CN116539596A - 基于光子晶珠的电化学发光传感器检测癌症标志物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于光子晶珠的电化学发光传感器检测癌症标志物的方法，属于分析化学技术领域。本发明以无定型的导电光子晶珠为双极电极，以光子晶珠的结构色为编码信号，首次将光子晶体编码和BP‑ECL成像技术相结合，用于癌症标志物的多元检测。本发明基于导电光子晶珠编码微球的BP‑ECL多元传感器的成功构建，为电化学发光多元检测技术提供了新的思路，并为电化学发光编码技术的开发奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体涉及一种基于光子晶珠的电化学发光传感器检测癌症标志物的方法。
背景技术
据国家癌症中心发布的最新数据分析，我国恶性癌症发病、死亡数持续上升，每年恶性癌症所致的医疗花费超过2200亿。研究发现癌症发病率持高不下的主要原因是临床就诊早期病例少、早诊率低以及晚期病例临床诊治不规范。因此，我国应扩大癌症的筛查及早诊早治覆盖面等，降低我国癌症死亡率。目前，癌症的早期诊断主要通过癌症标志物的检测来确诊是否患有癌症疾病。目前，常见的癌症标志物检测方法有化学发光免疫、酶联免疫、放射免疫等。但是，这些方法大都只能检测一种癌症标志物，这不足以准确诊断疾病。近年来，多元免疫分析引起了广泛关注。癌症标志物的多元免疫检测可以缩短检测时间，提供更高的样品通量，提高癌症诊断的准确性。因此，开发癌症标志物的多元检测方法对治疗癌症疾病具有重要意义。
发明内容
发明目的：为了解决现有技术存在的技术问题，本发明旨在提供一种基于光子晶珠的电化学发光传感器检测癌症标志物的方法。
技术方案：本发明所述的基于光子晶珠的电化学发光传感器检测癌症标志物的方法，包括以下步骤：
(1)制备具有结构色的导电光子晶珠；
(2)依次在导电无定型光子晶珠上偶联待测癌症标志物的一抗、抗原和量子点标记的二抗，形成导电复合微球；
(3)将导电复合微球放置在含有共反应试剂/缓冲液的混合溶液的双极电极电化学池中；
(4)在双极电极电化学池两端施加驱动电压，记录导电复合微球上的结构色图像和双极电极-电化学发光现象。
进一步地，步骤(1)中，所述导电光子晶珠为SiO2/CNTs导电光子晶珠或SiO2/GOx导电光子晶珠，直径为170-250μm；所述导电光子晶珠基于毛细管微流控芯片制备，其中，SiO2与CNTs或GOx的质量比为3-10:1，优选为9:1，具有良好的导电性和鲜明的结构色。
进一步地，步骤(2)中，所述癌症包括肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌和***癌；所述量子点为CdTe QDs、CdS QDs或CdTe@CdS QDs；所述导电无定型光子晶珠上偶联前还包括预处理：在导电无定型光子晶珠表面接枝羧基基团。
进一步地，步骤(3)中，所述共反应试剂为三丙胺、三乙醇胺、过硫酸钾或过氧化氢，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液；所述双极电极电化学池为设置有固态微通道的双极电极电化学池，固态微通道的宽度是双极电极电化学池宽度的1/5-1/30，固态微通道的长度为3-10mm。
进一步地，步骤(4)中，所述驱动电压为35-65V/cm，驱动电压随导电光子晶珠的直径的变化而变化，导电光子晶珠的直径越大，驱动电压越小；所述导电复合微球上的结构色图像由金相显微镜记录；所述导电复合微球上的双极电极-电化学发光现象由智能手机、普通相机或CCD相机记录。
发明原理：本发明在普通光子晶体微球中掺杂导电材料，可制得长程无序、短程有序的无定型的光子晶球。通过改变单分散胶体颗粒(二氧化硅)的大小可以改变结构色的颜色，二氧化硅纳米球的粒径越大，结构色越红移。且掺杂导电材料越多，制得的光子晶体微球的导电性越好，但其结构色越差。因此，需要综合考虑结构色性能和导电性能，选出一个最优的掺杂比例9:1。
本发明将导电光子晶珠作为双极电极，可应用于双极电极-电化学发光成像中。但是，双极电极在普通电化学池中符合“微纳米导电微球需要超高的驱动电压才能诱发电化学反应”这一理论。将制得的导电光子晶珠放入普通电化学池中，实验发现，需要至少112.3V/cm的驱动电压才能激发产生电化学发光。而在电化学池中设置了微通道后，只需最低35V/cm的驱动电压就可观察到电化学发光现象。本发明实现了光子晶体编码与电化学发光技术的首次联用，为多组分的定量和定性检测开辟了新方向，也进一步拓展了电化学发光技术在医疗诊断、生化分析领域的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
(1)本发明制备的导电光子晶珠结构色鲜明，不随观察角度的变化而发生变化，且拥有优异的导电性能，并且粒径尺寸可控，通过调节分散相和流动相的流速，实现微乳液滴和微球粒径尺寸的可控化制备；
(2)本发明以导电光子晶珠作为双极电极，以光子晶体的结构色为编码信号，结合电化学发光技术，实现光子晶体编码与电化学发光技术的首次联用，为多组分的定量和定性检测提供新思路。
附图说明
图1为本发明实施例1制备SiO2/CNTs导电光子晶珠的毛细管微流控装置的示意图；
图2为本发明实施例1-实施例3中质量比为9:1的SiO2/CNTs导电光子晶珠的金相显微镜图；
图3是本发明对比例1和实施例4采用的电化学池的结构示意图及BP-ECL成像图：(A)对比例1普通电化学池示意图，(B)实施例4设置有固态微通道的电化学池示意图(d/D＝1/5-1/30，l＝3-10mm)，(C)SiO2/CNTs导电光子晶珠在普通电化学池中，驱动电压为112.3V/cm时的BP-ECL，(D)SiO2/CNTs导电光子晶珠在设置有固态微通道的电化学池中，驱动电压为45V/cm时的BP-ECL；
图4是本发明实施例4-实施例6基于SiO2/CNTs导电光子晶珠的BP-ECL传感器对三种卵巢癌标志物的检测图；
图5是本发明实施例7基于SiO2/CNTs无定型光子晶珠的BP-ECL传感器对三种卵巢癌标志物的交叉实验。
具体实施方式
下面，结合具体实施例和附图进一步对本发明进行说明。
实施例1：如图1所示，基于毛细管微流控装置制备SiO2/CNTs导电光子晶体，步骤如下：
(1)单分散SiO2胶体纳米颗粒的制备：采用改良的法制备不同粒径的单分散SiO2胶体纳米颗粒。首先，80mL无水乙醇加入到250mL三口瓶中，然后加入18mL浓度为2％的氨水，以200rpm的速度搅拌混合均匀。待缓慢加热到60℃后，再加入2.2mL的正硅酸乙酯(TEOS)，保持温度和转速不变继续反应24h，最后得到淡蓝色的半透明SiO2种子溶液。然后，在500mL三口烧瓶中加入160mL无水乙醇、15mL浓氨水(30％)和2mL SiO2种子，保持25℃恒温水浴及搅拌速度不变。15min后用注射泵从三口***一边口缓慢滴加TEOS/乙醇溶液(TEOS/乙醇体积比为1:2)，速度为0.1mL/min；从另一边口缓慢滴加H2O/氨水/乙醇溶液(H2O/氨水/乙醇体积比为2:3:7)，速度为0.05mL/min。反应3h后，停止加液，继续搅拌12h，即制得205nm左右的SiO2胶体纳米颗粒。
(2)分散相溶液的制备：分别称取205nm左右的SiO2胶体纳米颗粒180mg，酸化后的CNTs粉末20mg(SiO2纳米颗粒与CNTs的质量比为9:1)溶于水中，超声分散均匀，制得质量分数为20％的分散相溶液；
(3)连续相溶液的准备：选取100cst的聚二甲基硅油作为连续相溶液；
(4)微乳液滴的制备：将分散相溶液和连续相溶液分别吸入注射器中，设置分散相的速度为0.5mL/h，连续相的速度为10mL/h，使连续相匀速通过毛细管微流控芯片，待微乳液滴均匀稳定后，用PP塑料盒收集粒径均匀的SiO2/CNTs微乳液滴。
(5)SiO2/CNTs导电光子晶珠的制备：收集有SiO2/CNTs微乳液滴的PP塑料盒放入真空干燥箱中，65℃固化12h，然后用正己烷反复吹洗SiO2/CNTs微球，以彻底清除残余油相溶剂。最后，将洗净的SiO2/CNTs导电光子晶体微球转移至坩埚中，于800℃马弗炉中煅烧2h，以增强SiO2/CNTs导电光子晶体微球的机械强度和稳定性。最终得到粒径约200μm，呈现蓝色结构色的SiO2/CNTs导电光子晶体微球，金相显微图见图2(A)。
实施例2：基于毛细管微流控装置制备SiO2/CNTs导电光子晶体，步骤如下：
(1)单分散SiO2胶体纳米颗粒的制备：采用改良的法制备不同粒径的单分散SiO2胶体纳米颗粒。首先，80mL无水乙醇加入到250mL三口瓶中，然后加入18mL浓度为2％的氨水，以200rpm的速度搅拌混合均匀。待缓慢加热到60℃后，再加入2.2mL的正硅酸乙酯(TEOS)，保持温度和转速不变继续反应24h，最后得到淡蓝色的半透明SiO2种子溶液。然后，在500mL三口烧瓶中加入160mL无水乙醇、15mL浓氨水(30％)和2mL SiO2种子，保持25℃恒温水浴及搅拌速度不变。15min后用注射泵从三口***一边口缓慢滴加TEOS/乙醇溶液(TEOS/乙醇体积比为1:2)，速度为0.1mL/min；从另一边口缓慢滴加H2O/氨水/乙醇溶液(H2O/氨水/乙醇体积比为2:3:7)，速度为0.05mL/min。反应5h后，停止加液，继续搅拌12h，即制得233nm左右的SiO2胶体纳米颗粒。
(2)分散相溶液的制备：分别称取233nm左右的SiO2胶体纳米颗粒180mg，酸化后的CNTs粉末20mg(SiO2纳米颗粒与CNTs的质量比为9:1)溶于水中，超声分散均匀，制得质量分数为20％的分散相溶液；
(3)连续相溶液的准备同实施例1；
(4)微乳液滴的制备同实施例1；
(5)SiO2/CNTs导电光子晶珠的制备同实施例1，SiO2/CNTs导电光子晶体微球粒径约210μm，具有绿色的结构色，金相显微图见图2(B)。
实施例3：基于毛细管微流控装置制备SiO2/CNTs导电光子晶体，步骤如下：
(1)单分散SiO2胶体纳米颗粒的制备：采用改良的法制备不同粒径的单分散SiO2胶体纳米颗粒。首先，80mL无水乙醇加入到250mL三口瓶中，然后加入18mL浓度为2％的氨水，以200rpm的速度搅拌混合均匀。待缓慢加热到60℃后，再加入2.2mL的正硅酸乙酯(TEOS)，保持温度和转速不变继续反应24h，最后得到淡蓝色的半透明SiO2种子溶液。然后，在500mL三口烧瓶中加入160mL无水乙醇、15mL浓氨水(30％)和2mL SiO2种子，保持25℃恒温水浴及搅拌速度不变。15min后用注射泵从三口***一边口缓慢滴加TEOS/乙醇溶液(TEOS/乙醇体积比为1:2)，速度为0.1mL/min；从另一边口缓慢滴加H2O/氨水/乙醇溶液(H2O/氨水/乙醇体积比为2:3:7)，速度为0.05mL/min。反应8h后，停止加液，继续搅拌12h，即制得278nm左右的SiO2胶体纳米颗粒。
(2)分散相溶液的制备：分别称取278nm左右的SiO2胶体纳米颗粒180mg，酸化后的CNTs粉末20mg(SiO2纳米颗粒与CNTs的质量比为9:1)溶于水中，超声分散均匀，制得质量分数为20％的分散相溶液；
(3)连续相溶液的准备同实施例1；
(4)微乳液滴的制备同实施例1；
(5)SiO2/CNTs导电光子晶体微球的制备同实施例1，SiO2/CNTs导电光子晶体微球粒径约230μm，具有红色的结构色，金相显微图见图2(C)。
实施例4：本发明所述的基于导电光子晶珠的生物传感器对卵巢癌标志物(一抗为：AFP-Ab1，抗原为：AFP-Ag，二抗为：AFP-Ab2)的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备具有蓝色、绿色、红色结构色的SiO2/CNTs光子晶珠(分别同实施例1、实施例2和实施例3)；
(2)SiO2/CNTs光子晶珠偶联AFP-Ab1：将上述制备的SiO2/CNTs光子晶珠置于食人鱼溶液(70％硫酸和30％过氧化氢的混合液)中浸泡6h，使得SiO2/CNTs光子晶珠表面修饰上羟基基团。随后，将羟基化的SiO2/CNTs光子晶珠置于5％的APTES乙醇溶液中缓慢振荡12h，使其表面氨基化。用10％琥珀酸酐的DMF溶液处理氨基化的SiO2/CNTs光子晶珠8h，即可得到带有羧基基团的SiO2/CNTs光子晶珠编码微载体。为了提高偶联率，将羧基化SiO2/CNTs光子晶珠浸于10mg/mL 1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)中30min，以活化羧基基团。用PBS缓冲液洗涤3次后，将带羧基基团的SiO2/CNTs光子晶珠与含有包被抗体AFP-Ab1的PBS缓冲液在37℃下孵育2h。用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)洗去未结合上的包被抗体。加入含有5％BSA的PBS溶液，37℃下振荡2h，以封闭光子晶珠上的非特异性结合位点。
