CN116515741A - 干细胞外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤再生及修复制品上的应用 - Google Patents
干细胞外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤再生及修复制品上的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116515741A CN116515741A CN202310556548.3A CN202310556548A CN116515741A CN 116515741 A CN116515741 A CN 116515741A CN 202310556548 A CN202310556548 A CN 202310556548A CN 116515741 A CN116515741 A CN 116515741A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- exosomes
- cells
- solution
- secretion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 13
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000008439 repair process Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 title abstract description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 53
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 38
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 22
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 11
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 31
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 abstract description 21
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 abstract description 21
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 abstract description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 58
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 29
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 26
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 8
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 8
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 8
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 8
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 8
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 8
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 5
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 5
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 5
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 5
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 5
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 5
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 3
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 3
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 3
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010051246 Photodermatosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- -1 pancreatin-EDTA Proteins 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008845 photoaging Effects 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000851054 Homo sapiens Elastin Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000851053 Mus musculus Elastin Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000693530 Staphylococcus aureus Staphylokinase Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008568 cell cell communication Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 102000054289 human ELN Human genes 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
- C12N2501/905—Hyaluronic acid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本申请公开了干细胞外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤再生及修复制品上的应用。该获得方法通过利用子宫内膜干细胞进行体外培养，并分泌培养过程中使用了特殊的分泌培养基和负载培养基，使得其分泌的外泌体不仅能够表达特殊的RNA，还同时负载有透明质酸。本申请实施例通过动物实验证明了此种外泌体对小鼠光老化皮肤的损伤修复作用，因而此种外泌体具有广泛的应用抗衰老、皮肤修复相关制品的应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及外泌体技术领域，尤其涉及外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤修复制品上的应用。
背景技术
外泌体(exosomes)是由细胞释放的一种内源性的胞外囊泡(extracellularvesicles,EVs)，具有磷脂双分子层，其内含有胞浆，尺寸约30150nm，含有蛋白质(膜蛋白与可溶性蛋白)、糖类、脂质、RNA(mRNA、miRNA，1ncRNA等)、DNA等多种生物活性分子。而这些生物活性分子不仅存在于外泌体中，它们还能够能够经由分泌细胞分泌至细胞外而被受体细胞接受，并且能够将其负载的生物活性分子运送到受体细胞中，如此即可进行细胞间的物质传递，促进细胞之间通信，并为这类外泌体的用于药物递送等领域的开发提供了开发前景。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提供一种能够转移传递具有抗衰老和皮肤修复的外泌体。
第一方面，本申请公开了一种外泌体的获得方法，包括：
融合培养，将EnSCs培养至80％～90％融合度时，进行传代培养；
消化处理传代后的第2代培养EnSCs，得到具有变圆、起皱的形态的待分泌细胞；
分泌培养，将所述待分泌细胞转移进行换液培养，所换溶液为分泌培养基，得到第一培养液；
负载培养，将所述第一培养液继续继续进行换液培养，所换溶液为负载培养基，即可得到分泌有外泌体的第二培养液，纯化后即可得到所述外泌体。
在本申请实施例中，融合培养的细胞接种浓度为1×106/mL。
在本申请实施例中，所述消化处理的部件具体包括：
将传代后的第2代EnSCs培养液用含有0.01％EDTA的胰酶溶液进行第一消化处理，清洗后；
将经过第一消化处理及清洗后的细胞，再次用0.01％EDTA的胰酶溶液进行第二消化处理，即可得到具有具有变圆、起皱的形态的待分泌细胞；
其中，第一消化处理加入的含0.01％EDTA的胰酶溶液体积为培养液的0.5％，处理时长为20min；第二消化处理加入的含0.01％EDTA的胰酶溶液体为培养液的6.25％，处理时长为60min。
在本申请实施例中，所述分泌培养基为含有20～65ng/mL TGF-α、2～7.2ng/mL HC的DMEM/F12培养基。
在本申请实施例中，所述分泌培养基为含有15～55ng/mL TGF-β、0.6～4.8ng/mLEGF、2～7.2ng/mL HC的DMEM/F12培养基。
在本申请实施例中，所述负载培养基为含有0.2～1.7mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
在本申请实施例中，所述外泌体的分离过程具体包括：
对所述第二培养液经过0.22μm过滤后，取滤液，依次进行300g离心10min；3000g离心10min；10000g离心30min后得到去除细胞及其碎片的初提液；
将所述初提液用外泌体提取试剂盒处理后，得到精提液；
再将所述精提液依次进行5000g离心30分钟、10000g离心30min和30000g离心30min处理，得到的沉淀即为最终的所述外泌体。
第二方面，本申请公开了包含第一方面所述的获得方法获得的外泌体的制剂。
第三方面，本申请公开了包含第一方面所述的获得方法获得的外泌体在制备抗衰老、皮肤修复制品上的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请实施例利用子宫内膜干细胞进行体外培养，获得了其分泌的外泌体，并且在对干细胞的分泌培养过程中使用了特殊的分泌培养基和负载培养基，使得其分泌的外泌体不仅能够表达特殊的RNA，还同时负载有透明质酸。本申请实施例通过动物实验证明了此种外泌体对小鼠光老化皮肤的损伤修复作用，因而此种外泌体具有广泛的应用抗衰老、皮肤修复相关制品的应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例1提供的外泌体微观图(200nm)。
图2为本申请实施例2提供的外泌体微观图(200nm)。
图3为本申请实施例3提供的外泌体微观图(200nm)。
图4为本申请实施例4提供的外泌体微观图(100nm)。
图5为本申请实施例5提供的外泌体微观图(100nm)。
图6为本申请实施例6提供的外泌体微观图(100nm)。
图7为本申请实施例7提供的外泌体微观图(200nm)。
图8为本申请实施例8提供的外泌体微观图(200nm)。
图9为本申请对比例2提供的外泌体微观图(200nm)。
图10为本申请对比例3提供的外泌体微观图(200nm)。
图11为本申请对比例4提供的外泌体微观图(200nm)。
图12为本申请对比例5提供的外泌体微观图(200nm)。
图13为本申请对比例6提供的外泌体微观图(200nm)。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。下方涉及的试剂、设备，若无详细说明均可从商业途径获取，若无详细说明的方法均为常规实验方法。
外泌体的分离与鉴定
1、实验材料与方法
1.1、细胞系来源
本申请实施例采用子宫内膜干细胞(EnSCs)作为细胞系来源进行分离外泌体，EnSCs购自深圳全美基因公司。
1.2、外泌体分泌过程
具体的实施例1的实施过程为：
1)融合培养
