CN116497062B - 一种d-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***及其构建方法和应用 - Google Patents
一种d-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种D‑2‑羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，涉及合成生物学，基因治疗和细胞免疫技术领域，所述控制***的感应对象为D‑2‑羟基戊二酸，分为高浓度D‑2‑羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind‑H和低浓度D‑2‑羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind‑L；所述控制***包括重组转录抑制子、D‑2‑羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列；本发明利用该***控制响应肿瘤代谢物D‑2‑HG的诊断基因路线、***基因路线和免疫细胞治疗性基因路线，从而开发出以D‑2‑HG为关键信息的活细胞传感器、***基因治疗产品和细胞治疗产品。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学，基因治疗和细胞免疫技术领域，具体说是一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***及其构建方法和应用。
背景技术
近年来发现D-2-羟基戊二酸(D-2-HG)是一种肿瘤代谢物，异柠檬酸脱氢酶IDH突变存在于多种肿瘤细胞中，是三羧酸循环关键酶，原功能为将异柠檬酸转变为2-酮基戊二酸(2-KG)，但突变可导致该酶产生强烈的催化2-KG还原生成D-2-HG的活力，造成胞内和肿瘤微环境D-2-HG的积累，因此D-2-HG这种代谢物是未来开发***策略和药物的重要切入点。例如，可以工程化改造T细胞，使其感应D-2-羟基戊二酸浓度从而发挥抗肿瘤功能；可以探索感应D-2-羟基戊二酸的***基因线路，使肿瘤细胞特异性***。
D-2-HG作为IDH替代标志物，在区分胶质瘤、急性髓性白血病等肿瘤IDH突变中展现出较大应用价值，早期诊断及灵敏监测复发/转移是有效***的关键。但是目前IDH检测方法面临着以下问题：早期瘤体产生标志物较少；标志物从微环境进入循环***的转运限制、巨量稀释及快速排出等。体内应用的化学分子探针依靠被动扩散作用较难精准地到达肿瘤部位。基于工程化细胞的“活”的传感器，不仅能在体外检测D-2-HG的浓度，还能够在体内主动迁移到肿瘤、感应肿瘤信息并放大信号，代表了一种新兴的高敏感性肿瘤诊断技术。例如有研究者改造巨噬细胞，通过精氨酸酶-1的启动子驱动荧光素酶表达的基因，这些工程化巨噬细胞注入体内后迁移到肿瘤部位，激活产生荧光素酶；能够检测25-50mm3的肿瘤，敏感性高于临床上所用的蛋白及核酸标志物检测方法。CAR-T等工程化免疫细胞药物的成功，为未来活细胞的临床应用打开了道路。微环境中积累的D-2-HG作为IDH突变肿瘤的特异性信息，是这种“活”传感器的理想感应对象。
因此，目前亟需研发以D-2-HG为信息的治疗产品或细胞传感器，将不同生物的功能元件进行有效设计、优化和组装，对细胞进行定向改造，使其特定的功能满足特定需求。
发明内容
为解决目前通过感应肿瘤代谢物D-2-羟基戊二酸的产品无法满足特定需求的问题，本发明的目的是提供一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***及其构建方法和应用。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，感应对象为D-2-羟基戊二酸，分为高浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-H和低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-L；所述控制***包括重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列；
所述高浓度为大于0.5mmol/L，所述低浓度为小于等于0.5mmol/L。
优选的，所述重组转录抑制子由转录抑制蛋白KRAB、感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子DhdR和核定位信号NLS融合得到；
所述转录抑制蛋白KRAB为大鼠锌指结构蛋白Kid-1，序列为SEQ ID NO.1，或人锌指结构蛋白ZNF10，序列为SEQ ID NO.2；
所述感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子DhdR为响应D-2-羟基戊二酸的细菌转录阻遏调控蛋白，应满足以下特征：
具有DNA结合结构域和配体结合结构域，在细菌中，结合在DhdR蛋白特异结合的DNA序列DhdO上阻止目标基因转录，结合D-2-羟基戊二酸后与DhdO脱离，从而使目标基因转录，DhdR和DhdO组成了细菌D-2-羟基戊二酸操纵子；
DhdR可以是Achromobacter denitrificans NBRC 15125中的DhdR-AD(序列为SEQID NO.3)、Achromobacter xylosoxidans ATCC27061中的DhdR-AX(序列为SEQ ID NO.4)及其他满足上述特征的细菌转录阻遏调控因子。
在重组转录抑制子中，KRAB可以位于DhdR的N端或C端。
所述核定位信号NLS为引导蛋白质进入细胞核的结构域，包括但不限于来源于SV40大T抗原的NLS，氨基酸序列为PKKKRKV。
优选的，所述D-2-羟基戊二酸诱导型启动子由组成型启动子Pc和DhdR蛋白特异结合的DNA序列DhdO串联组成，DhdO位于Pc的上游或/及下游；简称为DhdO(n1)-Pc-DhdO(n2)，其中n1和n2为DhdO的串联重复个数，0≤n1≤14，0≤n2≤14，且n1和n2不同时为0；
Pc为在真核细胞中组成型表达的常规启动子，具体为CMV、hPGK、mPGK或EF1α。
DhdO的最小序列为GTTATCAGATAAC；为提高或降低DhdO与DhdR的结合能力，也可以在此序列基础上引入点突变。
优选的，所述待转录序列包括作为报告基因序列和可作为疾病治疗的蛋白或小肽的基因序列；其中，所述报告基因序列包括但不限于分泌性碱性磷酸酶、Gaussia荧光素酶、萤火虫荧光素酶、增强型荧光蛋白、所述可作为疾病治疗的基因序列包括但不限于嵌合抗原受体、细胞因子、趋化因子、***基因或D-2-羟基戊二酸分解代谢酶。
优选的，当控制***为低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-L时，所述控制***还包括D-2-羟基戊二酸转运蛋白；
所述D-2-羟基戊二酸转运蛋白为哺乳动物细胞内将D-2-羟基戊二酸转运进入细胞内的蛋白，如SLC13A3蛋白，且SLC13A3蛋白由弱启动子或最小启动子驱动表达；所述弱启动子或最小启动子包括但不限于minimal CMV promoter、mini-TK promoter或CMV53。
本发明中所述D-2-羟基戊二酸浓度可以是人为添加，也可以是生物体自身形成，生物体自身形成原因包括但不限于异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因突变、羟酸酮酸转氢酶(ADHFE1)表达增强、D-2-羟基戊二酸脱氢酶(D2HGDH)基因突变；所述浓度可以是体液、细胞内、肿瘤微环境等处D-2-羟基戊二酸的浓度。
本发明还包括D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***的构建方法，包括以下步骤：
①设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，由重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列组成；
②制备携带D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***的载体，所述载体为真核质粒表达载体、病毒颗粒或转染试剂；
③载体携带D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***进入目的细胞，所述目的细胞为细胞系、肿瘤细胞或免疫细胞；
④目的细胞感受D-2-羟基戊二酸浓度从而诱导转基因表达。
优选的构建方法，当控制***为低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-L时，步骤①中在设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***时，还需要加入D-2-羟基戊二酸转运蛋白。
本发明还包括D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***在构建D-2-羟基戊二酸活细胞传感器，及活细胞传感器在生物体体外和生物体体内的应用。
本发明还包括D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***在构建***基因治疗载体及其在肿瘤***基因治疗中的应用。
本发明还包括D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***在构建治疗性细胞及其在肿瘤治疗中的应用。
本发明相比现有技术具有以下优点：
开发小分子抑制剂药物靶向肿瘤IDH突变是当前的精准医疗方向的主要策略。本发明并不是针对IDH基因突变，而是基于肿瘤细胞内部、微环境积累D-2-HG这一关键特征，本发明首先建立D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，然后利用该***控制响应肿瘤代谢物D-2-HG的诊断基因路线、***基因路线和免疫细胞治疗性基因路线，从而开发出以D-2-HG为关键信息的活细胞传感器、***基因治疗产品和细胞治疗产品。
本发明的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，分为高浓度和低浓度，其中高浓度的控制***采用重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子和待转录序列构成，待转录基因序列为报告基因、***基因或治疗性基因，可以用于开发活细胞传感器、***基因治疗产品或细胞治疗产品；低浓度的控制***采用重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸转运蛋白、D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子和待转录序列构成，待转录基因序列为报告基因，尤其适合用于开发高敏感性活细胞传感器。
附图说明
图1为D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***组成示意图；
图2为重组转录抑制子中KRAB和DhdR的排列图；
图3为两质粒组成的HGind中两质粒的比例优化图；
图4为由两质粒组成的HGind中DhdO的串联个数优化图；
图5为在两质粒组成的HGind中，D-2-羟基戊二酸剂量对响应性诱导D2eGFP表达的结果示意图；
图6为SLC13A3的引入对低浓度D-2-羟基戊二酸的HGind响应示意图；
图7为优化***中SLC13A3表达质粒的加量对基因表达的影响示意图；
图8为三质粒构成的HGind-L对D-2-羟基戊二酸的响应情况示意图；
图9为全基因合成长片段A的组成结构示意图；
图10为不同浓度的GCV对细胞毒性的影响示意图；
图11为Saline(n＝8)、GCV(n＝10)和生理盐水组小鼠的肿瘤大小示意图；
图12为各组(HT1080-saline、HT1080-GCV、HT1080-DHDO14-saline、HT1080-DHDO14-GCV)的小鼠肿瘤重量示意图；
图13为各组(HT1080-saline、HT1080-GCV、HT1080-DHDO14-saline、HT1080-DHDO14-GCV)的小鼠肿瘤体积示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***及其构建方法和应用，通过以下技术方案实现：
一、一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，所述控制***的感应对象为D-2-羟基戊二酸，分为高浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-H和低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-L；如图1所示：
(一)高浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-H
高浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***(HGind-H)，包括重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子和待转录序列。所述高浓度D-2-羟基戊二酸为大于0.5mmol/L的D-2-羟基戊二酸。
(二)低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-L
