CN116496983A - 一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116496983A
CN116496983A CN202310348957.4A CN202310348957A CN116496983A CN 116496983 A CN116496983 A CN 116496983A CN 202310348957 A CN202310348957 A CN 202310348957A CN 116496983 A CN116496983 A CN 116496983A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mesenchymal stem
exosome
human umbilical
hypoxia
umbilical cord
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310348957.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张翠萍
褚自强
张文华
付小兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese PLA General Hospital
Original Assignee
Chinese PLA General Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chinese PLA General Hospital filed Critical Chinese PLA General Hospital
Priority to CN202310348957.4A priority Critical patent/CN116496983A/zh
Publication of CN116496983A publication Critical patent/CN116496983A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括：将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1.5％；将培养得到的人脐带间充质干细胞进行差速超速离心，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。本发明利用低氧诱导制备外泌体的方法得到的外泌体用于糖尿病创面，其对糖尿病创面的治疗效果显著优于常氧条件下制备的外泌体，不仅在愈合速度上更具有优势，同时在刺激皮肤附属器再生和提升愈合质量方面具有更大应用潜力。

Description

一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
难愈合创面是糖尿病的严重并发症之一，严重影响着患者的生活质量甚至于生命健康。在这一机体高糖环境下，皮肤作为人体的保护屏障，处于严重的代谢紊乱状态。开发具有潜在应用价值且安全的糖尿病创面愈合治疗方法具有重要价值。
外泌体是细胞外分泌的微小囊泡，具有脂质双层膜结构，包含有蛋白质、DNA和RNA等各种小分子活性成分。外泌体作为旁分泌途径之一，可作为载体将其内容物通过融合细胞膜或者胞吞作用运输至靶细胞内，从而发挥有效生物学效应。相比于药物、小分子材料和干细胞治疗等，干细胞来源的外泌体具有更好的生物安全性和组织相容性。随着愈来愈多的疾病治疗需求，外泌体质量稳定，且适合大规模提取，在临床上应用更加安全。目前应用于糖尿病创面修复的外泌体的效果往往较差。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，所述制备方法能够高效应用于糖尿病创面修复。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1.5％；
对所述细胞培养液进行外泌体的提取，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。
优选的，所述培养用的培养基包括高糖DMEM培养基；所述高糖DMEM培养基中含有5％～10％的无外泌体血清。
优选的，所述培养的时间为36～48h；所述培养的温度为37℃。
优选的，所述提取的步骤包括：
将细胞培养液进行低速离心，取上清得到第一悬浮液；
将所述第一悬浮液进行中速离心，取上清得到第二悬浮液；
将所述第二悬浮液过滤后，进行高速离心，取沉淀进行重悬，再次进行高速离心后再次重悬，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体悬液。
优选的，所述低速离心的转速为1000～2000g；所述低速离心的时间为5～10min；
所述中速离心的转速为10,000～20,000g；所述中速离心的时间为20～30min；
所述高速离心的转速为100,000～200,000g；所述高速离心的时间为75～90min。
优选的，所述过滤用滤膜的孔径为0.22μm；所述重悬的试剂包括无菌PBS缓冲液；所述无菌PBS缓冲液的pH为7.2～7.4。
优选的，所述人脐带间充质干细胞包括传代2～4次得到的人脐带间充质干细胞。
本发明提供了一种上述技术方案所述制备方法制备得到的低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。