(3)量子点偶联AFP-Ab2：选用CdTe QDs，新鲜配置的EDC(100μL，10mg/mL)与CdTeQDs(500μL，5mg/mL)在室温条件下反应10min，以活化CdTe QDs所带的羧基基团。然后，加入500μL的AFP-Ab2，室温下避光振荡2h。用50kD的超滤管(3000rpm，10min)除去未结合的量子点。最后，用含有1％牛血清蛋白(BSA)的PBS溶液封闭非特异性结合位点。
(4)基于SiO2/CNTs无定型光子晶珠的BP-ECL传感器检测AFP抗原：将带有包被抗体的SiO2/CNTs-AFP-Ab1(每个离心管中10个微球)与含有不同浓度AFP-Ag的PBS缓冲液(100μL)在37℃的条件下孵育30min。随后，用0.01mol/L的PBS缓冲液轻柔地洗涤3次，以去除未结合的AFP-Ag。加入CdTe-AFP-Ab2(100μL)并在37℃的条件下孵育20min，然后用0.01mol/L的PBS缓冲液轻柔地洗涤3次。最后，将SiO2/CNTs-AFP-Ab1-Ag-Ab2导电复合微球放置在双极电极反应池(见图3(B))的固态微通道中(注意：这些导电复合微球不能相互碰触)，用金相显微镜收集导电复合微球的结构色图像；施加45V/cm的驱动电压后，用CCD记录BP-ECL过程(见图3(C))。结果如图4(A)所示，AFP抗原在0.05-0.78ng/mL的范围内与ECL强度有良好的线性关系，线性方程为y＝438.1CAFP+5297.7，检测限(LOD)为0.04ng/mL(S/N＝3)，R2＝0.986。
实施例5：本发明所述的基于导电光子晶珠的生物传感器对卵巢癌标志物(一抗为：CEA-Ab1，抗原为：CEA-Ag，二抗为：CEA-Ab2)的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备具有蓝色、绿色、红色结构色的SiO2/CNTs光子晶珠(分别同实施例1、实施例2和实施例3)；
(2)SiO2/CNTs光子晶珠偶联CEA-Ab1过程同实施例4；
(3)量子点偶联CEA-Ab2过程同实施例4；
(4)基于SiO2/CNTs无定型光子晶珠的BP-ECL传感器检测CEA抗原过程同实施例4。结果如图4(B)所示，CEA抗原与ECL强度在0.10-1.56ng/mL的范围内有良好的线性关系，线性回归方程为y＝248.6CCEA+5517.3，LOD为0.08ng/mL(S/N＝3)，R2＝0.975。
实施例6：本发明所述的基于导电光子晶珠的生物传感器对卵巢癌标志物(一抗为：CA125-Ab1，抗原为：CA125-Ag，二抗为：CA125-Ab2)的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备具有蓝色、绿色、红色结构色的SiO2/CNTs光子晶珠(分别同实施例1、实施例2和实施例3)；
(2)SiO2/CNTs光子晶珠偶联CA125-Ab1过程同实施例4；
(3)量子点偶联CA125-Ab2过程同实施例4；
(4)基于SiO2/CNTs无定型光子晶珠的BP-ECL传感器检测CA125抗原过程同实施例4。结果如图4C所示，CA125抗原在0.20-1.56U/mL的范围内与ECL强度有良好的线性关系，线性方程为y＝105.4CCA125+5227.6，LOD为0.17U/mL(S/N＝3)，R2＝0.979。
实施例7：本发明所述的基于导电光子晶珠的生物传感器对卵巢癌标志物的检测方法，包括以下步骤：
(1)制备具有蓝色、绿色、红色结构色的SiO2/CNTs光子晶珠(分别同实施例1、实施例2和实施例3)；
(2)SiO2/CNTs光子晶珠分别偶联AFP-Ab1、CEA-Ab1和CA125-Ab1的过程同实施例4；
(3)量子点分别偶联AFP-Ab2、CEA-Ab2和CA125-Ab2的过程同实施例4；
(4)基于SiO2/CNTs无定型光子晶珠的BP-ECL传感器对三种癌症标志物检测的交叉实验：将SiO2/CNTs-AFP-Ab1、SiO2/CNTs-CEA-Ab1和SiO2/CNTs-CA125-Ab1三种包被不同抗体的微球分装在三个离心管中(每个离心管中10个微球)，第一组试管中只加入AFP-Ag抗原，第二组试管中只加入CEA-Ag抗原，第三组试管中只加入CA125-Ag抗原(100μL)，在37℃的条件下孵育30min。用0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤后，加入CdTe-AFP-Ab2、CdTe-CEA-Ab2和CdTe-CA125-Ab2，在37℃的条件下孵育20min，然后用0.01mol/L的PBS缓冲液轻柔地洗涤3次。最后，将导电复合微球放置在双极电极反应池的固态微通道中(注意：这些导电复合微球不能相互碰触)，用金相显微镜收集导电复合微球的结构色图像；施加45V/cm的驱动电压后，用CCD记录BP-ECL过程。结果如图5所示，第一组实验中只加入了AFP-Ag抗原，因此只有蓝色光子晶珠上出现了BP-ECL；第二组实验中只加入了CEA-Ag抗原，因此只有绿色光子晶珠上出现了BP-ECL；第三组实验中只加入了CA125-Ag抗原，因此只有红色光子晶珠上出现了BP-ECL。
对比例1：与实施例4的区别在于：步骤(4)中，采用不具有微通道的普通化学池见图3(A))，需要112.3V/cm的驱动电压才能观察到发光现象(见图3(C))。
Claims (10)
1.基于光子晶珠的电化学发光传感器检测癌症标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备具有结构色的导电光子晶珠；
(2)依次在导电无定型光子晶珠上偶联待测癌症标志物的一抗、抗原和量子点标记的二抗，形成导电复合微球；
(3)将导电复合微球放置在含有共反应试剂/缓冲液的混合溶液的双极电极电化学池中；
(4)在双极电极电化学池两端施加驱动电压，记录导电复合微球上的结构色图像和双极电极-电化学发光现象。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述导电光子晶珠为SiO2/CNTs导电光子晶珠或SiO2/GOx导电光子晶珠，直径为170-250μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述癌症包括肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌和***癌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述量子点为CdTe QDs、CdSQDs或CdTe@CdS QDs。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述导电无定型光子晶珠上偶联前还包括预处理：在导电无定型光子晶珠表面接枝羧基基团。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述共反应试剂为三丙胺、三乙醇胺、过硫酸钾或过氧化氢。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述双极电极电化学池为设置有固态微通道的双极电极电化学池，固态微通道的宽度是双极电极电化学池宽度的1/5-1/30，固态微通道的长度为3-10mm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述驱动电压为35-65V/cm。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述导电复合微球上的结构色图像由金相显微镜记录。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述导电复合微球上的双极电极-电化学发光现象由智能手机、普通相机或CCD相机记录。
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