CN116528879A

CN116528879A - 用于表征t细胞杂质的流式细胞术方法

Info

Publication number: CN116528879A
Application number: CN202180073911.5A
Authority: CN
Inventors: 蔡绮; J·柯兹纳; D·H·T·李; B·索里拉扬; M·曾; H·沃沙库恩
Original assignee: Kite Pharma Inc
Current assignee: Kite Pharma Inc
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2023-08-01
Also published as: AU2021369507A1; US20220155299A1; WO2022093925A1; EP4237854A1; US20240168016A1

Abstract

本发明公开了用于血细胞群体的荧光激活细胞分析的组合物和方法。

Description

用于表征T细胞杂质的流式细胞术方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年10月28日提交的美国临时申请号63/106,728的权益，该美国临时申请据此出于所有目的全文以引用方式并入本文。

技术领域

背景技术

从血液样品制备的T细胞免疫疗法产品含有非T细胞杂质，诸如B细胞、NK细胞和单核细胞。考虑到这种细胞异质性，需要多种标志物来鉴定和表征单独子集。需要在T细胞免疫疗法产品的生产过程的不同阶段和在最终产物中表征和定量那些杂质的水平的方法。

发明内容

在一个实施方案中，本公开提供了用于对富含淋巴细胞的样品中的CD3-细胞杂质进行流式细胞术定量的方法和组合物。在一个实施方案中，本公开提供了符合目的的2-8色T细胞杂质流式细胞术组(panel)，该组检测多达七种不同的血细胞表面标志物并且还包括活力染料。在一个实施方案中，本公开提供了使用该组来检测和定量在用于免疫疗法的T细胞产物的不同制造阶段获得的样品中的CD3-细胞的方法。本文所公开的组和方法具有几种促进效率的性质，包括但不限于易于使用、消除滴定不同抗体批次的需要、包含批次匹配的同种型对照、批次间一致性、室温下的长期稳定性、使易于出错的移液步骤和混合最小化、流线型工作流程和改善的数据可靠性。在一个实施方案中，该组或方法可用于表征用于免疫疗法的T细胞群体中的杂质。以下是本公开的示例性、非限制性实施方案。

一种在细胞群体中同时鉴定淋巴细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合中的两者或更多者的方法，该方法包括使用如表2中所述的这些细胞的表面上的标志物中的两种或更多种标志物，任选地以及如表3、表4和表5中所述的荧光标记的抗体中的一种或多种荧光标记的抗体，使用荧光检测方法，来同时检测淋巴细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞和/或早期B细胞祖细胞中的两者或更多者的存在或不存在。

一种评估主要包括CD4+和/或CD8+T细胞的细胞群体中的非CD3+污染物的方法，该方法包括使所述细胞群体与针对淋巴细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞和/或早期B细胞祖细胞的特异性表面标志物的一种或多种抗体接触以产生混合物，其中该特异性细胞表面标志物中的两种或更多种特异性细胞表面标志物描述于表2中，任选地，其中该一种或多种抗体选自表3、表4和表5；以及通过荧光检测方法分析混合物中具有特异性细胞表面标志物的细胞的分布。

一种通过免疫疗法治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用T细胞制备物，其中该T细胞制备物中的CD3-杂质(例如，NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合)中的一种或多种CD3-杂质是通过根据实施方案1和2中任一项所述的方法表征的。

在实施方案中，该T细胞制备物是自体的，任选地来自癌症患者或健康供体。

在实施方案中，该T细胞制备物是同种异体的，任选地来自癌症患者或健康供体。

在实施方案中，该T细胞是用CAR或T细胞受体工程改造的。

一种用于确定T细胞产物是否适合于免疫疗法的方法，该方法包括使用表3、表4和表5中所述的抗体或抗体混合物中的一者表征该T细胞产物中的CD3-细胞杂质(例如，NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合)中的一种或多种CD3-细胞杂质；以及基于该T细胞产物中这些CD3-细胞杂质的水平确定该T细胞产物是否适合。

在实施方案中，可接受的水平由管理机构(例如，FDA、EMEA等)设定。

一种用于使用表3、表4和表5中所述的抗体或抗体混合物中的一者或多者在血细胞群体中鉴定T淋巴细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞总淋巴细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合中的至少一者的测定或试剂盒。

在实施方案中，该测定或试剂盒用于表征用于免疫疗法的T细胞产物中CD3-细胞的存在。

在实施方案中，该试剂盒包含(a)一种或多种抗体，这些抗体用于检测这些细胞中的任何一种或多种细胞的一种或多种细胞表面标志物(参见例如表2)；和(2)试剂，这些试剂用于进行该抗体与这些细胞表面标志物的结合；以及任选地(3)使用这些试剂用于该试剂盒的目的的使用说明书。

在实施方案中，抗体(两种或更多种)都在同一容器(例如，Lyovial)中一起冻干。

在实施方案中，抗体选自表3。

在实施方案中，抗体选自表4。

在实施方案中，抗体选自表5。

一种组合物，该组合物包含用于鉴定细胞群体中T细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合的存在或不存在的一组荧光标记的抗体，该一组荧光标记的抗体包括针对表2中鉴定出的细胞表面标志物中的两种或更多种细胞表面标志物的两种或更多种抗体，任选地其中表3、表4或表5中描述了这些抗体中的一种或多种抗体。

在实施方案中，该组合物包含表3、表4或表5中的所有抗体，任选地连同细胞活力标志物。

在实施方案中，该组合物包含针对表2中的所有细胞表面标志物的抗体，任选地连同细胞活力标志物。

在实施方案中，该组合物包含与表6相同的量或为这种量的相同倍数(例如，所有量相等地加倍、变成三倍、变成四倍等)的表6中所述的所有抗体。

附图说明

图1A和图1B抗CD3 APC(A)和抗CD14 PerCP-Cy5.5(B)的抗体滴定和单独散点图。

图2A和图2B示出了在使用健康供体(图2A流式细胞术抗体染色组-CD10-FITC/CD56-PE/CD14-PerCP-Cy5.5/CD19-PECy7/CD3-APC/CD34-BV421/CD45-V500)混合物和冻干试剂(图2B流式细胞术抗体染色组-CD10-FITC/CD56-PE/CD14-PerCP-Cy5.5/CD19-PECy7/CD3-APC/CD34-BV421/CD45-V500)试剂)，用液体进行的测定之间的FACS染色比较。

图3A示出了使用冻干试剂的临床样品的FACS染色的示例，并且图3B示出了使用患者和健康供体样品的冻干试剂的10天稳定性。图3B示出了来自表16的数据。

图4示出了测定间的精确度是最佳的。

图5方法特异性：CD34、CD19和CD56抗体检测评估的曲线图。

图6方法稳健性：抗体染色孵育时间。

具体实施方式

定义：

除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个术语应具有下文所阐述的含义。在整个本申请中阐述了附加定义。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的含义。例如，由John E.Coligan、AdaM.Kruisbeek、David H.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober编辑的手册“现代免疫学方案(Current Protocols In Immunology)”，(系列编辑：Richard Coico)，ISBN0471522767；“生物医学和分子生物学简明词典(Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology)”,Juo,Pei-Show，第2版，2002年，CRC出版社(CRC Press)；“细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)”，第3版，1999年，学术出版社(Academic Press)；以及“牛津生物化学与分子生物学词典(OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology)”，修订版，2006年，牛津大学出版社(Oxford University Press)为技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义该范围的数字。本文提供的公开内容并不限制本申请的各个方面，其可以参考作为整体的本说明书。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Juo，“生物医学与分子生物学简明词典(TheConcise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)”，第2版，2001年，CRC出版社(CRC Press)；“细胞与分子生物学词典(The Dictionary of Cell&MolecularBiology)”，第5版，2013年，学术出版社(Academic Press)；以及“牛津生物化学与分子生物学词典(The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)”，Cammack等人编辑，第2版，2006年，牛津大学出版社(Oxford University Press)为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

冠词“一个/一种(a/an)”是指任何叙述或列举的组分的“一个或多个/一种或多种”。

术语“约”或“基本上由……组成”是指在如本领域普通技术人员所确定的某个值或组成的可接受误差范围内的值或组成，这将部分地取决于如何测量或确定该值或组成，即测量***的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由……组成”可意指在1个或超过1个标准偏差内。可替代地，“约”或“基本上由……组成”可意指至多10％(即，±10％)的范围。例如，约3mg可包括在2.7mg与3.3mg之间的任何数量(对于10％)。关于生物***或过程，该术语可意指至多一个数量级或至多5倍的值。当在本申请和权利要求中提供某些值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“基本上由……组成”的含义包括在该值或组成的可接受误差范围。任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围包括在所叙述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。作为示例，根据本领域的实践，“约”或“大约”可意指在一个或超过一个标准偏差内。“约”或“大约”可意指至多10％(即，±10％)的范围。因此，“约”可被理解为在比所述值大或小10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。例如，约5mg可包括4.5mg与5.5mg之间的任何量。此外，特别是对于生物***或过程而言，这些术语可意指某个值的至多一个数量级或至多5倍。当在本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“大约”的含义应被假定在该特定值或组成的可接受误差范围内。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”被理解为包含性的并且涵盖“或”和“和”两者。术语“和/或”是指两个指定特征或部件中的每一者连同或不连同另一者。因此，如在本文中诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独的)和“B”(单独的)。类似地，如在诸如“A、B和/或C”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

术语“例如”和“即”仅以举例的方式使用，并非旨在进行限制，并且不被解释为仅指代说明书中明确列举的那些项目。

术语“或更多”、“至少”、“超过”等例如“至少一个”包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过xyx”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个xyx。还包括其间任何更小的数字或分数。

术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二”等包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。

在整个说明书中，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”之类的变型形式被理解为暗示包含所述元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤或者元素、整数或步骤的组。应当理解，无论本文在何处用语言“包括”描述各方面，还提供了按照“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的其他类似方面。术语“由……组成”排除未在权利要求中指明的任何要素、步骤或成分。至于Gray,53F.2d 520,11USPQ 255(CCPA 1931)；片面地Davis,80USPQ 448,450(Bd.App.1948)(“由……组成”定义为“闭合权利要求以包括除通常与其相关的杂质以外的与所叙述的那些材料不同的材料”)。术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些材料或步骤。

如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括在所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。

术语“施用”(administration/Administering)等是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送***中的任何一种将药剂物理引入受试者中。用于通过本文所公开的方法制备的免疫细胞的示例性施用途径包括静脉内(i.v.或IV)、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径(例如，通过注射或输注)。肠胃外施用途径是指除了肠内和局部施用之外的施用模式(通常通过注射)，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。在一个实施方案中，通过本发明方法制备的免疫细胞(例如，T细胞)通过注射或输注施用。非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、***、直肠、舌下或局部。也可以一次、两次或在一个或多个延长的时间段内多次执行施用。在施用一种或多种治疗剂(例如，细胞)的情况下，该施用可伴随地或序贯地进行。序贯施用包括仅在已完成另一种或多种药剂的施用之后才施用一种药剂。

术语“抗体”(Ab)包括但不限于特异性结合抗原的免疫球蛋白。一般而言，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条H链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区可包含三个或四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和/或CH4。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区可包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，其从氨基末端到羧基末端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白可以来源于任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类或亚类(例如，IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体两者；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。非人抗体可以通过重组方法人源化，以降低其在人体内的免疫原性。在未明确说明的情况下，并且除非上下文另外指示，否则术语“抗体”还包括前述免疫球蛋白中的任一种免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，单价和二价的片段或部分，以及单链抗体。

“抗原结合分子”、“抗体片段”等是指小于整个抗体的任何抗体部分。抗原结合分子可包含抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体以及由抗原结合分子形成的多特异性抗体。在一个方面，CD19CAR构建体包含抗CD19单链FV。“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的重链可变(V_H)结构域和轻链可变(V_L)结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般来讲，Fv多肽还包含V_H结构域和V_L结构域之间的多肽接头，这使scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。本文所使用的所有抗体相关术语均采用本领域中的惯常含义并且为本领域普通技术人员所充分理解。

“抗原”是指引起免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的活化，或两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)都可用作抗原。抗原可内源表达，即由基因组DNA表达，或者可重组表达。抗原可特异于某种组织(诸如癌细胞)，或者其可广泛表达。另外，较大分子的片段可充当抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。

术语“中和”是指结合配体并防止或降低该配体的生物学作用的抗原结合分子、scFv、抗体或其片段。在一些实施方案中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段直接阻断配体上的结合位点，或通过间接方式(例如，配体中的结构或能量改变)改变配体的结合能力。在一些实施方案中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段防止与其结合的蛋白质执行生物学功能。

术语“自体”是指来源于同一个体并且稍后再次引入该个体的任何材料。例如，本文所述的工程改造的自体细胞疗法方法涉及从个体(诸如供体或患者)收集淋巴细胞，然后将其工程改造以表达CAR构建体，随后施用回同一个体中。

术语“同种异体”是指来源于一个个体并且随后引入相同物种的另一个个体的任何材料，例如同种异体T细胞移植。

“癌”是指一组广泛的特征在于体内异常细胞的不受控制生长的各种疾病。不受调节的细胞***和生长导致恶性肿瘤的形成，恶性肿瘤侵袭邻近组织并且还可通过淋巴***或血流转移到身体的远端部分。“癌”或“癌组织”可包括各个阶段的肿瘤。在一个实施方案中，癌或肿瘤处于0期，使得例如该癌或肿瘤在非常早期的发育中并且尚未转移。在另一个实施方案中，癌或肿瘤处于I期，使得例如该癌或肿瘤的大小相对较小，没有扩散到附近的组织中，并且尚未转移。在其他实施方案中，癌或肿瘤处于II期或III期，使得例如该癌或肿瘤大于0期或I期中，并且其已经生长到相邻组织中，但其尚未转移，除了潜在地***之外。在附加实施方案中，癌或肿瘤处于IV期，使得例如该癌或肿瘤已转移。IV期也可以称为晚期或转移性癌。

在某些实施方案中，癌可以选自源自以下各项的肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、腺样囊性癌、肾上腺皮质癌、癌症、AIDS相关癌、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/杆状瘤、中枢神经***癌、B细胞白血病、淋巴瘤或其他B细胞恶性肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、中枢神经***癌、***、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性脊髓增生性障碍、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、胚胎肿瘤、中枢神经***癌、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、成感觉神经细胞瘤、尤因肉瘤家族肿瘤颅外生殖细胞瘤、颅外生殖细胞瘤肝外胆管癌、眼癌、骨纤维组织细胞瘤、恶性肿瘤、骨肉瘤、胆囊癌、胃(gastric/stomach)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、软组织肉瘤、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性)、原位小叶癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌伴有隐匿性原发性中线束癌(涉及NUT基因)、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、慢性髓性白血病(CML)、急性髓样白血病(AML)、多发性骨髓瘤、骨髓增生性障碍、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、***状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、中间体分化松果体瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始性神经外胚层肿瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经***(CNS)淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(gastric/stomach)癌、幕上原始性神经外胚层肿瘤、t细胞淋巴瘤、皮肤癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞瘤、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、***癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症、Wilms肿瘤。

在一个实施方案中，该方法可以用于***，其中该肿瘤是淋巴瘤或白血病。淋巴瘤和白血病是特异性地影响淋巴细胞的血液癌。血液中的所有白细胞均源自骨髓中发现的单一类型的多能造血干细胞。这种干细胞产生骨髓祖细胞和淋巴祖细胞两者，然后该骨髓祖细胞和淋巴祖细胞产生在体内发现的各种类型的白细胞。由骨髓祖细胞产生的白细胞包括T淋巴细胞(T细胞)、B淋巴细胞(B细胞)、自然杀伤细胞和浆细胞。由淋巴祖细胞产生的白细胞包括巨核细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。淋巴瘤和白血病可能影响患者中的这些细胞类型中的一种或多种细胞类型。

通常，淋巴瘤可以被分成至少两个子组：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤(NHL)是源自B淋巴细胞、T淋巴细胞或自然杀伤细胞的异质癌组。在美国，B细胞淋巴瘤代表80-85％的所报告病例。在2013年，估计发生了大约69,740例与疾病相关的新的NHL病例和超过19,000例死亡病例。非霍奇金淋巴瘤是最普遍的血液恶性肿瘤，并且是男性和女性中新癌的第七大主要部位，并且占所有新癌病例的4％和与癌相关的死亡病例的3％。

在一些实施方案中，该方法可以用于治疗淋巴瘤或白血病，其中该淋巴瘤或白血病是B细胞恶性肿瘤。B细胞恶性肿瘤的实例包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL/CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、FL、边缘区淋巴瘤(MZL)、结节外(MALT淋巴瘤)、结节(单核细胞样B细胞淋巴瘤)、脾脏弥漫性大细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和淋巴母细胞性淋巴瘤。在一些方面，淋巴瘤或白血病选自B细胞慢性淋巴细胞白血病/小细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤(例如，华氏巨球蛋白血症)、脾脏边缘区淋巴瘤、多毛细胞白血病、浆细胞肿瘤(例如，浆细胞骨髓瘤(即，多发性骨髓瘤、或浆细胞瘤)、结节外边缘区B细胞淋巴瘤(例如、MALT淋巴瘤)、节点边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化的滤泡性淋巴瘤(TFL)、原发性皮肤毛囊中心淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、Epstein-Barr病毒阳性DLBCL、淋巴细胞样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK+大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯特曼病中产生的大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、T细胞性幼淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、结节外NK/T细胞淋巴瘤、肠病相关T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病/塞扎里综合征、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、外周T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤、B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤伴有复发性遗传异常、T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在一些方面，癌对一种或多种既往治疗是难治性的，和/或癌在一种或多种既往治疗之后已经复发。

在一个实施方案中，癌选自滤泡性淋巴瘤、转化的滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和原发性纵膈(胸腺)大B细胞淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌是弥漫性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，癌对化学疗法、放射疗法、免疫疗法(包括T细胞疗法和/或用抗体或抗体-药物缀合物治疗)、自体干细胞移植或它们的任何组合中的一种或多种疗法是难治性的，或已在所述一种或多种疗法之后复发。在一个实施方案中，癌是难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。

如本文所用，“抗肿瘤作用”是指可表现为但不限于肿瘤体积减小、对肿瘤生长的抑制、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、转移数量/程度减小、总体或无进展生存期增加、预期寿命增加或与肿瘤相关的各种生理症状改善的生物学作用。抗肿瘤作用还可指肿瘤发生的预防，例如疫苗。

“治疗有效量”、“治疗有效剂量”等是指通过本发明方法产生(产生T细胞产物)并且当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时保护或治疗受试者免于疾病的发作或促进疾病消退(如通过疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率的增加和持续时间增加、和/或防止由于疾病折磨引起的损伤或失能所证明的)的细胞(诸如免疫细胞或工程改造的T细胞)的量。可使用技术人员已知的多种方法(诸如在临床试验期间的人类受试者中、在预测对人的功效的动物模型***中或通过在体外测定法中测定药剂的活性)来评估促进疾病消退的能力。在一些实施方案中，从患者获得用于T细胞疗法的供体T细胞(例如，用于自体T细胞疗法)。在其他实施方案中，从不是患者的受试者获得用于T细胞疗法的供体T细胞。可以以治疗有效量施用T细胞。例如，治疗有效量的T细胞(例如，工程改造的CAR+T细胞或工程改造的TCR+T细胞)可以是至少约10⁴个细胞、至少约10⁵个细胞、至少约10⁶个细胞、至少约10⁷个细胞、至少约10⁸个细胞、至少约10⁹个或至少约10¹⁰个。在另一个实施方案中，治疗有效量的T细胞是约10⁴个细胞、约10⁵个细胞、约10⁶个细胞、约10⁷个细胞或约10⁸个细胞。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR T细胞是约2×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、约1×10⁷个细胞/kg、约2×10⁷个细胞/kg、约3×10⁷个细胞/kg、约4×10⁷个细胞/kg、约5×10⁷个细胞/kg、约6×10⁷个细胞/kg、约7×10⁷个细胞/kg、约8×10⁷个细胞/kg或约9×10⁷个细胞/kg。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞介于每kg体重约1×10⁶与约2×10⁶个CAR阳性活T细胞之间直至约1×10⁸个CAR阳性活T细胞的最大剂量。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞介于约0.4×10⁸与约2×10⁸个CAR阳性活T细胞之间。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞是约0.4×10⁸、约0.5×10⁸、约0.6×10⁸、约0.7×10⁸、约0.8×10⁸、约0.9×10⁸、约1.0×10⁸、约1.1×10⁸、约1.2×10⁸、约1.3×10⁸、约1.4×10⁸、约1.5×10⁸、约1.6×10⁸、约1.7×10⁸、约1.8×10⁸、约1.9×10⁸或约2.0×10⁸个CAR阳性活T细胞。

如本文所用，术语“淋巴细胞”可包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞、NK-T细胞或B细胞。NK细胞是一种细胞毒性(对细胞有毒的)淋巴细胞，其代表固有免疫***的主要组分。NK细胞通过细胞凋亡或程序性细胞死亡过程排斥被病毒感染的肿瘤和细胞。它们被称为“自然杀手”，因为它们不需要活化即可杀死细胞。T细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中起主要作用。T细胞受体(TCR)将它们自身与其他淋巴细胞类型区分开。胸腺是免疫***的专门器官，主要负责T细胞的成熟。

存在几种类型的“免疫细胞”，包括但不限于巨噬细胞(例如，肿瘤相关巨噬细胞)、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞、T细胞、NK-T细胞、肥大细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)和树突状细胞。术语还包括这些免疫细胞的前体。造血干细胞和/或祖细胞可通过本领域已知的方法从骨髓、脐带血、细胞因子动员之后的成年外周血等衍生。一些前体细胞是可分化成淋巴样谱系(例如淋巴样谱系的造血干细胞或祖细胞)的那些细胞。可用于免疫疗法的附加免疫细胞实例描述于美国公布20180273601中，该专利全文以引用方式并入本文。

T细胞还有几种类型，即：辅助T细胞(例如，CD4+细胞、效应T_EFF细胞)、细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、细胞溶解T细胞、CD8+T细胞或杀伤性T细胞)、记忆T细胞((i)干记忆T_SCM细胞(如幼稚细胞)是CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+的，但它们还表达大量的CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出许多记忆细胞特有的功能属性)；(ii)中央记忆T_CM细胞表达L-选择素并且是CCR7⁺和CD45RO⁺的，它们分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，然而(iii)效应记忆T_EM细胞不表达L-选择素或CCR7，但确实表达CD45RO并产生效应细胞因子如IFNγ和IL-4)、调节性T细胞(Treg、抑制性T细胞，或CD4⁺CD25⁺调节性T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT)和γδT细胞。在肿瘤内发现的T细胞被称为“肿瘤浸润性淋巴细胞”(TIL)。另一方面，B细胞在体液免疫(有抗体参与)中起主要作用。其制造抗体和抗原并发挥抗原递呈细胞(APC)的作用，并在通过抗原相互作用活化后转变为记忆B细胞。在哺乳动物中，未成熟B细胞在其名称所来源的骨髓中形成。

“幼稚”T细胞是指保持免疫未分化的成熟T细胞。在胸腺中阳性和阴性选择后，T细胞作为CD4⁺或CD8⁺幼稚T细胞出现。在它们的幼稚状态中，T细胞表达L-选择素(CD62L⁺)、IL-7受体α(IL-7R-α)和CD132，但它们不表达CD25、CD44、CD69或CD45RO。如本文所用，“未成熟”还可以指表现出幼稚T细胞或未成熟T细胞(诸如T_SCM细胞或T_CM细胞)的表型特征的T细胞。例如，未成熟T细胞可以表达L-选择素(CD62L⁺)、IL-7Rα、CD132、CCR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1中的一种或多种。幼稚或未成熟T细胞可以与末端分化效应T细胞(诸如T_EM细胞和T_EFF细胞)形成对比。

术语细胞“增殖”(proliferation或proliferating等)是指细胞通过细胞***以数字生长的能力。增殖可通过用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色细胞来测量。可能在体外(例如，在T细胞培养期间)或在体内(例如在施用免疫细胞疗法(例如，T细胞疗法)之后)发生细胞增殖。细胞增殖可通过本文所述或本领域已知的方法来测量或确定。例如，可通过活细胞密度(VCD)或总活细胞(TVC)来测量或确定细胞增殖。VCD或TVC可以是理论的(在某个时间点从培养物中获取等分试样或样品以确定细胞数目，然后将该细胞数量乘以研究开始时的培养体积)或实际的(在某个时间点从培养物中获取等分试样或样品以确定细胞数量，然后将该细胞数量乘以在某个时间点的实际培养体积)。术语“T细胞活性”是指健康T细胞常见的任何活性。在一个实施方案中，T细胞活性包括细胞因子产生(诸如INFγ、IL-2和/或TNFα)。在其他实施方案中，T细胞活性包括产生一种或多种选自干扰素γ(IFNγ或IFN-γ)、组织坏死因子α(TNFα或IFNα)和两者的细胞因子。术语“细胞溶解活性”、“细胞毒性”等是指T细胞破坏靶细胞的能力。在一个实施方案中，靶细胞是癌细胞，例如肿瘤细胞。在其他实施方案中，T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)，并且靶细胞表达靶抗原。

术语“基因工程改造的”、“基因编辑”或“工程改造的”是指修饰细胞的基因组的方法，包括但不限于删除编码区或非编码区或者其一部分，或者***编码区或其一部分。在一个实施方案中，经修饰的细胞是可从患者或供体获得的淋巴细胞(例如T细胞)。可修饰细胞以表达掺入细胞基因组中的外源构建体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。

术语“转导”和“转导的”是指通过病毒载体将外源DNA引入细胞的过程(参见Jones等人，“遗传学：原理与分析(Genetics:principles and analysis)”，波士顿：琼斯和巴特利特出版社(Boston:Jones&Bartlett Publ.)，(1998))。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、RNA载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、***病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关联载体、慢病毒载体或它们的任何组合。