本发明提供了上述技术方案所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体在制备高miR-17-5p表达的试剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进糖尿病创面愈合药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1.5％；对所述细胞培养液进行外泌体的提取，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。本发明利用低氧条件制备人脐带间充质干细胞外泌体，所述人脐带间充质干细胞外泌体能够实现miR-17-5p的高表达。实施例结果表明：本发明提供的利用低氧诱导制备外泌体的方法，得到的外泌体用于糖尿病创面，其对糖尿病创面的治疗效果显著优于常氧条件下制备的外泌体，不仅在愈合速度上更具有优势，同时在刺激皮肤附属器再生和提升愈合质量方面具有更大应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制备得到的外泌体的粒径大小和粒子浓度检测结果图；
图2为对比例1制备得到的外泌体的粒径大小和粒子浓度检测结果图；
图3为实施例1制备的外泌体的透射电镜图；
图4为对比例1制备的外泌体的透射电镜图；
图5为实施例1和对比例1制备得到的外泌体和细胞蛋白的表面特异标记蛋白的表达水平图；
图6为实施例1制备得到的外泌体中miR-17-5p和对比例1制备得到的外泌体中miR-17-5p的丰度图；
图7为对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组在第0天、第3天、第7天和第14天的创面图；
图8为对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组的创面比例和创面愈合天数的关系图；
图9为对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组第7天和第14天创面组织HE染色图；
图10为对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组第7天和第14天创面组织创缘间距比例图。
具体实施方式
本发明提供了一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1.5％；
对所述细胞培养液进行外泌体的提取，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。
本发明将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1％，优选为1％。
在本发明中，所述人脐带间充质干细胞优选包括传代2～4次得到的人脐带间充质干细胞。在本发明中，所述人脐带间充质干细胞的获取方法优选包括以下步骤：
将脐带组织剪碎，加入II型胶原酶进行消化，得到脐带细胞消化液；
终止消化，过滤，离心，弃上清，得到人脐带间充质干细胞。
本发明优选将脐带组织剪碎，加入II型胶原酶进行消化，得到脐带细胞消化液。
在本发明中，所述脐带组织优选为新鲜脐带组织。在本发明中，所述脐带组织的保存方式优选包括将脐带组织放入含有0.1％青链双抗的生理盐水中。在本发明中，所述0.1％青链双抗的生理盐水具体为每1毫升生理盐水加入1μL青链双抗。在本发明中，所述青链双抗优选为青链霉素混合液(100×，P1400,索莱宝)购自于索莱宝生物科技有限公司。本发明所述保存方式优选适用于对脐带组织的短暂保存；所述短暂保存的时间优选≤2h。本发明将脐带组织剪碎前优选包括对脐带组织进行预处理。本发明所述预处理优选包括：将脐带组织在酒精中进行浸泡，得到浸泡脐带组织；将所述浸泡脐带组织除去脐带外膜，剥除脐动脉和脐静脉，用生理盐水冲洗干净。本发明所述预处理中，所述浸泡的时间优选为10～120min，更优选为10min。本发明将脐带组织进行浸泡的目的是维持组织细胞的活力，减少细胞死亡比例和预防感染。得到预处理完成的脐带组织后，本发明优选将脐带组织剪碎。本发明对剪碎的方法没有特殊限定，采用本领域常规剪碎方法均可。在本发明中，所述脐带组织优选剪碎为脐带组织块。在本发明中，所述脐带组织块的体积优选为1～2mm3，更优选为1mm3。在本发明中，所述脐带组织块优选均匀地铺入细胞培养皿中后加入II型胶原酶进行消化。本发明所述消化的时间优选为0.5～1h，更优选为1h。本发明所述消化完成后，得到脐带细胞消化液。
得到脐带细胞消化液后，本发明优选终止消化，过滤，离心，弃上清，得到人脐带间充质干细胞。在本发明中，所述终止消化优选使用的等体积的培养基进行；所述培养基优选为含血清的DMEM完全培养基。在本发明中，所含血清的DMEM完全培养基中血清的体积百分含量优选为15～20％，更优选为20％。终止消化后，本发明优选将终止消化液进行过滤。本发明所述过滤的方法优选为细胞筛过滤。过滤完成后，本发明优选取滤液进行离心。本发明所述离心的转速优选为1000r/min；所述离心的时间优选为5min。本发明离心完成后，弃上清，其沉淀物即为消化后的人脐带间充质干细胞。
得到消化后的人脐带间充质干细胞后，本发明进行原代培养，得到原代培养后的人脐带间充质干细胞。在本发明中，所述原代培养所用培养基优选为DMEM完全培养基。本发明所述原代培养的时间优选为3d。
得到原代培养后的人脐带间充质干细胞后，本发明优选进行传代培养。本发明对所述传代培养的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知的常规人脐带间充质干细胞的传代培养方法即可。在本发明中，所述传代培养的温度优选为37℃；所述传代培养优选在体积百分含量为5％CO2的细胞培养箱中进行。在本发明中，所述传代培养的次数优选为2～4次，更优选为3次。
得到传代后的人脐带间充质干细胞后，本发明将传代后的人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液。