将EnSCs以1×106/mL浓度接种于含有16mL DMEM/F12完全培养基(美国HyClone公司)的25cm2 T75细胞培养瓶(赛默飞)中，于37℃，5％CO2条件下在CO2培养箱中培养，每24h更换一次细胞培养基，期间于倒置显微镜(NIB-100，南京江南永新光学有限公司)下观察细胞形态，待细胞生长至80％～90％融合度时，进行传代培养；
2)消化处理
于无菌条件下，取第2代培养的EnSCs培养液中加入0.08mL含0.01％EDTA的胰酶溶液(北京索莱宝科技有限公司)进行第一消化处理，转至于CO2培养箱中5％CO2条件下消化20min用2mL PBS缓冲液轻轻冲洗细胞3次后；
再次向培养瓶中加入l mL含0.01％EDTA的胰酶溶液(体积比约为培养液的6.25％)进行第二消化处理，转至于CO2培养箱中5％CO2条件下消化60min，于倒置显微镜下观察细胞，当细胞开始皱缩、变圆时，拍打培养瓶侧壁使细胞脱落；
加入2倍消化后的溶液体积的含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，无菌移液管吹打混匀细胞悬浮液后，移至15ml离心管，1000r/min离心5min，弃上清，得到沉淀，即为待分泌细胞；
3)分泌培养
将待分泌细胞的沉淀用15mL 10％FBS的DMEM/F12培养基混悬后置于25cm2 T75细胞培养瓶，转至于CO2培养箱中，于培养瓶用酒精擦拭后置于37℃、5％CO2下培养，培养过程中每24h换液，换液体积量不低于10mL，连续培养4天，得到第一培养液；
所换溶液为分泌培养基，其为含有50ng/mL转化生长因子-α(TGF-α，Sigma-Aldrich)、5ng/mL皮质醇(Hydrocortisone，HC，湖北威德利化学科技有限公司)的DMEM/F12培养基。
4)负载培养
将上述的第一培养液继续换液培养3天，每24h换液，换液体积量不低于10mL，连续培养3天，得到第二培养液，以便进行后续步骤。
所换培养液负载培养基，其为含有0.5mg/mL透明质酸钠(简称为HA，分子量为3000左右，济南鲁欣化工科技有限公司)的DMEM/F12培养基。
实施例2的外泌体分泌的实施过程为：
步骤1)～2)均与实施例1相同，其步骤3)-4)中，分泌培养基为含有20ng/mL TGF-α、2ng/mL HC的DMEM/F12培养基；其负载培养基为含有0.5mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
实施例3的外泌体分泌的实施过程为：
步骤1)～2)与实施例1相同，其步骤3)-4)中，分泌培养基为含有65ng/mL TGF-α、7.2ng/mL HC的DMEM/F12培养基；其负载培养基为含有0.5mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
实施例4的外泌体分泌的实施过程为：
步骤1)～2)与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为含有35ng/mL转化生长因子-β(TGF-β，Sigma-Aldrich)、3ng/mL表皮生长因子(简称为EGF，Sigma-Aldrich)、5ng/mL HC的DMEM/F12培养基；其负载培养基为含有0.5mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
实施例5的外泌体分泌的实施过程为：
步骤1)～2)与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为含有15.0ng/mLTGF-β、0.6ng/mL EGF、2.0ng/mL HC的DMEM/F12培养基；其负载培养基为含有0.5mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
实施例6的外泌体分泌的实施过程为：
步骤1)～2)与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为含有55.0ng/mLTGF-β、4.8ng/mL EGF、7.2ng/mL HC的DMEM/F12培养基；其负载培养基为含有0.5mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
实施例7的外泌体分泌的实施过程为：
步骤1)～2)均与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为含有50ng/mL TGF-α、5ng/mL HC的DMEM/F12培养基；其负载培养基为含有0.2mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
实施例8的外泌体分泌的实施过程为：
步骤1)～2)均与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为含有50ng/mL TGF-α、5ng/mL HC的DMEM/F12培养基；负载培养基为含有1.7mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
对比例1的外泌体分泌的实施过程为：
选用了脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为细胞系分泌外泌体，购自Gibco，赛默飞，其培养过程大致与实施例1相同。
对比例2的外泌体分泌的实施过程为：
仍然以EnSCs作为细胞系分泌外泌体，其实施步骤1)～2)均与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为10％FBS的DMEM/F12培养基；负载培养基为含有0.5mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
对比例3的外泌体分泌的实施过程为：
仍然以EnSCs作为细胞系分泌外泌体，其实施步骤1)～2)均与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为50ng/mL TGF-α的DMEM/F12培养基；负载培养基为含有0.5mg/mLHA的DMEM/F12培养基。
对比例4的外泌体分泌的实施过程为：
仍然以EnSCs作为细胞系分泌外泌体，其实施步骤1)～2)均与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为含5ng/mL HC的DMEM/F12培养基；负载培养基为含有0.5mg/mLHA的DMEM/F12培养基。