低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***(HGind-L)，包括重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子和待转录序列，优选的，还包括D-2-羟基戊二酸转运蛋白。低浓度D-2-羟基戊二酸为小于等于0.5mmol/L的D-2-羟基戊二酸。
上述重组转录抑制子由转录抑制蛋白KRAB(Krueppe1 associated boxprotein)、感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子(命名为DhdR)及核定位信号(NLS)三者融合而成。转录抑制蛋白KRAB可以是来源于大鼠锌指结构蛋白Kid-1，序列为SEQ ID NO.1，也可以是来源于人锌指结构蛋白ZNF10的KRAB(简写为h-KRAB)，序列为SEQ ID NO.2。
DhdR主要满足以下特征：具有DNA结合结构域和配体结合结构域；在细菌中，结合在DNA结合序列(DhdO)上阻止目标基因转录；结合D-2-羟基戊二酸后与DhdO脱离，从而使目标基因转录。DhdR可以是Achromobacter denitrificans NBRC 15125中的DhdR-AD(序列为SEQ ID NO.3)、Achromobacter xylosoxidans ATCC27061中的DhdR-AX(序列为SEQ IDNO.4)及其他满足上述特征的细菌转录阻遏调控因子。
NLS为引导蛋白质进入细胞核的结构域，比较常用的是来源于SV40大T抗原的NLS，氨基酸序列为PKKKRKV。
在重组转录抑制子中，KRAB可以位于DhdR的N端或C端。DhdR-AD、NLS和Kid-1来源的KRAB融合为DhdR-AD-KRAB(序列为SEQ ID NO.5)或者KRAB-AD-DhdR(序列为SEQ IDNO.6)。DhdR-AX、NLS和h-KRAB融合为DhdR-AX-hKRAB(序列为SEQ ID NO.7)。
所述D-2-羟基戊二酸诱导型启动子由组成型启动子(Pc)和特定DNA结合序列(DhdO)串联组成，DhdO位于Pc的上游或/及下游；简称为DhdO(n1)-Pc-DhdO(n2)，其中n1和n2为DhdO的串联重复个数，0≤n1≤14，0≤n2≤14，且n1和n2不同时为0；
Pc为在真核细胞中组成型表达的常规启动子，例如CMV、hPGK、mPGK、EF1α等。DhdO的最小序列为GTTATCAGATAAC。另外，为提高或降低DhdO与DhdR的结合能力，也可以在此DhdO序列的基础上引入点突变【Nature Communications.2021,12:7108.】。
待转录序列包括作为报告基因序列和可作为疾病治疗的蛋白或小肽的基因序列；其中，所述报告基因序列包括分泌性碱性磷酸酶、Gaussia荧光素酶、萤火虫荧光素酶、增强型荧光蛋白等；所述可作为疾病治疗的基因序列包括嵌合抗原受体、细胞因子、趋化因子、***基因、D-2-羟基戊二酸分解代谢酶等。
D-2-羟基戊二酸转运蛋白为哺乳动物细胞内将D-2-羟基戊二酸转运进入细胞内的蛋白。在本申请中选取SLC13A3，序列为SEQ ID NO.8；且SLC13A3优选由弱启动子或者最小启动子驱动表达；所述弱启动子或者最小启动子包括但不限于常见的minimal CMVpromoter(序列为SEQ ID NO.9)、mini-TK promoter(序列为SEQ ID NO.10)、CMV53(序列为SEQ ID NO.11)等。
二、D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***在构建***基因治疗载体的应用
对于IDH突变及ADHFE1过表达的肿瘤细胞，细胞内部积累高浓度的D-2-HG是区别于正常细胞的典型特征。***基因(Suicide gene；简称为Sui)编码的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死。***基因可以选择单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)或者胞嘧啶脱氨酶基因(CD)等，其对应的药物前体分别为更昔洛韦或者5-氟胞嘧啶。
构建方法包括以下步骤：(1)设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***：将HGind-H中的待转录序列选择为***基因，形成感应D-2-羟基戊二酸的***基因线路(HGind-H-Sui)；(2)制备携带HGind-H-Sui的载体，其中所述载体为真核质粒表达载体、慢病毒、溶瘤病毒等病毒颗粒或聚合物等转染试剂等；(3)载体携带HGind-H-Sui进入目的细胞；其中所述目的细胞可以为细胞系及肿瘤细胞等原代细胞；(4)目的细胞感受D-2-羟基戊二酸浓度表达***基因，从而诱导细胞***。
三、D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***在构建活细胞生物传感器及其在体外和生物体体内的应用
活细胞传感器可以在体外响应D-2-羟基戊二酸的浓度，也可以植入动物体内感应血液D-2-羟基戊二酸的浓度；基于巨噬细胞或者免疫细胞的活细胞传感器可以迁移到肿瘤部位，用于评估和检测相关肿瘤。
构建活细胞传感器方法，包括以下步骤：(1)设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***。选择报告基因作为待转录序列，报告基因可以选择分泌性碱性磷酸酶(SEAP)、萤火虫荧光素酶、Gaussia荧光素酶等，对于体内应用传感器，优选Gaussia荧光素酶，因为其具有可分泌、发光强度高、无需ATP、半衰期短、适合活细胞或生物体实时监测等优势。根据传感器敏感性需求不同，可以选择HGind-H或HGind-L，从而形成感应高浓度或者低浓度D-2-HG的基因线路。(2)制备携带D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***的载体，其中所述载体为真核质粒表达载体、慢病毒等病毒颗粒或聚合物等转染试剂等；(3)载体携带D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***进入目的细胞；其中所述目的细胞可以为细胞系及免疫细胞等原代细胞；(4)这些活细胞传感器感受D-2-羟基戊二酸浓度从而诱导报告基因表达。
四、D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***在构建治疗性细胞及其在肿瘤治疗中的应用
IDH突变及ADHFE1过表达的实体肿瘤，其肿瘤微环境中积累较高浓度的D-2-羟基戊二酸。治疗性细胞构建方法包括以下步骤：(1)设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***。对于构建治疗性细胞来说，待转录序列应为治疗性基因。治疗性基因可以是嵌合抗原受体(CAR)、趋化因子、细胞因子、抗体、D-2-HG分解代谢酶等基因的表达。(2)制备携带D-2-羟基戊二酸诱导治疗性基因表达的控制***的载体，其中所述载体为真核质粒表达载体、慢病毒等病毒颗粒或聚合物等转染试剂等；(3)载体携带D-2-羟基戊二酸诱导治疗性基因表达的控制***进入目的细胞；其中所述目的细胞可以是T淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞或其他哺乳动物来源细胞。(4)这些治疗性细胞感受D-2-羟基戊二酸浓度从而诱导治疗性基因表达。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
两质粒组成的HGind-H，构建过程包括以下步骤：
①全基因合成重组转录抑制子：根据氨基酸序列，DhdR-AD-KRAB，序列为SEQ IDNO.5(KRAB位于C端)及KRAB-AD-DhdR，序列为SEQ ID NO.6(KRAB位于N端)，这两个融合基因分别通过HindIII/KpnI酶切位点连入pCDNA3.1(+)，构建质粒pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB及pCDNA3.1(+)-KRAB-DhdR，重组转录抑制子由pCDNA3.1(+)的CMV启动子驱动表达；
②全基因合成10个串联重复的DhdO(DhdO10)及荧光蛋白D2eGFP的片段(序列为SEQ ID NO.12，含5’端BamHI，3’端XbaI酶切位点)，命名为DhdO10-D2eGFP，通过BamHI、XbaI连入pCDNA3.1(+)，构建质粒pCDNA3.1(+)-DhdO10-D2eGFP，在该质粒上DhdO10和CMV组成了D-2-羟基戊二酸诱导型启动子；
③利用脂质体(Lipofectamine 3000)将质粒转染HEK293FT细胞；转染质粒组合1为pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB和pCDNA3.1(+)-DhdO10-D2eGFP或者质粒组合2pCDNA3.1(+)-KRAB-DhdR和pCDNA3.1(+)-DhdO10-D2eGFP；12孔板内3*105/孔铺板细胞，pCDNA3.1(+)-DhdO10-D2eGFP加量为1μg/孔，重组转录抑制子质粒与其比例为0:1、1:1、3:1；
④次日添加D-2-羟基戊二酸，浓度为0mM、1mM、5mM、10mM；转染后64h荧光显微镜拍照，吸掉上清，荧光酶标仪测定荧光强度，结果如图2所示；
⑤图2表明，pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB和pCDNA3.1(+)-DhdO10-D2eGFP或者pCDNA3.1(+)-KRAB-DhdR和pCDNA3.1(+)-DhdO10-D2eGFP这两种质粒组合，均能实现D-2-羟基戊二酸剂量性控制D2eGFP的表达。
实施例2
实施例1所述的HGind-H***中两质粒比例试验
①选择pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB和pCDNA3.1(+)-DhdO10-D2eGFP，如上利用脂质体进行转染；两质粒比例设定为0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.75、1；
②次日加药D-2-羟基戊二酸，浓度为0mM、5mM；转染后64h荧光显微镜拍照，吸掉上清，荧光酶标仪测定荧光强度；
③如图3所示，结果表明，比例为0(即不加pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB)时，添加0mM和5mM D-2-羟基戊二酸对荧光强度影响不大；如表1所示，比例为0.1时，抑制效率(与比例为0时对比)能够达到96.3％，随着比例的加大，抑制越来越强，最高可达到98.4％(比例为1时)；诱导倍数(5mM时的荧光强度除以0mM时的荧光强度)在比例为0.4时达到最大(7.11倍)。
表1两质粒组成的HGind中两质粒的比例和抑制效率、诱导倍数的关系
| 两质粒比例 | 抑制效率/％ | 诱导倍数 |
| 0 | / | / |
| 0.1 | 96.3 | 5.16 |
| 0.3 | 97.6 | 6.30 |
| 0.4 | 97.5 | 7.11 |
| 0.5 | 97.9 | 5.10 |
| 0.75 | 93.2 | 4.30 |
| 1 | 98.4 | 4.59 |
实施例3
实施例1的HGind-H***中DhdO的串联个数
①全基因合成n(n＝3或7或10或14)个串联重复的DhdO(DhdOn)及荧光蛋白D2eGFP的片段(序列SEQ ID NO.12-15)，命名为DhdOn-D2eGFP，通过BamHI、XbaI连入pCDNA3.1(+)，构建质粒pCDNA3.1(+)-DhdOn-D2eGFP，在该质粒上DhdOn和CMV组成了D-2-羟基戊二酸诱导型启动子；
②利用脂质体(Lipofectamine 3000)将质粒转染HEK293FT细胞；转染质粒组合为pCDNA3.1(+)-DhdR-NLS-KRAB和pCDNA3.1(+)-DhdOn-D2eGFP；n＝3或7或10或14；
③次日加药D-2-羟基戊二酸，浓度为0mM、5mM；转染后64h荧光显微镜拍照，吸掉上清，荧光酶标仪测定荧光强度；
④如图4所示，结果显示，当n＝3或7或10或14时，诱导倍数分别为3.92，20.97，4.69和10.98；因此n＝7时，诱导倍数最大。
实施例4
实施例1～3的HGind-H***D-2-羟基戊二酸剂量响应性诱导D2eGFP表达
①选择pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB和pCDNA3.1(+)-DhdO7-D2eGFP，如上利用脂质体进行转染；两质粒比例设定为0.4；
②次日加药D-2-羟基戊二酸，浓度为0、0.5、1、5、10、20mM；荧光酶标仪测定荧光强度；
③如图5所示，结果表明，0.5mM的D-2-羟基戊二酸即能与0mM的D-2-羟基戊二酸组产生的差异具有显著性；随着浓度的升高，荧光强度越来越大。
实施例5
D-2-羟基戊二酸转运蛋白SLC13A3的引入对以上***的影响
①根据氨基酸序列(序列SEQ ID NO.8)，全基因合成SLC13A3，克隆入pCDNA3.1(+)载体，构建pCDNA3.1(+)-SLC13A3；同时合成序列长度类似的SEAP(序列SEQ ID NO.16)，克隆入pCDNA3.1(+)载体，构建pCDNA3.1(+)-SEAP，该质粒可以作为对照；
②除pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB和pCDNA3.1(+)-DhdO7-D2eGFP这两个质粒以外，转染第3个质粒(即步骤1构建的pCDNA3.1(+)-SLC13A3和pCDNA3.1(+)-SEAP)，如上利用脂质体进行转染；三质粒比例设定为1:0.4:0.1；
③次日加药D-2-羟基戊二酸，浓度为0、0.05、0.25、0.5、1、5mM；
④结果如图6所示，可以看出，pCDNA3.1(+)-SEAP的加入并不能引起D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的明显改变；而pCDNA3.1(+)-SLC13A3使得该***对于低浓度的D-2-羟基戊二酸(0～0.05mM)响应，相对于pCDNA3.1(+)-SEAP的加入，大大提高。
实施例6
优化***中SLC13A3表达质粒的加量
①除pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB和pCDNA3.1(+)-DhdO7-D2eGFP这两个质粒以外，转染第3个质粒即pCDNA3.1(+)-SLC13A3，如上利用脂质体进行转染；三质粒比例设定为1:0.4:X；X＝0或0.01或0.05或0.1或0.2或0.4；
②次日加药D-2-羟基戊二酸，浓度为0(control)、5、50μM；荧光酶标仪测定荧光强度；
③结果如图7所示，pCDNA3.1(+)-SLC13A3加量最少的情况(比例为0.01)下，荧光强度最高，即该***诱导转基因表达最高。这也意味着SLC13A3在不需要很高表达量的情况下，即可使***对D-2-羟基戊二酸的敏感性大大增强。
实施例7
三质粒构成的HGind-L
①pCDNA3.1(+)-DhdR-KRAB、pCDNA3.1(+)-DhdO7-D2eGFP及pCDNA3.1(+)-SLC13A3，此三质粒分别携带了重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型启动子及D-2-羟基戊二酸转运蛋白，组成了低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达***HGind-L；
②如上利用脂质体进行转染；三质粒比例设定为1:0.4:0.01；
③次日加药D-2-羟基戊二酸，浓度为0、1、2.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80μM；荧光酶标仪测定荧光强度；
④结果如图8所示，三质粒组成的控制***能够感应低浓度的D-2-羟基戊二酸，实现D-2-羟基戊二酸浓度依赖性的转基因表达控制。
实施例8
构建携带HGind-L的转座质粒
①设计长片段A：设计片段如图9所示，序列SEQ ID NO.17。依次含有DhdR-KRAB、SV40 poly(A)signal、CMV enhancer and promoter、DhdO7、SEAP、bGH poly(A)signal、minimal CMV promoter、SLC13A3、bGH poly(A)signal；其中5’端含XbaI酶切位点，3’端含有NotI酶切位点；
②全基因合成长片段A；
③通过XbaI、NotI将长片段A连入PiggyBac Dual promoter质粒，构建的质粒命名为PiggyBac-HGind-L，该质粒即含有HGind-L：DhdR-KRAB本身由PiggyBac Dual promoter质粒的CMV启动子驱动表达；CMV enhancer and promoter和DhdO7组成了诱导型启动子；SEAP为待转录基因；D-2-羟基戊二酸转运蛋白SLC13A3由弱启动子CMV53(序列SEQ IDNO.11)启动表达。
实施例9
构建携带HGind-H的转座质粒
①上述构建的PiggyBac-HGind-L质粒，通过KpnI单酶切，即可切下SLC13A3片段，自连即可得到不含有SLC13A3的质粒，同时在XbaI处***CMV enhancer and promoter，最后得到质粒命名为PiggyBac-HGind-H。
②PiggyBac-HGind-H质粒，该质粒含有HGind-H：DhdR-NLS-KRAB本身由CMVenhancer and promoter驱动表达；CMV enhancer and promoter和DhdO7组成了诱导型启动子；SEAP为待转录基因。
实施例10
基于HEK293细胞构建感应高浓度D-2-羟基戊二酸的活细胞传感器
①将PiggyBac-HGind-H质粒和Super PiggyBac Transposase(PB200PA-1)质粒按照3:1的比例，利用脂质体(Lipofectamine 3000)转染HEK293细胞；
②48h后，加入嘌呤霉素筛选10天左右；必要时可进行单克隆筛选；得到活细胞传感器293-HGind-H；
③筛选后的细胞加入D-2-HG；D-2-HG浓度为0mM和10mM；
④72h后取上清测定SEAP；
⑤不加D-2-HG的上清中SEAP约为30U/L；加D-2-HG 10mM的上清中SEAP为620U/L。
实施例11
基于HEK293细胞构建感应低浓度D-2-羟基戊二酸的活细胞传感器
①将PiggyBac-HGind-L质粒和Super PiggyBac Transposase(PB200PA-1)质粒按照3:1的比例，利用脂质体(Lipofectamine 3000)转染HEK293、HEK293FT细胞；
②48h后，加入嘌呤霉素筛选10天左右；必要时可进行单克隆筛选；得到活性胞传感器293-HGind-L；
③筛选后的细胞加入D-2-HG；D-2-HG浓度为0、20、40μM；
④72h后取上清测定SEAP；
⑤不加D-2-HG的上清中SEAP约为25U/L；加D-2-HG 20μM的细胞上清中SEAP为750U/L；加D-2-HG浓度40μM的细胞上清中SEAP为1200U/L。
实施例12
裸鼠皮下接种D-2-羟基戊二酸活细胞传感器
①裸鼠一组接种HT1080成瘤；一组不接种细胞；HT1080细胞携带天然的IDH突变，能够产生D-2-HG；
②7天后，皮下接种活性胞传感器293-Sensor-L，每只小鼠接种3*106个活细胞；
③72h后取血，利用SEAP测定试剂盒测SEAP活性；
④对照组血液SEAP约为30mU/L，接种HT1080的组血液SEAP约为900mU/L。
实施例13
D-2-羟基戊二酸活细胞传感器检测小鼠体内早期肿瘤
①通过常规方法将PiggyBac-HGind-L质粒上的SEAP换成分泌型的Gaussia荧光素酶(Gluc)(序列SEQ ID NO.18)，得到质粒PiggyBac-HGind-L-Gluc；
②利用脂质体(Lipofectamine 3000)，转染PiggyBac-HGind-L-Gluc和SuperPiggyBac Transposase进入RAW264.7巨噬细胞，嘌呤霉素筛选稳转细胞，得到的活细胞传感器命名为RAW-1；
③以小鼠结肠癌细胞CT26为出发细胞，利用基于慢病毒构建稳转细胞系的方法【Nat Commun.2021,12(1):7108】，构建CT26-Fluc-IDH，该细胞稳定表达IDH1 R132H突变蛋白；
④皮下接种CT26-FLuc-IDH细胞至6-8周龄的BALB/c小鼠成瘤；在0–500mm3范围时注射细胞传感器RAW-1；根据肿瘤体积(mm3)，分为0、0-50、50-100、>100组别(n＝12)；尾静脉注射细胞传感器RAW-1(1×107/只)；
⑤注射细胞传感器24h后，持续4天每隔24h颌下静脉取血50μl，离心处理后试剂盒测定GLuc发光强度；
⑥对比各个组别发光强度进行统计学分析，得出活细胞传感器可以有效区分0与50-100mm3的肿瘤。
实施例14
体内转染携带HGind-L的转座质粒
①利用Polyplus公司的in vivo-jetPEI试剂，按照操作说明将PiggyBac-HGind-L,质粒，与转染试剂混合；
②室温孵育15分钟；
③如实施例12裸鼠分组，尾静脉注射；
④72h后，对照组血液SEAP约为20mU/L，接种HT1080的组血液SEAP约为300mU/L。
实施例15
构建并优化携带HGind-H的慢病毒质粒
①选用pLenti PGK GFP Puro(w509-5)【addgene No.19070】来源的慢病毒质粒作为骨架，常规分子克隆将重组转录抑制子DhdR-KRAB置于mPGK启动子下替代Puro；
②常规分子克隆将hPGK promoter换为D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子，即DhdO(n1)-hPGK promoter-DhdO(n2)；有以下几种组合：n1＝0且n2＝3(所得质粒命名为PGK-DHDO3)；n1＝0且n2＝7(所得质粒命名为PGK-DHDO7)；n1＝1且n2＝1(所得质粒命名为PGK-DHDO11)；n1＝1且n2＝2(所得质粒命名为PGK-DHDO12)；n1＝1且n2＝3(所得质粒命名为PGK-DHDO13)；n1＝2且n2＝1(所得质粒命名为PGK-DHDO21)；n1＝2且n2＝2(所得质粒命名为PGK-DHDO22)；n1＝2且n2＝3(所得质粒命名为PGK-DHDO23)；n1＝3且n2＝3(所得质粒命名为PGK-DHDO33)。以DhdO2-hPGK promoter-DhdO2为例，见序列SEQ ID NO.19，其他序列根据DhdO的个数(上述n1和n2)在相应位置增加或减去DhdO序列即可。
③常规分子克隆，将质粒上的EGFP换为待转录基因序列D2eGFP。
④由此，慢病毒质粒上携带了重组抑制子DhdR-KRAB，D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子以及待转录序列，组成了HGind-H；
⑤使用胰酶消化下293FT细胞，铺24孔板，每孔1.5*105个/孔，每孔500μl完全培养基(DMEM高糖+10％FBS+1％青链霉素)；次日以每孔0.75μg相应质粒进行转染)以及不转染质粒的Blank组；24h后，每一组细胞加入终浓度为0、10mM D-2-HG浓度的完全培养基。48h后，去上清，使用多功能酶标仪检测GFP荧光强度。
⑥结果表明，从诱导倍数角度看，PGK-DHDO7、PGK-DHDO13、PGK-DHDO23、PGK-DHDO33能够达到8倍左右，高于其他组合；从荧光强度(荧光蛋白表达量)看，PGK-DHDO13、PGK-DHDO23、PGK-DHDO33三者较为接近，是PGK-DHDO7的10倍左右。
实施例16
制备携带HGind-H的慢病毒并感染Jurkat细胞
①改造慢病毒质粒：在上述PGK-DHDO33质粒的基础上，常规分子克隆将重组转录抑制子DhdR-KRAB置于EF1A启动子下；得到质粒PGK-DHDO33-D2eGFP-EF1A-DHDRKRAB；
②慢病毒制备：
a)制备A液：将1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入10μg PGK-DHDO33-D2eGFP-EF1A-DHDRKRAB质粒(带有嘌呤霉素抗性片段)和7.5μg psPAX2质粒、2.5μgpMD2.G质粒，涡旋振荡5-10s以彻底混匀；
b)制备B液：取1.2mL Opti-MEM培养基加入1.5mL离心管中，并加入100μLlipo3000(p3000 50μL+lipo3000 50μL)，涡旋振荡5-10s；
c)将A液和B液1:1(v/v)混合，室温放置20分钟；
d)293ft细胞准备：将293ft细胞培养于10cm培养皿，培养至细胞密度为60-70％；
e)将步骤c)A液和B液的混合液均匀滴在步骤d)的10cm培养皿中，静置3-5min，轻轻摇匀，37℃培养箱培养2天；
f)300rcf离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液，超速离心110000g*2h，去上清，将沉淀用无菌PBS重悬，分装置于-80℃保存；
③上述慢病毒加入到Jurkat细胞中(MOI＝30)。
④将Jurkat细胞和感染上述慢病毒的Jurkat细胞计数，将这两种细胞分别铺于24孔板，每孔1*105个/孔，分为4个组别(每组3重复孔)，分别于0mM，1mM，5mM，10mM D-2-HG浓度的完全培养基中培养48h。
⑤将细胞取出进行流式细胞术，使用FITC通道检测细胞上D2eGFP阳性率的高低(表2)
表2FITC阳性率
实施例17
HGind-H在构建治疗性CAR-T细胞中的应用
①常规分子克隆，将pLenti PGK GFP Puro(w509-5)【addgene No.19070】来源质粒hPGK promoter换为D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子，即DhdO3-hPGK promoter-DhdO3；同时将合成的靶向CD19的BBZ-CAR片段(序列SEQ ID NO.20)置于该启动子控制；所得质粒命名为PGK-DHDO33-BBZ-Puro；
②常规分子克隆，将pLenti PGK GFP Puro(w509-5)【addgene No.19070】来源质粒hPGK promoter换为EF1A启动子；将DhdR-KRAB置于EF1A启动子下；将嘌呤霉素抗性基因换为潮霉素抗性基因HygR；所得质粒命名为PGK-EF1A-DhdRKRAB-HygR；
③类似上述实施例，分别用PGK-DHDO33-BBZ-Puro和PGK-EF1A-DhdRKRAB-HygR包装慢病毒；
④利用文献报道【Cytotherapy.2021,23(12):1085-1096.】方法分离、激活和扩增人原代CD3+T细胞，将上述慢病毒同时加入以MOI＝30的比例和CD3+T细胞混匀培养；72h后开始直至收获培养基中加入嘌呤霉素和潮霉素；所得T细胞为携带HGind-H且靶向CD19抗原的CAR-T细胞(HGind-H-CD19CAR-T)；
⑤HT1080细胞系存在天然的IDH R132C突变，其中IDH R132C突变能够使细胞分泌过多的D-2-HG。利用文献报道的慢病毒方法，构建稳定表达CD19抗原和萤火虫荧光素酶的HT1080细胞，所得细胞命名为HT1080-CD19-Luc；构建稳定表达萤火虫荧光素酶的HT1080细胞，所得细胞命名为HT1080-Luc。
⑥将HT1080-CD19细胞和HT1080细胞分别铺于96孔板中，每孔1*104个细胞。待HT1080-CD19细胞和HT1080细胞贴壁后，去上清，按照组别加入相应T细胞，分为以下4组：(a)HT1080-luc细胞：对照T细胞＝1:5(b)HT1080-luc细胞：HGind-H-CD19CAR-T细胞＝1:5(c)HT1080-CD19-luc细胞：对照T细胞＝1:5(d)HT1080-CD19-luc细胞：HGind-H-CD19CAR-T细胞＝1:5。其中每一组都以相应的生长相同时间的肿瘤细胞(不加入任何T细胞)作为空白对照。
⑦作用72h后，去上清，将孔板中的细胞分别消化下来，使用试剂盒测量luciferase。肿瘤细胞存活率(Survival rate)％＝实验组别的荧光度÷相应空白组别的荧光度×100％。
⑧结果：HT1080细胞系存在IDH R132C突变，其中IDH R132C突变能够使细胞分泌过多的D-2-HG。HGind-H-CD19CAR-T细胞能够响应细胞上清中的D-2-HG从而表达靶向CD19的CAR分子，可以特异性杀伤表达CD19抗原的HT1080-luc。在72小时后，HGind-H-CD19CAR-T细胞对HT1080-CD19-luc的杀伤能够达到81.3％(平均值)，即HT1080-CD19-luc的存活能够达到18.7％，而其他组存活率在60％以上。
实施例18
HGind-H在控制细胞表达细胞因子和趋化因子方面的应用
①常规基因合成及分子克隆将上述实施例中PGK-DHDO33-BBZ-Puro的BBZ换为7-10组合基因，即IL-7(促进T细胞的增殖)和趋化因子CXCL10(诱导T细胞浸润【J ClinInvest.2017,127(4):1425-1437】)，两者通过2A序列连接(所得多肽见序列SEQ IDNO.21)，所得质粒命名为PGK-DHDO33-7-10-Puro；
②类似上述实施例，分别用PGK-DHDO33-7-10-Puro和PGK-EF1A-DhdRKRAB-HygR包装慢病毒；
③如上实施例提取、激活和扩增T细胞，步骤2所得慢病毒感染T细胞，72h后开始直至收获培养基中加入嘌呤霉素和潮霉素；所得T细胞为携带HGind-H且控制细胞因子IL-7和趋化因子CXCL10表达的T细胞(HGind-H-7-10-T)；
④对照T细胞和HGind-H-7-10-T细胞分别加入0、5mM D-2-HG培养72h；取上清ELISA试剂盒测定。相比于对照T细胞，IL-7和CXCL10浓度分别上调了约20倍和14倍。
实施例19
HGind-H控制D-2-羟基戊二酸分解代谢酶表达方面的应用
①常规分子克隆将上述实施例中PGK-DHDO33-BBZ-Puro的BBZ换为人D-2-羟基戊二酸脱氢酶D2HGDH(序列SEQ ID NO.22)，所得质粒命名为PGK-DHDO33-D2HGDH-Puro；
②类似上述实施例，分别用PGK-DHDO33-D2HGDH-Puro和PGK-EF1A-DhdRKRAB-HygR包装慢病毒；
③如上实施例提取、激活和扩增T细胞，步骤②所得慢病毒感染T细胞，72h后开始直至收获培养基中加入嘌呤霉素和潮霉素；所得T细胞为携带HGind-H且控制D2HGDH表达的T细胞(HGind-H-D2HGDH-T)；
④对照T细胞和HGind-H-D2HGDH-T细胞分别加入0、5mM D-2-HG培养72h；取细胞裂解，测定裂解液中D2HGDH酶活性。相比于对照T细胞，HGind-H-D2HGDH-T细胞D2HGDH酶活性上调了约8倍。
实施例20
HGind-H控制***基因的体外表达方面的应用
①选用pLenti PGK GFP Puro(w509-5)【addgene No.19070】来源的慢病毒质粒作为骨架，常规分子克隆将重组转录抑制子DhdR-KRAB置于mPGK启动子下替代Puro；将hPGKpromoter换为D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子，即DhdO(n1)-hPGK promoter-DhdO(n2)；n1＝0且n2＝14；将质粒上的EGFP基因换为pU△TK基因，该基因为缩短型HSV-TK与嘌呤霉素抗性基因的融合基因【Nucleic Acids Res.2004,32(20):e161】，表达的融合蛋白同时具有这两个基因编码蛋白的功能。由此，慢病毒质粒上携带了重组抑制子DhdR-KRAB，D-2-羟基戊二酸诱导型强启动子以及***基因Sui，组成了HGind-H-Sui；该质粒命名为PGK-DHDO14-pU△TK；
②如上常规方法，利用PGK-DHDO14-pU△TK质粒制备携带HGind-H-Sui的慢病毒；
③人纤维肉瘤细胞系HT1080于MEM完全培养基中培养(89％MEM+10％胎牛血清+1％青链霉素)，于37℃，5％CO2环境中培养。步骤②制备的慢病毒加入到5*105个HT1080细胞中，其中MOI＝30。待细胞贴壁后，培养基中加入终浓度为2μg/ml嘌呤霉素进行筛选，扩大培养，在此专利中命名为HT1080-DHDO14细胞系。
④分别消化下HT1080细胞和HT1080-DHDO14细胞铺96孔板，每孔3000个细胞，200μl MEM完全培养基。待细胞贴壁后，将细胞分为六组，培养基中GCV浓度为0，1ng/ml，100ng/ml，1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml。
⑤48h后，使用CCK8试剂盒进行细胞毒性的测定，在450nm处测viable cells(％)＝(实验组发光强度-对照组发光强度)/对照组发光强度*100％。
⑥结果如图10所示，HT1080细胞系存在IDH R132C突变，其中IDH R132C突变能够使细胞分泌过多的D-2-HG，表明HT1080-DHDO14细胞能够响应高浓度D-2-HG从而表达***基因，使突变的肿瘤细胞死亡。因此通过体外实验证明了HGind-H控制了***基因的表达。
实施例21
HGind-H控制***基因在动物体内表达方面的应用
①购买Balb/c nude crlj18只，雄，5周龄。HT1080和HT-1080-DHDO14细胞用PBS重悬，都以1.5×106个/侧*只(100μl体积)进行注射，其中HT1080注射到小鼠左侧背部，HT1080-DHDO14注射到小鼠右侧背部。
②将小鼠分为两组，对照组(n＝8)注射生理盐水，实验组(n＝10)注射更昔洛韦(GCV)。
③于肿瘤模型构建第5天至第12天，对照组腹腔注射生理盐水100μl/天*只，实验组每只小鼠腹腔注射GCV 50mg/kg*天。于第8天开始每天测量小鼠肿瘤的长径和短径。
④于第14天处死小鼠，对小鼠肿瘤进行称重。
如图11所示，生理盐水组的小鼠左侧的HT1080肿瘤及右侧的HT1080-DHDO14肿瘤大小基本一致，GCV组的小鼠右侧的HT1080-DHDO14肿瘤明显小于小鼠左侧的HT1080肿瘤。图12显示了GCV组中的HT1080-DHDO14肿瘤重量明显小于其他组，图13显示了GCV组中的HT1080-DHDO14肿瘤在测量后期体积明显小于其他三组。以上数据表明了当肿瘤微环境中D-2-HG含量高时，前体药物更昔洛韦可以靶向杀死带有HGind及***基因的肿瘤细胞。
实施例22
体内转染携带HGind-H及***基因的质粒
①如实施例20构建***基因质粒，不同之处在于n1＝3且n2＝3，所得质粒命名为PGK-DHDO33-pU△TK；
②利用Polyplus公司的in vivo-jetPEI试剂，按照操作说明将PGK-DHDO33和PGK-DHDO33-pU△TK质粒，分别与转染试剂混合；室温孵育15分钟；
③裸鼠接种HT1080细胞成瘤，分2组，分别瘤内注射步骤②质粒与in vivo-jetPEI试剂的混合物；每隔4天注射1次；共注射3次；每只小鼠腹腔注射GCV 50mg/kg*天；
④于第14天处死小鼠，对小鼠肿瘤进行称重。体内转染PGK-DHDO33-pU△TK质粒的小鼠组，其肿瘤重量是转染PGK-DHDO33质粒的30％。这表明通过体内转染试剂可以将携带HGind-H和***基因的质粒转染进入肿瘤细胞，HT1080肿瘤积累高浓度的D-2-HG，能够诱导***基因的表达。
Claims (6)
1.一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，其特征在于：所述控制***的感应对象为D-2-羟基戊二酸，分为高浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-H和低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-L；所述控制***包括重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列；
所述高浓度为大于0.5mmol/L，所述低浓度为小于等于0.5mmol/L；
所述重组转录抑制子由转录抑制蛋白KRAB、感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子DhdR和核定位信号NLS融合得到；
所述转录抑制蛋白KRAB为大鼠锌指结构蛋白Kid-1，序列为SEQ ID NO.1，或人锌指结构蛋白ZNF10，序列为SEQ ID NO.2；
所述感应D-2-HG的细菌转录阻遏调控因子DhdR为响应D-2-羟基戊二酸的细菌转录阻遏调控蛋白，应满足以下特征：
具有DNA结合结构域和配体结合结构域，在细菌中，结合在DhdR蛋白特异结合的DNA序列DhdO上阻止目标基因转录，结合D-2-羟基戊二酸后与DhdO脱离，从而使目标基因转录，DhdR和DhdO组成了细菌D-2-羟基戊二酸操纵子；
所述核定位信号NLS为引导蛋白质进入细胞核的结构域，氨基酸序列为PKKKRKV；
所述D-2-羟基戊二酸诱导型启动子由组成型启动子Pc和DhdR蛋白特异结合的DNA序列DhdO串联组成，DhdO位于Pc的上游或/及下游；简称为DhdO(n1)-Pc-DhdO(n2)，其中n1和n2为DhdO的串联重复个数，0≤n1≤14，0≤n2≤14，且n1和n2不同时为0；
Pc为在真核细胞中组成型表达的启动子，包括但不限于为CMV、hPGK、mPGK或EF1α。
2.根据权利要求1所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，其特征在于：所述待转录序列包括但不限于分泌性碱性磷酸酶、Gaussia 荧光素酶、萤火虫荧光素酶、增强型荧光蛋白、嵌合抗原受体、细胞因子、趋化因子、***基因或D-2-羟基戊二酸分解代谢酶。
3.根据权利要求1所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，其特征在于：当控制***为低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-L时，所述控制***还包括D-2-羟基戊二酸转运蛋白；
所述D-2-羟基戊二酸转运蛋白为SLC13A3蛋白，且SLC13A3蛋白由弱启动子或最小启动子驱动表达；
所述弱启动子或最小启动子包括但不限于minimal CMV promoter、mini-TK promoter或CMV53。
4.权利要求1~2所述的任一种D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
①设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***，由重组转录抑制子、D-2-羟基戊二酸诱导型启动子和待转录序列组成；
②制备携带D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***的载体，所述载体为真核质粒表达载体、病毒颗粒或转染试剂；
③载体携带D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***进入目的细胞，所述目的细胞为细胞系或者原代细胞，所述原代细胞包括但不限于肿瘤细胞或免疫细胞；
④目的细胞感受D-2-羟基戊二酸浓度从而诱导转基因表达。
5.根据权利要求4所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***的构建方法，其特征在于：当控制***为低浓度D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***HGind-L时，步骤①中在设计并合成D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***时，还需要加入D-2-羟基戊二酸转运蛋白。
6.权利要求1所述的D-2-羟基戊二酸诱导转基因表达的控制***在构建D-2-羟基戊二酸活细胞传感器中的应用。
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