本申请的嵌合抗原受体(CAR或CAR-T)和T细胞受体(TCR)是基因工程改造的受体。根据本领域已知的技术，这些工程改造的受体可容易地***包括T细胞在内的免疫细胞中并由其表达。使用CAR，可对单个受体进行编程，使其既识别特异性抗原，又在结合该抗原时激活免疫细胞以攻击并破坏携带或表达该抗原的细胞。当这些抗原存在于肿瘤细胞上时，表达CAR的免疫细胞可靶向并杀死肿瘤细胞。在一个实施方案中，根据本申请制备的细胞是具有包含抗原结合分子、一个或多个共刺激结构域和一个或多个激活结构域的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体的细胞。共刺激结构域可包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一个实施方案中，细胞外结构域包含铰链或截短的铰链结构域。

“抗原结合分子”可包括与肿瘤抗原的结合分子。结合分子可以是抗体或其抗原结合分子。例如，抗原结合分子可以选自scFv、Fab、Fab'、Fv、F(ab')2和dAb以及它们的任何片段或组合。嵌合抗原受体还可以包括铰链区。铰链区可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、CD28或CD8α的铰链区。在一个实施方案中，铰链区衍生自IgG4的铰链区。嵌合抗原受体还可以包含跨膜结构域。跨膜结构域可以是任何跨膜分子的跨膜结构域，该跨膜结构域是免疫细胞上的共受体或免疫球蛋白超家族成员的跨膜结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域衍生自以下物质的跨膜结构域：CD28、CD28T、CD8α、CD4或CD19。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含衍生自CD28跨膜结构域的结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含衍生自CD28T跨膜结构域的结构域。

“抗原”可以是肿瘤抗原，该肿瘤抗原选自707-AP(707丙氨酸脯氨酸)、AFP(阿尔法(a)-甲胎蛋白)、ART-4(由T4细胞识别的腺癌抗原)、BAGE(B抗原；b-连环蛋白/m、b-连环蛋白/突变的)、BCMA(B细胞成熟抗原)、Bcr-abl(裂点簇区-Abelson)、CAIX(碳酸酐酶IX)、CD19(分化簇19)、CD20(分化簇20)、CD22(分化簇22)、CD30(分化簇30)、CD33(分化簇33)、CD44v7/8(分化簇44，外显子7/8)、CAMEL(黑色素瘤上的CTL识别的抗原)、CAP-1(癌胚抗原肽1)、CASP-8(半胱天冬酶8)、CDC27m(突变的细胞***周期蛋白27)、CDK4/m(突变的环化素依赖性激酶4)、CEA(癌胚抗原)、CT(癌/睾丸(抗原))、Cyp-B(亲环蛋白B)、DAM(黑色素瘤上的分化抗原)、EGFR(表皮生长因子受体)、EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)、EGP-2(表皮糖蛋白2)、EGP-40(表皮糖蛋白40)、Erbb2、3、4(成红细胞白血病病毒癌基因同源物-2、-3、4)、ELF2M(突变的延伸因子2)、ETV6-AML1(Ets变体基因6/急性髓样白血病1基因ETS)、FBP(叶酸盐结合蛋白)、fAchR(胎儿乙酰胆碱受体)、G250(糖蛋白250)、GAGE(G抗原)、GD2(二唾液酸神经节苷2)、GD3(二唾液酸神经节苷3)、GnT-V(N-乙酰葡糖胺转移酶V)、Gp100(糖蛋白100kD)、HAGE(解旋酶抗原)、HER-2/neu(人表皮受体2/神经的；也称为EGFR2)、HLA-A(人白细胞抗原A)、HPV(人***瘤病毒)、HSP70-2M(突变的热休克蛋白70-2)、HST-2(人环状体肿瘤因子2)、hTERT或hTRT(人端粒酶逆转录酶)、iCE(肠道羧基酯酶)、IL-13R-a2(白介素13受体亚基α-2)、KIAA0205、KDR(激酶***区受体)、κ轻链、LAGE(L抗原)、LDLR/FUT(低密度脂质受体/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-L岩藻糖基转移酶)、LeY(Lewis-Y抗体)、L1CAM(L1细胞粘附分子)、MAGE(黑色素瘤抗原)、MAGE-A1(黑色素瘤相关抗原1)、MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、鼠CMV感染细胞、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑色素瘤抗原1/黑色素瘤抗原A)、MC1R(黑皮质素1受体)、肌球蛋白/m(突变的肌球蛋白)、MUC1(粘蛋白1)、MUM-1、-2、-3(黑色素瘤遍在突变蛋白1、2、3)、NA88-A(患者M88的NA cDNA克隆)、NKG2D(自然杀伤组2、成员D)配体、NY-BR-1(纽约乳腺分化抗原1)、NY-ESO-1(纽约食管鳞状细胞癌-1)、癌胚胎抗原(h5T4)、P15(蛋白质15)、p190较小bcr-abl(190KD蛋白质bcr-abl)、Pml/RARa(前髓细胞性白血病/视黄酸受体a)、PRAME(黑色素瘤的优先表达抗原)、PSA(***特异性抗原)、PSCA(***干细胞抗原)、PSMA(***特异性膜抗原)、RAGE(肾抗原)、RU1或RU2(肾遍在蛋白1或2)、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1或SART-3(排斥肿瘤的鳞状抗原1或3)、SSX1、-2、-3、4(滑膜肉瘤X1、-2、-3、-4)、TAA(肿瘤相关抗原)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白72)、TEL/AML1(易位Ets家族白血病/急性髓样白血病1)、TPI/m(突变的磷酸丙糖异构酶)、TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1或gp75)、TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2)、TRP-2/INT2(TRP-2/内含子2)、VEGF-R2(血管内皮生长因子受体2)、WT1(Wilms肿瘤基因)、以及它们的任何组合。在一个实施方案中，肿瘤抗原是CD19。

在一个实施方案中，本公开的T细胞产物用于“CD19定向的遗传修饰的自体T细胞免疫疗法”，该T细胞产物是指嵌合抗原受体(CAR)阳性免疫细胞的悬浮液。此类免疫疗法的实例是Clear CAR-T疗法，其使用不含循环肿瘤细胞并富集CD4+/CD8+T细胞的CAR-T细胞。另一个实例是阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)(也称为Axi-cel^TM，)。参见Kochenderfer等人，《免疫治疗杂志》(J Immunother)，2009年；32:689-702。在一个实施方案中，T细胞产物是brexucabtagene autoleucel(以前为KTE-X19；Tecartus)。其他非限制性示例包括JCAR017、JCAR015、JCAR014、Kymriah(tisagenlecleucel)、Uppsala U、抗CD19 CAR(NCT02132624)和UCART19(Celectis)。参见Sadelain等人，《自然综述：癌(NatureRev.Cancer)》，第3卷，2003年；Ruella等人，《最新血液恶性肿瘤报告(Curr Hematol MaligRep.)》，纽约施普林格出版社(Springer,NY)，2016年；以及Sadelain等人，《癌发现》(Cancer Discovery)(2013年4月)。为了制备CD19定向的基因修饰自体T细胞免疫疗法，可以收集患者自身的T细胞并且将其离体通过逆转录转导进行基因修饰而表达嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含连接到CD28和CD3-ζ共刺激结构域的抗CD19单链可变区片段(scFv)。在一些实施方案中，所述CAR包含与4-1BB和CD3-ζ共刺激结构域连接的鼠抗CD19单链可变片段(scFv)。可以扩增抗CD19 CAR T细胞并将其输注回患者体内，其中它们可以识别并消除表达CD19的靶细胞。

在一些实施方案中，将T细胞用T细胞受体(TCR)工程改造，该T细胞受体可包含与肿瘤抗原的结合分子。在一些方面，肿瘤抗原选自由以下组成的组：707-AP、AFP、ART-4、BAGE、BCMA、Bcr-abl、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44v7/8、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、Erbb2、3、4、ELF2M、ETV6-AML1、FBP、fAchR、G250、GAGE、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A、HPV、HSP70-2M、HST-2、hTERT或hTRT、iCE、IL-13R-a2、KIAA0205、KDR、κ轻链、LAGE、LDLR/FUT、LeY、L1CAM、MAGE、MAGE-A1、间皮素、鼠CMV感染细胞、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NKG2D配体、NY-BR-1、NY-ESO-1、癌胚胎抗原、P15、p190较小bcr-abl、Pml/RARa、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SSX1、-2、-3、4、TAA、TAG-72、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF-R2、WT1以及它们的任何组合。在一个方面，所述TCR包含与病毒癌基因的结合分子。在一个实施方案中，病毒癌基因选自人***瘤病毒(HPV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)。在其他实施方案中，TCR包含与睾丸、胎盘或胎儿肿瘤抗原的结合分子。在一个实施方案中，睾丸、胎盘或胎儿肿瘤抗原选自由以下组成的组：NY-ESO-1、滑膜肉瘤X裂点2(SSX2)、黑色素瘤抗原(MAGE)及它们的任何组合。在另一个实施方案中，TCR包含与谱系特异性抗原的结合分子。在附加实施方案中，谱系特异性抗原选自由以下组成的组：由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART-1)、gp100、***特异性抗原(PSA)、***特异性膜抗原(PSMA)、***干细胞抗原(PSCA)及它们的任何组合。在某些实施方案中，T细胞疗法包括向患者施用表达与CD19结合的嵌合抗原受体的工程改造的CAR T细胞并且还包含CD28共刺激结构域和CD3-ζ信号传导区。在附加实施方案中，该T细胞疗法包括向患者施用KTE-C19或KTE-X19。在一个方面中，抗原部分还包括但不限于Epstein-Barr病毒(EBV)抗原(例如，EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3、LMP-1、LMP-2)、甲型肝炎病毒抗原(例如，VP1、VP2、VP3)、乙型肝炎病毒抗原(例如，HBsAg、HBcAg、HBeAg)、丙型肝炎病毒抗原(例如，包膜糖蛋白E1和E2)、单纯疱疹病毒1型、2型或8型(HSV1、HSV2或HSV8)病毒抗原(例如，糖蛋白gB、gC、gC、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、UL20、UL32、US43、UL45、UL49A)、巨细胞病毒(CMV)病毒抗原(例如，糖蛋白gB、gC、gC、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM或其他包膜蛋白)、人免疫缺陷病毒(HIV)病毒抗原(糖蛋白gp120、gp41或p24)、流感病毒抗原(例如，血凝素(HA)或神经氨酸酶(NA))、麻疹或腮腺炎病毒抗原、人***瘤病毒(HPV)病毒抗原(例如，L1、L2)、副流感病毒病毒抗原、风疹病毒病毒抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)病毒抗原或水痘-带状疱疹病毒病毒抗原。在此类方面，细胞表面受体可以是任何TCR、或识别病毒感染靶细胞上的任何前述病毒抗原的任何CAR。在其他方面，抗原部分与具有免疫或炎症功能障碍的细胞相关。此类抗原部分可以包括但不限于髓磷脂碱蛋白(MBP)、髓磷脂蛋白脂质蛋白质(PLP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、癌胚抗原(CEA)、胰岛素原、谷氨酰胺脱羧酶(GAD65、GAD67)、热休克蛋白(HSP)或参与致病性自身免疫过程或与之相关的任何其他组织特异性抗原。

“共刺激结构域”可以是源自例如以下的信号传导区域：CD28、CTLA4、CD16、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、程序性死亡配体-1(PD-L1)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、ICOS-L、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CDl la/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性地结合的配体或它们的任何组合。“激活结构域”可以来源于例如CD3，诸如CD3ζ、ε、δ、γ等。在一个实施方案中，该CAR被设计成具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。

“免疫应答”是指免疫***的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和中性粒细胞)和这些细胞中的任何细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括Ab、细胞因子和补体)的作用，导致选择性地靶向、结合、损害、破坏和/或清除来自脊椎动物身体的侵入病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞、或在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。

术语“免疫疗法”(immunotherapy或immune therapy等)是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法来治疗罹患疾病或者有患上疾病或遭受疾病复发的风险的受试者。免疫疗法的实例包括但不限于T细胞和NK细胞疗法。T细胞疗法可包括过继性T细胞疗法、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)免疫疗法、自体细胞疗法、工程改造的自体细胞疗法和同种异体T细胞移植。本领域技术人员将认识到本文所公开的制备免疫细胞的方法将增强任何癌或移植的T细胞疗法的功效。T细胞疗法的示例描述于美国专利公布号2014/0154228和2002/0006409；美国专利号7,741,465；6,319,494和5,728,388；以及PCT公布号WO 2008/081035中，这些专利全文以引用方式并入。

本文所述的一种或多种免疫细胞可获自任何来源，包括例如人供体。供体可以是需要抗癌治疗(例如，用通过本文所述的方法产生的一种免疫细胞治疗)的受试者(即，自体供体)，或可以是捐献淋巴细胞样品的个体(即同种异体供体)，所述淋巴细胞样品在产生通过本文所述的方法产生的细胞群体后将被用于治疗不同的个体或癌患者。免疫细胞可以在体外从造血干细胞群分化或者免疫细胞可以从供体获得。免疫细胞群可通过本领域使用的任何合适的方法从供体获得。例如，淋巴细胞群可通过任何合适的体外方法、静脉穿刺或其他血液采集方法获得，通过所述方法获得具有或不具有淋巴细胞的血液样品。淋巴细胞群通过血液单采术获得。可从包含一种或多种免疫细胞的任何组织(包括但不限于肿瘤)收集一种或多种免疫细胞。从受试者收集肿瘤或其部分，并从肿瘤组织中分离一种或多种免疫细胞。任何T细胞都可用于本文所公开的方法中，包括适合用于T细胞疗法的任何免疫细胞。例如，可用于本申请的一种或多种细胞可选自由以下组成的组：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T细胞、CAR T细胞、工程改造的TCR T细胞、自然杀伤T细胞、树突状细胞和外周血淋巴细胞。T细胞可获自例如外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。另外，T细胞可衍生自本领域中可用的一种或多种T细胞系。还可使用技术人员已知的多种技术(诸如FICOLL^TM分离和/或血液单采术)从收集自受试者的血液单位中获得T细胞。T细胞还可获自人工胸腺类器官(ATO)细胞培养***，其复制人类胸腺环境以支持T细胞从原代和重新编程的多能干细胞的有效离体分化。分离T细胞疗法用T细胞的附加方法公开于美国专利公布号2013/0287748、PCT公布号WO2015/120096和WO2017/070395中，所有这些专利公布全体以引用方式全文并入本文以用于描述这些方法的目的。在一个实施方案中，T细胞是肿瘤浸润性白细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种T细胞表达CD8，例如，是CD8⁺T细胞。在其他实施方案中，所述一种或多种T细胞表达CD4，例如，是CD4⁺T细胞。分离T细胞用于T细胞疗法的附加方法公开于美国专利公布号2013/0287748、PCT公布号WO2015/120096和WO2017/070395中，所有这些专利公布全体以引用方式全文并入本文以用于描述这些方法的目的。在一些方面中，本申请的细胞可以通过从受试者获得的T细胞获得。在一个方面，T细胞可以获自例如外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。另外，T细胞可衍生自本领域中可用的一种或多种T细胞系。还可使用技术人员已知的多种技术(诸如FICOLL^TM分离和/或血液单采术)从收集自受试者的血液单位中获得T细胞。在一些方面，洗涤通过血液单采术收集的细胞以去除血浆级分，并将其置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理。在一些方面中，用任何溶液(例如，具有中和PH值的溶液或PBS)或培养基洗涤细胞。应当理解，可使用洗涤步骤，诸如通过使用半自动流通式离心机，例如Cobe^TM2991细胞处理器、Baxter CytoMate^TM等。在一些方面，将洗涤的细胞重悬于一种或多种生物相容性缓冲液或者具有或不具有缓冲液的其他盐溶液中。在一些方面，去除血液单采术样品的不需要的组分。分离T细胞疗法用T细胞的附加方法公开于美国专利公布2013/0287748中，该专利公布据此全文以引用方式并入。

在一些实施方案中，通过裂解红血细胞并耗竭单核细胞(例如通过使用通过PERCOLL^TM梯度的离心)来从PBMC分离T细胞。在一些实施方案中，通过本领域已知的阳性或阴性选择技术来进一步分离T细胞的特定亚群，诸如CD4+、CD8+、CD28+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，可使用针对阴性选择的细胞特有的表面标记物的抗体组合来完成通过阴性选择的T细胞群的富集。在一些实施方案中，可使用经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20和HLA-DR的抗体。在一些实施方案中，使用流式细胞术和细胞分选来分离用于本公开中的感兴趣的细胞群。

在一个实施方案中，使用涂覆有抗CD3抗体的Dynabeads从PBMC中分离CD3+T细胞。使用CD8微珠(例如，德国天美旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)和/或CD4微珠(例如，德国天美旎生物技术公司)通过阳性选择进一步单独分离CD8+和CD4+T细胞。

PBMC可以直接用于免疫细胞的基因修饰(诸如CAR)。在分离PBMC之后，进一步分离T淋巴细胞，并且在基因修饰和/或扩增之前或之后，将细胞毒性和辅助T淋巴细胞两者分选为幼稚、记忆和效应T细胞亚群。在一个实施方案中，通过鉴定与这些类型的CD8+细胞的每一种相关的细胞表面抗原，可以将CD8+细胞进一步分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。在其他实施方案中，中央记忆T细胞的表型标志物的表达包括CCR7、CD3、CD28、CD45RO、CD62L和CD127并且对颗粒酶B是阴性的。在一些实施方案中，中央记忆T细胞是CD8+、CD45RO+和CD62L+T细胞。在某个实施方案中，效应T细胞对CCR7、CD28、CD62L和CD127是阴性的并且对颗粒酶B和穿孔素是阳性的。在附加实施方案中，可以将CD4+T细胞进一步分选为亚群。例如，可通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群来将CD4+T辅助细胞分选为幼稚、中央记忆和效应细胞。

本文所述的方法进一步包括在从供体收获与暴露从供体受试者获得的一种或多种细胞之间富集或制备从供体获得的免疫细胞群。富集免疫细胞(例如所述一种或多种T细胞)群可以通过任何合适的分离方法完成，所述分离方法包括但不限于使用分离介质(例如，FICOLL-PAQUE^TM、ROSETTESEP^TMHLA总淋巴细胞富集混合物、淋巴细胞分离培养基(LSA)(MP生物医疗公司(MP Biomedical)目录号0850494X)等)、通过过滤或淘选进行细胞大小、形状或密度分离、免疫磁性分离(例如，磁性激活细胞分选***，MACS)、荧光分离(例如，荧光激活细胞分选***，FACS)或基于珠粒的柱分离。

在一个实施方案中，本文所述的T细胞制备物可用于工程改造自体细胞疗法。术语“工程改造的自体细胞疗法”(可缩写为“eACT^TM”，也称为过继细胞转移)是通过其收集患者自身的T细胞并随后对这些细胞进行基因改造以识别和靶向在一种或多种特异性肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的一种或多种抗原的过程。可以将T细胞工程改造以表达例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。对CAR阳性(+)T细胞进行工程改造以表达对某种肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变区片段(scFv)，该scFv连接到包含共刺激结构域和激活结构域的细胞内信号传导部分。

在一些实施方案中，从患者获得用于T细胞疗法的供体T细胞(例如，用于自体T细胞疗法)。在其他实施方案中，从不是患者的受试者获得用于T细胞疗法的供体T细胞。可以以治疗有效量施用T细胞。例如，治疗有效量的T细胞可以是至少约10⁴个细胞、至少约10⁵个细胞、至少约10⁶个细胞、至少约10⁷个细胞、至少约10⁸个细胞、至少约10⁹个或至少约10¹⁰个。在另一个实施方案中，治疗有效量的T细胞是约10⁴个细胞、约10⁵个细胞、约10⁶个细胞、约10⁷个细胞或约10⁸个细胞。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR T细胞是约2×10⁶个细胞/kg、约3×10⁶个细胞/kg、约4×10⁶个细胞/kg、约5×10⁶个细胞/kg、约6×10⁶个细胞/kg、约7×10⁶个细胞/kg、约8×10⁶个细胞/kg、约9×10⁶个细胞/kg、约1×10⁷个细胞/kg、约2×10⁷个细胞/kg、约3×10⁷个细胞/kg、约4×10⁷个细胞/kg、约5×10⁷个细胞/kg、约6×10⁷个细胞/kg、约7×10⁷个细胞/kg、约8×10⁷个细胞/kg或约9×10⁷个细胞/kg。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞介于每kg体重约1×10⁶与约2×10⁶个CAR阳性活T细胞之间直至约1×10⁸个CAR阳性活T细胞的最大剂量。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞介于约0.4×10⁸与约2×10⁸个CAR阳性活T细胞之间。在一些实施方案中，治疗有效量的CAR阳性活T细胞是约0.4×10⁸、约0.5×10⁸、约0.6×10⁸、约0.7×10⁸、约0.8×10⁸、约0.9×10⁸、约1.0×10⁸、约1.1×10⁸、约1.2×10⁸、约1.3×10⁸、约1.4×10⁸、约1.5×10⁸、约1.6×10⁸、约1.7×10⁸、约1.8×10⁸、约1.9×10⁸或约2.0×10⁸个CAR阳性活T细胞。

如本文所用，“患者”包括罹患疾病或障碍(包括癌(例如，淋巴瘤或白血病))的任何人。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。术语“供体受试者”是指其细胞被获得以进行进一步体外工程改造的受试者。供体受试者可以是将用通过本文所述的方法产生的细胞群治疗的癌患者(即，自体供体)，或者可以是捐献淋巴细胞样品的个体(即，同种异体供体)，该淋巴细胞样品在产生通过本文所述的方法产生的细胞群后将用于治疗不同的个体或癌患者。接受通过本发明方法制备的细胞的那些受试者可以被称为“受体受试者”。

可以在施用T细胞疗法之前对患者进行预调理或淋巴耗竭。可以根据本领域已知的任何方法预调理患者，该已知的任何方法包括但不限于用一种或多种化学疗法药物和/或放射疗法治疗。在一些方面，预调理可以包括减少内源性淋巴细胞的数量、去除细胞因子水平、增加一种或多种稳态细胞因子或促炎症因子的血清水平、增强在调理之后施用的T细胞的效应功能、增强T细胞疗法之前的抗原呈递细胞激活和/或可用性或者它们的任何组合的任何治疗。预调理可以包括增加受试者的一种或多种细胞因子的血清水平。所述方法还包括施用化学疗法药。化学疗法药可以是淋巴耗竭(预调理)化学疗法药。有益的预调理治疗方案连同相关的有益生物标记物一起描述于美国专利9,855,298中，该专利据此全文以引用方式并入本文。这些临时专利申请描述了例如调理需要T细胞疗法的患者的方法，所述方法包括向患者施用指定有益剂量的环磷酰胺(200mg/m²/天与2000mg/m²/天之间)和指定剂量的氟达拉滨(20mg/m²/天与900mg/m²/天之间)。一种这样的剂量方案涉及治疗患者，包括在向患者施用治疗有效量的工程改造的T细胞之前，持续三天每天向患者施用约500mg/m²/天的环磷酰胺和约60mg/m²/天的氟达拉滨。在一个方面，该调理方案包括持续3天的500mg/m²环磷酰胺+30mg/m²氟达拉滨。它们可以在第-4天、第-3天和第-2天或在第-5天、第-4天和第-3天施用(第0天是施用细胞的那天)。在一个实施方案中，该调理方案包括每天200mg/m²、250mg/m²、300mg/m²、400v、500mg/m²环磷酰胺持续2天、3天或4天和20mg/m²、25mg/m²或30mg/m²氟达拉滨持续2天、3天或4天。在一个实施方案中，以及在白细胞单采术之后，调理性化学疗法(每天30mg/m²氟达拉滨和每天500mg/m²环磷酰胺)在静脉内输注CD19 CAR-T细胞的悬浮液之前第-5天、第-4天和第-3天施用。在一些实施方案中，静脉内输注时间在15分钟和120分钟之间。在一个实施方案中，静脉内输注时间在1分钟和240分钟之间。在一些实施方案中，静脉内输注时间至多30分钟。在一些实施方案中，静脉内输注时间为至多5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟或至多100分钟。在一些实施方案中，输注量在50mL和100mL之间。在一些实施方案中，输注量在20mL和100ml之间。在一些实施方案中，输注体积为约30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL或约65mL。在一些实施方案中，输注量为约68mL。在一些实施方案中，悬浮液已经被冷冻并且在解冻的6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时内使用。在一些实施方案中，悬浮液尚未被冷冻。在一些实施方案中，从输液袋输注该免疫疗法。在一些实施方案中，在输注期间搅拌输液袋。在一些实施方案中，在解冻后3小时内施用该免疫疗法。在一些实施方案中，该悬浮液还包含白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白以约2％至3％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，白蛋白以约2.5％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，白蛋白以约1％、2％、3％、4％或5％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，白蛋白是人白蛋白。在一些实施方案中，该悬浮液还包含DMSO。在一些实施方案中，DMSO以约4％至6％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，DMSO以约5％(体积/体积)的量存在。在一些实施方案中，DMSO以1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(v/v)的量存在。

如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。在一个实施方案中，体外细胞包括T细胞。

术语“减少”和“降低”在本文可互换使用并且指示任何小于原始值的变化。“减少”和“降低”是相对术语，需要测量前和测量后之间的比较。“减少”和“降低”包括完全耗竭。如本文所用，术语“调节”T细胞成熟是指使用本文所述的任何干预控制一种或多种细胞(诸如T细胞)的成熟和/或分化。例如，调节是指失活、延迟或抑制T细胞成熟。在另一个实例中，调节是指加速或促进T细胞成熟。术语“延迟或抑制T细胞成熟”是指将一种或多种T细胞维持在未成熟或未分化状态。例如，“延迟或抑制T细胞成熟”可以是指将T细胞维持在幼稚或T_CM状态，与进展到T_EM或T_EFF-状态相反。此外，“延迟或抑制T细胞成熟”可以是指增加或富集T细胞混合群体中的未成熟或未分化T细胞(例如，幼稚T细胞和/或T_CM--细胞)的总百分比。可以例如通过筛选各种基因的表达以及在T细胞表面上表达的各种蛋白质的存在来确定T细胞的状态(例如，如成熟或未成熟)。例如，选自由L-选择素(CD62L+)、IL-7R-α、CD132、CR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、LFA-1及它们的任何组合组成的组的一种或多种标志物的存在可以指示较少成熟的未分化T细胞。

受试者/患者的“治疗”或“处理”是指在受试者/患者上执行的任何类型的干预或过程，或对受试者/患者施用通过本申请制备的一种或多种T细胞，目的是逆转、缓解、改善、抑制、减慢或预防与疾病相关的症状、并发症或病症或者生化指标的发作、进展、发展、严重程度或复发。在一个方面，“治疗”或“处理”包括部分缓解。在另一个方面，“治疗”或“处理”包括完全缓解。

在本公开的实施例部分中提及的另外术语在下表1中定义。

表1：实施例中所用的术语

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在以下小节中进一步详细描述本申请的各个方面。

在一个实施方案中，本公开提供了用于对富含淋巴细胞的样品中的CD3-细胞杂质进行流式细胞术定量的方法和组合物。在一个实施方案中，本公开提供了符合目的的2-8色T细胞杂质流式细胞术抗体组。在一个实施方案中，将那些组中描述的抗体中的一种或多种抗体组合成用于鉴定T细胞样品中的CD3-细胞杂质的抗体混合物。在一个实施方案中，该抗体混合物是冻干的。在一个实施方案中，本公开提供了使用该组来检测和定量在用于免疫疗法的T细胞产物的不同制造阶段获得的样品中的CD3-细胞的方法。

在一个实施方案中，本公开提供了可用于使用各种特定细胞类型的细胞表面标志物模式鉴定、定量和任选地分离这些细胞类型的方法。这些特定细胞类型包括但不限于白细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、单核细胞、B细胞、早期B祖细胞和干细胞。在一个实施方案中，同时测定七种或更多种细胞表面标志物的存在或不存在。在一个实施方案中，荧光激活细胞分选(FACS)分析可以一次性在细胞群体上进行，并且可以基于细胞表面标志物一次性确定存在或不存在什么细胞。在一个实施方案中，该方法进一步用细胞表面标志物同时评估细胞的活力。在一个实施方案中，不需要为了能够表征T细胞产物中的细胞杂质而进行多于一次的FACS分析或用多个样品进行FACS分析。

在一个实施方案中，该方法提供用于样品中T淋巴细胞总量的检测和/或定量。在一个实施方案中，该方法提供用于同一样品中非T淋巴细胞总量的检测和定量。

在一个实施方案中，样品是来自健康供体或患者(例如，癌症患者)的血液样品。在一个实施方案中，样品是单采血液成分术样品。在一个实施方案中，样品来自骨髓。在一个实施方案中，样品是可商购获得的血细胞混合物，诸如CYTO-TROL、Stem-Trol、泛T细胞、CD56+NK细胞、全患者单采血液成分术、NHL患者单采血液成分术等。在一个实施方案中，样品获自用于免疫疗法的T细胞产物的制造。在一个实施方案中，T细胞产物是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞产物。在一个实施方案中，样品是在通过密度梯度分离富集T细胞中的单采血液成分术产物后获得的。在一个实施方案中，样品是在通过磁珠细胞分离富集CD4+和/或CD8+T细胞中的单采血液成分术产物后获得的。在一个实施方案中，样品获自准备好施用以用于免疫疗法的最终产物。

在一个实施方案中，该方法提供用于表2中鉴定的细胞群体的特定组合或其子组合(至少两种、至少三种、至少四种、至少5种、至少6种、至少7种)的检测和定量。在一个实施方案中，细胞的特定组合或子组合是通过表2中所述的标志物的特定组合或子组合(例如，CD45、CD10、CD19)来鉴定的。在一个实施方案中，将这些标志物进一步与CD8和CD4组合。需注意，有其他可能的细胞表面标志物可用于表征在其他情况下富集的淋巴细胞组合物中的“污染”细胞(例如，CD25、CD2、CD7和CD5)。在一个实施方案中，本公开进一步提供了更特异性地鉴定可能存在于T细胞群体中的各种类型的癌细胞的方法，其中该T细胞群体获自急性淋巴性白血病(ALL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者。在一个实施方案中，表2显示了本申请中所述的标志物的示例性具体组合。

表2A：细胞表面标志物和相关参数的示例性选择

+意指细胞显示出可检测水平的标志物。-意指细胞未显示出可检测水平的标志物。dim意指细胞显示出暗淡水平的标志物。

表2B：细胞表面标志物和相关参数的示例性选择

在一个实施方案中，CD4+T细胞被鉴定为CD3+CD4+CD45+细胞。在一个实施方案中，CD8+T细胞被鉴定为CD3+CD8+CD45+细胞。在一个实施方案中，CD45用于检测CD45+白细胞以及区分CD45dim B-母细胞与CD45+群体。在一个实施方案中，CD3用于区分CD3+T细胞与CD3-非T细胞。在一个实施方案中，CD56用于区分CD56+CD3+NK T细胞和CD56+CD3-NK细胞。在一个实施方案中，CD14用于鉴定共表达CD56和/或CD34抗原的普通CD14+单核细胞和异常细胞。在一个实施方案中，CD34用于区分外周中固定的CD34+细胞、CD34+CD19+和CD19-B-母细胞。在一个实施方案中，CD19用于区分表达CD34和/或CD10表面抗原的正常和异常CD19+B细胞。在一个实施方案中，CD10用于区分异常的CD19+早期B祖细胞或CD10+未成熟B细胞。在一个实施方案中，CD56+CD3-和CD56+CD3+细胞通常分别被定义为NK和NKT细胞，因为CD56抗原传统上被认为是造血***中的NK细胞标志物。然而，值得注意的是，已报道CD56表达不限于NK或NKT细胞，还在其他血细胞诸如γδT细胞、αβT细胞和树突细胞上。

在一个实施方案中，本公开提供了一种方法，其中这些标志物中的每种标志物是由用不同的荧光染料荧光标记的抗体识别的。在一个实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体。

与单色流式细胞术相反，多色流式细胞术在测定开发中引入了更高的技术困难。为了同时分析几种表面标志物，每种表面标志物需要用于检测的特异性抗体。在流式细胞术中，最好使用直接与荧光染料缀合的抗体，而不是用于检测的一抗和用于信号扩增的二抗。因此，当同时使用多种抗体时，必须明智地选择它们的缀合荧光染料，使得这些荧光染料的发射波长不重叠。可以选择在色谱中尽可能远离的荧光染料。组选择取决于多种因素，包括精确补偿和抗原-荧光染料平衡。

在一个实施方案中，将每种抗体用不同的荧光染料/荧光团标记。在一个实施方案中，基于例如细胞表面上的细胞表面标志物的相对丰度和每种细胞类型所代表的细胞群体的相对分数，荧光染料可以选自本领域已知的任何荧光染料。

在一个实施方案中，荧光团亮度以以下次序增大：V500、近红外染料(最低)；APC-Cy7、PerCP-Cy5.5；FITC；PE-Cy7；BV421、APC；PE、PE-Cy7(最高)。在一个实施方案中，抗原丰度和/或密度以以下次序减小：CD45+(最高)；CD3+；CD14+、CD19+；CD56+；CD10+；和CD34+(最低)。对照纯化的泛T细胞、人外周血CD19+B细胞、人外周血NK细胞和其他纯化的细胞在本领域中可从不同制造商(例如，干细胞技术公司(StemCell Technologies))获得。

策略性地，较高丰度的抗原与较暗的荧光染料匹配，而较低丰度的那些抗原与较亮的荧光染料匹配。存在本领域普通技术人员已知的各种行业标准。

在一个实施方案中，荧光染料可选自任何荧光染料，包括V500(或任何其他蓝色发光染料)、FITC(或任何其他绿色发光染料)、BV421(或任何其他蓝色发光染料)、PE(或任何其他黄色发光染料)、APC(或任何其他红色发光染料)、PE-Cy7(或任何其他远红外发光染料)、PerCP.Cy5.5(或任何其他远红外发光染料)、PacificBlue(或任何其他蓝色发光染料)、PerCP(或任何其他红色发光染料、任何AlexaFluor(例如，AlexaFluor700(或任何其他红色发光染料)、AlexaFluor647(或任何其他红色发光染料)、V450(例如，BD HorizonV450，或任何其他蓝色发光染料)、APC-Cy7(或任何其他红外发光染料)、SAV-TR-PE、PE-Cy7(或任何其他红外发光染料)、PE-Texas Red、Texas Red(或任何其他橙色发光染料)、AmCyan(或任何其他绿色发光染料)、AlexaFluor 488(或任何其他绿色发光染料)、PE-Cy5(或任何其他红色发光染料)、DyeCycle染料、Fluo-3、Fluo-5、Fura染料、Qdot染料、FVS染料、Sytox染料和本领域可得的任何其他荧光染料。在一个实施方案中，活/死染料是APC-CY7/近红外染料。

在一个实施方案中，荧光标记的抗体中的一种或多种荧光标记的抗体选自表3中的抗体。

表3：示例性的符合目的的抗体组

在一个实施方案中，荧光染料与表3中的特定分配不同地分布。例如，在一个实施方案中，抗CD45抗体是FITC标记的，并且抗CD10抗体是V500标记的。在一个实施方案中，抗体标记中的至少一种抗体标记选自本领域中可得的其他荧光标记。在一个实施方案中，用于鉴定样品中的细胞的抗体中的至少一种抗体不来自表3。

在一个实施方案中，抗CD45、抗CD10、抗CD34、抗CD56、抗CD3、抗CD19和抗CD14抗体中的每一者都可以定制。在一个实施方案中，这些抗体中的任何抗体可以选自任何可商购可得的针对这些细胞表面标志物的抗体。有许多商购可得的针对这些标志物的抗体，这些抗体可获自例如BD生物科学公司(BD Biosciences)、艾博抗公司(Abcam)、赛默飞世尔公司(Thermofisher)、义翘神州公司(Sinobiological)、百进生技公司(Biolegend)、研发***公司(R&D Systems)、西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)、干细胞公司(Stem Cell)、圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechonologies)、蛋白质技术公司(ProteinTech)或任何其他抗体供应商。在一个实施方案中，一种或多种抗体选自表4中的抗体。

表4.用于符合目的的组的示例性克隆。

抗原

CD45

CD10

CD34

CD56

CD3

CD19

CD14

示例性选项

HI30

H10a

561

NCAM16.2

SK7

HIB19

MfP9

其他克隆

任何

在一个实施方案中，抗CD19抗体选自克隆SJ25C1和HIB19。在一个实施方案中，抗CD14抗体选自克隆MφP9和M5E2。在一个实施方案中，抗CD56抗体选自克隆NCAM16.2和HCD56。在一些实施方案中，对CD34、CD19和CD56缀合的抗体的特异性可通过测试已知的阳性和阴性样品的对应标志物来检查。在一个示例中，对于CD34抗体特异性，来自干细胞技术公司的Stem-Trol(商业来源/制造的CD34+阳性对照细胞)可用作阳性样品。在一些实施方案中，MAVER-1/MRL3008(CD19+B细胞系)和纯NK细胞(来自干细胞技术公司)可分别用作CD19抗体特异性和CD56抗体特异性的阳性样品。CD34+细胞、CD19+细胞和NK细胞百分比是这种评估的输出测量值。阳性对照测试材料CYTO-TROL也可用于特异性测试，因为其具有由制造商提供的批次特异性参考范围。在一个实施方案中，使用除表4至表6中的那些以外的一种或多种抗体的方法的准确度和其他性能参数可通过使用实施例中所述的方法作为参考值来评估。每个测定的线性可按照已建立的方法使用连续稀释来确定。

在一个实施方案中，一种或多种抗体选自表5中的抗体。关于这些特定克隆的来源的更多细节可以在实施例中找到。

表5.用于符合目的组的示例性克隆/荧光染料组合。

抗原

CD45

CD10

CD34

CD56

CD3

CD19

CD14

克隆

HI30

H10a

561

NCAM16.2

SK7

HIB19

MfP9

荧光染料

V500

FITC

BV421

PE

APC

PE-Cy7

PerCP.Cy5.5

组选择还取决于最佳滴定的抗体。在一个实施方案中，染色组合物中的抗体中的一种或多种抗体及其相应量选自表6的那些。在一个实施方案中，组合物(在本文中也被描述为抗体混合物)已被冻干。

表6.1×10⁶个细胞的示例性符合目的组的示例性量。

*总12.9/100μl，加上任选的87.1μl染色缓冲液和200μl的1:3000稀释度的活/死近红外可固定染料。

在一个实施方案中，每种抗体的总量不同于表6中的那些。在一个实施方案中，符合目的产物中每种抗体的比率如表7中所反映。

表7.染色组合物/产物中抗体相对于产物中抗体总量的示例性比率(％)。

**“约”意指在1标准偏差内

##“约”意指加上或减去所述值的10％

％％“约”意指加上或减去所述值的20％

在一个实施方案中，抗体中的一种或多种抗体以比表6中的量大于或小于1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％等或其分数的量的存在。在一个实施方案中，相对于CD45抗体的量，染色组合物/产品/混合物中CD10、CD34、CD56、CD3、CD19和/或CD14抗体的比率改变。在一个实施方案中，相对于CD10抗体的量，CD45、CD34、CD56、CD3、CD19和/或CD14抗体的比率改变。在一个实施方案中，相对于CD34抗体的量，CD45、CD10、CD56、CD3、CD19和/或CD14抗体的比率改变；等等。在一个实施方案中，比率改变是因为荧光染料变化，从而相对于表6的那些改变了每微克抗体的摩尔数。在一个实施方案中，荧光染料改变，但就未标记的抗体的摩尔数而言，抗体的比率与表6中的相同。

在一个实施方案中，每次测试的抗体总量是表6中的抗体总量。在一个实施方案中，相对于表6中的量，每次测试的每种单独抗体的量可独立地增加或减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％或500％或其分数。在一个实施方案中，相对于表6中的量，每次测试的每种单独抗体的量可独立地增加到1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、51倍、52倍、53倍、54倍、55倍、56倍、57倍、58倍、59倍、60倍、61倍、62倍、63倍、64倍、65倍、66倍、67倍、68倍、69倍、70倍、71倍、72倍、73倍、74倍、75倍、76倍、77倍、78倍、79倍、80倍、81倍、82倍、83倍、84倍、85倍、86倍、87倍、88倍、89倍、90倍、91倍、92倍、93倍、94倍、95倍、96倍、96倍、97倍、98倍、99倍、100倍、200倍、300倍、400倍或500倍或其分数或者减少到1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19、1/20、1/21、1/22、1/23、1/24、1/25、1/26、1/27、1/28、1/29、1/30、1/31、1/32、1/33、1/34、1/35、1/36、1/37、1/38、1/39、1/40、1/41、1/42、1/43、1/44、1/45、1/46、1/47、1/48、1/49、1/50、1/51、1/52、1/53、1/54、1/55、1/56、1/57、1/58、1/59、1/60、1/61、1/62、1/63、1/64、1/65、1/66、1/67、1/68、1/69、1/70、1/71、1/72、1/73、1/74、1/75、1/76、1/77、1/78、1/79、1/80、1/81、1/82、1/83、1/84、1/85、1/86、1/87、1/88、1/89、1/90、1/91、1/92、1/93、1/94、1/95、1/96、1/96、1/97、1/98、1/99、1/100、1/200、1/300、1/400或1/500或其分数。

在一个实施方案中，相对于表6中的量，每次测试的抗体中的每种抗体的量可以独立地增加或减少1纳克、2纳克、3纳克、4纳克、5纳克、6纳克、7纳克、8纳克、9纳克、10纳克、11纳克、12纳克、13纳克、14纳克、15纳克、16纳克、17纳克、18纳克、19纳克、20纳克、21纳克、22纳克、23纳克、24纳克、25纳克、26纳克、27纳克、28纳克、29纳克、30纳克、31纳克、32纳克、33纳克、34纳克、35纳克、36纳克、37纳克、38纳克、39纳克、40纳克、41纳克、42纳克、43纳克、44纳克、45纳克、46纳克、47纳克、48纳克、49纳克、50纳克、51纳克、52纳克、53纳克、54纳克、55纳克、56纳克、57纳克、58纳克、59纳克、60纳克、61纳克、62纳克、63纳克、64纳克、65纳克、66纳克、67纳克、68纳克、69纳克、70纳克、71纳克、72纳克、73纳克、74纳克、75纳克、76纳克、77纳克、78纳克、79纳克、80纳克、81纳克、82纳克、83纳克、84纳克、85纳克、86纳克、87纳克、88纳克、89纳克、90纳克、91纳克、92纳克、93纳克、94纳克、95纳克、96纳克、96纳克、97纳克、98纳克、99纳克、100纳克、200纳克、300纳克、400纳克、500纳克、600纳克、700纳克、800纳克、900纳克、1000纳克或其分数。

在一个实施方案中，相对于表6中的量，每次测试的抗体中的每种抗体的量可以独立地增加或减少1微克、2微克、3微克、4微克、5微克、6微克、7微克、8微克、9微克、10微克、11微克、12微克、13微克、14微克、15微克、16微克、17微克、18微克、19微克、20微克、21微克、22微克、23微克、24微克、25微克、26微克、27微克、28微克、29微克、30微克、31微克、32微克、33微克、34微克、35微克、36微克、37微克、38微克、39微克、40微克、41微克、42微克、43微克、44微克、45微克、46微克、47微克、48微克、49微克、50微克、51微克、52微克、53微克、54微克、55微克、56微克、57微克、58微克、59微克、60微克、61微克、62微克、63微克、64微克、65微克、66微克、67微克、68微克、69微克、70微克、71微克、72微克、73微克、74微克、75微克、76微克、77微克、78微克、79微克、80微克、81微克、82微克、83微克、84微克、85微克、86微克、87微克、88微克、89微克、90微克、91微克、92微克、93微克、94微克、95微克、96微克、96微克、97微克、98微克、99微克、100微克、200微克、300微克、400微克、500微克、600微克、700微克、800微克、900微克、1000微克或其分数。

在一个实施方案中，为了优化抗体组，可滴定抗体以确定提供稳健的信噪比、最小背景和具有一致的阳性信号百分比的染色密度的使用体积/浓度。在一个实施方案中，为了确定染色的最佳浓度，可将抗体连续稀释，并将染色系数(SI)计算为[MFIp-MFIn]/2xrSDn，其中MFIp是阳性群体的中值荧光强度(MFI)，MFIn是阴性群体的MFI，并且rSDn是阴性群体的稳健标准偏差。在一个实施方案中，这通过在Maecker HT.等人细胞计量术部分A(Cytometry Part A)2006(69A):1037-1042中所述的方法进行。在一个实施方案中，可以创建SI曲线以选择给出显著SI值的抗体的稳健质量。过量的抗体体积可人为地增加整个细胞群体的阳性信号和阴性信号两者。

在一个实施方案中，在鉴定T细胞样品中的CD3-杂质的方法中使用少于上表中所述的所有七种抗体，和/或将这些抗体混合在染色组合物或混合物中。在一个实施方案中，该混合物仅包含检测CD45+CD3+淋巴细胞(混合物中的所有淋巴细胞)的抗体。在一个实施方案中，该混合物仅包含检测CD45+/CD3+/CD56+NK T细胞的抗体。在一个实施方案中，该混合物仅包含检测CD45+/CD3-/CD56+NK细胞的抗体。在一个实施方案中，该混合物仅包含检测CD45+/CD3-/CD14+CD19-单核细胞的抗体。在一个实施方案中，该混合物仅包含检测CD45+/CD3-/CD14-CD19+B细胞的抗体。在一个实施方案中，该混合物仅包含检测CD45+/CD34+干细胞和祖细胞的抗体。在一个实施方案中，该混合物仅包含检测CD45dim/CD10+CD19+早期B祖细胞的抗体。在一些实施方案中，该混合物包含用于其任何组合的抗体。在一些实施方案中，该混合物是冻干的。

在一个实施方案中，该抗体混合物组合物包含用于预定数量的测试(每个测试是使细胞群体与抗体混合物接触)的足够抗体。在一个实施方案中，每个测试样品的抗体混合物(cocktail/mixture)的总体积是100μL。在一个实施方案中，每个测试样品中抗体混合物(cocktail/mixture)的总体积是10μL、50μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL或1000μL。在一个实施方案中，每个测试样品的抗体混合物(cocktail/mixture)的总体积是1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL、20μL、21μL、22μL、23μL、24μL、25μL、26μL、27μL、28μL、29μL、30μL、31μL、32μL、33μL、34μL、35μL、36μL、37μL、38μL、39μL、40μL、41μL、42μL、43μL、44μL、45μL、46μL、47μL、48μL、49μL、50μL、51μL、52μL、53μL、54μL、55μL、56μL、57μL、58μL、59μL、60μL、61μL、62μL、63μL、64μL、65μL、66μL、67μL、68μL、69μL、70μL、71μL、72μL、73μL、74μL、75μL、76μL、77μL、78μL、79μL、80μL、81μL、82μL、83μL、84μL、85μL、86μL、87μL、88μL、89μL、90μL、91μL、92μL、93μL、94μL、95μL、96μL、96μL、97μL、98μL、99μL或100μL。

在一个实施方案中，每个测试被设计为分析大约1百万个血细胞。在一个实施方案中，每个测试被设计为分析大约2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万或1千万个细胞。在一个实施方案中，细胞样品具有大约200μL的体积。在一个实施方案中，细胞样品具有大约10μL、50μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL或1000μL的体积。在一个实施方案中，细胞样品在200μL的细胞染色缓冲液中包含1百万个细胞。在一个实施方案中，每个样品在200μL的细胞染色缓冲液中包含大约1百万个细胞，并且这可以与100μL的抗体混合物混合用于分析。

在一个实施方案中，本公开提供了一种容器，该容器携带用于20个样品的足量的上表的七种抗体的混合物(cocktail/mixture)。在一个实施方案中，该容器携带足量的抗体混合物(mixture/cocktail)以用于对每容器1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、96个、97个、98个、99个或100个样品染色。在一个实施方案中，将混合物(mixture/cocktail)冻干。在一个实施方案中，将混合物(mixture/cocktail)悬浮在缓冲液中。

在一个实施方案中，将冻干混合物(例如，表6或表7中指定的量)重悬于适合用于FACS的缓冲液中。在一个实施方案中，当重悬于2000μL的缓冲液中时，该重悬在室温下稳定至少10天。在一个实施方案中，当重悬于400μL的缓冲液中时，该重悬在室温下稳定至少3个月。在一个实施方案中，当重悬于100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1000μL、1100μL、1200μL、1300μL、1400μL、1500μL、1600μL、1700μL、1800μL、1900μL或2000μL的缓冲液中时，该重悬在室温下稳定至少或大约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、61天、62天、63天、64天、65天、66天、67天、68天、69天、70天、71天、72天、73天、74天、75天、76天、77天、78天、79天、80天、81天、82天、83天、84天、85天、86天、87天、88天、89天、90天、91天、92天、93天、94天、95天、96天、96天、97天、98天、99天或100天。

在一个实施方案中，作为每个CD3-群体(例如，CD34+、CD56+NK、CD19+B细胞)的定量下限(LLOQ)的测定对于CD34+细胞和CD19+B细胞为约0.2％，并且对于CD56+CD3-NK细胞为约1.4％。在一个实施方案中，LLOQ为约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。在一个实施方案中，LLOQ可以通过将目标群体与阴性群体混合作为线性研究来评估。可以以2倍进行系列稀释(6.25％、3.13％、1.56％、0.78％、0.39％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％和0.00％)，并且每次稀释可以一式三份进行测试。具有可接受的％回收率(在80％至120％内)和对于重复的可接受的％CV(≤25)的最低稀释度可设定为LLOQ。在一个实施方案中，可执行LLOQ测试以确认该测定是否足够灵敏以检测低于10％的CD34+群体。CD34+细胞在人PBMC中通常是罕见的。

在一个实施方案中，样品是包含健康供体PBMC的单采血液成分术样品。此类样品的典型细胞组成包含25％-60％的CD4+T细胞、5％-30％的CD8+T细胞、5％-10％的CD19+B细胞、10％-30％的CD56+CD3-NK细胞和4％-10％的CD14+单核细胞。在一个实施方案中，样品是包含来自癌症患者的PBMC的单采血液成分术样品。

在一个实施方案中，本公开提供了一种表征T细胞制备物中可能被认为是杂质的CD3-细胞(例如，NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合)的方法，该方法包括使T细胞制备物的样品与如本公开中所述的抗体混合物接触，以及通过荧光检测方法分析该混合物中具有特异性细胞表面标志物的细胞的分布。

在一个实施方案中，本公开提供了一种用T细胞制备物治疗有需要的受试者的癌症的方法，其中该T细胞制备物中的CD3-杂质(例如，NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合)中的一种或多种CD3-杂质已经通过或通过需要使用如本公开中所述的抗体中的一种抗体或抗体混合物(mixture/cocktail)的方法进行表征。在一个实施方案中，该T细胞制备物是自体的。在一个实施方案中，该T细胞制备物是同种异体的。T细胞群体的示例和制备用于免疫疗法的示例性T细胞群体的方法的示例在本公开中先前描述。在一个实施方案中，T细胞是用CAR或T细胞受体工程改造的。CAR和T细胞受体的示例在本公开中先前描述。

在一个实施方案中，本公开提供了一种用于确定T细胞产物是否适合于免疫疗法的方法，该方法包括使用本公开所述的抗体或抗体混合物中的一者表征该T细胞产物中的CD3-细胞杂质(例如，NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合)中的一种或多种CD3-细胞杂质；以及基于该T细胞产物中这些CD3-细胞杂质的水平确定该T细胞产物是否适合。在一个实施方案中，可接受的水平由管理机构(例如，FDA、EMEA等)设定。在一些实施方案中，这些细胞类型中的至少一种细胞类型的水平高于可接受的水平。在一些实施方案中，这些细胞类型中的至少一种细胞类型的水平低于可接受的水平。

在一个实施方案中，本公开提供了用于鉴定血细胞群体中白细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、总淋巴细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合中的至少一者的方法/测定或试剂盒。在一些实施方案中，该测定和/或试剂盒用于表征用于免疫疗法的T细胞产物中的CD3-细胞。在一个实施方案中，该试剂盒包含(a)一种或多种抗体，这些抗体用于检测这些细胞中的任何一种或多种细胞的一种或多种细胞标志物(参见例如表2)；和(2)试剂，这些试剂用于进行该抗体与这些细胞表面标志物的结合；以及任选地(3)使用这些试剂用于该试剂盒的目的的使用说明书。在一些实施方案中，抗体(两种或更多种)都在同一容器(例如，Lyovial)中一起冻干。在一个实施方案中，这些抗体选自表3。在一个实施方案中，这些抗体选自表4。在一个实施方案中，这些抗体选自表5。试剂盒的小瓶中每种抗体的量可不同于这些量，如本说明书中别处所述。

本申请中所引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献出于所有目的据此全文以引用方式并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文献被单独指示为处于所有目的以引用方式并入一样。

虽然已经说明和描述了各种具体实施方案，但是应当理解在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以进行各种改变。

实施例

实施例1

设计用于CD3-杂质的符合目的的流式细胞术组

实验地开发了符合目的的8色T细胞杂质流式细胞术组，以评估T细胞样品或产物中的CD3+细胞纯度，以及活细胞。该组可用于表征血细胞样品中的CD3-杂质(NK-T细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞)，包含通过单采血液成分术获得的那些、PBMC、和在用于免疫疗法的T细胞产物的制造过程中制备的那些。

首先选择一组细胞表面标志物以鉴定血液样品中的不同细胞群体。这些标志物如表8所示。

表8.所使用的标志物及其相关报告参数。

然后按照多种标准开发了七种抗体和荧光团组合(加上远红外活力染料)的特定组。具有较高丰度的抗原与较暗的荧光染料匹配，而具有较低丰度的那些抗原与较亮的荧光染料匹配。这使得该组能够进行更灵敏的检测。评估各种抗体与荧光染料的组合以最小化光谱溢出到仪器中的相邻通道中，并且实现所有群体的最佳分辨率。补偿设置也确保了频谱溢出的校正。所选择的组描述于表9.1、表9.2、表9.3、表9.4和表9.5中。

表9.1.抗体组

表9.2同种型抗体组

表9.3补偿对照

表9.4样品抗体组

表9.5同种型抗体组

为了优化方法组，滴定所有七种抗体以确定给出稳健信噪比、最小背景、具有一致％阳性信号的染色强度的使用体积/浓度。参见表9.1、表9.2、表9.3、表9.4和表9.5。

通过用处于所滴定的体积/浓度或制造商推荐体积的抗体混合物对样品进行染色来验证所选抗体滴定的性能。

用于该方法的试剂如表10中所指定。

表10.方法开发中所使用的试剂的列表。

为了确定用于染色的最佳抗体浓度，将抗体连续稀释并一式两份地测量。使用以下等式计算染色指数(SI)：

其中MFIp是阳性群体的中值荧光强度(MFI)，MFIn是阴性群体的MFI，并且rSDn是阴性群体的稳健标准偏差。

创建SI曲线以选择给出显著SI值的抗体的稳健质量。过量的抗体体积可人为地增加整个细胞群体的阳性信号和阴性信号两者。因为不能通过单独的SI确定最佳抗体浓度，所以检查阳性和阴性靶群体的MFI以及阳性群体的频率。例如，针对以下抗体比较两个不同的抗体克隆，并且选择具有较高SI的克隆以包括在示例性组中的一个组中：

PE-Cy7 CD19抗体：滴定并比较克隆SJ25C1和HIB19。两个克隆显示出相似的特异性，但克隆HIB19具有更高的SI。

PerCP-Cy5.5 CD14抗体：克隆MφP9和M5E2经测试并显示出相似的特异性。克隆MφP9具有更高的SI。

PE CD56抗体：滴定并比较克隆NCAM16.2和HCD56。NCAM16.2显示出更好的特异性和分辨率。

在该优化努力期间滴定该方法中所使用的所有抗体。作为示例，图1A和图1B中分别指示了针对抗CD3 APC和抗CD14 PerCP-Cy5.5的优化抗体体积(μL)和浓度/质量(ng或μg)。CD14 PerCP-Cy5.5抗体显示没有CD14+MFI饱和。对流式曲线图的详细检查表明，1.3μL的抗体足以产生阳性信号，并随后优化用于FACSCanto II***中的样品获取/分析的对数参数。1×10⁶个细胞的每次反应的抗体体积如表12中最终确定。

将(A)从每种不同抗体的液体原液为每次运行新鲜制备的上述抗体的新鲜制备的液体混合物的性能与(B)从所有七种抗体的冻干混合物新鲜制备的或在重悬后使用几天的相同抗体的液体混合物的性能进行比较。

如表11和表12中所述，将(A)液体混合物和(B)冻干混合物从它们个别的组分混合。

表11.在(A)液体混合物制备中所使用的抗体量。

抗体	抗体体积/反应(μL)
		CD3-APC	1.0
CD14-PerCP-Cy5.5	1.3
		CD56-PE	1.3
CD19-PE-Cy7	1.0
		CD10-FITC	1.3
CD45-V500	2.0
		CD34-BV421	2.0
总抗体	14.9
		所添加的BSA染色缓冲液	85.1

表12.在(B)冻干混合物(lyovial)之一的制备中所使用的抗体量。

抗体	抗体体积/反应(μL)	抗体μg/测试
			CD3-APC	1.0μL	0.05
CD14-PerCP-Cy5.5	1.3μL	0.065
			CD56-PE	1.3μL	0.02
CD19-PE-Cy7	1.0μL	0.05
			CD10-FITC	1.3μL	0.52
CD45-V500	2.0μL	0.20
			CD34-BV421	5.0μL	0.5
总抗体体积	12.9μL
			染色缓冲液(BSA)	87.1μL
活/死近红外可固定染料	1:3000稀释度的200μL

还制备了同种型对照液体混合物。表13。

表13.同种型混合物中所使用的抗体混合物。

抗体	抗体体积/反应(μL)
		CD3-APC	1.0
CD14-PerCP-Cy5.5	1.3
		m IgG2b-PE	1.3
CD19-PE-Cy7	1.0
		CD45-V500	2.0
m IgG1-FITC	2.0
		m IgG2a-BV421	2.0
总抗体	14.9
		所添加的BSA染色缓冲液	85.1

每个细胞样品使用总共100μl的各混合物，该混合物通常含有大约1百万个细胞。通过向冻干抗体混合物小瓶(Lyovial)中添加2000μl的BD BSA细胞染色缓冲液来制备从所有七种抗体的冻干组合制备的(B)液体混合物，并且还以5×10⁶个细胞/mL细胞染色缓冲液的浓度使用每大约1百万个细胞的样品100μl的所得(B)液体混合物。通常，样品可以是新鲜的单采血液成分术样品、在单采血液成分术样品的阳性选择之后的CD4+/CD8+阳性细胞、或在T细胞产物的制造过程中收获的任何其他样品，包括最终的CAR-T或TCR-T细胞收获产物。lyovial含有足够用于20次测试的抗体。每种抗体的量如上表中所示。

实施例2

(A)液体试剂和(B)冻干试剂的染色可比性

测试该方法的可再现性。用以下两种类型的混合物一式两份地测试五个健康供体单采血液成分术样品：(A)通过将根据表5和表6的液体形式的单独抗体组合而新鲜制备的混合物，或(B)冻干的抗体混合物(试验试剂)。在同一天由一名分析者并行进行测试，以理解冻干试剂和液体试剂之间的可比性并评估冻干试剂的功能性。测定每种感兴趣的参数CD45+、T细胞、NK细胞、单核细胞和B细胞的％变化。

从五个健康供体收获单采血液成分术样品。将悬浮在细胞染色缓冲液(BSA)中的含有1百万个血细胞的总共200微升与100微升的(A)液体混合物或(B)从冻干混合物重悬的混合物混合。将CYTO-TROL对照细胞()(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))用作阳性对照。它们是表现出可用所选单克隆抗体检测的表面抗原的人淋巴细胞的冻干制备物。这些细胞是从外周血中分离的并且表达代表在正常淋巴细胞上发现的那些抗原的抗原。

将样品在2℃至8℃避光孵育大约25分钟。一旦孵育完成，就将100微升的细胞染色缓冲液(BSA)添加到各个样品中并将样品离心。将沉淀的细胞用每次200微升的细胞染色缓冲液(BSA)洗涤三次，然后用活力染料染色。然后将样品与适当的单色补偿对照一起通过FACS进行处理。结果示出于图2A和图2B(图3)和表14中。使用FlowJo软件，在BD FACSCantoII流式细胞仪上分析CD3+T细胞和CD3-非T细胞杂质的频率。

表14.液体和冻干试剂的染色比较的流式细胞术数据。

在抗体混合物的两个来源之间比较靶群体的平均频率。如图2和表14所示，当抗体试剂从新鲜液体形式的混合物变为重构的冻干抗体混合物时，测试是可再现的，并且所有％CV都在可接受的范围内(≤25％)。

实施例3

在重悬于染色缓冲液中后冻干试剂的10天稳定性

冻干的抗体试剂经测定为在室温下稳定18个月。在将冻干试剂重悬于每小瓶400μL的染色缓冲液中(这可用于20次测试/小瓶)后，预计产物具有3个月稳定性。还测试了重悬于2000μL的染色缓冲液中后产物的10天稳定性。

在第1天，将冻干的抗体混合物重悬于2000μL的染色缓冲液中。将一部分用于第1天，并将其余部分保存到第10天。单独制备新鲜液体抗体试剂以用于比较。测试来自四名癌症患者和一名健康供体的单采血液成分术样品。将CytoTrol用作阳性对照测试材料(PCTM)。CytoTrol由冻干的富含人淋巴细胞的细胞组成，这些细胞具有批次特异性参照范围的表面标志物。结果示于表15中。

表15.使用癌症患者和健康供体单采血液成分术样品的冻干试剂的第1天稳定性。

表16.使用癌症患者和健康供体样品的冻干试剂的第10天稳定性

图3B和表16指示了冻干抗体试剂的10天稳定性，与新鲜液体抗体试剂相比保留了全部活性和功能，所计算的百分比变化在≤25％CV的可接受范围内。另外，补偿对照从制备日起稳定使用10天(数据未显示)。

实施例4

中间体精确度-分析者间变异性

分析者间变异性测试评估分析方法在由多个分析者执行时精确操作的能力。两名分析者一式两份地独立测试了两个单采血液成分术样品和CYTO-TROL。两名分析者在同一天使用相同批次的CytoTrol(PCTM)和2个健康供体样品独立地制备和分析样品。结果示于表17中。

表17.冻干试剂的使用，分析者间变异性数据。

跨分析者比较靶群体的平均频率，并计算％变化。表15显示分析者间变异性是最小的，并且所有靶群体的％CV在可接受范围内(≤25％CV)。

实施例5

测定间的精确度

测定间精确度测试评估了分析方法在不同日子由不同分析者执行时精确操作的能力。在10个不同的轮次中独立地测试CYTO-TROL(PCTM)。跨轮次比较靶群体的平均频率，并计算％变化。结果示出于图4和表18中。

表18.冻干试剂的使用—测定间精确度

图4和表18和表19显示测定间精确度是最佳的，并且所有靶群体的％变化在可接受范围内(≤25％CV)。靶群体的所有频率都在CYTO-TROL批次特异性数据范围(参考范围)的参考范围内。通常，CYTO-TROL中的参考范围是；95％-100％的CD45+；71％-87％的CD3+；2.7％-11.1％的CD56+CD3-；和5％-21％的CD19+。

2名分析者在同一天使用相同批次的CytoTrol(PCTM)和2个健康供体样品独立地制备和分析样品。

表19冻干试剂的使用，分析者间变异性

实施例6

T检验

如表20中所示，执行双尾配对T检验，比较来自不同的日子执行的液体和冻干染色的14个数据集。

表20.液体混合物和冻干试剂之间的比较。

液体试剂

冻干试剂

H_o染色后液体抗体试剂和冻干抗体试剂的平均差异为0。

H_a染色后液体抗体试剂和冻干抗体试剂的平均差异不等于0。

附加的表21汇总了来自T检验的数据。

表21.与液体试剂配对T检验可比的方法性能(汇总)

可报告属性	对的数目	P值	差异(s或ns？)
				CD45hi	14	0.4	ns
T细胞	14	0.36	ns
				NK细胞	14	0.14	ns
单核细胞	14	0.29	ns
				B细胞	14	0.11	ns
CD45dim细胞	14	0.73	ns
				CD45dim/CD19+CD34+细胞	14	0.39	ns
CD45dim/CD19+CD10+细胞	14	0.2	ns

跨14个数据集中比较靶群体的平均频率，并计算％变化。表17显示平均值之间的差异是最小的。所有靶群体的p值在可接受范围内(p值>0.05)。

使用健康供体和患者批次将冻干混合物与同种型、样品和补偿对照的液体试剂进行比较。冻干试剂与液体试剂的可比性是通过参数频率、测定间精确度和配对T检验值的％差异来确认的。重悬于2000μL的染色缓冲液中的冻干产物显示出至少10天稳定。单色冻干的补偿对照稳定达至少10天。

实施例7

方法性能参数

基于例如Sconochia G.等人，“白血病(Leukemia)”2005；19:69-76和Van AckerHH等人“免疫学前沿(Frontiers in Immunology)”2017；8:892，上述方法满足所有预期的性能参数。这些性能参数可汇总如下：

表21：示例性方法性能参数

实施例8

方法特异性

充分研究该方法的灵敏度以确保最佳分析性能。特异性测量测试对感兴趣的靶群体的特异性程度，并且是通过将样品中已知的％靶群体与通过测试检测的％群体进行比较来测量的。对CD34、CD19和CD56缀合的抗体的特异性是通过测试已知的阳性和阴性样品的对应标志物来检查的。对于CD34抗体特异性，来自干细胞技术公司的Stem-Trol(商业来源/制造的CD34+阳性对照细胞)用作阳性样品。类似地，MAVER-1/MRL3008(CD19+B细胞系)和纯NK细胞(来自干细胞技术公司)分别用作CD19抗体特异性和CD56抗体特异性的阳性样品。CD34+细胞、CD19+细胞和NK细胞百分比是这种评估的输出测量值。方法PCTM，CYTO-TROL也用于特异性测试，因为其具有由制造商提供的批次特异性参考范围。

图5和表21显示该方法成功地检测到了测试材料的预期值：阴性测试材料为阴性结果，阳性测试材料为阳性结果，并且在CYTO-TROL的参考范围内。总之，该方法对于CD34⁺细胞、CD19⁺细胞和NK细胞的检测是特异性的。

表21在特异性研究中使用的样品以及其对于％CD34⁺、％CD19⁺和％CD56⁺CD3^-NK细胞的预期值和检测值

实施例9

方法准确度

方法的准确度描述了通过该方法获得的测试结果与可接受的参考值(通过先前认可的方法获得)的接近度。使用PCTM，CYTO-TROL对CD3^-杂质方法的准确度或回收率进行了评估，该CYTO-TROL的参考范围由制造商提供。在不同的日子进行三个独立的实验。计算三个实验的平均频率。％准确度测定为：

表21显示了与由制造商提供的CD45⁺、CD3⁺、CD56⁺CD3^-和CD19⁺的频率的批次特异性参考范围相比，CYTO-TROL批次号729188的测试结果。三个实验显示了良好的精确度(％CV≤20)和准确度(％准确度在80％-120％内)，并且所有列出的群体都在参考范围内。

表23.CYTO-TROL对照细胞的测试结果

实施例10

方法稳健性

上述实施例中描述的方法也是稳健的。稳健性评估分析方法的可靠性，并且是该方法在方法参数的小但故意的变化下产生类似数据的能力的量度。这种方法的方法稳健性可例如在以下方面评估：

抗体染色/孵育时间：测试抗体染色的孵育持续时间从10分钟至45分钟。任何孵育时间≥45分钟对于表面染色都不是必需的，并且被认为在测试工作流程中是无效的。

所接种的总TVC/孔和获取事件的下限：以0.5×10⁶个或1×10⁶个TVC接种细胞数/孔以用于染色。

为了确定当检测小的或稀少的群体时将提供给定精确度的样品的大小，可以使用如Maecker HT等人细胞计量术部分A(Cytometry Part A)2006(69A):1037-1042；ICSH/ICCS工作组(ICSH/ICCS Workgroup).细胞计量术B临床细胞计量术(Cytometry B ClinCytometry).2013；84:279-357；或Allan AL等人，《肿瘤学杂志(Journal of Oncology)》2010(2010:426218中所述的方法。

在10分钟、20分钟、30分钟和45分钟的抗体染色孵育时间测试这种方法的稳健性。在每个时间点运行两个样品，并比较以下靶细胞群体的检测频率：白细胞中的％CD45⁺，CD45⁺细胞中的％亚群(CD3⁺T细胞、CD56⁺CD3⁺NKT细胞、CD56⁺CD3^-NK细胞、CD14⁺CD3^-单核细胞和CD19⁺CD3^-B细胞)。图6和表21显示所有靶细胞群体在所测试的孵育时间范围内是可比的。所有靶细胞群体的％CV小于25％。因此，建立了10分钟至45分钟的动态孵育时间范围。将100μL的染色体积用于所有样品。

表21.方法稳健性：抗体染色孵育时间

该方法设定了每孔接种的TVC的极限，当检测小的或稀少的亚群诸如最终产物中的非T细胞或高肿瘤负荷患者起始材料中的T细胞时，该极限将提供给定的精确度。基于对临床流式细胞术方法的相关指导，实施简单的计算以确定样品的大小，当检测小的或稀少的亚群时，该样品的大小将提供给定的精确度，如下所示：

其中r是满足所需标准的事件的数量，而CV是期望的变化系数。/>

基于这种计算，5％的期望％CV提供了良好水平的置信度和精确度。因此，并且，所建立的关键报告参数的LLOQ值中的这种可检测性质量的下限是0.2％。通过外推法，获得400个此类残留细胞需要获取最少0.04×10⁶个TVC。使用这种方法，如果可接受的％CV是15％，则应当获取最少50,000个TVC，因为使用2种起始患者材料执行基础研究，并用全抗体组对10,000个、20,000个、50,000个、100,000个和200,000个事件的CD45+获取事件进行染色。如表22和表23所示，通过％CV将各种获取事件相互比较。当在50,000个、100,000个和200,000个获取事件中比较时，发现表22中所列的数据没有显著影响。这是当收集50,000个事件时具有小于1％的值的潜在变量。结果列于表23中，其中较低的％B细胞数据(仅等于或大于LLOQ值)受到影响，有10,000个和20,000个收集的CD45+事件，但这对B-母细胞参数没有影响。

在同一天，使用3个不同的样品，用1×10⁶个和1×10⁵个TVC执行简单的TVC接种实验，以进行粗略的接种极限估计评估。表24中显示的数据提供了两个TVC接种/孔测试之间所有报告参数频率的可比性。表24中还显示了样品单采血液成分术批次AC25809161中％B细胞低于LLOQ的发现。

总之，当这种方法被设定为获取停止标准时，当存活的CD45+细胞达到150,000个事件时，足以实现22,222个事件的最小计算数目。在100,000个存活的CD45+事件处的停止门保证了在0.2％的LLOQ下检测较低频率细胞群体所需的最少细胞事件，CV≤15％。此外，这将不会使细胞获取过于耗时且对于测试工作流程而言无效。为了说明在细胞染色和洗涤步骤期间潜在的细胞损失，将原始细胞接种密度和每孔的TVC设定为每孔1E6。

表22.方法稳健性：从各种存活的CD45⁺获取事件收集的数据

注：当各值彼此进行比较时，较低的值在统计学上具有较高的％CV；％B细胞的值都<LLOQ(<0.2％)

表23.方法稳健性：对于％CD14⁺单核细胞测量，较低的存活CD45⁺获取事件停止门数据和10K CD45⁺是不可比的。

注：当各值彼此进行比较时，较低的值在统计学上具有较高的％CV；％B细胞的LLOQ为0.2％

表24.方法稳健性：用于铺板的TVC/孔

注：在统计学上，当各值彼此进行比较时，较低的值具有较高的％CV；％B细胞的LLOQ为0.2％

实施例11

单色冻干补偿对照的稳定性

根据制造商，补偿对照稳定性是在用染色缓冲液(BSA)重构后一天。在Kite，我们评估了补偿对照的14天稳定性。在冻干补偿对照试剂盒(BD目录号625812)中包括七个冻干补偿对照CD3-APC、CD10-FITC、CD14-PerCPCy5.5、CD19-PECy7、CD34-BV421、CD45-V500和CD56-PE。将300μL的染色缓冲液(BSA)和一滴UltroComp eBeads(补偿珠粒)添加到每个冻干的补偿对照管中并孵育15分钟以制备用于测定的补偿对照。重构后将冻干的补偿对照管在4℃保存14天，并计算MFI以评估稳定性。

表25.单色冻干补偿对照的十四天稳定性

表25显示从第0天和第14天重构的冻干单色补偿对照的MFI是可比的。来自第14天冻干的补偿对照的数据显示与第0天新鲜单色补偿对照的差异百分比<25％。这显示了在4℃下储存14天的补偿对照的稳定性。

Claims

1.一种在细胞群体中同时鉴定淋巴细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合中的两者或更多者的方法，所述方法包括使用如表2中所述的这些细胞的表面上的标志物中的两种或更多种标志物，任选地以及如表3、表4和表5中所述的荧光标记的抗体中的一种或多种荧光标记的抗体，使用荧光检测方法，来同时检测淋巴细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞和/或早期B细胞祖细胞中的两者或更多者的存在或不存在。

2.一种评估主要包括CD4+和/或CD8+T细胞的细胞群体中的非CD3+污染物的方法，所述方法包括使所述细胞群体与针对淋巴细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞和/或早期B细胞祖细胞的特异性表面标志物的一种或多种抗体接触以产生混合物，其中所述特异性细胞表面标志物中的两种或更多种特异性细胞表面标志物描述于表2中，任选地，其中所述一种或多种抗体选自表3、表4和表5；以及通过荧光检测方法分析所述混合物中具有特异性细胞表面标志物的细胞的分布。

3.一种通过免疫疗法治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用T细胞制备物，其中所述T细胞制备物中的CD3-杂质(例如，NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合)中的一种或多种CD3-杂质是通过根据权利要求2所述的方法表征的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述T细胞制备物是自体的，任选地来自癌症患者或健康供体。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述T细胞制备物是同种异体的，任选地来自癌症患者或健康供体。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述T细胞是用CAR或T细胞受体工程改造的。

7.一种用于确定T细胞产物是否适合于免疫疗法的方法，所述方法包括使用表3、表4和表5中所述的抗体或抗体混合物中的一者表征所述T细胞产物中的CD3-细胞杂质(例如，NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合)中的一种或多种CD3-细胞杂质；以及基于所述T细胞产物中CD3-细胞杂质的水平确定所述T细胞产物是否适合。

8.根据权利要求7所述的方法，其中能够接受的水平由管理机构(例如，

FDA、EMEA等)设定。

9.一种用于使用表3、表4和表5中所述的抗体或抗体混合物中的一者或多者在血细胞群体中鉴定T淋巴细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞总淋巴细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合中的至少一者的测定或试剂盒。

10.根据权利要求9所述的测定或试剂盒，其中所述测定或试剂盒用于表征用于免疫疗法的T细胞产物中CD3-细胞的存在。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含(a)一种或多种抗体，所述抗体用于检测这些细胞中的任何一种或多种细胞的一种或多种细胞表面标志物(参见例如表2)；和(2)试剂，所述试剂用于进行所述抗体与所述细胞表面标志物的结合；以及任选地(3)使用所述试剂用于所述试剂盒的目的的使用说明书。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗体(两种或更多种)都在同一容器中一起冻干。

13.一种组合物，所述组合物包含用于鉴定细胞群体中T细胞、NK-T细胞、NK细胞、单核细胞、早期B细胞祖细胞或它们的组合的存在或不存在的一组荧光标记的抗体，所述一组荧光标记的抗体包括针对表2中鉴定出的所述细胞表面标志物中的两种或更多种细胞表面标志物的两种或更多种抗体，任选地其中表3、表4或表5中描述了所述抗体中的一种或多种抗体。

14.一种组合物，所述组合物包含用根据权利要求13所述的组合物荧光染色的免疫细胞。

15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物包含表3、表4或表5中的所有所述抗体，任选地连同细胞活力标志物。

16.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物包含针对表2中的所有所述细胞表面标志物的抗体，任选地连同细胞活力标志物。

17.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物包含与表6相同的量或为这种量的相同倍数的表6中所述的所有所述抗体。