对比例5的外泌体分泌的实施过程为：
仍然以EnSCs作为细胞系分泌外泌体，其实施步骤1)～2)均与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为含有35ng/mL TGF-β、3ng/mL EGF的DMEM/F12培养基；负载培养基为含有0.5mg/mL HA的DMEM/F12培养基。
对比例6的外泌体分泌的实施过程为：
仍然以EnSCs作为细胞系分泌外泌体，其实施步骤1)～2)均与实施例1相同，其步骤3)～4)中，分泌培养基为50ng/mL TGF-α、5ng/mL HC的DMEM/F12培养基；负载培养基为含有含有10％FBS的DMEM/F12培养基。
1.3、外泌体的分离
实施例1的实施过程为：
(1)将上述培养得到细胞培养液用0.22μm过滤器过滤，滤液置于离心管中，转至台式超高速离心机中进行梯度离心：300g离心10min；3000g离心10min；10000g离心30min以去除细胞以及细胞碎片。
(2)将离心后的上清液转移至另一清洁无菌的离心管中，按照1/10的上清液体积量加入的ExoQuick-TC提取液(美国SBI公司)，混匀，将混合液置于4℃下冰冻孵育过夜(至少12小时)，在孵育期间保持离心管直立，避免倾倒再次混匀。
(3)将试管转移至离心机中，4℃条件下，依次在5000g离心30分钟、10000g离心30min和30000g离心30min进行处理，每次离心均弃除上清液，得其沉淀进行下一步操作，最终得到的沉淀即为纯化的外泌体，用无菌PBS缓冲溶液重悬沉淀，即可。
实施例2-8以及对比例1-6分离外泌体的实施过程均与实施例1相同。
1.4、外泌体的分析
(1)外泌体粒径分布
用动态光散射法分析得到的外泌体粒径分布情况，使用0.1μm的微孔滤膜过滤PBS缓冲液，以减少其溶液中可能存在的颗粒背景干扰，用于稀释浓缩的外泌体样本。将外泌体样本经梯度稀释后，经马尔文纳米粒度分析仪器测试，测样时保证溶液表面无气泡。
马尔文纳米粒度分析仪(Nano ZS90，马尔文仪器有限公司)进行测试，粒径测试条件为温度25℃，溶剂为PBS，材料折光系数为1.400，材料吸光系数0.001，173℃背向光散射。当临近浓度梯度的样本，所测得粒径分布稳定、相似时，即为合适检测的样本浓度。将该样品平行测试5次，数据经Zetasizer软件处理，并取平均值。
(2)扫描电子显微镜观察
将外泌体样本悬液与5％的戊二醛以1:1的体积比混合，在4℃下静置30min，以固定颗粒形貌，并滴加至单抛光硅片上，随后分别用50％、60％、70％、80％、90％的甲醇对样本进行梯度脱水，以除去样本的水分和盐等充分，并在下4℃保存，直至扫描电镜检测。
(3)WesternBlot鉴定外泌体蛋白质标志物
取上述分离得到的外泌体，于4℃条件下，向外泌体的悬浮液中加RIPA裂解液(加入的RIPA裂解液为外泌体悬浮液体积的10％)处理30min，以充***解外泌体；再于4℃、12000rpm 10min离心，弃去沉淀，保留上清液，并采用BCA蛋白浓度试剂盒(Abcam中国)进行总蛋白质含量测定。
完成蛋白质浓度定量后，与5×SDS的上样缓冲液稀释，使蛋白质终浓度为1μg/μL，最后于95℃下水浴5min，使蛋白质变性，以作为SDS-PAGE的上样液，SDS-PAGE电泳，每孔上样体积为15μL，在室温、电压100mV条件下，电泳2.5h，使Marker)相互分离；
随后将凝胶置于转膜缓冲液中，摇床震荡10min，之后采用经甲醇活化30s的PVDF膜，在4℃、电压30mV下转膜过夜；
转膜过程完成后，将转膜用TBST缓冲液清洗1次后转置于含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，在摇床上室温震荡1h，以使膜封闭；随后加入一抗孵育，于4℃条件下摇床震荡过夜；一抗孵育完成后，将膜置于TBST缓冲液中摇床震荡洗脱3次，每次10min，之后避光孵育二抗，在室温下摇床震荡孵育1h；二抗孵育完成后，将膜置于TBST缓冲液中摇床震荡洗脱3次，每次10min，之后经ECL发光显影液显影，采用F1uorChem HD2***拍摄成像，ImageJ对条带灰度定量。
上述对转膜封闭后加入的一抗分别有CD90(EPR2949)、CD63(EPR21151)、Calnexin(EPR21205)和GADPH(EPR16891)，均购自购自Abcam公司，加入的二抗均为为HRP-conjugated二抗，购自Abcam公司，以分别进行平行实验，检测外泌体CD90、CD63和Calnexin的含量。
1.5、miR-21-5p的表达检测：
在对细胞培养及外泌体分泌步骤完成后，即上述步骤8)之后，用荧光定量PCR法检测细胞及其外泌体中的miR-21-5p中的表达水平。
(1)样品液制备
第一供试样品：取上述分离得到的外泌体，于4℃条件下，向外泌体的悬浮液中加RIPA裂解液(加入的RIPA裂解液为外泌体悬浮液体积的10％)处理30min，以充***解外泌体；再于4℃、12000rpm 10min离心，弃去沉淀，保留上清液，以作为第一供试样品，用于检测外泌体中的miR-21-5p表达量。
第二供试样品：取上述培养得到的细胞培养液用0.22μm过滤器过滤，取滤渣，用RIPA裂解液悬浮，处理30min后，再于4℃、12000rpm 10min离心，弃去沉淀，保留上清液，以作为第二供试样品，用于检测细胞中的miR-21-5p表达量。
(2)按照荧光定量PCR试剂盒All-in-OneTM miRNA qPCR Synthesis Kit(货号QPO11，购自GeneCopoeia公司)进行荧光定量PCR检测，分别用总RNA提取试剂TRIzonReagent(购自康为世纪公司)提取上述第一样品和第二样品中的总RNA。
(3)利用逆转录试剂盒All-in-OneTM miRNAFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(货号QP014:购自GeneCopoeia公司)进行逆转录合成cDNA，以提取的5μL RNA溶液，按照42℃60min→95℃3min的条件进行加polyA尾及逆转录反应，合成cDNA。
(4)将cDNA产物稀释10倍，取2μL作为模版，引物2μL，All-in-OneTM miRNAqPCRMix10μL，Universal Adaptor PCR Primer 2μL，ROX Reference Dye 0.1μL，双蒸水配制总体积为20μL的荧光定量PCR反应体系，按照三步法95℃15min起始变性(1个循环)→94℃20s变性，65℃30s退火，72℃34s延伸进行预扩增(5个循环)→94℃20s变性，61℃34s退火延伸进行扩增，并采集荧光信号(40个循环)的条件进行荧光定量PCR反应。其中，miR-21-5p引物序列为：CCGCGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA；U6引物序列为GCTTCGGCACTTATACTAAAAT；均由上海生工提供。
(5)miR-21-5p表达水平采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析，其中以内参基因U6为参照基因，Ct为循环阈值，每个标本重复5次，取平均值进行统计学分析。
1.6、透明质酸含量测定
在对细胞培养及外泌体分泌步骤完成后，即上述步骤8)之后，用HPLC法检测外泌体中及细胞悬液中透明质酸含量，细胞悬液为即外泌体分离步骤中用0.22μm过滤器过滤得到的滤液。
(1)采用HPLC进行检测，色谱条件为：MCI GEL CK08EH色谱柱(8mm×300mm，5μm，三菱液相)；流动相：1％磷酸；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；检测波长：232nm。
(2)标准样品：精密称取透明质酸钠标准品约5mg于50mL容量瓶中，加入10mL酶解缓冲液(称取5mmol/L磷酸二氢钠、5mmol/L磷酸氢二钠，pH 6.0)充分溶解并定容至刻度，混匀；取上述溶液0.2mL，加入0.5mL透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2h，煮沸2min使酶失活；将上述溶液转移入10mL容量瓶中以缓冲液定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得对照溶液。
(3)供试样品
第三供试样品：取上述细胞悬液(大约5mL)，于3000g离心10min；10000g离心30min后，取上清液0.2mL，加入0.4mL透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2h，煮沸2min使酶失活；将上述溶液转移入10mL容量瓶中以流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得第三供试样品。
第四供试样品：取上述分离得到的外泌体，于4℃条件下，向外泌体的悬浮液中加RIPA裂解液10mL处理30min，以充***解外泌体；加入0.5mL透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解2h，煮沸2min使酶失活；再于4℃、12000rpm 10min离心，弃去沉淀，保留上清液；将上述溶液转移入10mL容量瓶中以流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得第四供试样品。
(4)以标准样品按照上述色谱条件进行检测，获得其色谱图中的特征峰面积，制作标准曲线和标准方程，同样进行供试样品进行检测，获得其对应的特征峰面积，代入标准方程，计算得到第三供试样品和第四供试样品中透明质酸钠的含量。其中，则细胞悬液中透明质酸的含量等于第三试样品测定的对应HA含量(mg/mL)50×10/0.6；外泌体中透明质酸含量为：外泌体中HA的载量＝第四供试样品中HA含量(μg/mL)×第四供试样品体积(20mL)/外泌体质量(μg)，外泌体质量为外泌体分离步骤最终得到的沉淀物质量。
1.7、数据分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较，并进行显著性差异标记。
2、结果
表1相对于GADPH的表达量
| 实施方式 | CD90 | CD63 | Calnexin |
| 实施例1 | 167.2±1.3％a | 152.4±12.7％a | 15.7±0.6％d |
| 实施例2 | 143.1±5.2％ab | 148.3±8.6％a | 16.2±1.4％d |
| 实施例3 | 171.2±2.4％a | 147.8±7.2％a | 21.3±2.1％d |
| 实施例4 | 175.5±6.7％a | 162.8±7.5％a | 14.2±0.4％d |
| 实施例5 | 161.7±3.8％a | 150.2±6.2％a | 10.3±1.4％d |
| 实施例6 | 168.5±2.1％a | 154.3±4.2％a | 13.4±2.1％d |
| 实施例7 | 164.2±3.1％a | 150.7±2.8％a | 8.2±1.3％de |
| 实施例8 | 166.0±0.9％a | 151.3±4.2％a | 5.8±0.2％de |
| 对比例1 | 2.7±0.3％d | 12.7±2.1％d | 94.2±3.7％a |
| 对比例2 | 32.4±5.7％c | 43.2±4.1％c | 76.2±5.8％b |
| 对比例3 | 88.8±4.1％cd | 77.7±6.2％c | 64.2±7.2％b |
| 对比例4 | 92.1±3.2％c | 85.1±1.3％b | 43.1±5.2％c |
| 对比例5 | 81.4±2.6％c | 99.3±7.3％c | 62.8±4.8％b |
| 对比例6 | 158.8±4.3％a | 153.1±4.4％a | 13.6±3.1％d |
由表1可知，实施例1-8以及对比例6制备的样品液中CD90和CD63的相对表达量均超过100％，为阳性表达，而Calnexin相对表达量低于100％，为阴性表达，依据国际细胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles ISEV)在2014年公布的“最低鉴定标准”，证明经过上述细胞系培养过程进行培养后细胞确实分泌了外泌体。而对比例1-5制备的样品液中CD90、CD63和Calnexin的相对表达量均未超过100％，并不能证明这些实施例进行细胞培养后分泌了外泌体，或者其分泌的外泌体含量较低。但是通过对各实施例和对比例经过上述实施例步骤得到的沉淀物进行微观观察，如图所示，实施例1-8以及对比例2-6均得到了分泌体，而对比例1中并未见明显的分泌体。
结合上述对外泌体分泌过程的步骤分析发现，外泌体分泌过程中，采用子宫内膜干细胞作为分泌细胞有利于获得高浓度的外泌体，在其分泌步骤6)中添加合适浓度的TGF-α、TGF-β、EGF和HC对分泌体的分泌量产生了显著影响。
表2
实施例1-8和对比例1-6对应的miR-21-5p表达量如表2所示。由表2可知，实施例1-8以及对比例6对应的细胞中miR-21-5p表达量显著低于对比例1-5，而其外泌体中miR-21-5p表达量显著高于对比例1-5，说明本申请实施例1-8以及对比例6的细胞分泌过程更有利于促进miR-21-5p在其分泌的外泌体中的表达。其中，由于对比例1通过微观观察并未见明显的外泌体形成，因而并未进行miR-21-5p的表达分析。
表2还列出了实施例1-8和对比例1-6对应的相关透明质酸含量检测情况。对于细胞悬液中的透明质酸含量，实施例1-8与对比例2-5相差不大。而对于外泌体中HA的载量，实施例1-8显著高于对比例2-5，说明实施例1-8的细胞分泌过程更有利于促进透明质酸向外泌体中的转移而负载在外泌体上，其中对比例1由于并未形成外泌体而未进行分析，对比例6由于在细胞分泌过程中并未添加透明质酸，也未进行分析。
动物实验
为进一步阐明本申请提供的外泌体的具体功能及其应用价值，本申请还进行相关的动物实验，具体如下。
1、材料与方法
1.1、实验动物
选用清洁级Sprague-Dawlay大鼠(南通特洛菲饲料科技有限公司)，在恒温22℃、相对湿度65％～70％、光照周期12h:12h，自由进食标准颗粒型动物饲料，饮自来水，适应饲养1周后开始实验。
1.2、造模
在小鼠背部剃毛形成3cm×3cm范围的暴露皮肤，保持背部光滑。小鼠放在紫外线灯下，调整灯管位置，使光源与小鼠之间距离约3℃m左右，每次照射前先预热灯管5min并轮换鼠笼的位置，以此来平衡小鼠照射的紫外线量。照射频率为每周6次，共照射12周，前1-3周每天照射0.25小时；第6-9周，每天照射1.5小时；第10-12周，每天照射3小时；至第13周结束，终止照射共照12周。UV照射强度约为261.79J/cm2，照射后小鼠的暴露皮肤皮肤干燥暗沉、小鼠出现活动减少、神情倦怠疲劳、身体蜷缩不舒展，背部红色圆形癖斑增多、纹理增粗等表现。
1.2、实验分组
将小鼠分为空白组、模型组、注射组和阳性对照组，除空白组未进行造模外，其他各组小鼠均进行造模处理。其中，注射组：在造模前，每天向小鼠的背部暴露皮肤注射上述各实施例和对比例制备制备的外泌体悬浮液100μL，每周1次，其中，由于对比例1并未制备得到分泌体，故而未进行分组实验。阳性对照组：在造模前，每天向小鼠背部暴露皮肤注射玻尿酸(艾莉薇)100μL，每周1次。实验连续处理4周。模型组不做处理，正常组小鼠并未机械能造模处理。
1.3、小鼠皮肤组织及细胞的获取
处死小鼠，在无菌手术台上剪下各组小鼠造模区的皮肤组织，冲洗和消毒处理后，将皮肤组织放置1h，目的是为了使组织从组织源解离下来，从开始到发生酶解的时间即1个小时；将皮肤组织用剪成的组织小块，加入两倍体积的混合酶液(PrimaCellTM系列组织消化酶液，含胰酶、胰酶-EDTA、胶原酶、中性蛋白酶、透明质酸酶)，37℃，进行45min降解；利用振荡器充分震荡，使皮肤细胞可以尽可能多的脱落下来；1500rmp，5min，弃上清，留沉淀，用无菌的PBS充分悬浮沉淀，清洗两次；再次离心，弃上清，用DMEM培养基(Thermo Fisher)悬浮沉淀，将其转至培养皿中。
1.4、细胞RNA提取
取上述小鼠皮肤细胞溶液用DMEM培养基配制成105个/mL的悬浮液10mL，加入l mL的Trizol裂解液处理15min，离心，上清用氯仿和异丙醇悬浮后，用PureLink RNA小量提取试剂盒，提取细胞的RNA，获取RNA样品，于紫外分光光度计上检测提取的RNA浓度。参照上述实施例的方法检测细胞内miR-21-5p表达量。
1.5、细胞内胶原蛋白含量测定
取上述小鼠皮肤细胞溶液用DMEM培养基配制成105个/mL的悬浮液10mL，加入0.1mL含有1％ PMSF的RIPA裂解液，处理30min，离心，去上清，使用羟脯氨酸检测试剂盒(
氨酸含量，以间接检测其胶原蛋白含量。
1.6、细胞内弹性蛋白含量测定
参照1.5方法收集孔中待测细胞裂解样品，使用小鼠弹性蛋白(ELN)ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份公司)检测细胞内***性蛋白含量。
1.8、细胞内透明质酸含量测定
参照1.6方法收集孔中待测细胞裂解样品，参照上述实施例的方法，使用透明质酸酶制备供试样品，利用HPLC检测其中透明质酸含量。
1.7、Western blot检测蛋白表达水平
取上述细胞使用，LSBIO试剂盒(T-PERTM，赛默飞)提取总蛋白并转移到PVDF膜上，使用5％脱脂奶粉室温封闭2h后加入抗体，孵育2h，以actin为内参蛋白，采用image软件对蛋白灰度分析计算相关表达量。计算相对表达水平。
1.9、数据分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较，并进行显著性差异标记。
2、结果
表3
/>
表3列出了各自实验动物皮肤细胞中的胶原蛋白、弹性蛋白以及透明质酸含量。由表3可知，相对于正常组，模型组小鼠的皮肤组织细胞中的胶原蛋白、弹性蛋白以及透明质酸含量均显著降低，表面造模成功。相对于造模组，阳性对照组小鼠皮肤细胞中胶原蛋白、弹性蛋白以及透明质酸含量有显著提升，表明阳性对照组使用的玻尿酸注射剂对于小鼠被光老化皮肤细胞能够起到改善作用。实施例1-8制备的外泌体注射小鼠光老化皮肤后，其细胞内胶原蛋白、弹性蛋白以及透明质酸含量相对阳性对照组进一步提升，其对于小鼠皮肤光老化皮肤细胞的改性作用非常显著，相对于现有的玻尿酸注射剂具有显著的提升效果。对比例6并未在分泌体的细胞培养过程中添加透明质酸，相对模型组，其几乎对于小鼠光老化皮肤无改善作用。同样，相对于模型组，对比例2-5制备的外泌体对于小鼠光老化皮肤改善作为甚微。
表4
/>
由表4列出了各组小鼠光老皮肤细胞中的miR-21-5p、P38、p-P38、P65和p-P65的表达情况的。表4中，正常组、模型组和阳性对照组均未见有miR-21-5p的表达，表明仅有注射组能够给于小鼠光老化细胞提供miR-21-5p。并且注射组中小鼠光老化细胞miR-21-5p的表达量，实施例1-8显著高于对比例2-6，与体外实验的结果一致，表明外泌体提供了光老化细胞外源的miR-21-5p表达量。
表4中，对于P38和p-P38的表达量，模型组低于正常组，而阳性对照组能够提升其表达量，说明造模对于P38和p-P38的表达量产生了影响，而阳性对照组能够促使小鼠光老化皮肤中P38和p-P38的表达量恢复正常。而注射组中，实施例1-8同样能够促使小鼠光老化皮肤中P38和p-P38的表达量恢复正常。
表4中，对于P65和p-P65的表达量，模型组低于正常组，说明造模对于P65和p-P65的表达量产生了影响，而阳性对照组能够提升二者表达量，恢复对于小鼠光老化皮肤的损坏机能。而注射组各实施例和对比例能够相对于阳性对照组显著提升小鼠光老化皮肤细胞中P65和p-P65的表达量，说明通过向小鼠光老化皮肤中注射外泌体，不仅能够恢复光对其皮肤老化损耗，还能起到二者的表达起到促进和激活作用。
由于P38和p-P38为MAPK信号通路的相关蛋白，而P65和p-P65为NF-κB信号通路的相关蛋白，由此说明本申请实施例提供的外泌体能够促进miR-21-5p表达，激活MAPK信号通路和NF-κB信号通路，同时还能促进胶原蛋白、弹性蛋白的表达，结合这些结论可推测，本申请提供的外泌体可能通过提供miR-21-5p的外源表达量，以激活MAPK信号通路和NF-κB信号通路，从而达到促进胶原蛋白和弹性蛋白表达的作用，实现对小鼠光老化皮肤的损伤修复以及保护作用，同时该外泌体还能提供外源的透明质酸，进一步提供小鼠皮肤的保湿和抗衰老作用。由此说明，本申请实施例提供的外泌体具有应用发挥抗衰老和皮肤保护作用的相关制品中，例如皮肤修复产品，皮肤再生产品等。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种外泌体的获得方法，包括：
融合培养，将子宫内膜干细胞培养至80％～90％融合度时，进行传代培养；所述融合培养的细胞接种浓度为1×106/mL；
消化处理传代后的第2代培养子宫内膜干细胞，得到具有变圆、起皱形态的待分泌细胞；
分泌培养：将所述待分泌细胞转移进行换液培养，所换溶液为分泌培养基，得到第一培养液；所述分泌培养基为含有15～55ng/mL TGF-β、0.6～4.8ng/mL EGF、2～7.2ng/mL HC的DMEM/F12培养基；以及
负载培养，将所述第一培养液继续继续进行换液培养，所换溶液为负载培养基，即可得到分泌有外泌体的第二培养液，纯化后即可得到所述外泌体；所述负载培养基为含有0.2～1.7mg/mL HA的DMEM/F12培养基；
其中，所述消化处理的部件具体包括：
将传代后的第2代子宫内膜干细胞培养液用含有0.01％EDTA的胰酶溶液进行第一消化处理，清洗后；
将经过第一消化处理及清洗后的细胞，再次用0.01％EDTA的胰酶溶液进行第二消化处理，即可得到具有具有变圆、起皱的形态的待分泌细胞；
再使用2倍第二消化处理后溶液体积的含10％FBS的DMEM/F12培养基终止消化，即可得到所述待分泌细胞；
其中，第一消化处理加入的含0.01％EDTA的胰酶溶液体积为培养液的0.5％，处理时长为20min；第二消化处理加入的含0.01％EDTA的胰酶溶液体为培养液的6.25％，处理时长为60min。
2.根据权利要求1所述的获得方法，其特征在于，所述外泌体的分离过程具体包括：
对所述第二培养液经过0.22μm过滤后，取滤液，依次进行300g离心10min；3000g离心10min；10000g离心30min后得到去除细胞及其碎片的初提液；
将所述初提液用外泌体提取试剂盒处理后，得到精提液；
再将所述精提液依次进行5000g离心30分钟、10000g离心30min和30000g离心30min处理，得到的沉淀即为最终的所述外泌体。
3.一种包含权利要求1或2所述的获得方法获得的外泌体的制剂。
4.权利要求1或2所述的获得方法获得的外泌体在制备抗衰老、皮肤修复制品上的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310556548.3A CN116515741A (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 干细胞外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤再生及修复制品上的应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210398089.6A CN114703125B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤修复制品上的应用 |
| CN202310556548.3A CN116515741A (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 干细胞外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤再生及修复制品上的应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210398089.6A Division CN114703125B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤修复制品上的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116515741A true CN116515741A (zh) | 2023-08-01 |
Family
ID=82174549
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210398089.6A Active CN114703125B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤修复制品上的应用 |
| CN202310556548.3A Pending CN116515741A (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 干细胞外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤再生及修复制品上的应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210398089.6A Active CN114703125B (zh) | 2022-04-13 | 2022-04-13 | 外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤修复制品上的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN114703125B (zh) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109172859A (zh) * | 2018-09-06 | 2019-01-11 | 上海长海医院 | 人干细胞来源外泌体复合外源性透明质酸在制备皮肤创面缺损修复药物或材料中的应用 |
| CN108815189A (zh) * | 2018-09-27 | 2018-11-16 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 一种含有自体子宫内膜间充质干细胞外泌体的制剂 |
| EP4137561A4 (en) * | 2020-04-01 | 2024-07-24 | Primoris Co Ltd | METHOD FOR PRODUCING A CULTURE MEDIUM WITH HIGH LEVELS OF HIGHLY POTENTIAL EXOSOMES SECRETED BY UMBILICAL CORD BLOOD STEM CELLS AND USE THEREOF |
| CN112920996B (zh) * | 2021-04-23 | 2023-05-02 | 广州研华生物科技有限公司 | 一种外泌体分泌培养基及脐带间充质干细胞外泌体的培养分离方法 |
| CN113388575A (zh) * | 2021-06-11 | 2021-09-14 | 杭州露源生物科技有限公司 | 一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法 |
-
2022
- 2022-04-13 CN CN202210398089.6A patent/CN114703125B/zh active Active
- 2022-04-13 CN CN202310556548.3A patent/CN116515741A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114703125B (zh) | 2023-07-04 |
| CN114703125A (zh) | 2022-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3189828B1 (en) | Composition for differentiation induction of adipocyte containing stem cell-derived exosome, regeneration of adipose tissue, and skin whitening or wrinkle improvement | |
| CN104958320A (zh) | 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法 | |
| CN111484969B (zh) | 毛囊干细胞来源外泌体在促进毛囊干细胞增殖以及向毛囊细胞分化中的用途 | |
| CN109136174B (zh) | 一种延缓衰老的干细胞来源外泌体制剂 | |
| García-Contreras et al. | Differences in exosome content of human adipose tissue processed by non-enzymatic and enzymatic methods | |
| US20240150717A1 (en) | Methods and compositions for manufacturing extracellular matrix | |
| CN112795535B (zh) | 诱导间充质干细胞释放促进皮肤上皮细胞分化特定功能外泌体的组合物及其应用 | |
| KR20160108925A (ko) | 배아줄기세포에서 유래한 인공 나노베시클을 이용하여 세포 증식을 향상시키는 방법 | |
| CN114703125B (zh) | 外泌体的获得方法、制剂及其在制备抗衰老、皮肤修复制品上的应用 | |
| CN114317426A (zh) | 一种小鼠脂肪干细胞外泌体制备方法 | |
| CN113846064A (zh) | 一种fgf18基因修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN110747162B (zh) | 小分子化合物4-氨基联苯在促干细胞增殖与成软骨分化中的应用 | |
| CN115011554B (zh) | 骨髓间充质干细胞的外泌体、体外培养方法以及应用 | |
| CN115820548B (zh) | 一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用 | |
| CN110777083A (zh) | 一种从酵母细胞中提取外泌体的方法 | |
| CN104862316A (zh) | 具有显著促进牛前脂肪细胞增殖生物功能的miRNA-2400 | |
| CN114807005A (zh) | 使用动物尸体制备基质胶的方法 | |
| CN113559240A (zh) | 珍珠多肽液、分离提取工艺及其促进伤口愈合的应用 | |
| CN115232786B (zh) | 一种脂肪干细胞外泌体及其应用 | |
| CN111394301A (zh) | 白皮杉醇在增加多能干细胞分泌外泌体数量及生物活性中的应用 | |
| CN113151279B (zh) | hsa_circ_0001236及其应用 | |
| CN117586955B (zh) | 一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备与应用 | |
| CN117384833B (zh) | 一种大鼠牙槽骨组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用 | |
| CN116790493A (zh) | 一种经血源干细胞外泌体递送体系及其制备方法和应用 | |
| CN118384089A (zh) | 促进毛发生长的方法和使用的脐带间充质干细胞源外泌体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |