CN116509916B - 一种灯盏细辛活性部位脂质体，其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灯盏细辛活性部位脂质体，所述灯盏细辛活性部位按重量份计由灯盏细辛经提取转化的黄酮类化合物80‑95份、咖啡酸酯类化合物105‑120份组成，其中：黄酮类化合物中高黄芩素质量百分含量为50‑65％，咖啡酸酯类化合物中4,5‑二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为10‑20％、3,4‑二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为5‑20％，脂质体中灯盏细辛活性部位载药量为0.8‑1.2mg/ml。本发明所述活性部位脂质体具有提高缺氧耐受、降低血管阻力、抑制血小板聚集、抑制血栓形成、减少缺氧复氧引起的脂质过氧化生物活性，对全脑缺血、局部脑缺血有治疗作用，用于药品和日化用品中。

Description

一种灯盏细辛活性部位脂质体，其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及中药材脂质体制备技术领域，尤其涉及一种灯盏细辛活性部位脂质体及其制备方法和用途。
背景技术
灯盏细辛是菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz的干燥全草，初花期采收，分布于云南、四川、贵州、广西、湖南、西藏等地，其中95％产于云南省，主要分布于云南的红河、文山、楚雄、大理、玉溪等地。灯盏细辛含黄酮类、咖啡酸酯类、芳香酸类、香豆素及吡喃酮类等多种活性成分，具有清除自由基和抗氧化作用、抑制血栓形成、抑制血小板聚集、抗脑缺血再灌注等多种生理活性和功能，在临床上广泛运用于治疗心脑血管疾病、糖尿病、肾脏病变、低氧性肺动脉高压、慢性肺源性心脏病、类风湿性关节炎及肝功能损害等多种疾病。
长期以来，围绕灯盏细辛的开发应用主要物质基础/活性部位为以灯盏乙素/灯盏花素为代表的黄酮类化合物。现代药理学、药效学和药代动力学研究表明：灯盏乙素本身并无药理活性或活性很低，进入机体后需经吸收、代谢转化为灯盏乙素苷元(高黄芩素)才能发挥药效，且口服给药吸收和生物利用度低。鉴于机体对灯盏乙素代谢转化存在明显的种族、性别、年龄、给药途径差异，导致围绕灯盏乙素/灯盏花素活性部位开发上市的产品，其疗效存在明显个体差异，开发应用价值受限，不能实现最大化的开发利用。
现代植物化学、药理学研究表明：源自灯盏细辛的咖啡酸酯类化合物与灯盏乙素/灯盏花素具有相同/相似药理活性，部分化合物药理活性明显优于灯盏乙素/灯盏花素，且在灯盏细辛药材中含量远高于黄酮类部位，同样为灯盏细辛主要活性部位。随着研究的深入，发现二咖啡酸酯类化合物各同分异构体之间存在体外相互转化。现代动力学研究表明：二咖啡酸酯类化合物被机体吸收入血后，3,5-二咖啡酰基奎宁酸血药浓度快速衰竭并消失，在血浆中检测到的原型化合物主要为4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸，且3,5-二咖啡酰基奎宁酸与4,5-二咖啡酰基奎宁酸血药浓度存在明显此消彼长情况。据此证明：咖啡酸酯类化合物被机体吸收入血后存在同分异构体转化，且发挥药效的化合物为4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸，二者具有明确的开发应用优势。但由于咖啡酸酯类化合物存在口服不吸收，体内、体外存在相互转化等问题，开发应用存在成分不清、机理不明、质量不可控等技术瓶颈。
综上，灯盏细辛黄酮类和咖啡酸酯类主要活性部位均存在质量稳定可控性差、口服吸收低、体内转化和代谢过程较长、显效时间长、疗效个体差异大等问题，极大的限制了灯盏细辛的发展应用。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题和瓶颈，本发明提供了一种灯盏细辛活性部位脂质体及其制备方法；同时还提供了所述活性部位脂质体的应用和用途。
本发明提供了一种灯盏细辛活性部位脂质体，是采用下述技术方案来实现的：
首先，本发明提供一种灯盏细辛活性部位脂质体。所述灯盏细辛活性部位按重量份计由灯盏细辛经提取转化的黄酮类化合物80-95份、咖啡酸酯类化合物105-120份组成；所述黄酮类化合物为高黄芩素、灯盏乙素、灯盏甲素，咖啡酸酯类化合物为4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸、1,5-二咖啡酰基奎宁酸；所述黄酮类化合物中高黄芩素质量百分含量为50-65％，咖啡酸酯类化合物中4,5-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为10-20％、3,4-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为5-20％；所述脂质体灯盏细辛活性部位载药量为0.8-1.2mg/ml。
优选地，所述灯盏细辛活性部位按重量份计由灯盏细辛经提取转化的黄酮类化合物84-92份、咖啡酸酯类化合物108-116组成；所述黄酮类化合物为高黄芩素、灯盏乙素，咖啡酸酯类化合物为4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸；所述黄酮类化合物高黄芩素质量百分含量为55-62％，咖啡酸酯类化合物4,5-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为12-17％、3,4-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为9-18％；所述脂质体灯盏细辛活性部位载药量为0.9-1.1mg/ml。
所述灯盏细辛活性部位脂质体按照下述步骤制备：
(1)灯盏细辛提取分离：灯盏细辛干燥全草经粉碎、40-70％乙醇渗漉提取，收集渗漉液于60℃减压浓缩至25℃测定相对密度为0.92-1.10，浓缩液上大孔树脂，先用65℃热水洗脱，再用50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液于60℃减压浓缩至25℃测定相对密度为0.92-1.10，用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液及萃取后母液，备用；
(2)灯盏细辛活性部位制备：步骤(1)收集的乙酸乙酯萃取液于60℃减压浓缩至原体积的五分之一，添加等体积40-70％乙醇热回流1.5-2.0小时，减压浓缩，干燥，制得咖啡酸酯类化合物；步骤(1)收集的萃取后母液添加盐酸调pH为1-2，静置24h，沉淀用95％乙醇制成20mg/ml溶液，用20％NaOH调节pH至中性，添加质量比为浓盐酸：乙二醇：水＝1:10:10的溶液于温度90-120℃条件下反应4-6h，滤过，干燥，制得黄酮类化合物；二者按比例粉碎、混合、过100目筛，制得灯盏细辛活性部位；
(3)空白脂质体制备：以摩尔比为氢化大豆卵磷脂：胆固醇：聚乙二醇＝20-60:5-40:5为脂质，用乙醇充分溶解后加入摩尔浓度为300毫摩尔/升、pH为7.3-7.5的醋酸钙和质量浓度为20％的羟丙基-β-环糊精混合溶液组成的水合介质,于65℃下搅拌45min，依次通过400nm、200nm、100nm、50nm微孔滤膜，用1％-10％的蔗糖、pH为7.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的一种作为透析介质，于4℃透析过夜，即得；
(4)灯盏细辛活性部位脂质体制备：步骤(2)制备的灯盏细辛活性部位添加摩尔浓度为300-500毫摩尔/升、pH为6.0-7.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和质量浓度为15％-45％羟丙基-β-环糊精的混合溶液组成的增溶缓冲液，于50℃超声制备成1.6-1.9mg/ml的饱和溶液，添加步骤(3)经预热的空白脂质体配置成所需载药浓度，于60℃下保温搅拌孵育45min，于-20℃预冻12h，冷冻干燥，即得。
本发明还提供了该灯盏细辛活性部位脂质体的应用和用途，是通过以下技术方案实现的：
首先，本发明提供的灯盏细辛活性部位脂质体对全脑缺血、局部脑缺血有治疗作用，用于药品、日化用品中。
其次，本发明提供的灯盏细辛活性部位添加或不添加药品、日化用品可接受的辅料进一步制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、滴丸、口服液、注射剂、贴剂、膏霜、面膜。
与现有技术相比，本发明所述灯盏细辛活性部位脂质体具有以下有益技术效果：
(1)本发明制备的灯盏细辛活性部位脂质体，通过本发明完整技术方案，将源自灯盏细辛以灯盏乙素为主的黄酮类化合物转化为以高黄芩为主的黄酮类化合物，以3,5-二咖啡酰基奎宁酸为主的二咖啡酸酯类同分异构体转化为以4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸为主的咖啡酸酯类化合物，给药后无需再通过机体代谢转化直接发挥药效，显著缩短显效时间、规避因机体代谢不同而产生的个体差异；
(2)本发明制备的灯盏细辛活性部位脂质体，通过本发明特定技术方案将转化后的黄酮类、咖啡酸酯类特定组成物质按特定比例组合，并进一步制成特定载药量的脂质体，阻断了活性部位各化合物(尤其二咖啡酰基奎宁酸同分异构体)体外转化，实现口服稳定、高效吸收，具有成分清楚、机理明确、质量稳定可控、使用安全有效等特点；
(3)本发明制备的灯盏细辛活性部位脂质体，通过多组分(以现代药代动力学研究确认直接发挥药效的生物活性化合物高黄芩素、4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸为主)、多靶点(黄酮类、咖啡酸酯类作用靶点不同)、多机理(各化合物药理作用机理存在明显差异)协同，显著提高药理活性、缩短显效时间，对卒中(脑络瘀阻症)等急重症治疗、最大限度开发应用灯盏细辛具有极其重要意义。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来对本发明作进一步的说明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围，基于本发明所作的任何变化或替换，均属本发明保护范围。
实施例1灯盏细辛提取分离
取灯盏细辛干燥全草，粉碎过20目筛，经检测：总黄酮含量为2.2％，总咖啡酸酯含量为3.8％。
灯盏细辛干燥全草经粉碎、70％乙醇渗漉提取，收集渗漉液于60℃减压浓缩至25℃测定相对密度为1.10，浓缩液上大孔树脂，先用65℃热水洗脱，再用50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液于60℃减压浓缩至25℃测定相对密度为
1.10，用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液及萃取后母液，备用；
实施例2咖啡酸酯类化合物制备
取实施例1收集的乙酸乙酯萃取液1升，经浓缩、干燥，制得咖啡酸酯类化合物Ⅰ；
取实施例1剩余的乙酸乙酯萃取液，于60℃减压浓缩至原体积的五分之一，添加等体积40％乙醇热回流2.0小时，减压浓缩，干燥，制得咖啡酸酯类化合物Ⅱ。经检测：4,5-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为14.43％、3,4-二咖啡酰奎宁酸质量百分含量为17.53％。
实施例3黄酮类化合物制备
取实施例1收集的萃取后母液1升，经浓缩、干燥，制得黄酮类化合物Ⅰ；
实施例1剩余萃取后母液添加盐酸调节pH为1.5，静置24h，沉淀用95％乙醇制成20mg/ml溶液，用20％NaOH调节pH至中性，采用质量比为浓盐酸：乙二醇：水＝1∶10∶10的溶液于温度105℃的条件下反应5h，滤过，干燥，得黄酮类化合物Ⅱ。经检测：高黄芩素质量百分含量为59.29％。
实施例4活性部位Ⅰ制备
分别取实施例2制备的咖啡酰酯类化合物Ⅱ105g，实施例3制备的黄酮类化合物Ⅱ95g，经粉碎、混合、过100目筛，制得活性部位Ⅰ。
实施例5活性部位Ⅱ制备
分别取实施例2制备的咖啡酰酯类化合物Ⅱ107.5g，实施例3制备的黄酮类化合物Ⅱ87.5g，经粉碎、混合、过筛100目筛，制得活性部位Ⅱ。
实施例6活性部位Ⅲ制备
分别取实施例2制备的咖啡酰酯类化合物Ⅱ117g，实施例3制备的黄酮类化合物Ⅱ83g，经粉碎、混合、过100目筛，制得活性部位Ⅲ。
实施例7活性部位Ⅳ制备
分别取实施例2制备的咖啡酰酯类化合物Ⅱ139.5g，实施例3制备的黄酮类化合物Ⅱ160.5g，经粉碎、混合、过100目筛，制得活性部位Ⅳ。
实施例8空白脂质体Ⅰ制备
以摩尔比为氢化大豆卵磷脂：胆固醇：聚乙二醇＝54:35:5为脂质，用乙醇充分溶解后加入300mM pH＝7.4的醋酸钙和20％羟丙基-β-环糊精混合溶液,于65℃下搅拌45min，依次通过400nm、200nm、100nm、50nm微孔滤膜，用pH＝7.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸作为透析介质于4℃透析过夜，即得。
实施例9空白脂质体Ⅱ制备
以摩尔比为氢化大豆卵磷脂：胆固醇：聚乙二醇＝60:21:5为脂质，用乙醇充分溶解后加入300mM pH＝7.5的醋酸钙和20％羟丙基-β-环糊精混合溶液,于65℃下搅拌45min，依次通过400nm、200nm、100nm、50nm微孔滤膜，用10％蔗糖作为透析介质于4℃透析过夜，即得。
实施例10活性部位脂质体Ⅰ制备
取实施例5制备的灯盏细辛活性部位II添加400mM pH＝6.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和30％羟丙基-β-环糊精的混合溶液，于50℃超声制备成1.8mg/ml的饱和溶液，添加实施例8经预热的空白脂质体I配置成载药浓度，于60℃下保温搅拌孵育45min，于-20℃预冻12h，冷冻干燥，即得。经检测：脂质体灯盏细辛活性部位载药量为0.95mg/ml。
实施例11活性部位脂质体Ⅱ制备
取实施例6制备的灯盏细辛活性部位III添加300mM pH＝6.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和20％羟丙基-β-环糊精的混合溶液，于50℃超声制备成1.6mg/ml的饱和溶液，添加实施例9经预热的空白脂质体Ⅱ配置成载药浓度，于60℃下保温搅拌孵育45min，于-20℃预冻12h，冷冻干燥，即得。经检测：脂质体灯盏细辛活性部位载药量为0.9mg/ml。
实施例12活性部位脂质体Ⅲ制备
取实施例7制备的灯盏细辛活性部位Ⅳ添加400mM pH＝6.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和30％羟丙基-β-环糊精的混合溶液，于50℃超声制备成饱和溶液，添加实施例8经预热的空白脂质体I，于60℃下保温搅拌孵育45min，于-20℃预冻12h，冷冻干燥，即得。经检测：脂质体灯盏细辛活性部位载药量为0.76mg/ml。
实施例13颗粒剂制备
称取实施例10制备的活性部位脂质体Ⅰ50g，添加乳糖、预胶化淀粉适量，经制粒、干燥、整粒，制得颗粒剂。
实施例14片剂制备
称取实施例10制备的活性部位脂质体Ⅰ50g，添加预胶化淀粉、糊精、微晶纤维素适量，经混合、制粒、干燥、压片，制得片剂。
实施例15硬胶囊制备
称取实施例11制备的活性部位Ⅱ100g，添加乳糖、微晶纤维素、二氧化硅、硬脂酸镁适量，经混合、制粒、充填，制得硬胶囊。
实施例16冻干粉针剂制备
称取实施例11制备的活性部位Ⅱ150g，添加碳酸氢钠、氯化钠、甘露醇、注射用水，经溶解、过滤、灌封、灭菌、冻干，制得冻干粉针剂。
为了对本发明作进一步的说明，选取实施例2制备的咖啡酸酯类化合物Ⅰ、实施例2制备的咖啡酸酯类化合物Ⅱ、实施例3制备的黄酮类化合物Ⅰ、实施例3制备的黄酮类化合物Ⅱ、实施例5制备的活性部位Ⅱ、实施例7制备的活性部位Ⅳ、实施例10制备的活性部位脂质体Ⅰ、实施例12制备的活性部位脂质体Ⅲ作为试验样品，编号为①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧。开展咖啡酸酯类化合物同分异构体转化考察、黄酮类灯盏乙素转化考察、活性部位稳定性试验、活性部位脂质体稳定性试验、活性部位脂质体生物利用度试验、活性部位和脂质体对脑缺血影响试验，并对结果进行比较，具体如下：
1、咖啡酸酯类化合物同分异构体转化考察
选取①、②为试验样品，分别检测3,5-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸含量，结果见表1。
表1咖啡酸酯类化合物同分异构体转化考察结果
表1显示：与样品组①相比，经本发明特定技术方案制备的样品组②中3,5-二咖啡酰基奎宁酸与4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸含量发生了明显此消彼长变化。其中：3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量降低了41.5％，而4,5-二咖啡酰基奎宁酸含量提高了4.78倍，3,4-二咖啡酰基奎宁酸含量提高了1.19倍。
据此认定：本发明特定技术方案制备可明显促进源自灯盏细辛药材的二咖啡酸酯类化合物同分异构体间转化，将3,5-二咖啡酰基奎宁酸转化为4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸。
2、黄酮类灯盏乙素转化考察
选取样品③、④为试验样品，分别检测灯盏乙素、高黄芩素含量，结果见表2。
表2黄酮类灯盏乙素转化考察结果
表2显示：与样品组③相比，经本发明特定技术方案制备的样品组④中灯盏乙素和高黄芩素的含量发生了明显的变化。其中：灯盏乙素含量降低了90.08％，而高黄芩素含量提高了35.93倍。
据此认定：通过本发明特定技术方案制备可显著促进源自灯盏细辛药材的灯盏乙素大幅转化为高黄芩素。
3、活性部位稳定性试验
选取样品⑤、⑥为试验样品，分别称取适量置洁净密闭的透明玻璃瓶中，按原料药与制剂稳定性试验指导原则(《中国药典》2020版四部9001)，置于温度为(40±2)℃、相对湿度为(75±5)％的稳定性考察箱，于0、30、60、90天进行高黄芩素、灯盏乙素、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量检测，结果见表3。
表3活性部位稳定性考察
表3显示：在90天的稳定性考察试验中，两个样品组的各指标成分含量均有不同程度的变化。其中：样品组⑤中各化合物含量变化不明显。样品组⑥黄酮类化合物高黄芩素含量明显降低、灯盏乙素含量明显增加；咖啡酸酯类化合物3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量明显增加，而3,4-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-二咖啡酰基奎宁酸含量显著降低。
据此认定：本发明特定技术方案制备的活性部位(样品⑤)，阻断了黄酮类、咖啡酸酯类化合物之间相互转化，实现了成分清楚、质量稳定可控技术效果。而采用本发明技术方案制备的黄酮类化合物、咖啡酸酯类化合物用非本发明技术方案组合成活性部位(样品组⑥)，依然存在相互转化的可能。
4、活性部位脂质体稳定性试验
选取样品⑦、⑧为试验样品，除去游离药物后置于4℃条件下保存，分别于0、30、60、90天取样测量包封率，结果见表4。
表4活性部位脂质体稳定性(包封率)考察结果
表4显示：在90天的稳定性考察试验中，两组样品包封率均有不同程度的降低，其中：样品⑦在90天考察试验中药物仅泄漏了7.6％，而样品⑧药物泄漏了20.7％。表明本发明完整技术方案制备的灯盏细辛活性部位脂质体稳定性显著提高。
5、活性部位脂质体生物利用度试验
样品及分组：市购高黄芩素、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-二咖啡酰基奎宁酸标准物质作为参比物，另选取样品⑤、⑦作为试验样品。
动物：试验动物采用体重约3kg的健康家兔24只，随机分为2组，每组12只，并做好标记。试验前12h起及试验期间禁食，仅自由饮水。
剂量设计：
本发明活性部位脂质体口服临床推荐剂量为120mg(以活性部位计)，其中：含高黄芩素40mg、3,4-二咖啡酰基奎宁酸12mg、4,5-二咖啡酰基奎宁酸11.6mg。按60kg成人体重计算，用量为2mg/(kg·d)，折算家兔给药剂量为2.8mg/(kg·d)，即家兔高黄芩素给药剂量为0.93mg/(kg·d)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸给药剂量为0.28mg/(kg·d)、4,5-二咖啡酰基奎宁酸给药剂量为0.27mg/(kg·d)。
根据等剂量可比原则，样品组⑤给药剂量为2.8mg/(kg·d)，样品组⑦给药剂量为0.74g/(kg·d)。
试验方案设计：
家兔试验前预先禁食12h，仅自由饮水，随后溶解上述样品分别进行灌胃给样，给予样品后密集测定血浆中高黄芩素、3,4-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-二咖啡酰基奎宁酸含量，至达血药峰浓度时间后半小时，检测最大血药浓度(Cmax)。
试验样品灌胃结束后，停药一周，至动物体内样品完全代谢。然后静脉注射给予等剂量的高黄芩素、3,4-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-二咖啡酰基奎宁酸标准物质溶液，并测定血浆中各标准物质含量(ng/mL)，以此作为参比数据计算生物利用度，结果详见表5。
表5生物利用度测试结果(均值)
表5显示：样品⑦高黄芩素、3,4-二咖啡酰基奎宁酸和4,5-二咖啡酰基奎宁酸在家兔血浆中的血药浓度明显高于样品组⑤，且与样品组⑤相比，样品组⑦高黄芩素生物利用度提高了2.06倍、3,4-二咖啡酰基奎宁酸生物利用度提高了2.56倍、4,5-二咖啡酰基奎宁酸生物利用度提高了2.70倍。
据此认定：按本发明完整技术方案制备的活性部位脂质体(样品⑦)，显著提高了活性部位口服吸收生物利用度。
6、活性部位和脂质体对脑缺血影响试验
试验动物：中科院上海药物研究所实验动物室提供的雄性沙土鼠，体重为79±10g，总数为50只。
分组：本试验共设5个组，每组10只动物。其中：一组灌胃给予生理盐水作为空白对照组，另选取样品⑤、⑥、⑦、⑧作为试验组。
剂量设置：本发明活性部位脂质体拟推荐临床剂量为120mg(以活性部位计)，按成人60kg体重计算，用量为2mg/(kg·d)；按沙土鼠体表面积折算相应的剂量为8.64mg/(kg·d)。根据等剂量可比原则，样品组⑤给药剂量为8.64mg/(kg·d)、样品组⑥给药剂量为8.64mg/(kg·d)、样品组⑦给药剂量为2.27g/(kg·d)、样品组⑧给药剂量为2.84g/(kg·d)。
样品液配制：分别取各组样品用0.1％的碳酸钠溶液溶解，配制成受试液，待用。
实验方法：将沙土鼠置于加热板上保持体温在37℃，用***麻醉，切开颈中线皮肤，分离两侧颈总动脉，结扎两侧颈总动脉30min后，进行再灌注。造模成功后按各组样品剂量及时灌胃给药受试液，给药次数为单次给药。沙土鼠缺血再灌注行为学评分标准如下：
数据及统计：给药后分别观察各组动物行为学评分及累积死亡数，观察时间分别为缺血再灌注后2，4，6，24小时。行为学评分数据用x±SD表示，累积死亡率用％表示。结果见表6、7。
表6对沙土鼠缺血再灌注后行为学评分的影响(x±SD)
表6显示：给药后，随着时间不断延长，各组受试动物行为学评分均有不同程度的上升。样品组⑤、⑥、⑦、⑧受试动物缺血再灌注后行为学评分在2h、4h、6h和24h均明显低于空白对照组(P<0.05)；样品组⑦受试动物缺血再灌注后行为学评分在2h、4h、6h和24h均明显低于样品组⑤、⑥、⑧(P<0.05)。
表7对沙土鼠缺血再灌注后的累积死亡率的影响
表7显示：给药后随着时间的不断增加，各组受试动物累积死亡率均有不同程度的增加。其中：空白对照组给药24h后受试动物累计死亡率明显高于其余各组；样品组⑦给药24h后受试动物累计死亡率明显低于样品组⑤、⑥、⑧。
试验结论：按本发明完整技术方案制备的灯盏细辛活性部位脂质体(样品⑦)对沙土鼠脑缺血再灌注造成全脑缺血损伤有保护作用，可明显降低其脑缺血在灌注后行为学评分和死亡率。
综上，本发明完整技术方案制备的灯盏细辛活性部位脂质体，实现了源自灯盏细辛药材的灯盏乙素转化为高黄芩素、3,5-二咖啡酰基奎宁酸转化为4,5-二咖啡酰基奎宁酸和3,4-二咖啡酰基奎宁酸并阻断了各化合物之间进一步转化，具有成分清楚、机理明确、质量稳定可控、口服吸收和生物利用度显著提高、显著降低脑缺血再灌注后行为学评分和死亡率等特点。

Claims (3)

1.一种灯盏细辛活性部位脂质体，其特征在于：所述灯盏细辛活性部位按重量份计由灯盏细辛经提取转化的黄酮类化合物80-95份、咖啡酸酯类化合物105-120份组成；所述黄酮类化合物含高黄芩素、灯盏乙素、灯盏甲素，咖啡酸酯类化合物含4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸、1,5-二咖啡酰基奎宁酸；所述黄酮类化合物中高黄芩素质量百分含量为50-65％，咖啡酸酯类化合物中4,5-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为10-20％、3,4-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为5-20％；所述脂质体灯盏细辛活性部位载药量为0.8-1.2mg/ml；所述灯盏细辛活性部位脂质体对全脑缺血、局部脑缺血具有治疗作用；所述活性部位脂质体按以下步骤制备：
(1)灯盏细辛提取分离：灯盏细辛干燥全草经粉碎、40-70％乙醇渗漉提取，收集渗漉液于60℃减压浓缩至25℃测定相对密度为0.92-1.10，浓缩液上大孔树脂，先用65℃热水洗脱，再用50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液于60℃减压浓缩至25℃测定相对密度为0.92-1.10，用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液及萃取后母液，备用；
(2)灯盏细辛活性部位制备：步骤(1)收集的乙酸乙酯萃取液于60℃减压浓缩至原体积的五分之一，添加等体积40-70％乙醇热回流1.5-2.0小时，减压浓缩，干燥，制得咖啡酸酯类化合物；步骤(1)收集的萃取后母液添加盐酸调pH为1-2，静置24h，沉淀用95％乙醇制成20mg/ml溶液，用20％NaOH调节pH至中性，添加质量比为浓盐酸：乙二醇：水＝1:10:10的溶液于温度90-120℃条件下反应4-6h，滤过，干燥，制得黄酮类化合物；二者按比例粉碎、混合、过100目筛，制得灯盏细辛活性部位；
(3)空白脂质体制备：以摩尔比为氢化大豆卵磷脂：胆固醇：聚乙二醇＝20-60:5-40:5为脂质，用乙醇充分溶解后加入摩尔浓度为300毫摩尔/升、pH为7.3-7.5的醋酸钙和质量浓度为20％的羟丙基-β-环糊精混合溶液组成的水合介质,于65℃下搅拌45min，依次通过400nm、200nm、100nm、50nm微孔滤膜，用1％-10％的蔗糖、pH为7.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的一种作为透析介质，于4℃透析过夜，即得；
(4)灯盏细辛活性部位脂质体制备：步骤(2)制备的灯盏细辛活性部位添加摩尔浓度为300-500毫摩尔/升、pH为6.0-7.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和质量浓度为15％-45％羟丙基-β-环糊精的混合溶液组成的增溶缓冲液，于50℃超声制备成1.6-1.9mg/ml的饱和溶液，添加步骤(3)经预热的空白脂质体配置成所需载药浓度，于60℃下保温搅拌孵育45min，于-20℃预冻12h，冷冻干燥，即得。
2.一种如权利要求1所述灯盏细辛活性部位脂质体，其特征在于：所述灯盏细辛活性部位按重量份计由灯盏细辛经提取转化的黄酮类化合物84-92份、咖啡酸酯类化合物108-116份组成；所述黄酮类化合物含高黄芩素、灯盏乙素，咖啡酸酯类化合物含4,5-二咖啡酰基奎宁酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸；所述黄酮类化合物高黄芩素质量百分含量为55-62％，咖啡酸酯类化合物4,5-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为12-17％、3,4-二咖啡酰基奎宁酸质量百分含量为9-18％；所述脂质体灯盏细辛活性部位载药量为0.9-1.1mg/ml。
3.一种如权利要求2所述的灯盏细辛活性部位脂质体，其特征在于：所述活性部位脂质体用于药品、日化用品中，添加或不添加药品、日化用品可接受的辅料进一步制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、滴丸、口服液、注射液、冻干粉针、贴剂、膏霜、面膜。
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