抗体水平与SM102-gDED-mRNA相当。
中和抗体滴度实验
取酶联免疫吸附实验中第21、35天小鼠血清进行中和实验检测中和抗体滴度。提前以每孔2×104个细胞将Vero细胞接种到96孔板中。将大鼠血清倍比梯度稀释多个，每个稀释浓度设置4个复孔。将2型单纯疱疹病毒(HSV-2)病毒稀释为100个病毒每孔。将稀释好的血清和病毒以体积比1：1的比例加入到新的96孔板中，放到37℃、5％CO2的培养箱中孵育1小时。将Vero细胞上清弃除，加入孵育好的中和液体，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养48小时。培养结束后，放入高内涵活细胞监测站中观察绿色荧光，根据公式LgND50＝L+d(s-0.5)计算出中和抗体的效价。
中和抗体滴度实验结果如图13所示，Lipid-VI能较早刺激机体产生中和抗体，并随着时间的增加，中和抗体效价没有显著降低，在免疫三针后，Lipid-12的中和抗体效价与SM102相当，Lipid-14的中和抗体效价略高于SM102。
酶联免疫斑点实验(ELIspot)
第68天脱颈法处死小鼠，取脾脏研磨过筛，加入红细胞裂解液后，PBS终止裂解，离心去上清后加入完全培养基重悬，细胞计数，以每孔2×105个细胞将单细胞悬液接种到预包被IFN-γ的PVDF96孔板上。以经过紫外灯灭活30min的2型单纯疱疹病毒(HSV-2)(106CCID50/孔)刺激实验组、PMA和离子霉素为阳性对照/完全培养基(无抗原)为阴性对照，细胞与抗原孵育48h后，用PBS洗涤平板5次，加入检测抗体(MTH29-biotin)37℃中孵育1.5小时。洗板5次，添加酶连亲和素Streptavidin-ALP 37℃孵育1小时。洗板5次，避光条件下加入BCIP/NBT-plus显色，随后加入注水洗涤终止显色。将板放置在室温阴凉处自然晾干后用自动ELISpot计数器统计斑点个数，结果如图14所示，Lipid-VI-gDED-mRNA脂质纳米颗粒、Lipid-12-gDED-mRNA脂质纳米颗粒、Lipid-14-gDED-mRNA脂质纳米颗粒、SM102-gDED-mRNA脂质纳米颗粒均能刺激机体产生细胞免疫，除Lipid-12-gDED-mRNA脂质纳米颗粒产生的特异性斑点相对较少，其他脂质纳米颗粒的特异性斑点与SM102组斑点数相当，说明激起细胞免疫的能力相当。
实施例10脂质纳米颗粒LNP-SδT-mRNA免疫C57BL/6小鼠
Lipid-VI-SδT-mRNA免疫C57BL/6小鼠
Lipid-VI包封新冠刺突蛋白的mRNA(Lipid-VI-SδT-mRNA)于第0天、第14天免疫C57BL/6小鼠两针后，第14、21、28天眼眶取血，分离血清，通过ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平。将刺突蛋白包被在96孔平板，4℃过夜备用。用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤平板1次，用1％BSA在37℃中封闭2小时。洗板3次后，板与稀释1000倍的小鼠血清在37℃中孵育1小时。洗板3次，添加HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时。洗板5次，避光条件下加入TMB显色，随后加入2M硫酸终止显色，在450nm吸光度下读板；ELISA检测结果如图15所示，Lipid-VI包封新冠刺突蛋白的mRNA免疫C57BL/6小鼠两针后通过ELISA检测小鼠血清中IgG抗体水平，发现随着接种第二针后时间的延长，小鼠体内的IgG表达水平也逐渐增高。
实施例11脂质纳米颗粒LNP-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠
Lipid-VI-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠
Lipid-VI包封新冠刺突蛋白的mRNA于第0天、第21天免疫叙利亚仓鼠两针后，第28、35天心脏取血，分离血清，通过ELISA检测仓鼠血清中IgG抗体效价。将刺突蛋白包被在96孔平板，4℃过夜备用。用PBST洗涤平板1次，用1％BSA在37℃中封闭2小时。洗板3次后，板与稀释不同倍数的仓鼠血清在37℃中孵育1小时。洗板3次，添加HRP标记的兔抗叙利亚仓鼠IgG，37℃孵育1小时。洗板5次，避光条件下加入TMB显色，随后加入2M硫酸终止显色，在450nm吸光度下读板。当OD值大于阴性对照平均OD值的2.1倍时，按最高血清稀释度计算抗体效价。检测结果如图16所示，Lipid-VI包封新冠刺突蛋白的mRNA免疫叙利亚仓鼠两针后可产生强烈的体液免疫反应；相同剂量下，IgG滴度高于SM102或与之相当。
第51天处死仓鼠，取脾脏研磨过筛，加入红细胞裂解液后，PBS终止裂解，离心去上清后加入完全培养基重悬，细胞计数，以每孔40万个细胞将单细胞悬液接种到预包被IFN-γ的PVDF96孔板上。以刺突蛋白刺激物为实验组、PMA和离子霉素为阳性对照/完全培养基(无抗原)为阴性对照，细胞与抗原孵育48h后，用PBS洗涤平板5次，加入检测抗体(MTH29-biotin)37℃中孵育1.5小时。洗板5次，添加酶连亲和素Streptavidin-ALP 37℃孵育1小时。洗板5次，避光条件下加入BCIP/NBT-plus显色，随后加入注水洗涤终止显色。将板放置在室温阴凉处自然晾干后用自动ELISpot计数器统计斑点个数；ELISpot斑点检测结果如图17所示，Lipid-VI-SδT-mRNA可诱导强大的抗原特异性T细胞免疫反应，且明显优于SM102。
Lipid-12-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠
Lipid-12包封新冠刺突蛋白的mRNA于第0天、第21天免疫叙利亚仓鼠两针后，第28、35天心脏取血，分离血清，通过ELISA检测仓鼠血清中IgG抗体效价，检测方法同Lipid-VI-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠，检测结果如图18所示，Lipid-12包封新冠刺突蛋白的mRNA免疫叙利亚仓鼠两针后可产生强烈的体液免疫反应；高剂量条件下，IgG滴度明显高于SM102。
第42天处死仓鼠进行ELISpot检测，检测方法同Lipid-VI-SδT-mRNA免疫叙利亚仓鼠ELISpot斑点检测，如图19所示，相同剂量下，与SM102相比，Lipid-12能诱导更强的抗原特异性T细胞免疫应答。
实施例12脂质纳米颗粒LNP-SδT-mRNA的毒性实验
用Lipid-VI、SM102、ALC-0315包封新冠刺突蛋白的mRNA(LNP-SδT-mRNA)，设置低剂量组与高剂量组，通过肌肉注射给药48小时后，处死动物，收集脾、肝、心以及注射部位的皮肤和肌肉，石蜡包埋、切片、H&E染色，检测结果如图20所示，脂质纳米颗粒，Lipid-VI-SδT-mRNA组肝脏除了汇管区充血，肝细胞形态完整、胞核无增大、肝小叶形态完整；ALC-0315-SδT-mRNA心肌间隔断裂明显，其他器官切片无明显病变，说明Lipid-VI无明显毒性。
以上对本公开进行了详细介绍，本公开中应用了具体个例对本公开的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本公开及核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本公开原理的前提下，还可以对本公开进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本公开权利要求的保护范围内。

Claims (1)

1.一种脂质纳米颗粒在制备新型冠状病毒疫苗或溶瘤病毒疫苗或抗肿瘤疫苗中的应用，其特征在于，所述脂质纳米颗粒包括可离子化脂质化合物、辅助分子及核酸分子；其中，
所述可离子化脂质化合物如下结构式所示化合物中的一种或多种：
（Lipid-VI）、（Lipid-12）、
（Lipid-13）、（Lipid-14）；
所述辅助分子为二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇及1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000；所述可离子脂质化合物与所述辅助分子按可离子化脂质化合物：二硬脂酰磷脂酰胆碱：胆固醇：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000=50：10：38.5：1.5的摩尔比例形成脂质体，其中，形成脂质体的溶液中的各组分浓度之和为12.5 mM；
所述核酸分子为新型冠状病毒刺突蛋白的mRNA或II型单纯疱疹病毒gD包膜糖蛋白的mRNA；所述核酸分子与所述脂质体形成脂质纳米颗粒，其中，所述核酸分子的溶液与所述脂质体的溶液混匀时的体积比为1：4，混匀时的总速率为12 mL/min；
所述脂质纳米颗粒的粒径为60~100 nm。
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