CN116509816A - 一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116509816A
CN116509816A CN202310283120.6A CN202310283120A CN116509816A CN 116509816 A CN116509816 A CN 116509816A CN 202310283120 A CN202310283120 A CN 202310283120A CN 116509816 A CN116509816 A CN 116509816A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chloride
dimethylamino
carbamate
ethyl
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310283120.6A
Other languages
English (en)
Inventor
杨雅童
智英
赵坤
王丽颖
王昕�
刘璐
董心萌
雷思齐
孙潇宇
董梦旋
解一品
于文博
龙保邦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Original Assignee
Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences filed Critical Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority to CN202310283120.6A priority Critical patent/CN116509816A/zh
Publication of CN116509816A publication Critical patent/CN116509816A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C201/00—Preparation of esters of nitric or nitrous acid or of compounds containing nitro or nitroso groups bound to a carbon skeleton
    • C07C201/06—Preparation of nitro compounds
    • C07C201/12—Preparation of nitro compounds by reactions not involving the formation of nitro groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/02—Preparation of carboxylic acid amides from carboxylic acids or from esters, anhydrides, or halides thereof by reaction with ammonia or amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C231/00—Preparation of carboxylic acid amides
    • C07C231/12—Preparation of carboxylic acid amides by reactions not involving the formation of carboxamide groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C269/00—Preparation of derivatives of carbamic acid, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C269/04—Preparation of derivatives of carbamic acid, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups from amines with formation of carbamate groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/20—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。其包括可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG脂质。本发明通过对可电离脂质分子的结构进行调整，并对LNP各组分的比例进行优化筛选。以实现LNP组分方案能够充分发挥mRNA‑LNP制剂的效力并且也较好的实现靶向递送的目的，通过对本发明的可电离脂质纳米颗粒进行检测，发现粒径大多集中于80‑100nm，符合纳米药物尺度，说明所制备的LNP可顺利穿过细胞间隙，具有优异的核酸药物递送性能，包封率在60％‑95％之间，此外转染率在10％到90％之间，有良好的转染性能。

Description

一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
核酸药物因兼具基因修饰和传统药物的双重特点，已逐渐成为精准生物医学和疾病治疗的热点。近年来，随着对疾病基因相关机制的不断深入研究，包括siRNA、mRNA、质粒DNA及其他基因疗法在内的核酸类药物，成为当前新药开发的热门领域，其中一些核酸类药物以获得批准上市，用于临床治疗。核酸药物针对基因转录后水平治疗，候选靶点丰富，尤其一些蛋白靶点难以成药的基因，开发和应用潜力巨大。
然而，核酸类药物需要进入细胞内部才能较好地发挥其调节基因表达的作用，为实现这一目的，现有技术使用脂质纳米颗粒(LNP)来封装和递送RNA到机体特定部位。LNP主要有以下四种成分组成：1)“可离子化(或阳离子)的脂质分子”是LNP技术的关键，它的极性随着pH值的变化会发生改变，在低pH值的环境中携带正电荷，通过静电作用与电负性的核酸结合形成纳米粒，可保护核酸药物免遭核酸酶的降解，实现核酸药物在体内的稳定递送。在生理pH值时是电中性分子，减少了毒副作用。2)聚乙二醇修饰的脂质分子，聚乙二醇(PEG)的修饰具有多种功能，能够防止LNP的聚集，使LNP粒度均匀，并可降低网状内皮***的清除作用。3)胆固醇，增加LNP稳定性，促进膜融合；4)磷脂分子，为LNP双分子层提供结构，协助构成LNP的完整结构。
在体内，LNP的成分和比例发生变化会对运载效果以及mRNA在体内的生物活性产生深远影响，此外有些mRNA需要靶向递送到特定的组织才能有效发挥其作用。而现有的LNP组分方案无法充分发挥mRNA-LNP制剂的效力并且也较难实现靶向递送的目的，因此需要持续对可电离脂质分子的结构进行调整，并对LNP各组分的比例进行优化筛选。
因此，针对上述缺陷，本发明提出一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用，解决现有的LNP组分方案无法充分发挥mRNA-LNP制剂的效力并且也较难实现靶向递送的难题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种可电离脂质纳米颗粒，包括下式(I)的化合物：
或其同分异构体；
其中所述R为-(CH2)nCH3。
作为本发明的一种优选技术方案，还包括辅助脂质、胆固醇、PEG脂质，其中所述辅助脂质包括DMG-PEG。
作为本发明的一种优选技术方案，所述结构(I)的化合物为：
2,3-二壬酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
2,3-二癸酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
2,3-二十一碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
2,3-二十二碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
2,3-二十三碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
2,3-二十四碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
2,3-二十五碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
2,3-二十六碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
中任一种或任一种的同分异构体。
本发明的第二个方面，提供一种上述可电离脂质纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
向烧瓶中加入2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐以及N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后加入三乙胺，冰浴条件下滴加引发剂，于室温下反应2小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应；向反应体系中加入水，随后以二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品，所得粗产品通过柱层析法进行纯化分离，得到产物A；
向反应瓶中加入产物A以及四氢呋喃，于-40℃冷却10分钟后，滴加硼氢化锂溶液，反应2小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应；向反应体系中加入水，随后以二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品。所得粗产品通过柱层析法进行纯化分离，得到产物B；
向反应瓶中加入产物B、吡啶以及四氢呋喃，在冰浴中冷却10分钟后，加入4-硝基苯基羰基氯，反应2小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应；向反应体系中加入水，随后以二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得产物C；
于反应管中加入产物C、N，N-二甲基乙-1,2-二胺、三乙胺以及二氯甲烷，室温下搅拌4小时，TLC检测原料反应完全，停止反应，向反应体系中加入水，随后以二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品，所得粗产品通过柱层析法进行纯化分离，得到最终产物。
作为本发明的一种优选技术方案，所述引发剂为壬酰氯、癸酰氯、十一碳酰氯、十二碳酰氯、十二碳酰氯、十三碳酰氯、十四碳酰氯、十五碳酰氯、十六碳酰氯中的任一种。
本发明的第三个方面，提供了一种可电离脂质纳米颗粒在肿瘤诊断和治疗中的应用
本发明的有益效果：
本发明通过对可电离脂质分子的结构进行调整，并对LNP各组分的比例进行优化筛选。以实现LNP组分方案能够充分发挥mRNA-LNP制剂的效力并且也较好的实现靶向递送的目的，通过对本发明的可电离脂质纳米颗粒进行检测，发现粒径大多集中于80-100nm，符合纳米药物尺度，说明所制备的LNP可顺利穿过细胞间隙，具有优异的核酸药物递送性能，包封率在60％-95％之间，此外转染率在10％到90％之间，有良好的转染性能。
附图说明
图1为本发明实施例9中动态光散射检测LNP的粒径图；
图2为本发明实施例9中动态光散射检测LNP的电位图；
图3为本发明实施例9中LNP包封率的测定结果图；
图4为实施例9中LNP转染率的测定结果图。
下面通过具体实施方式和实施例，对本发明的技术方案作进一步的详细描述。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)合成2,3-二壬酰胺丙酸甲酯
向250毫升的圆底烧瓶中加入2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐(3.56mmol，0.68g)以及50毫升N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后加入三乙胺(35.56mmol，5mL)。在冰浴中向反应液滴加壬酰氯(14.22mmol，3.28mL)，于室温下反应2小时后，薄层色谱法(TLC)检测原料反应完全，停止反应。向反应体系中加入水100mL，随后以二氯甲烷萃取(50mL*3)，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品。所得粗产品通过柱层析法(DCM/MeOH＝30/1到10/1)进行纯化分离，得到2,3-二壬酰胺丙酸甲酯为白色固体(1.15g，81％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ6.89(d,J＝12Hz,1H),6.25(t,J＝11.2Hz,1H),4.57(m,1H),3.72(s,3H),3.60(t,J＝9.0Hz,2H),2.11-2.21(m,4H),1.58(m,4H),1.21(b,20H),0.82-0.85(t,J＝11.2Hz,6H)ppm；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ177.1,145.0,143.6,143.5 141.5,140.9,136.4,132.1,130.2(2C),128.5,127.7(2C),125.9,123.6,116.8,112.4,111.8,71.7,41.8,21.4ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C22H43N2O4 399.5960；found399.5962。
(2)合成N，N'-(3-羟基丙烷-1,2-二酰基)二壬酰胺