在本发明中，所述低氧环境中氧气的体积百分含量为0.5％～1.5％，优选为0.5％～1％，更优选为1％。在本发明中，所述培养用的培养基优选包括高糖DMEM培养基或干细胞专用培养基。本发明所述培养用的培养基为高糖DMEM培养基时，所述高糖DMEM培养基中优选包括无外泌体血清，所述无外泌体血清在高糖DMEM培养基中的体积百分含量优选为5％～10％，更优选为10％。本发明在培养基中添加血清的目的主要是提供细胞营养支持，保证外泌体的产出。在本发明中，所述培养的时间优选为36h～48h，更优选为48h；所述培养的温度优选为37℃。在本发明中，所述低氧环境中二氧化碳的体积百分含量优选为5％。本发明低氧环境培养完成后，得到细胞培养液。
得到细胞培养液后，对所述细胞培养液进行外泌体的提取，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。
本发明所述提取的步骤优选包括：
将细胞培养液进行低速离心，取上清得到第一悬浮液；
将所述第一悬浮液进行中速离心，取上清得到第二悬浮液；
将所述第二悬浮液过滤后，进行高速离心，取沉淀进行重悬，再次进行高速离心后再次重悬，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体悬液。
在本发明中，所述差速超速离心过程中优选控制温度为4℃。在本发明中，所述低速离心的转速优选为1000～2000g，更优选为2000g；所述低速离心的时间优选为5～10min，更优选为10min。低速离心完成后，本发明优选取上清得到第一悬浮液。得到第一悬浮液，本发明优选对第一悬浮液进行中速离心。在本发明中，所述中速离心的转速优选为10,000～20,000g，更优选为10,000g；所述中速离心的时间优选为20～30min，更优选为30min。中速离心完成后，本发明优选取上清得到第二悬浮液。本发明优选通过低速离心和中速离心去除大颗粒物质，包括细胞、死细胞和碎片等。得到第二悬浮液后，本发明优选将第二悬浮液进行过滤，得到滤液。本发明所述过滤用滤膜的孔径优选为0.22μm。得到滤液后，本发明优选将滤液进行高速离心。在本发明中，所述高速离心的转速优选为100,000～200,000g，更优选为100,000g；所述高速离心的时间优选为60～90min，更优选为75min。第一次高速离心完成后，本发明优选取沉淀进行重悬。在本发明中，所述重悬优选使用PBS缓冲液进行重悬，得到重悬液。得到重悬液后，本发明优选将重悬液再次进行高速离心。在本发明中，再次高速离心的转速优选为100,000～200,000g，更优选为100,000g；所述高速离心的时间优选为60～90min，更优选为75min。再次高速离心完成后，本发明优选取沉淀进行再次重悬，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体悬液。本发明所述再次重悬优选使用PBS缓冲液进行重悬。在本发明中，所述PBS缓冲液的pH优选为7.2～7.4。得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体悬液后，本发明可以直接对低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体悬液进行使用，也可以冻存备用。
本发明提供的低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法利用低氧条件对人脐带间充质干细胞进行诱导，然后对外泌体进行提取。所述制备方法在保持了外泌体天然结构的同时，增加了其内miR-17-5p的含量，能够有效改善糖尿病创面的愈合。
本发明提供了一种上述技术方案制备得到的低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。在本发明中，所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体保持了外泌体天然结构，经验证，本发明所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体能够高表达miR-17-5p。
本发明还提供一种上述技术方案所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体用于制备miR-17-5p高表达的试剂。
本发明还提供一种上述技术方案所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进糖尿病创面愈合药物中的应用。本发明提供的利用低氧诱导制备外泌体的方法，得到的外泌体用于糖尿病创面，其对糖尿病创面的治疗效果显著优于常氧条件下制备的外泌体，不仅在愈合速度上更具有优势，同时在刺激皮肤附属器再生和提升愈合质量方面具有更大应用潜力。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体，其制备方法步骤如下：
1)人脐带间充质干细胞的获取方法为：
(1)从临床医院的手术室获取新鲜脐带组织(所有操作均已通过所在医院临床委员会批准通过)，放入含有0.1％青链双抗的生理盐水中，运送至实验室(所述含有0.1％青链双抗的生理盐水用于保存脐带组织的时间不能超过2h，仅能用于脐带组织的短暂保存)；将脐带置于酒精内浸泡数分钟，除去脐带外膜，剥除脐动脉和脐静脉，用生理盐水冲洗干净；
(2)在超净台内将处理后的脐带组织剪碎，剪成约1mm3的组织块，均匀地铺入细胞培养皿，加入II型胶原酶，置于恒温细胞培养箱中进行消化；
(3)1h后加入等体积的含有体积百分含量为20％的血清的完全培养基DMEM终止消化，用细胞筛过滤，以1000r/min的速度离心滤过的细胞悬液5min；
(4)弃上清，用DMEM完全培养基重悬细胞在5％CO2细胞培养箱中进行原代培养，培养温度为37℃，培养3天更换培养基，之后2～3天换一次液，原代培养完成后，进行传代培养，取传代培养第三代次培养得到的人脐带间充质干细胞进行后续实验。
2)设置低氧环境为1％的氧气浓度和5％的二氧化碳浓度。在低氧环境中使用含有10％无外泌体血清的Gibco高糖DMEM培养基培养步骤1)得到的人脐带间充质干细胞。培养的温度为37℃，培养的时间为48h(细胞融合度达80％左右)。
3)将低氧条件下培养的人脐带间充质干细胞的培养上清在离心机中2,000g低速离心10min，收集上清，得到第一悬浮液；将第一悬浮液继续10,000g离心30min，得到第二悬浮液。
4)将第二悬浮液利用0.22μm超滤膜进行过滤，然后100,000g高速离心所得过滤液75min。去除上清，用无菌PBS缓冲液重悬沉淀，并再次100,000g高速离心75min。低速离心、中速离心和高速离心的离心过程中温度均控制在4℃。再次离心后，去除上清，用无菌PBS缓冲液重悬沉淀分别得到低氧外泌体悬液试剂。可现用或者冻存以备后期使用。
对比例1
一种人脐带间充质干细胞外泌体，其制备方法步骤同实施例1，区别在于，设置常氧环境为21％的氧气浓度和5％的二氧化碳浓度。
应用例1
将实施例1制备得到的低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体和对比例1制备得到的人脐带间充质干细胞外泌体进行相关鉴定。
1.纳米粒子分析检测外泌体的浓度和粒径。
检测方法操作如下：将外泌体悬液分出20μL，使用5～10mL PBS缓冲液进行稀释，放入纳米***样品室(ParticleMetrix)中进行检测，然后使用软件ZetaView 8.04.02对结果数据处理和分析，记录下各实施例和对比例外泌体的粒径大小和粒子浓度。其中实施例1制备得到的外泌体的粒径大小和粒子浓度检测结果如图1所示；对比例1制备得到的外泌体的粒径大小和粒子浓度检测结果如图2所示。
由图1和图2结果显示常氧组和低氧组外泌体的粒径大小和浓度均相似，所述常氧组和低氧组外泌体的粒径大小分别为123.4±36.7nm和121.8±28.3nm；所述常氧组和低氧组外泌体的浓度均约为1×109Particies/mL。表明常氧组和低氧组获得的外泌体在粒径大小和粒子浓度方面无明显差异。
2.透射电镜检测和观察外泌体的形态
利用透射电镜对外泌体形态进行拍照和记录，具体检测方法操作如下：
(1)锇酸固定：将20μL含有sEVs的悬液加入到500μL的2％的锇酸溶液中，放置在4℃冰箱内静置2h进行固定；
(2)脱水：固定结束后，用PBS缓冲液对其进行3遍清洗，每次清洗需静置15min左右，然后按顺序依次在50％、70％、80％和90％浓度梯度的乙醇溶液中进行脱水处理，每次脱水的时间均为15min。当脱水完成后继续静置15min，最后浸泡在无水乙醇中脱水，脱水时间为15min。按上述流程再进行一次脱水；
(3)置换：将上述脱水后获得的样品浸泡在丙酮中，时间为15min，将脱水溶液置换出来，随后重复一次该置换流程；
(4)浸渍：浸渍液I由丙酮和包埋剂按体积比2:1的比例配制而成，浸渍液II由丙酮和包埋剂按体积比1:1的比例配制而成，浸渍液III由丙酮和包埋剂按体积比1:2的比例配制而成，浸渍液IV由100％包埋剂配制而成。依次在浸渍液I、浸渍液II和浸渍液III中浸渍2h，最后在浸渍液IV中浸渍24h，并重复在浸渍液IV浸渍一次；
(5)包埋：浸渍完成后，将样品放入装有纯包埋剂的包埋板中进行包埋处理；
(6)聚合切片：包埋后将样品在65℃下聚合，48h后将样品切成薄片，厚度为60～80nm；
(7)染色：使用醋酸双氧铀对切片样品进行染色，浸泡10min，清洗后再用醋酸铅进行染色处理，10min后再清洗一遍，使用电镜对其进行观察；
(8)拍照：100kv条件下进行电镜(Hitachi)检测成像，加速电压设置为40-120kV(100V增量)。
采用上述方法利用透射电镜对实施例1和对比例1制备得到的外泌体悬液进行拍照，实施例1制备的外泌体的拍照图片如图3所示，对比例1制备的外泌体的拍照图片如图4所示。其中，图3和图4中的白色标尺为200nm。
由图3和图4可得，常氧外泌体和低氧外泌体均具有外泌体的经典双层膜样结构，整体呈现杯状或球形形态，两者间的直径亦未见明显差异。
3.提取外泌体的总蛋白进行检测
通过BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，使用蛋白印迹实验，经过电泳、转膜、封闭、一二抗孵育和化学发光成像分析检测外泌体的表面特异性标志物：CD63、CD9、TSG101和Calnexin。具体操作如下：
(1)BCA法检测蛋白浓度：分别取约50μL实施例1和对比例1制备得到的外泌体悬液分别加入50μL RIPA裂解液(R0010，索莱宝公司)，4℃下充***解15min，离心(12000g，4℃)20min后，用移液枪缓缓吸出上清液，置于1.5mL的EP管内。细胞裂解产物的制备是将人脐带间充质干细胞在直径为6cm的细胞培养皿中进行培养后，吸弃培养上清，使用100μL RIPA裂解液，4℃下充***解15min，将细胞刮下并转移至1.5mL的EP管内，离心(12000g，4℃)20min后，用移液枪缓缓吸出上清液，置于1.5mL的EP管内。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒(PC0020，索莱宝公司)对细胞裂解液和两组外泌体的蛋白浓度进行测定后，通过计算用PBS缓冲液将三组样品稀释到相同浓度，按照蛋白样品：上样缓冲液(5×)为4:1的体积比例将二者充分混合均匀，105℃铁浴中煮沸10min。
(2)电泳：根据配胶试剂盒说明操作，下胶为分离胶，上胶为浓缩胶。加完下胶(分离胶)后使用无水乙醇压平，加完上胶(浓缩胶)尽快插梳子，避免槽中出现气泡(气泡的存在影响样品的电泳)。步骤(1)中煮沸后的蛋白样品拿出冰箱后解冻，再涡旋震荡和瞬离(因为少数水蒸气会凝结在管盖处，影响样品浓度)。上样量根据蛋白浓度选择，浓度高10μl即可，浓度低则30～40μL。上样两侧的样品槽添加彩虹Marker，作为目的蛋白位置参照，上样顺序依次为细胞蛋白、常氧外泌体蛋白和低氧外泌体蛋白。电泳在室温下进行，70mV恒压浓缩，进入分离胶后130mV恒压，电泳至实验需求位置。
(3)电转：备好电转用设备(电转槽、打冰等)和试剂(电转液配置：每1000mL电转液中含100mL 10×电转液、700mL纯水和200mL甲醇)。转膜时，PVDF膜在甲醇中浸泡激活10s以上，胶与膜间不可出现气泡，电转液可提前放入冰中预冷。冰槽中，300mA恒流1h(可根据目的蛋白大小调整时间)；
(4)封闭：从电转槽中取出PVDF膜，浸泡在脱脂牛奶中(5％，100mL加5克奶粉)，封闭1h以上。封闭完的牛奶回收放4℃冰箱，次日用于稀释二抗；
(5)一抗孵育：使用一抗稀释液对一抗(CD63、CD9、TSG101和Calnexin)进行稀释(1:1000，即1mL一抗稀释液加1μL一抗原液)，同时根据目的蛋白条带大小对膜进行裁剪，将裁剪好的条带放入一抗中，4℃摇床慢摇过夜；
(6)二抗孵育：将一抗进行回收，PBST(PBS+0.1％吐温)或TBST(TBS+0.1％吐温)对膜进行漂洗，在摇床上快摇3次，每次10min。然后将膜浸泡在二抗(二抗使用5％脱脂牛奶稀释，比例1:10000)中室温孵育1h；
(7)曝光：配置好发光液，将二抗孵育后的条带放入曝光机(GE公司)中，滴上发光液进行曝光，采集图片。必要时可使用Image J软件对蛋白条带进行灰度值的分析。
采用上述方法对实施例1和对比例1制备得到的外泌体悬液和细胞裂解液中的总蛋白进行检测。
实施例1和对比例1制备得到的外泌体和细胞蛋白的表面特异标记蛋白的表达水平检测的结果如图5所示。
由图5可得，常氧外泌体和低氧外泌体均能够表达外泌体特异标志物CD63、CD9和TSG101，而不能表达Calnexin(Calnexin仅在细胞蛋白中表达)。证实所提取的常氧外泌体和低氧外泌体是外泌体。
4.提取外泌体的总RNA后，使用qRT-PCR检测低氧来源外泌体内miR-17-5p的表达水平。
(1)样品制备：分别取500μL外泌体悬液，其中分别加入200μLTrizol裂解液，涡旋震荡，在室温下静置30min；
(2)RNA沉淀：每个EP管中加入200μL氯仿，剧烈涡旋震荡10s，继续室温静置5min，然后在4℃离心机13000g离心15min。离心后可见液体分层，吸取上层无色透明液相层液体(避免吸到下层粉红色液相层液体)，加入到装有400μL异丙醇的无酶EP管中，轻柔颠倒混匀，室温下静置10min。继续在4℃离心机13000g离心20min。离心完可见白色RNA沉淀(若RNA量少，肉眼会看不见)；
(3)RNA洗涤：小心吸弃上清，加入1mL 75％乙醇(使用DEPC水与无水乙醇配置)，在4℃离心机10000g离心5min。吸弃上清，继续用无水乙醇重复洗涤一遍。离心完吸弃上清，打开EP管盖状态下晾干，使乙醇挥发；
(4)RNA溶解与浓度测定：使用适量DEPC溶解RNA，使用Nanodrop检测RNA浓度、OD260和OD280，在管壁上记录RNA浓度，放入-80℃冰箱保存。
(5)miRNA反转录：根据TakaraPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(D6210A)试剂盒说明获得cDNA；
根据表1配置以下溶液和反转录体系
表1 miRNA反转录体系
试剂 用量
5×primerscript buffer 1μL
RT MixI 2μL
RT primer for U6(U6-R) 0.25μL
RT primer for miRNA(miR-RT) 0.25μL
RNA 400ng
DEPC水 6.5μL
Total volume 10μL
将装有上述混液的pcr管震荡离心后，放入PCR仪中，16℃30min，42℃30min，85℃1min。cDNA可保存于-20℃冰箱；
引物序列如表2所示。
表2反转录引物序列
(6)cDNA进行PCR
PCR反应液体系如表3所示(整个过程在冰上操作)。
表3 PCR反应液体系
试剂 使用量
cDNA 2μL
TB green Premix Ex TaqII 12.5μL
上/下游引物 各1μL
ddH2O 8.5μL
Total volume 25μL
PCR反应条件如表4所示。
表4 PCR反应条件
PCR反应的引物如表5所示。
表5 PCR反应的引物
经过35个循环后，对结果进行相对定量分析。
采用上述方法提取实施例1和对比例1制备得到的外泌体的总RNA后，使用qRT-PCR检测低氧来源外泌体内miR-17-5p的表达水平。
实施例1制备得到的外泌体中miR-17-5p和对比例1制备得到的外泌体中miR-17-5p的丰度如图6所示。
由图6可得，低氧外泌体组中miR-17-5p的相对表达水平达到12.5，而常氧外泌体组miR-17-5p的相对表达水平仅为1.5。低氧外泌体组中miR-17-5p的丰度显著高于常氧外泌体组，说明了低氧诱导能够增加miR-17-5p在外泌体中的含量。
应用例2
外泌体制剂对糖尿病小鼠治疗对照试验
1.糖尿病创面模型建立
取性别、年龄、体重以及生长状态相似的糖尿病基因鼠(db/db鼠)12只，随机分成两组，每组6只。麻醉后进行背部脱毛和消毒铺巾处理，无菌环境下，在小鼠背部制造直径20mm的创面，并使用胶圈进行防挛缩固定。
2.干细胞外泌体对糖尿病创面愈合的治疗
实验共分为PBS对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组。在各组创面模型建立后，PBS对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组每间隔一天在创缘的四周行3、6、9、12点注射法，每处注射12.5μL外泌体悬液，共50μL。其中，常氧外泌体组注射对比例1制备得到的外泌体；低氧外泌体组注射实施例1制备得到的外泌体；PBS对照组注射无菌PBS缓冲液。PBS对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组的注射方法和注射体积相同。
3.创面愈合的评估和外泌体疗效评价
(1)创面愈合评估
对3组小鼠的创面进行拍照，记录每日创面愈合情况，并对破损的胶圈进行替换更新。创面面积愈合率为：(A0-An)/A0×100％，其中A0是造模当天创面面积，An是造模后第n天创面面积。面积通过ImageJ软件计算获取，实验结束后对创面的愈合率进行统计分析和作图。在构建好创面模型后的第3天、第7天和第14天，随机各从3组中取6只小鼠，实施安乐死，沿着创缘周围(距离创缘约1cm)，使用组织剪将创面皮肤完整地(深达肌肉层)裁剪下来，放入4％多聚甲醛固定液中进行固定，以备后续HE染色分析。
其中，对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组在第0天、第3天、第7天和第14天的创面进行拍照，所得图片如图7所示。对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组的创面比例和创面愈合天数的关系如图8和表6所示。
表6对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组的创面比例和创面愈合天数的关系
天数 第0天 第3天 第7天 第10天 第14天 第17天 第21天
对照组1 100 88.36 78.76 46.74 17.14 6.95 1.53
对照组2 100 87.04 76.39 49.52 20.25 7.53 0
对照组3 100 88.19 79.35 44.79 24.26 9.78 1.04
对照组4 100 87.02 80.72 52.42 17.49 5.64 0
对照组5 100 85.94 75.38 44.74 27.59 7.64 0
对照组6 100 87.35 80.99 42.45 23.72 9.75 0
常氧外泌体1 100 86.87 67.04 31.85 6.09 1.75 0
常氧外泌体2 100 81.34 60.73 28.14 10.16 2.92 0
常氧外泌体3 100 85.38 66.31 37.86 9.19 1.96 0
常氧外泌体4 100 84.29 68.16 33.76 8.25 1.64 0
常氧外泌体5 100 87.43 61.33 31.53 5.48 0 0
常氧外泌体6 100 89.57 70.69 36.84 9.68 2.17 0
低氧外泌体1 100 89.55 48.34 19.52 0.26 0 0
低氧外泌体2 100 90.42 46.83 26.74 2.3 0 0
低氧外泌体3 100 87.86 43.16 21.75 1.03 0 0
低氧外泌体4 100 85.63 42.08 23.75 2.11 0 0
低氧外泌体5 100 88.43 40.83 21.67 0.84 0 0
低氧外泌体6 100 90.42 48.48 24.42 0 0 0
由图7和图8、表6可得，对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组自第4到5天开始，三组间的创面愈合率开始出现差异。第7天时，常氧外泌体组和低氧外泌体组创面面积均小于对照组，其中对照组创面比例为78.6±2.3％，常氧外泌体组创面比例为65.7±3.9％，低氧外泌体组创面比例为44.9±3.3％。到第14天，对照组还留有不小的创面，而常氧外泌体处理组和低氧外泌体处理组的创面都接近完全愈合，其中对照组创面比例为21.7±4.1％，常氧外泌体组创面比例为8.1±1.9％，低氧外泌体组创面比例为1.1±0.9％。这些结果说明无论常氧还是低氧诱导下的外泌体均能够促进创面的愈合，但是低氧外泌体相比常氧外泌体能够更快的缩小创面面积。
(2)HE染色评估
组织脱水：将第7天和第14天的创面组织块从固定液中取出，在流水中冲洗30min，将组织块按顺序依次放入75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和无水乙醇中脱水，最后放入二甲苯溶液中，将组织中的酒精脱去。
石蜡包埋切片：将组织块按创面朝上的顺序摆放在融化的石蜡中进行包埋，石蜡冷却凝固后，使用切片机对组织块进行切片，厚度5μm。将切下来的薄片轻柔平铺在温水上，用载玻片***薄片所在水面下，轻轻抬起载玻片，让薄片平展地贴在载玻片上，用铅笔在玻片上做好分组标记；
脱蜡：将石蜡切片放置在烤片机中烘烤2小时，使石蜡软化。随后将石蜡切片先后浸在二甲苯(I)和二甲苯(II)中，室温静置10分钟。再依次放入无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇和75％乙醇中，每次静置2分钟，最后在清水中浸泡2分钟；
染色：将脱蜡后的切片浸泡在苏木精溶液中，20分钟后用纯水清洗3遍，再在1％盐酸乙醇中分化10秒，分化完成后置于5％氨溶液中蘸浸3秒进行返蓝，再用纯水清洗3遍。最后浸泡于伊红染色液中，室温静置5分钟后用纯水漂洗3遍；
脱水、透明和封片：使用低到高浓度梯度的乙醇对切片进行脱水，然后浸泡于二甲苯中，持续2分钟，使切片透明化，最后将适量中性树胶滴在载玻片的组织切片处，压上盖玻片进行封片，使用显微镜(Olympus)对其进行观察拍照和分析。
对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组第7天和第14天创面组织HE染色结果如图9所示；对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组第7天和第14天创面组织创缘间距比例如图10和表7所示。
表7对照组、常氧外泌体组和低氧外泌体组第7天和第14天创面组织创缘间距比例
对所收集创面组织行HE染色，实验结果发现当使用常氧外泌体或低氧外泌体处理创面后，相比对照组均能够显著促进糖尿病创面的上皮化，让创缘新生皮肤组织更快的向创面中心覆盖聚拢，缩小创缘间距，同时能观察到更多的皮肤附属器如皮脂腺和毛囊等的再生(图9)。而且低氧外泌体的促上皮化作用优于常氧外泌体，能够更好的加快创缘新生皮肤组织向中心迁移，缩短创缘间距，从而增加创面的愈合速度，提高组织再生质量(图10)。
综上，本发明提供的低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法制备得到的人脐带间充质干细胞外泌体应用于糖尿病小鼠创面，不仅在愈合速度上更具有优势，同时在刺激皮肤附属器再生和提升愈合质量方面具有更大应用潜力。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将人脐带间充质干细胞在低氧环境中进行培养，得到细胞培养液；所述低氧环境的氧气体积百分含量为0.5％～1.5％；
对所述细胞培养液进行外泌体的提取，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养用的培养基包括高糖DMEM培养基；所述高糖DMEM培养基中含有5％～10％的无外泌体血清。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述培养的时间为36～48h；所述培养的温度为37℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提取的步骤包括：
将细胞培养液进行低速离心，取上清得到第一悬浮液；
将所述第一悬浮液进行中速离心，取上清得到第二悬浮液；
将所述第二悬浮液过滤后，进行高速离心，取沉淀进行重悬，再次进行高速离心后再次重悬，得到低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体悬液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述低速离心的转速为1000～2000g；所述低速离心的时间为5～10min；
所述中速离心的转速为10,000～20,000g；所述中速离心的时间为20～30min；
所述高速离心的转速为100,000～200,000g；所述高速离心的时间为60～90min。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述过滤用滤膜的孔径为0.22μm；所述重悬的试剂包括无菌PBS缓冲液；所述无菌PBS缓冲液的pH为7.2～7.4。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞包括传代2～4次得到的人脐带间充质干细胞。
8.权利要求1～7任一项所述制备方法制备得到的低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体。
9.权利要求8所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体制备miR-17-5p高表达的试剂。
10.权利要求8所述低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进糖尿病创面愈合药物中的应用。
CN202310348957.4A 2023-04-04 2023-04-04 一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用 Pending CN116496983A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310348957.4A CN116496983A (zh) 2023-04-04 2023-04-04 一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310348957.4A CN116496983A (zh) 2023-04-04 2023-04-04 一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116496983A true CN116496983A (zh) 2023-07-28

Family

ID=87325733

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310348957.4A Pending CN116496983A (zh) 2023-04-04 2023-04-04 一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116496983A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150125950A1 (en) * 2012-05-18 2015-05-07 Agency For Science, Technology And Research (A*Sta (A*Star) Umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes
CN109414459A (zh) * 2016-03-24 2019-03-01 斯坦姆实验室 源自脐带血的外泌体用于组织修复的用途
CN115125198A (zh) * 2022-07-11 2022-09-30 湖北沃德利派生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
CN115651901A (zh) * 2022-12-07 2023-01-31 北京泓凯生物科技有限公司 一种脐带来源间充质干细胞外泌体的制备方法、制备的外泌体及应用
CN116515762A (zh) * 2023-04-04 2023-08-01 中国人民解放军总医院 一种促进糖尿病创面愈合的工程化改造外泌体及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150125950A1 (en) * 2012-05-18 2015-05-07 Agency For Science, Technology And Research (A*Sta (A*Star) Umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes
CN109414459A (zh) * 2016-03-24 2019-03-01 斯坦姆实验室 源自脐带血的外泌体用于组织修复的用途
CN115125198A (zh) * 2022-07-11 2022-09-30 湖北沃德利派生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
CN115651901A (zh) * 2022-12-07 2023-01-31 北京泓凯生物科技有限公司 一种脐带来源间充质干细胞外泌体的制备方法、制备的外泌体及应用
CN116515762A (zh) * 2023-04-04 2023-08-01 中国人民解放军总医院 一种促进糖尿病创面愈合的工程化改造外泌体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHI-MIN ZHOU: ""Small extracellular vesicles from hypoxic mesenchymal stem cells alleviate intervertebral disc degeneration by delivering miR-17-5p"", 《ACTA BIOMATERIALIA》, vol. 140, pages 642 *
陈三 等: ""预处理来源外泌体在细胞增殖分化及凋亡中的作用"", 《中国组织工程研究》, vol. 27, no. 19 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107245472B (zh) 一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法、使用方法
CN106676065B (zh) 一种脂肪组织来源外泌体胶及制备方法及应用
CN104490931B (zh) 人脐带间质干细胞分泌的exosome治疗皮肤损伤的应用
LU500561A1 (en) In vitro construction method and use of liver organoids
CN111394314B (zh) 一种肠癌类器官的培养基及培养方法
CN111826340B (zh) 一种抗皮肤衰老的鹿茸干细胞外泌体的制备方法及其应用
CN113943705B (zh) 一种凋亡微囊泡及其制备方法和应用
CN106913583A (zh) 人间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法及应用
CN109136174B (zh) 一种延缓衰老的干细胞来源外泌体制剂
WO2016154082A2 (en) Methods of primary tissue culture and drug screening using autologous serum and fluids
CN111484969B (zh) 毛囊干细胞来源外泌体在促进毛囊干细胞增殖以及向毛囊细胞分化中的用途
CN113388575A (zh) 一种皮肤损伤修复用间充质干细胞外泌体的制备方法
CN112587720A (zh) 一种cgf和脐带间充质干细胞外泌体混合物、制备及应用
CN116904394A (zh) 一种抗炎性间充质干细胞来源外泌体的制备方法及其应用
CN116496983A (zh) 一种低氧诱导的人脐带间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
NL2034093B1 (en) Method for separating exosomes from apostichopus japonicus body fluid sample
CN116515762A (zh) 一种促进糖尿病创面愈合的工程化改造外泌体及其制备方法和应用
CN113209312B (zh) 一种抑制转录因子mef2c表达的试剂在制备治疗瘢痕疙瘩的药物中的应用
CN114964966A (zh) 一种血液样本分离和冻存的方法
CN115161282A (zh) 一种小鼠脑微血管内皮细胞与周细胞联合提取培养方法
CN114736855A (zh) 一种干细胞外泌体高纯度提取方法
EP3878512A1 (en) Transplant and use thereof
CN113943700B (zh) 一种牛血清外泌体用于干细胞培养的方法
CN113750117B (zh) 从吸脂废液中制备的脂肪组织精华、其制备方法和应用
CN116814529A (zh) 一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination