CN116536412A - 生物标记物pglyrp2及其试剂盒的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及生物标志物PGLYRP2及其试剂盒在诊断***性红斑狼疮活动度中的应用。本发明提供了一种首创的、易于临床操作的诊断***性红斑狼疮活动度的生物标志物PGLYRP2以及其试剂盒，该生物标志物可灵敏地、特异地诊断***性红斑狼疮的疾病活动以及脂代谢异常；本发明首次将易变位点做成试剂盒并发现在***性红斑狼疮患者中进行高效表达，因此试剂盒可用于评估***性红斑狼疮疾病的疾病活动。

Description

生物标记物PGLYRP2及其试剂盒的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及生物标志物PGLYRP2在制备诊断***性红斑狼疮或评估疾病活动度的产品中的应用。
背景技术
***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)好发于育龄期女性，是一种多器官受累的慢性自身免疫性疾病，影响多个终末器官，包括肾脏、大脑、心脏等。其中肾脏累及是***性红斑狼疮发病率和死亡率的主要原因，影响约60％的患者，是影响***性红斑狼疮预后主要原因之一。除了传统的狼疮病情活动的常规评估指标，如抗双链DNA、补体C3，C4等，以及传统的肾损伤标志物如肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)和蛋白尿等，仍需要更多对***性红斑狼疮疾病活动敏感性强并能预测更多脏器组织损害或不良预后的生物标志物出现。
研究发现***性红斑狼疮疾病活动性与心脏代谢风险状态相关，自身抗体和免疫复合物可通过损伤血管内皮细胞，影响脂蛋白代谢，使得内皮损伤与动脉粥样硬化的保护机制失去平衡，最终导致动脉粥样硬化，***性红斑狼疮患者动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等的发生率与健康人群相比增加2倍。血脂异常在***性红斑狼疮患者动脉粥样硬化中起着关键作用，但确切机制尚不明确。目前为止，对于***性红斑狼疮疾病活动与血脂代谢异常相关研究进展甚少。
肽聚糖识别蛋白2(Peptidoglycan recognition protein 2,PGLYRP2)，是一种先天免疫模式识别受体，在肝脏组织中特异性表达并参与调节炎症。PGLYRP2可以分离交联的细菌肽聚糖(PGN)，通过水解N-乙酰氨基甲酸和L-丙氨酸之间的酰胺键，从而将其消化成碎片。关于PGLYRP2与自身免疫性疾病相关研究极少，有研究显示在关节炎诱导模型中，PGLYRP2作为诱导细胞因子、趋化因子及其一些受体是必需的；还有报道称，抗PGLYRP2可能为类风湿关节炎的新型标志物；PGLYRP2为胆固醇逆转运(RCT)和血脂异常相关蛋白，PGLYRP2在维持先天免疫和慢性炎症方面很重要，高水平的PGLYRP2诱导长期炎症，促进动脉粥样硬化病变的形成，可导致RCT受损和慢性炎症，导致动脉粥样硬化和心肌梗塞。还有报道称PGLYRP2还参与肿瘤微环境中的免疫反应、感染性疾病、炎症反应和脑部疾病等活动。截止到目前，还没有研究描述过PGLYRP2在***性红斑狼疮中的表达情况及与疾病相关性。因此，本研究旨在检测***性红斑狼疮病例的血清PGLYRP2水平，并探讨其与疾病活动、脏器受累的联系。
近年来对***性红斑狼疮发病机制的研究不断深入，但是仍然尚无能同时特异性评估***性红斑狼疮疾病活动度、脏器组织受累及血脂代谢异常的生物学标志物被广泛认可并接受。寻找一种在***性红斑狼疮的早期阶段能够有效预测早期肾脏受累的生物标志物对改善狼疮肾炎的治疗及预后非常重要。我们的研究发现了一种便于临床操作的生物学标志物，既与***性红斑狼疮活动指数显著相关，可作为***性红斑狼疮临床疾病活动度判断指标之一，且是***性红斑狼疮肾炎恶化的预测因子，同时与脂代谢指标相关，可为临床同步预测***性红斑狼疮疾病活动及脂代谢异常相关疾病发病提供预测价值。
发明内容
本发明首次发现血清PGLYRP2在***性红斑狼疮患者血清表达水平是增高的，是***性红斑狼疮患者全身疾病活动良好指标，同时可作为肾功能纵向恶化的预测因素，也是狼疮性肾炎预后不良的危险因素；并且首次发现PGLYRP2表达水平与***性红斑狼疮脂质代谢异常相关，从而预测***性红斑狼疮心血管疾病发生风险。
有鉴于此，本发明提供了生物标志物PGLYRP2在制备诊断***性红斑狼疮或评估疾病活动度的产品中的应用。本发明克服现有技术诊断及评估***性红斑狼疮疾病活动度的缺陷，提供一种新型诊断***性红斑狼疮、评估其疾病活动度的生物标志物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种***性红斑狼疮进行辅助诊断的标记物，更为准确的测定了***性红斑狼疮，对已形成的***性红斑狼疮进行确诊并评价其活动度。
一种检测***性红斑狼疮的基因表达谱检测试剂盒，所述试剂盒含有检测PGLYRP2蛋白或其蛋白片段特异结合的物质；和/或，与PGLYRP2基因或其基因片段特异结合的物质。
所与PGLYRP2基因或其基因片段特异结合的物质包括引物对、探针、反义寡核苷酸、适配体中的一种或几种。
所述引物对包括：扩增PGLYRP2基因的引物对，如下：
所述PGLYRP2基因的检测位点为rs34440547、rs892145、rs74688727、rs3813135，以上位点的上下游引物如下：
所述扩增引物用于PGLYRP2的基因表达水平。
一种与检测***性红斑狼疮相关的SNP位点，所述的SNP位点位于PGLYRP2基因编码区，为整个基因的序列第3407位，其碱基为A/G；PGLYRP2基因编码区，为整个基因的序列第7216位，其碱基为T；PGLYRP2基因编码区，为整个基因的序列第7692位，其碱基为T；PGLYRP2基因编码区，为整个基因的序列第7889位，其碱基为A中的任意一种或二种以上组合。
一种用于检测***性红斑狼疮的试剂盒，包括以下试剂：
(1)试剂1：第一次长片段PCR扩增的试剂；
(2)试剂2：第二次高含量PCR扩增的试剂；
(3)引物与探针：所述用于PCR扩增的试剂包含本发明所述的引物组和DNA探针；
(4)内标物：管家基因引物对。
所述DNA探针的核苷酸序列如下：
核苷酸序列
探针1CGCCTTATCTGGGCCGCCCGAAGCTGCTGCAGCTGCCGCTGGG
探针2CGCCTTATCCGGGCCGCCCGAAGCTGCTGCAGCTGCCGCTGGG
探针3TTAACCAAGGCCTTCCTCAATGGCGCCCTGGATGG
探针4TGGTACTGGCACCTGATGGCTCGACCGTGGCTGTGGA
探针5AAAGTGCCAGCTGCCAAGACCAGACACACAGCTTCT
所述DNA探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为Eclipse。
一种用于检测***性红斑狼疮的试剂盒的使用方法，所述试剂盒的检测方法包括以下步骤：
1)核酸提取：提取待测样本的DNA；
制备反应体系：制备15μL定量PCR反应体系，包括模板DNA、dNTP混合物、DNA聚合酶、引物、探针、10×PCR Buffer和水；
2)第一次PCR反应：包括96℃预变性5分钟；95℃变性15秒、59℃退火延伸90秒，30-38个循环；
3)第二次PCR反应：包括96℃预变性5分钟；95℃变性15秒、59℃退火延伸90秒，30-38个循环；
4)结果检测：加入DNA探针进行实时荧光信号判读、绘制标准曲线。
在本发明提供的具体实施例中，用于检测PGLYRP2基因存在或不存在、或者表达量的方法包括但不限于：基于PCR的检测方法、Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交、DNA微阵列、高通量测序平台中的一种或几种。
在本发明提供的具体实施例中，基于PCR的检测方法包括但不限于反转录PCR、实时定量PCR。
在本发明提供的实施例中，产品的检测样本包括血清、皮肤、关节、浆膜、胎盘、骨骼肌、肾脏、主动脉内皮细胞或肝脏中的一种或几种。
在本发明提供的实施例中，试剂盒包括但不限于qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒和电化学发光检测试剂盒。
在本发明提供的实施例中，诊断或辅助诊断***性红斑狼疮的方法为：若检测样本血清PGLYRP2的水平5299.94±570.87pg/ml，则诊断为***性红斑狼疮高活动性。
在本发明提供的实施例中，评估或辅助评估***性红斑狼疮疾病活动度中：***性红斑狼疮为稳定性期者，则检测样本血清PGLYRP2的水平在4468.99±457.02pg/ml；***性红斑狼疮为活动性LN者，则血清PGLYRP2的水平在5152.93±446.13pg/ml。
在本发明提供的一具体实施例中，诊断或辅助诊断***性红斑狼疮中，***性红斑狼疮高脂代谢种样本血清PGLYRP2表达水平与C3、C4以及肾功能参数eGFR、IgA、24小时尿蛋白呈相关性。
在本发明提供的一具体实施例中，诊断或辅助诊断系***性红斑狼疮活动性中血清PGLYRP2水平与脂质代谢指标HDL-c、Apo-A1、Apo B/A1比值呈相关性。
在本发明提供的实施例中，主要的检测样本为血清和晨尿。
本发明另一方面提供了一种筛选用于预防和/或治疗***性红斑狼疮的候选药物的方法，包括如下步骤：
(1)将待测物质与含有或表达PGLYRP2蛋白的体系接触；
(2)检测所述体系中PGLYRP2蛋白的表达水平；
(3)检测HDL-c、Apo-A1、Apo-B/A1比值；
(4)选择可降低PGLYRP2蛋白的表达水平的物质为预防和/或治疗***性红斑狼疮的候选药物。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明提供了一种首创的、易于临床操作的诊断***性红斑狼疮活动度的生物标志物PGLYRP2，该生物标志物可灵敏地、特异地诊断***性红斑狼疮活动度，特异度和灵敏度较高，通过实验验证，生物标志物PGLYRP2的符合率在85％以上。
本发明首次发现PGLYRP2在高疾病活动度患者以及神经精神狼疮患者中表达更高，因此该生物标志物还可用于评估疾病活动度；本发明首次发现血浆PGLYRP2在***性红斑狼疮患者中表达增加，可作为***性红斑狼疮肾炎恶化的预测因子；本发明首次发现血浆PGLYRP2与脂质代谢指标HDL-c、Apo-A1呈显著负相关，与Apo-B/A1比值呈显著负相关，表明PGLYRP2可用于预测***性红斑狼疮心血管疾病风险及疾病严重程度；
本发明还提供了一种用于***性红斑狼疮诊断和检测疾病活动度的试剂盒，包括：实时荧光定量PCR扩增试剂预混料、PGLYRP2基因的引物对、管家基因GAPDH的引物对，并给出了具体的引物序列。通过对已经确诊的45名符合条件的***性红斑狼疮患者和15名健康志愿者的血清检测，进一步验证本发明的试剂盒的准确度，通过灵敏度和特异度实验发现，该试剂盒的符合率达到了90％以上。
本发明还发现PGLYRP2可用于筛选预防和/或治疗***性红斑狼疮的候选药物，从而进一步开发针对该疾病的有效治疗药物。
附图说明
图1在健康志愿者、病情稳定的***性红斑狼疮患者、活动性LN患者以及NP-***性红斑狼疮患者中血清PGLYRP2的含量。图1结果显示，与健康志愿者(3938.56±576.07pg/ml)相比，***性红斑狼疮稳定期(4468.99±457.02pg/ml)、LN活动期(5152.93±446.13pg/mL)和NP-***性红斑狼疮患者(5141.52±579.61pg/mL)的血清PGLYRP2水平显著升高。活动期LN患者血清PGLYRP2水平高于稳定期***性红斑狼疮患者，但活动期LN患者与NP-***性红斑狼疮患者之间无显著差异(P>0.05)。
图2血清中PGLYRP2在健康志愿者、病情稳定的***性红斑狼疮患者以及活动性LN患者中的相对表达。结果显示活动期LN或NP-***性红斑狼疮患者的血清PGLYRP2表达水平高于健康志愿者(P<0.01)。
图3血清中PGLYRP2能够区分***性红斑狼疮活动期患者和稳定期患者的ROC曲线。通过描绘ROC曲线来测试PGLYRP2在***性红斑狼疮中的诊断潜力，如图3所示AUC＝0.841，这一结果表示预测准确性良好，证明PGLYRP2在区分活动期和稳定期***性红斑狼疮患者中具有敏感性和特异性。
图4在健康志愿者、低活动度LN患者(0-9)、中活动度LN患者(10-14)以及高活动度LN患者(≥15)中血清PGLYRP2的含量。高活动组血清PGLYRP2(5299.94±570.87pg/mL)显著高于低活动组(4610.64±533.59pg/mL)(P<0.01)。中度活动组(4970.85±402.61pg/mL)与高度活动组(5299.94±570.87pg/mL)比较，无明显差异(P>0.05)。但是所有***性红斑狼疮患者血清中PGLYRP2含量均高于健康志愿者。
图5血清PGLYRP2与***性红斑狼疮疾病活动性的相关性曲线。在***性红斑狼疮患者中，血清PGLYRP2含量和***性红斑狼疮DAI之间存在正相关的关系，随着血清PGLYRP2含量的增加，***性红斑狼疮患者病情活动度增加(R＝0.5783，p<0.01，n＝45)
图6PGLYRP2试剂盒检测***性红斑狼疮患者的ROC曲线
具体实施例
本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述，可以对那些细节进行不同的修饰或替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
实施例1：引物设计与构建
根据GenBank中选取PGLYRP2基因，使用本发明基因试剂盒进行检测，阳性率准确率高达95％以上，利用Primer Premier 5.0在线引物设计软件，设计出引物和探针组合物，引物由上海某生物技术有限公司合成，引物具体序列情况如下表1所示。
表1 4个位点选择的引物
为了进一步优化检测程序，对各基因保守序列进行DNA探针设计，所述的DNA探针两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为Eclipse。探针的合成均由上海某有限公司合成，具体序列情况如下表2所示。
表2探针的序列以及和核苷酸
核苷酸序列
探针1 CGCCTTATCTGGGCCGCCCGAAGCTGCTGCAGCTGCCGCTGGG
探针2 CGCCTTATCCGGGCCGCCCGAAGCTGCTGCAGCTGCCGCTGGG
探针3 TTAACCAAGGCCTTCCTCAATGGCGCCCTGGATGG
探针4 TGGTACTGGCACCTGATGGCTCGACCGTGGCTGTGGA
探针5 AAAGTGCCAGCTGCCAAGACCAGACACACAGCTTCT
实施例2、***性红斑狼疮细胞基因提取
使用核酸提取试剂盒和核酸提取仪提取***性红斑狼疮细胞的DNA，利用含异硫氰酸胍的裂解液对***性红斑狼疮细胞破碎裂解，经过Wash Buffer A和Buffer B洗涤两次，去除蛋白和其它杂质，最终将蛋白质与核酸分离，收集液体，并在TE缓冲液中溶解，最终的洗脱体积为50μL，即制得50μL含***性红斑狼疮细胞DNA的提取物，作为待检测样本。
实施例3、***性红斑狼疮细胞基因扩增与检测
第一次PCR扩增反应：***性红斑狼疮细胞基因在提取过程中存在较多其他DNA的干扰，以实施例2提取后标化好的DNA为模板，采用巢式PCR法进行扩增，反应体系(15μl)：1.5μl10×Taq Buffer(Mg2+Plus)，1μl 2mM dNTP，0.2μl 10mM Primer，1μl模板DNA(50ng)，0.5UTaq，用ddH2O补足15μl。
纯化第一次PCR产物：根据各个样本的DNA含量以1×TE稀释到30-50ng/μl，置于-20℃下保存备用。
第二次PCR扩增反应：取稀释后的1μL提取物进行PCR扩增实验，分别筛选本发明所述的8对引物进行2次扩增，PCR反应体系均为20ul。反应体系(15μl)：1.5μl 10×TaqBuffer(Mg2+Plus)，1μl 2mM dNTP，0.2μl 10mM Primer，1μl模板DNA(50ng)，0.5UTaq，用ddH2O补足15μl，DNA探针引物(1.5ng/ml)。第一次扩增的序列结果作为第二次扩增结果的DNA模板，最终通过筛选的SNPs位点进一步扩增显示，具体的反应体系和引物如表3下：
表3反应体系和引物
第一次PCR扩增反应PCR反应控制过程如下：
表4各基因PCR反应引物以及PCR过程
第二次PCR扩增
表4各基因PCR反应引物以及PCR过程
表5第2次PCR反应过程的引物
表6反应体系和引物
结果检测：进行实时荧光信号判读、绘制标准曲线。
实施例4：第二次退火延伸温度优化
第二次PCR扩增反应由于存在DNA探针，因此不能以设计软件中的为参考标准，通过退火温度的设计以及碱基排序来看，设计5套反应程序：
反应程序1：第一步：95℃预变性5分钟；第二步：95℃变性15秒，59℃退火延伸90秒，延伸后采集荧光；重复运行第二步38个循环。
反应程序2：第一步：95℃预变性5分钟；第二步：95℃变性15秒，55℃退火延伸90秒，延伸后采集荧光；重复运行第二步38个循环。
反应程序3：第一步：95℃预变性5分钟；第二步：95℃变性15秒，56℃退火延伸90秒，延伸后采集荧光；重复运行第二步38个循环。
反应程序4：第一步：95℃预变性5分钟；第二步：95℃变性15秒，57℃退火延伸90秒，延伸后采集荧光；重复运行第二步38个循环。
反应程序5：第一步：95℃预变性5分钟；第二步：95℃变性15秒，58℃退火延伸90秒，延伸后采集荧光；重复运行第二步38个循环。
表7退火延伸温度优化对比试验
反应程序1 反应程序2 反应程序3 反应程序4 反应程序5
rs34440547 N/A -- -- N/A N/A
rs892145 N/A N/A N/A N/A N/A
rs74688727 N/A N/A N/A N/A --
rs3813135 N/A -- N/A -- N/A
以上5组反应程序的区别之处在于退火延伸温度不同，扩增结果如表所示，N/A
表示无扩增，检测结果为阴性，数值为检测Ct值表示有扩增，检测结果为阳性(反应程序2依次为：21.5、35.2；反应程序3依次为：30.5；反应程序4为：24.7；反应程序5为：23.1)。从扩增结果可以看出：退火温度为59℃时，4套引物对特异性最好，没有出现假阳性扩增结果，而当退火温度为56-58℃时，3套引物均出现个别非特异性显著，即出现假阳性的检测结果。
实施例5：***性红斑狼疮病的基因纯化与检测
扩增完成后，每个样本取5μl，对于阳性个体进行在1％的DNA凝胶上检测。结果片段长度为rs34440547为105bp，rs892145为135bp，rs74688727为114bp，rs3813135为109bp。可以看出的是，通过2次PCR的扩增，清晰的看到目标片段，说明了PCR的效果良好，本发明的其他条件满足检测需求。
实施例6：一种用于检测***性红斑狼疮活动度的试剂盒
包括***性红斑狼疮细胞提取套装、6种基因的引物以及DNA探针、管家基因GAPDH(引物对位5′-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3′和5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′)。
实施例7：研究资料及标本
2019年1月1日至2020年11月1日在我院招募了45名符合条件的***性红斑狼疮患者(15名稳定型***性红斑狼疮患者、15名活动性LN患者和15名活动性NP-***性红斑狼疮患者和15名健康志愿者。在45例***性红斑狼疮患者中，女性39例(86.6％)，男性6例(13.4％)，平均年龄36.53±13.54岁。
分类标准：
根据1982年美国风湿病学会修订的***性红斑狼疮分类标准对***性红斑狼疮进行诊断和分类，将入选的***性红斑狼疮患者分为低疾病活动组(***性红斑狼疮DAI≦9，n＝19)、中度疾病活动组(10<***性红斑狼疮DAI<14，n＝12)和高疾病活动组组(***性红斑狼疮DAI≧15，n＝14)。
血清中的PGLYRP2检测方法：
①在45名***性红斑狼疮患者和15名志愿者空腹8小时后采集晨静静脉血。
②将每个参与者采集的血液1000×G离心10分钟，分装并储存在-80℃下。
③将样品取出放置室温下解冻，将血清样品稀释1:10，注意每个样品仅循环和解冻一次，以防止蛋白质降解。
④用PGLYRP2 ELISA试剂盒检测PGLYRP2的血清水平。
⑤用酶标仪检测450nm处的光密度，每个样本测量两次。血清PGLYRP2的表达量为PG/ml。
检测结果以及分析
在健康志愿者、病情稳定的***性红斑狼疮患者、活动性LN患者以及NP-***性红斑狼疮患者中血清PGLYRP2的含量；血清中PGLYRP2在健康志愿者、病情稳定的***性红斑狼疮患者以及活动性LN患者中的相对表达；血清中PGLYRP2能够区分***性红斑狼疮活动期患者和稳定期患者的ROC曲线；在健康志愿者、低活动度LN患者、中活动度LN患者以及高活动度LN患者中血清PGLYRP2的含量；血清PGLYRP2与***性红斑狼疮疾病活动性的相关性曲线。
经过检测发现高活动组血清PGLYRP2(5299.94±570.87pg/mL)显著高于低活动组(4610.64±533.59pg/mL)(P<0.01)。中度活动组(4970.85±402.61pg/mL)与高度活动组(5299.94±570.87pg/mL)比较，无明显差异(P>0.05)。但是所有***性红斑狼疮患者血清中PGLYRP2含量均高于健康志愿者。
实施例8：PGLYRP2试剂盒用来检测***性红斑狼疮活动度的符合率
为了进一步验证本发明试剂盒的准确性，对于3种6基因进行分类组合，具体如表7的组合，其组合的理论在于尽可能降低成本费用，提高实验效率。
试剂盒选自实施例6中的试剂盒，操作如下：
第一次PCR扩增反应：***性红斑狼疮细胞基因在提取过程中存在较多其他DNA的干扰，以实施例2提取后标化好的DNA为模板，采用巢式PCR法进行扩增，反应体系(15μl)：1.5μl10×Taq Buffer(Mg2+Plus)，1μl 2mM dNTP，0.2μl 10mM Primer，1μl模板DNA(50ng)，0.5UTaq，用ddH2O补足15μl。
纯化第一次PCR产物：根据各个样本的DNA含量以1×TE稀释到30-50ng/μl，置于-20℃下保存备用。
第二次PCR扩增反应：取稀释后的1μL提取物进行PCR扩增实验，分别筛选本发明所述的6对引物进行2次扩增，PCR反应体系均为20ul。反应体系(15μl)：1.5μl 10×TaqBuffer(Mg2+Plus)，1μl 2mM dNTP，0.2μl 10mM Primer，1μl模板DNA(50ng)，0.5UTaq，用ddH2O补足15μl，DNA探针引物(1.5ng/ml)。第一次扩增的序列结果作为第二次扩增结果的DNA模板，最终通过筛选的SNPs位点进一步扩增显示。
现有理论可以知道，通过组合可以看出，组合3的检出应该事最为高效的，但是组合3中使用的引物以及其他试剂较多，耗费的时间和成本较高。具体检测结果如表8和表9所示。
组合方式
表8探针组合方式
组合方式 位点
① 探针1+探针3
② 探针1+探针3+探针4
③ 探针1+探针3+探针4+探针5
④ 探针1+探针2+探针3+探针4+探针5
表9 3种不同组合基因检测的结果
组合方式 阳性数 真阳性数 假阳性数 假阴性数 阳性率(％)
① 31 14 17 31 68.9
② 30 22 8 12 66.7
③ 37 33 4 7 82.2
④ 43 42 1 2 95.6
通过表8可以看出，组合④的检测结果更为可靠，准确率在95％以上，组合①-③的检测结果有将近一半的患者没有检出。因此，不建议采用组合①-③的检测方法。
实施例9：利用PGLYRP2试剂盒检测***性红斑狼疮的不同活动度的程度
试剂盒：PGLYRP2试剂盒，采用实施例8中的④组合方式中的探针。
实施例7的45名***性红斑狼疮患者和15名健康志愿者，为评价PGLYRP2试剂盒的测试效果，对上述的***性红斑狼疮患者和15名健康志愿者进行检测。诊断结果分为健康志愿者、低活动度LN患者、中活动度LN患者以及高活动度LN患者4个等级，分别用1-4表示结果如表10所示。
表10PGLYRP2试剂盒的测试评分结果
具体检测结果如图6所示，检测结果显示：该试剂盒的ROC曲线下面积为0.936，与0.5相比具有显著性差(P<0.001)，说明该试剂盒的检测能力比较好。

Claims (10)

1.一种检测***性红斑狼疮活动度的基因表达谱检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测PGLYRP2蛋白或其蛋白片段特异结合的物质；和/或，与PGLYRP2基因或其基因片段特异结合的物质。
2.根据权利要求1所述的基因表达谱检测试剂盒，其特征在于，所与PGLYRP2基因或其基因片段特异结合的物质包括引物对、探针、反义寡核苷酸、适配体中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的基因表达谱检测试剂盒，其特征在于，所述引物对包括：扩增PGLYRP2基因的引物对，如下：
4.根据权利要求2所述的基因表达谱检测试剂盒，其特征在于，所述PGLYRP2基因的单核苷酸多态性位点为rs34440547、rs892145、rs74688727、rs3813135。
5.根据权利要求4所述的基因表达谱检测试剂盒，其特征在于，所述rs34440547、rs892145、rs74688727、rs3813135的上下游引物如下：
6.根据权利要求1所述的基因表达谱检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物用于PGLYRP2基因的表达水平。
7.一种与检测***性红斑狼疮活动度相关的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点位于PGLYRP2基因编码区，为整个序列第3407位，其碱基为A或G；PGLYRP2基因编码区，为整个序列第7216位，其碱基为T；PGLYRP2基因编码区，为整个序列第7692位，其碱基为T；PGLYRP2基因编码区，为整个序列第7889位，其碱基为A中的任意一种或二种以上组合。
8.一种用于检测***性红斑狼疮活动度的试剂盒，包括以下试剂：
(1)试剂1：第一次长片段PCR扩增的试剂；
(2)试剂2：第二次高含量PCR扩增的试剂；
(3)引物与探针：所述用于PCR扩增的试剂包含权利要求1-2任一项所述的引物组和DNA探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的核苷酸序列如下：
探针1CGCCTTATCTGGGCCGCCCGAAGCTGCTGCAGCTGCCGCTGGG
探针2CGCCTTATCCGGGCCGCCCGAAGCTGCTGCAGCTGCCGCTGGG
探针3TTAACCAAGGCCTTCCTCAATGGCGCCCTGGATGG
探针4TGGTACTGGCACCTGATGGCTCGACCGTGGCTGTGGA
探针5AAAGTGCCAGCTGCCAAGACCAGACACACAGCTTCT
所述的DNA探针两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为Eclipse。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测方法包括以下步骤：
1)核酸提取：提取待测样本的DNA；
制备反应体系：制备15μL定量PCR反应体系，包括模板DNA、dNTP混合物、DNA聚合酶、引物、探针、10×PCR Buffer和水；
2)第一次PCR反应：包括96℃预变性5分钟；95℃变性15秒、59℃退火延伸90秒，30-38个循环；
3)第二次PCR反应：包括96℃预变性5分钟；95℃变性15秒、59℃退火延伸90秒，30-38个循环；
4)结果检测：加入DNA探针进行实时荧光信号判读、绘制标准曲线。
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