向25毫升反应瓶中加入2,3-二壬酰胺丙酸甲酯1-1(0.73mmol，0.35g)以及10毫升四氢呋喃，于-40℃冷却10分钟后，滴加硼氢化锂溶液(4N in THF，0.22mmol，0.055mL)。反应2小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应。向反应体系中加入水15mL，随后以二氯甲烷萃取(20mL*3)，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品。所得粗产品通过柱层析法(DCM/MeOH＝30/1到10/1)进行纯化分离，得到N，N'-(3-羟基丙烷-1,2-二酰基)二壬酰胺为白色固体(0.21g，76％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.01(s,1H),5.52(s,1H),4.49(s,1H),3.50–3.33(m,5H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),2.52(s,2H),2.23–2.17(m,2H),1.62–1.57(m,2H),1.39(m,2H),1.31–1.24(m,26H),0.89(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ172.6,63.7,62.7,47.4,41.3,36.5,31.9(2C),30.8,29.6,29.3(3C),28.9,28.6,27.0,25.6,22.7(2C),14.1(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd forC21H43N2O3 371.5860；found371.5861。
(3)合成2,3-二壬酰胺丙基(4-硝基苯基)碳酸酯
向15毫升反应瓶中加入N，N'-(3-羟基丙烷-1,2-二酰基)二壬酰胺1-2(0.57mmol，0.21g)、吡啶(0.74mmol，60μL)以及5毫升四氢呋喃，在冰浴中冷却10分钟后，加入4-硝基苯基羰基氯(0.74mmol，0.15g)。反应2小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应。向反应体系中加入水10mL，随后以二氯甲烷萃取(15mL*3)，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品2,3-二壬酰胺丙基(4-硝基苯基)碳酸酯为浅黄色固体，该粗品直接用于下一步反应中。HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C21H43N2O3536.3336；found536.3337。
(4)合成2,3-二壬酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
于10毫升的反应管中加入2,3-二壬酰胺丙基(4-硝基苯基)碳酸酯1-3(0.08mmol，42.8mg)、N，N-二甲基乙-1,2-二胺(0.12mmol，10.5mg)、三乙胺(0.24mmol，10μL)以及1毫升二氯甲烷。将反应混合液在室温下搅拌4小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应。向反应体系中加入水10mL，随后以二氯甲烷萃取(15ml*3)，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品。所得粗产品通过柱层析法(DCM/MeOH＝30/1到10/1)进行纯化分离，得到产物2,3-二壬酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯为白色固体(25mg，65％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.17(d,J＝7.8Hz,1H),6.89(t,J＝6.6Hz,1H),6.03(t,J＝6.6Hz,1H),4.21–4.11(m,3H),3.50–3.33(m,4H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),2.52(s,6H),2.23–2.17(m,4H),1.62–1.57(m,4H),1.31–1.24(m,20H),0.89(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.7,172.6,157.6,62.3,60.3,50.7,46.7(2C),41.7,38.2,36.8,36.5,31.9(2C),29.3(2C),28.9(2C),28.6(2C),25.6(2C),22.7(2C),14.1(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C28H46N3O7 536.6900；found 536.6904。
实施例2
合成2,3-二癸酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
以2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐和癸酰氯为原料，用类似于实施例1的方法可制备得到2,3-二癸酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯为白色固体(51％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.15(d,J＝7.8Hz,1H),6.90(t,J＝6.6Hz,1H),6.03(t,J＝6.6Hz,1H),4.21–4.11(m,3H),3.61–3.29(m,4H),2.83(t,J＝6.6Hz,2H),2.48(s,6H),2.21–2.15(m,4H),1.68–1.43(m,4H),1.28–1.18(m,24H),0.81(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.8,172.5,157.8,62.4,60.1,50.9,46.5(2C),41.5,38.2,36.8,36.5,31.8(2C),29.1(2C),28.5(2C),28.3(2C),25.5(2C),22.8(2C),14.2(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C28H57N4O4 513.7880；found 513.7881。
实施例3
合成2,3-二十一碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
以2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐和十一碳酰氯为原料，用类似于实施例1的方法可制备得到2,3-二十一碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯为浅黄色固体(64％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.23(d,J＝7.8Hz,1H),6.79(t,J＝6.6Hz,1H),6.10(t,J＝6.6Hz,1H),4.31–4.14(m,3H),3.42–3.31(m,4H),2.61(t,J＝6.6Hz,2H),2.47(s,6H),2.27–2.12(m,4H),1.64–1.52(m,4H),1.31–1.24(m,28H),0.89(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.2,172.6,157.3,62.3,60.5,50.7,46.9(2C),41.7,38.3,36.7,36.5,31.9(2C),29.6(4C),29.3(2C),28.9(2C),28.6(2C),25.6(2C),22.7(2C),14.3(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C30H61N4O4 541.4963；found 541.4964。
实施例4
合成2,3-二十二碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
以2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐和十二碳酰氯为原料，用类似于实施例1的方法可制备得到2,3-二十二碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯为浅黄色固体(57％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.16(d,J＝7.8Hz,1H),6.84(t,J＝6.6Hz,1H),6.08(t,J＝6.6Hz,1H),4.35–4.09(m,3H),3.57–3.32(m,4H),2.74(t,J＝6.6Hz,2H),2.57(s,6H),2.33–2.20(m,4H),1.67–1.56(m,4H),1.29–1.23(m,32H),0.88(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.7,172.2,157.4,62.3,60.0,50.5,46.7(2C),41.7,38.3,36.8,36.5,31.9(2C),29.4(6C),29.3(2C),28.9(2C),28.6(2C),25.6(2C),22.7(2C),14.1(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C32H65N4O4 569.5006；found 569.5007。
实施例5
合成2,3-二十三碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
以2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐和十三碳酰氯为原料，用类似于实施例1的方法可制备得到2,3-二十三碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯为白色固体(65％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.17(d,J＝7.8Hz,1H),6.89(t,J＝6.6Hz,1H),6.03(t,J＝6.6Hz,1H),4.21–4.11(m,3H),3.50–3.33(m,4H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),2.52(s,6H),2.23–2.17(m,4H),1.62–1.57(m,4H),1.31–1.24(m,36H),0.89(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ173.8,172.6,157.8,62.3,60.3,50.7,46.7(2C),41.7,38.3,36.8,36.5,31.9(2C),29.6(8C),29.3(2C),28.9(2C),28.6(2C),25.6(2C),22.7(2C),14.1(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C34H69N4O4 597.5319；found 597.5319。
实施例6
2,3-二十四碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
以2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐和十四碳酰氯为原料，用类似于实施例1的方法可制备得到2,3-二十四碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯为浅黄色固体(61％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.17(d,J＝7.8Hz,1H),6.89(t,J＝6.6Hz,1H),6.03(t,J＝6.6Hz,1H),4.21–4.11(m,3H),3.50–3.33(m,4H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),2.52(s,6H),2.23–2.17(m,4H),1.62–1.57(m,4H),1.31–1.24(m,40H),0.89(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ175.1,174.4,156.7,63.6,57.9,49.3,44.5(2C),41.0,37.5,36.7(2C),31.9(2C),29.8(4C),29.7(4C),29.6(2C),29.5(2C),29.4(2C),29.3(2C),25.8,25.7,22.7(2C),14.1(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C36H73N4O4 625.5632；found 625.5635。
实施例7
2,3-二十五碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
以2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐和十五碳酰氯为原料，用类似于实施例1的方法可制备得到2,3-二十五碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯为白色固体(53％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.14(d,J＝7.8Hz,1H),6.79(t,J＝6.6Hz,1H),6.10(t,J＝6.6Hz,1H),4.27–4.10(m,3H),3.52–3.31(m,4H),2.79(t,J＝6.6Hz,2H),2.54(s,6H),2.25–2.15(m,4H),1.68–1.58(m,4H),1.31–1.25(m,44H),0.84(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ175.5,174.4,156.7,63.6,57.9,49.3,44.5(2C),41.0,37.5,36.7(2C),31.9(2C),29.8(4C),29.7(4C),29.6(4C),29.5(2C),29.4(2C),29.3(2C),25.8,25.7,22.7(2C),14.1(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C38H77N4O4 653.5945；found 653.5947。
实施例8
2,3-二十六酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯
以2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐和十六碳酰氯为原料，用类似于实施例1的方法可制备得到2,3-二十六酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯为白色固体(64％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.17(d,J＝7.8Hz,1H),6.89(t,J＝6.6Hz,1H),6.03(t,J＝6.6Hz,1H),4.21–4.11(m,3H),3.50–3.33(m,4H),2.77(t,J＝6.6Hz,2H),2.52(s,6H),2.23–2.17(m,4H),1.62–1.57(m,4H),1.31–1.24(m,48H),0.89(t,J＝7.8Hz,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ175.0,174.3,156.8,63.5,58.0,50.1,44.9(2C),41.1,38.1,36.8,36.7(4C),31.9(4C),29.7(4C),29.7(2C),29.6(2C),29.4(2C),29.4,29.3(2C),29.3,25.8,25.7,22.7(2C),14.1(2C)ppm；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+calcd for C40H81N4O4 681.6258；found681.6259。
实施例9
以上所述的本发明实施例设计合成的可电离脂质分子主要用于制备LNP，具体操作如下：
将可电离脂质、胆固醇、PEG、辅助脂质溶于乙醇中，将编码表达EGFP的mRNA溶于pH＝4.0的柠檬酸盐缓冲液中。将混合脂质溶液和mRNA溶液按照表1中的处方用微流控法混合得到mRNA-LNP。
通过微流控法合成LNP
借助微流控合成仪(NanoAssemblr)及随厂的微流控芯片。预处理微流控芯片通道后，一侧的注射器吸入900μL的mRNA缓冲液，另外一侧的注射器吸入450μL的含有各组分的乙醇溶液。具体参数如下：总流速为12ml/min，水相/有机相为2:1，收集所有的产物LNP溶液，随后加入1×PBS缓冲液稀释至溶液中乙醇比例小于0.5％。
表1中，mRNA浓度为1mg/mL，体积为40μL且水相总体积为900μL，可电离脂质浓度为10mg/mL，体积为40μL且有机相总体积为450μL，胆固醇浓度为5mg/mL，PEG浓度为5mg/mL，辅助脂质浓度为5mg/mL，可电离脂质与mRNA的重量比约为10：1，混合方法为微流控法。通过形成的8组样品，进行以下的测试。
样品 可电离脂质 胆固醇 PEG 辅助脂质 固醇(μL) PEG(μL) DOPE(μL) 乙醇(μL)
1 1 胆固醇 C14-PEG2K DOPE 50.5 8.2 48.5 152.8
2 2 胆固醇 C14-PEG2K DOPE 50.5 8.2 48.5 152.8
3 3 胆固醇 C14-PEG2K DOPE 50.5 8.2 48.5 152.8
4 4 胆固醇 C14-PEG2K DOPE 50.5 8.2 48.5 152.8
5 5 胆固醇 C14-PEG2K DOPE 50.5 8.2 48.5 152.8
6 6 胆固醇 C14-PEG2K DOPE 50.5 8.2 48.5 152.8
7 7 胆固醇 C14-PEG2K DOPE 50.5 8.2 48.5 152.8
8 8 胆固醇 C14-PEG2K DOPE 50.5 8.2 48.5 152.8
表1
为了测量LNP的尺度，进行了mRNA-LNP的粒径与电位表征：
使用Malvern Zetasizer Nano ZS，以90°反向散射检测模式，利用动态光散射检测LNP的粒径和电位。结果如图1、图2所示。图1所示LNP粒径范围在70-110nm，大多集中于80-100nm，符合纳米药物尺度，说明所制备的LNP可顺利穿过细胞间隙，具有优异的核酸药物递送性能。图2所示ζ电位在-6～6mV之间，证明LNP制剂体系稳定，不易聚集或沉降。
为了测量LNP的包封率，进行mRNA-LNP的包封率表征：
使用Quant-iTTM RNA试剂及多模式微孔板检测***Mutimode PlateReader(EnSight)，测定LNP包封率。Quant-iTTM/>RNA试剂是无法透过LNP，因此只有游离的未被LNP包载的核酸可以被结合。Triton-100作为一种表面活性剂常被用做破乳剂，使用2％的Triton-100处理获得的LNP可以使包载的核酸释放，得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量，再除以总核酸量即可得到包封率。测得本系列产品包封率在60％-95％之间，结果如附图3所示。
为了测量LNP的转染率，进行mRNA-LNP的转染效率表征：
取对数生长期的Hep3B细胞接种到6孔细胞板(20万细胞/孔)培养过夜，待细胞密度达到80％以上，弃掉培养基并使用1X PBS洗涤3次，取1mL无血清DMEM培养基配制的EGFPmRNA-LNP(1μg/mL)溶液，加入到细胞孔中并设置3个复孔。6小时后弃掉培养基，更换为有血清的正常DMEM培养基继续培养24小时，使用流式细胞仪检测细胞的荧光比例。结果如附图4所示，转染率在10％到90％之间，有良好的转染性能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种可电离脂质纳米颗粒，其特征在于，包括下式(I)的化合物：
或其同分异构体；
其中所述R为-(CH2)nCH3。
2.根据权利要求1所述的可电离脂质纳米颗粒，其特征在于，还包括辅助脂质、胆固醇、PEG脂质，其中所述辅助脂质包括DMG-PEG。
3.根据权利要求1所述的可电离脂质纳米颗粒，其特征在于，所述结构(I)的化合物为：
2,3-二壬酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯、
2,3-二癸酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯、
2,3-二十一碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯、
2,3-二十二碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯、
2,3-二十三碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯、
2,3-二十四碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯、
2,3-二十五碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯、
2,3-二十六碳酰胺丙基(2-(二甲氨基)乙基)氨基甲酸酯的任一种或任一种的同分异构体。
4.一种制备权利要求1～3任一项所述的可电离脂质纳米颗粒的方法，其特征在于，具体的制备步骤包括：
向烧瓶中加入2,3-二氨基丙酸甲酯二盐酸盐以及N,N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀后加入三乙胺，冰浴条件下滴加引发剂，于室温下反应2小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应；向反应体系中加入水，随后以二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品，所得粗产品通过柱层析法进行纯化分离，得到产物A；
向反应瓶中加入产物A以及四氢呋喃，于-40℃冷却10分钟后，滴加硼氢化锂溶液，反应2小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应；向反应体系中加入水，随后以二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品。所得粗产品通过柱层析法进行纯化分离，得到产物B；
向反应瓶中加入产物B、吡啶以及四氢呋喃，在冰浴中冷却10分钟后，加入4-硝基苯基羰基氯，反应2小时后，TLC检测原料反应完全，停止反应；向反应体系中加入水，随后以二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得产物C；
于反应管中加入产物C、N，N-二甲基乙-1,2-二胺、三乙胺以及二氯甲烷，室温下搅拌4小时，TLC检测原料反应完全，停止反应，向反应体系中加入水，随后以二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗、无水硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩得粗产品，所得粗产品通过柱层析法进行纯化分离，得到最终产物。
5.根据权利要求4所述的可电离脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述引发剂为壬酰氯、癸酰氯、十一碳酰氯、十二碳酰氯、十二碳酰氯、十三碳酰氯、十四碳酰氯、十五碳酰氯、十六碳酰氯中的任一种。
6.一种如权利要求1～3任一项所述的可电离脂质纳米颗粒在肿瘤诊断和治疗中的应用。
CN202310283120.6A 2023-03-22 2023-03-22 一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用 Pending CN116509816A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310283120.6A CN116509816A (zh) 2023-03-22 2023-03-22 一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310283120.6A CN116509816A (zh) 2023-03-22 2023-03-22 一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116509816A true CN116509816A (zh) 2023-08-01

Family

ID=87392947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310283120.6A Pending CN116509816A (zh) 2023-03-22 2023-03-22 一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116509816A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111902397B (zh) 改进了细胞内动力学的阳离子脂质
EP4282855A1 (en) Ionizable lipid molecule, preparation method therefor, and application thereof in preparation of lipid nanoparticle
WO2022166213A1 (zh) 一种可离子化脂质分子、其制备方法及其在制备脂质纳米颗粒中的应用
EP3640237B1 (en) Lipid membrane structure for delivery into sirna cell
EP3842412B1 (en) Biodegradable lipids for delivery of active compounds into tumor cells comprising two or more tertiary amino groups
CA3215389C (en) Ionizable lipids and compositions for nucleic acid delivery
EP2319519B1 (en) Composition for inhibiting expression of target gene
CN104352440A (zh) 一种阳离子脂质体核酸类药物制剂及其制备方法和应用
CN113372226B (zh) 一种脂质分子、脂质纳米粒及其制备方法和应用
CN113121381B (zh) 一种神经酰胺类化合物及其阳离子脂质体、制备方法和应用
CN116199646B (zh) 一种基于Tris的可电离脂质及其制备方法与应用
CN117623978A (zh) 可生物降解的氨基酸衍生可电离脂质及其制备方法与应用
CN116509816A (zh) 一种可电离脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
CN116082275A (zh) 一种脾脏中高表达的阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途
CN116143707B (zh) 一种碱基可电离脂质及其制备方法与应用
CN106188230A (zh) 一种阳离子脂质类化合物及其制备方法与应用
CN116535381B (zh) 具有五元环缩醛结构的阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途
RU2747559C1 (ru) Незаряженный липид, композиция на его основе с поликатионным амфифилом и нейтральным фосфолипидом и способ ее получения для доставки нуклеиновых кислот in vitro
CN117257965B (zh) 一种核酸递送载体组合物及其应用
CN114436994B (zh) 金刚烷尾链脂质及其在细胞转染中的应用
CN114315606B (zh) 一种脂样分子及其应用
CN117229160B (zh) 三酯类阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途
TW201815736A (zh) 作為陽離子性脂質之化合物
CN118497281A (zh) 一种高效低毒细胞转染试剂及其应用
CN117843603A (zh) 一种可电离脂质材料及其在制备核酸递送载体中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination