CN116529356A - 检测样品中的微生物菌体的回收方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在不影响菌体的状态的情况下简单且高效地回收发酵乳中的微生物的方法。一种微生物的回收方法，是从含有发酵乳的检测样品中回收微生物的方法，该方法依次进行(a)使用缓冲液将检测样品以蛋白质浓度成为3mg/mL以下的方式稀释的工序、(b)离心分离的工序、以及(c)清洗回收的工序，由此从检测样品中回收微生物。

Description

检测样品中的微生物菌体的回收方法
技术领域
本发明涉及从含有发酵乳的检测样品中高效地回收微生物的方法。
背景技术
从发酵乳分离、回收菌体在正确地把握种菌和制品中的菌的性质方面是必要的操作。已知发酵乳中含有以酪蛋白为首的β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白等蛋白质，但在pH下降的酸性的发酵乳中酪蛋白胶束变得不稳定，形成凝集块(凝乳)。从如此以难溶化的状态含有蛋白质的发酵乳中分离回收微生物菌体是困难的。
与此相对，以往，使用碱性溶液、螯合剂等分离菌体。另外，还已知有将含有发酵乳的检测样品调节为pH5.4以上后，加入高分子有机物分解酶来回收菌体的方法(专利文献1)。
另一方面，这样的处理对发酵乳中的菌体的状态、特别是表层结构有影响，担心无法正确地测定乳中的菌的性状、结构。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第6153461号
发明内容
本发明提供一种在不影响菌体的状态的情况下简便且高效地回收发酵乳中的微生物的方法。
本发明人等经过深入研究，结果发现通过使用特定浓度的缓冲液将含有发酵乳的检测样品稀释至蛋白质浓度成为一定值以下，从而难溶化的蛋白质溶解，在该状态下实施离心分离，能够大体上除去牛奶蛋白，能够在不给微生物带来过大的负荷的情况下高效地回收检测样品中的菌体。
即，本发明涉及以下的1)～9)。
1)一种微生物的回收方法，是从含有发酵乳的检测样品中回收微生物的方法，该方法依次进行(a)使用缓冲液将检测样品以蛋白质浓度成为3mg/mL以下的方式稀释的工序、(b)离心分离的工序、以及(c)清洗回收的工序，由此从检测样品中回收微生物。
2)根据1)的方法，其中，以蛋白质浓度成为2mg/mL以下的方式稀释。
3)根据1)或2)的方法，其中，缓冲液为pH6.5～7.5的缓冲液。
4)根据1)～3)中任一项的方法，其中，缓冲液为磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或者HEPES缓冲液。
5)根据4)的方法，其中，上述缓冲液的浓度为25mM～1000mM。
6)根据4)的方法，其中，缓冲液为25mM～100mM的磷酸钾缓冲液。
7)根据1)～6)中任一项的方法，其中，在工序(a)后接着实施选自筛网处理、加温处理、均化器处理、匀质器处理和超声波处理中的处理。
8)根据1)～7)中任一项的方法，其中，微生物为活菌。
9)根据1)～8)中任一项的方法，其中，检测样品为酸性乳饮料。
根据本发明的方法，能够在维持检测样品中的状态的情况下简单、低成本且高收率地回收发酵乳中的微生物。由此，能够高精度地实施检测样品的品质判定、回收的微生物的活性评价。
具体实施方式
本发明的方法是从含有发酵乳的检测样品中回收微生物的方法，其特征在于，
依次进行(a)使用缓冲液将检测样品以蛋白质浓度成为3mg/mL以下的方式稀释的工序、(b)离心分离的工序以及(c)清洗回收的工序。
本发明中，“发酵乳”是指含有来自乳的成分的发酵物。作为发酵乳，例如可举出将含有牛奶、山羊奶、绵羊奶、马奶等动物奶、来自奶粉或脱脂奶粉的复原乳、奶油等乳成分的培养基作为原料，向其中添加乳酸菌、双歧杆菌、酵母等微生物使其发酵而成的发酵物(也包括在乳饮料等中添加上述微生物作为活菌的发酵物)以及其加工物、稀释物、处理物等，不限于关于乳及乳制品成分规格等的日本省令等(乳等的日本省令)中规定的发酵乳。
“含有发酵乳的检测样品”的pH优选小于5.4，pH进一步优选为3.0～5.2，pH特别优选为3.4～5.2。
作为检测样品的形态，可举出饮食品、化妆品、医药品等，优选饮食品或化妆品，更优选为饮食品，特别优选为酸性乳饮料。检测样品中，例如乳等的日本省令中提及的发酵乳、乳制品、乳酸菌饮料这样的酸性乳饮料等饮食品中，通常活菌和死菌是混合存在的，在实施了加热杀菌的加工食品等中，仅包含死菌。本发明的方法可应用于包含活菌和死菌中的任一者或者两者的检测样品，但特别适合用于包含活菌的检测样品。在此，活菌是指具有菌落形成能力的菌。另外，死菌是指不具有菌落形成能力的菌，不仅包含已经死了的菌，也包含丧失菌落形成能力且具有膜的稳定性、酶活性的菌等。
本发明中，“微生物”没有特别限定，例如可举出干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳球菌、短乳杆菌、棒状乳杆菌、格氏乳杆菌、玉米乳杆菌、约氏乳杆菌、德氏乳杆菌德氏亚种、德氏乳杆菌保加利亚亚种等乳杆菌属细菌，嗜热链球菌等链球菌属细菌，乳酸乳球菌、植物乳球菌、棉子糖乳球菌等乳球菌属细菌，肠膜明串珠菌、肠膜明串珠菌乳脂亚种、乳酸明串珠菌等明串珠菌属细菌、或者粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)等肠球菌属细菌等乳酸菌，两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、角双歧杆菌、链状双歧杆菌、假链状双歧杆菌等双歧杆菌属细菌，以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌属、裂殖酵母属等酵母。
其中，从微生物的回收率的观点考虑，优选乳酸菌、双歧杆菌属细菌，作为乳酸菌，优选乳杆菌属细菌、链球菌属细菌、乳球菌属细菌等。应予说明，这些微生物可以含有1种或者2种以上。
本发明的(a)工序是使用缓冲液将检测样品以蛋白质浓度成为3mg/mL以下的方式稀释的工序。
稀释通过采集一定量的检测样品并向其中添加缓冲液而进行，此时，以稀释液中的蛋白质浓度成为3mg/mL以下的方式进行。为超过3mg/mL的浓度时，有时无法充分除去蛋白质，在菌体的回收中产生不良情况。
在此，从蛋白质除去率和菌体回收率的观点考虑，蛋白质浓度优选为2mg/mL以下，更优选为1.5mg/mL以下，更优选为0.7mg/mL以下。
作为这种稀释液的制备，可举出向检测样品溶液中添加10～40倍、优选20～40倍的缓冲液的方式。
作为稀释中使用的缓冲液，优选在pH7附近发挥pH缓冲能力的缓冲液，具体而言可举出pH6.5～7.5的缓冲液。
作为这种缓冲液，例如可举出磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸钠缓冲液、磷酸缓冲食盐水、柠檬酸-磷酸缓冲液、Tris缓冲盐水、碳酸氢盐缓冲液、MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、ADA缓冲液、PIPES缓冲液、ACES缓冲液、MOPSO缓冲液、BES缓冲液、TES缓冲液、DIPSO缓冲液、TAPSO缓冲液、POPSO缓冲液、HEPPSO缓冲液、EPPS缓冲液，其中优选磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液，其浓度为25mM～1000mM。
更具体而言，可举出25mM～100mM的磷酸钾缓冲液、100mM～1000mM的Tris-HCl缓冲液、50mM～500mM的HEPES缓冲液，优选25mM～100mM的磷酸钾缓冲液。
本发明的方法中，在上述(a)的稀释工序后接着可以实施选自筛网处理、加温处理、均化器(homogenizer)处理、匀质器(stomachere)处理和超声波处理中的处理。由此，蛋白质除去率提高。
在此，筛网处理是指使用网孔为5μm以上的过滤器除去比微生物大的粒子、或者施加压力将大的粒子粉碎成网孔以下的尺寸的处理，例如可举出使其通过Filcon SSyringe10μm筛网(BD Medimachine)的方法。
作为加温处理，是指在25～50℃下加温的处理，例如可举出在40℃的恒温水槽中静置10分钟。
均化器处理是使用均化器的机械搅拌处理，例如可举出用安装有S10N-10G发电机(IKA)的T10 basic ULTRA-TURRAX均化器(IKA)以30000rpm搅拌1分钟。
匀质器处理是使用匀质器的机械搅拌处理，例如可举出装入塑料袋中，并用Stomachere Pro-media SH-IIM(Elmex Co.,Ltd)处理10分钟。
超声波处理优选使用超声波处理装置以频率20～200kHz处理10～30分钟，例如可举出用超声波槽US-104N(振荡38kHz、输出150W)处理10分钟。
(b)工序的离心分离工序中的离心分离只要为微生物菌体沉降的条件就没有限制，在4℃～40℃、优选在25℃，以最大旋转半径部分(Rmax)的离心力为1000×g以上、优选为5000～10000×g的离心力进行5～30分钟、优选15分钟左右。
如后述的参考例所示，通过进行(a)工序和(b)工序，能够除去90％以上的检测样品中的蛋白质。
(b)工序的离心分离结束后，对除去上清液而残留的沉淀物进行清洗回收操作(工序(c))。
清洗操作可以通过向含有沉淀物的溶液添加10～500倍量左右的清洗液，使用吸管和/或旋涡混合器使沉淀物悬浮，离心分离后回收来进行。
在此，作为使用的清洗液，优选使用与(a)工序中使用的缓冲液相同的缓冲液，但也可以使用水、蛋白胨生理食盐水、蛋白胨水、PBS(磷酸缓冲食盐水)、林格氏液、生理食盐水、Mitsuoka’s缓冲液等。
另外，本工序中进行的离心分离的条件优选为与(b)工序中的离心分离相同的条件，例如可举出在室温、5000×g、15分钟左右的条件。清洗回收操作可以进行多次的清洗液的添加和离心分离直至充分实现牛奶蛋白的除去。
如此，根据本发明的方法，能够从含有发酵乳的检测样品中高效地回收微生物。因此，通过使用该方法，能够对发酵乳制品更快速且可靠地进行如下的操作：实施以往乳成分难以测定或观测的试验或显微观察、评价减小因乳成分带来的影响时的发酵乳中微生物的各种活性、通过测定活菌数或测定包括活菌、死菌的总菌数来验证该发酵乳制品的有用性、根据活菌数或总菌数来判定检测样品是否满足设定的基准、判定检测样品有无批次差异、判定检测样品中有无污染微生物或其个数的测定、根据活菌与死菌的比率验证检测样品的保存状态、劣化等。
以下，举出实施例对本发明的内容进行更详细的说明，但本发明不受这些例子限制。
实施例
参考例1酸乳中的蛋白质的除去(1)
(1)将在水中溶解脱脂奶粉而制备的复原脱脂乳(10％(w/v)脱脂乳)在121℃加热灭菌15分钟。灭菌结束后在脱脂乳中添加0.8％(w/v)的DL-乳酸(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation)而调节成pH4.4，制成模拟发酵乳(以下记载为“酸乳”)。另外，利用TaKaRa BCA蛋白定量试剂盒(Takara Bio Inc.)对酸乳1.0mL中的蛋白质量进行定量。
(2)在(1)的酸乳1.0mL中添加50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)，以蛋白质浓度成为11.9mg/mL、5.9mg/mL、3.0mg/mL、1.5mg/mL、0.7mg/mL的方式稀释。接着将试样在5000×g、室温下离心分离15分钟。除去上清液，添加纯水1mL，测定悬浮液的蛋白质量。应予说明，蛋白质量利用TaKaRa BCA蛋白定量试剂盒(Takara Bio Inc.)进行定量，作为蛋白质残留量。另外，将由“(1－蛋白质残留量/(1)的酸乳1.0mL中的蛋白质量)×100”的计算式求出的值作为除去率。
(3)结果
如表1所示，稀释后的蛋白质浓度为3.0mg/mL以下时，能够除去约92％以上的蛋白质，特别是蛋白质浓度为1.5mg/mL以下时，能够除去约98％以上的蛋白质，蛋白质的残留量大幅减少。
[表1]
参考例2酸乳中的蛋白质的除去(2)
与参考例1(2)同样地在酸乳1.0mL中分别添加25mM～100mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)、100mM～1000mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)、50mM～500mM的HEPES缓冲液(pH7.0)，以蛋白质浓度成为3.0mg/mL的方式稀释。接着将试样在5000×g、室温下离心分离15分钟。除去上清液，添加10mL的相同的缓冲液，用吸管和旋涡混合器使沉淀悬浮。在5000×g、室温下离心分离15分钟，除去上清液，再次使沉淀悬浮后，在同样的条件下离心分离。除去上清液，添加纯水1mL，测定悬浮液的蛋白质量，作为蛋白质残留量。另外，与参考例1同样地求出除去率。将结果示于表2。
如表2所示，即使变更缓冲液的种类、浓度也能够除去蛋白质。另外，通过在最初的稀释工序、离心分离工序后加入清洗工序，与参考例1相比能够提高蛋白质除去率。
[表2]
参考例3酸乳中的蛋白质的除去(3)
与参考例1(2)同样地在酸乳1.0mL中添加50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)，以蛋白质浓度成为3.0mg/mL的方式稀释。对稀释后的试样分别进行以下1)～5)的处理。
1)筛网处理：通过Filcon S Syringe10μm筛网(BD Medimachine)30次。
2)加温处理：在40℃的恒温水槽中静置10分钟。
3)均化器处理：用安装有S10N-10G发电机(IKA)的T10 basic ULTRA-TURRAX均化器(IKA)以30000rpm搅拌1分钟。
4)匀质器处理：装入塑料袋中，用Stomachere Pro-media SH-IIM(Elmex Co.,Ltd)处理10分钟。
5)超声波处理：用超声波槽US-104N(振荡38kHz、输出150W)处理10分钟。
接下来将处理过的试样在5000×g、室温下离心分离15分钟。除去上清液，添加纯水1mL，测定悬浮液的蛋白质量，作为蛋白质残留量。另外，与参考例1同样地求出除去率。将结果示于表3。
根据表3，无论哪种处理都能使蛋白质的除去率提高，残留量与没有进行处理的情况相比减半。
[表3]
实施例1从发酵乳中回收菌体
(1)发酵乳的制备
将在以121℃加热灭菌15分钟的10％(w/v)脱脂乳上接种0.1％(v/v)的LcS(干酪乳杆菌YIT 9029)并在好氧条件下的37℃培养48小时而得的发酵乳(pH4.6)作为“LcS发酵乳”。同样地，将接种0.1％(v/v)的LL(乳酸乳球菌YIT 2027)或者ST(嗜热链球菌YIT 2001)并在好氧条件下的30℃(LL)或37℃(ST)培养24小时而成的发酵乳(各自为pH4.3、4.0)分别作为“LL发酵乳”和“ST发酵乳”。
另外，将在以厌氧条件下的115℃加热灭菌20分钟的双歧杆菌用乳培养基(12％(w/v)脱脂奶粉、0.2％碳酸钙、0.1％酵母提取物、0.03％半胱氨酸盐酸盐)上接种1.0％(v/v)的BB(短双歧杆菌YIT 12272)并在厌氧条件下的37℃培养11小时而得的发酵乳(pH4.7)作为“BB发酵乳”。
测定各发酵乳1.0mL中的蛋白质量、总菌数和活菌数，将所测定的值记为稀释前蛋白质量、稀释前总菌数和稀释前活菌数。总菌数和活菌数的测定如下进行。
(2)在(1)的发酵乳1.0mL中添加50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)，以蛋白质浓度成为0.7mg/mL的方式稀释。接下来将试样在5000×g、室温下离心分离15分钟。除去上清液，添加10mL的相同的缓冲液，用吸管和旋涡混合器使沉淀悬浮。接着，在5000×g、室温下离心分离15分钟，除去上清液。添加纯水1mL，测定悬浮液的蛋白质量、总菌数和活菌数，将所测定的值作为残留蛋白质量、残留总菌数和残留活菌数。另外，将由“1－(残留蛋白质量/稀释前蛋白质量)×100”的计算式求出的值作为蛋白质除去率，将由“残留总菌(活菌)数/稀释前总菌(活菌)数×100”的计算式求出的值作为总菌(活菌)数回收率。
(3)将(2)中发酵乳以蛋白质浓度成为0.7mg/mL的方式稀释后，进行筛网处理(通过Filcon S Syringe10μm筛网30次)，其后的操作与(2)同样地进行，测定残留蛋白质量、残留总菌数和残留活菌数。
＜总菌数的测定＞
利用DAPI的核酸染色法进行了计数。将用70％乙醇稀释成20～50倍的试样在带有1cm×1cm方格(桝)的MAS涂层载玻片(松浪硝子工业株式会社)的各方格上涂布5μL。风干后，以4.5μL/方格滴加VECTASHIELD Mounting Medium for Fluorescence with DAPI H-1200(Vector Laboratories，Inc.)，在其上放置盖玻片(松浪硝子工业株式会社)。观察载玻片使用光学显微镜Leica DM5500 B(Leica Biosystems)，荧光图像的取得使用LeicaMMAF***(Leica Biosystems)。利用A4(DAPI用)荧光滤光片，使DAPI(激发光358nm、释放荧光461nm)的荧光为单色对每1方格拍摄10个视野后，用图像解析用软件Image-Pro Plusver.6.1(株)(Nippon Roper株式会社)进行图像解析，算出每1mL稀释液中的细胞数。将4～8个方格的平均值乘以稀释倍率，作为该样品中的细胞数(cells/mL)。
＜活菌数的测定＞
使用螺旋接种仪Spiral Plater EDDY JET 2(IUL Instruments GmbH)将用0.85％(w/v)氯化钠水溶液(生理盐水)适当稀释过的试样涂布在MRS平板培养基(在BDDifco乳酸杆菌MRS肉汤中添加1.5％(w/v)BA-30琼脂(伊那食品工业株式会社))上。
将涂布有菌的平板培养基在好氧条件下的37℃培养2天时间以上。用自动计数装置ProtoCOL3(Synoptics Ltd.)计测产生的菌落的数目，由稀释倍率算出每1mL菌液的菌落形成单位(CFU)数，作为活菌数。应予说明，由于在好氧条件下进行操作，所以预料对活菌数有很大影响的BB未测定活菌数。
(4)结果
如表4所示，几乎所有的蛋白质都可以从任一种菌属的细菌的发酵乳中除去，并且能够回收半数以上的菌体。另外，认为BB的总菌数回收率超过100％是由于与凝乳牢固结合的菌块随着牛奶蛋白的溶解而分散，因此表观上的回收菌数变多。另外，除BB以外，通过进行筛网处理，发现菌体的回收率有提高的趋势。
[表4]
实施例2从乳制品中回收菌体
(1)在以含有LcS的发酵乳为原料的制品“Yakult 400LT”(Yakult Honsha Co.,Ltd.)(以下也称为制品)50mL中，添加50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)，以蛋白质浓度成为约1.6mg/mL的方式稀释。通过筛网(Filcon S Syringe10μm)2次后，将试样在5000×g、室温下离心分离15分钟。除去上清液，向相当于试样1mL的沉淀以2mL的比例添加相同的缓冲液，用吸管和旋涡混合器使沉淀悬浮。接下来，在5000×g、室温下离心分离15分钟，除去上清液。添加纯水1mL，用与实施例1同样的方法测定悬浮液(回收液)的残留总菌数和残留活菌数。另外，测定制品1.0mL中的稀释前总菌数和稀释前活菌数，由“残留总菌(活菌)数/稀释前总菌(活菌)数×100”的计算式求出回收率。
(2)结果
从外观未发现明显的乳蛋白质的残留，如表5所示，总菌数、活菌数的回收率均为80～94％，没有大的菌数的损失，也没有对菌体的伤害，能够从乳制品中分离LcS。
[表5]

Claims (9)

1.一种微生物的回收方法，是从含有发酵乳的检测样品中回收微生物的方法，该方法依次进行(a)使用缓冲液将检测样品以蛋白质浓度成为3mg/mL以下的方式稀释的工序、(b)离心分离的工序、以及(c)清洗回收的工序，由此从检测样品中回收微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以蛋白质浓度成为2mg/mL以下的方式稀释。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，缓冲液为pH6.5～7.5的缓冲液。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，缓冲液为磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液或者HEPES缓冲液。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述缓冲液的浓度为25mM～1000mM。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，缓冲液为25mM～100mM磷酸钾缓冲液。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在工序(a)后接着实施选自筛网处理、加温处理、均化器处理、匀质器处理和超声波处理中的处理。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，微生物为活菌。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，检测样品为酸性乳饮料。
CN202180079366.0A 2020-11-30 2021-11-29 检测样品中的微生物菌体的回收方法 Pending CN116529356A (zh)

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