CN116496397B

CN116496397B - 靶向cd19 car-t细胞人源化抗体

Info

Publication number: CN116496397B
Application number: CN202310346252.9A
Authority: CN
Inventors: 吴国祥; 梅双; 臧超琦; 王文靓; 吴莉莉; 李春莲
Original assignee: Keyi Zhejiang Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Keyi Zhejiang Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2023-04-03
Filing date: 2023-04-03
Publication date: 2024-03-01
Anticipated expiration: 2043-04-03
Also published as: CN116496397A

Abstract

本发明涉及靶向CD19CAR‑T细胞人源化抗体。该嵌合抗原受体包括信号肽、靶向CD19的单链可变区片段、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域。本发明提供的靶向CD19人源化抗体能够高特异性地结合CD19抗原，具有较高的亲和力和生物活性，以及低的免疫原性，结构稳定，成药性良好，对CD19阳性肿瘤细胞具有显著的杀伤效果。

Description

靶向CD19 CAR-T细胞人源化抗体

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及靶向CD19 CAR-T细胞人源化抗体。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。过继性细胞免疫治疗(adoptive celltherapy，ACT)，是将具有抗肿瘤活性的免疫细胞输注给癌症患者,是一种高度个体化的癌症治疗新手段，而早期的细胞免疫疗法往往依赖于T细胞自身的表面相容性抗原，限制了其治疗范围。

为了解决这一问题，嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor gene-modifiedT cell，CAR-T)技术应运而生。CAR-T细胞是将融合有CAR基因的核酸导入到自体或异体T淋巴细胞基因组中构建而成，抗原结合域用于识别目标肿瘤细胞，通常采用靶向肿瘤抗原抗体的scFv区，它包括抗体的轻链可变区(light chainvariable，VL)和重链可变区(heavy chain variable，VH)，并且二者之间采用Linker连接。

CD19是B细胞表达的一种CD分子(即白细胞分化抗原)。除浆细胞外的所有B细胞系，恶性B细胞与FDC(滤泡树突状细胞)都会表达该分子。它是参与B细胞增殖、分化、活化及抗体产生的重要膜抗原，还可促进BCR的信号转导。CD19在B细胞活化以及信号传导中起协同受体作用，调节B细胞活化及增殖，参与B细胞的信号传导功能，并介导T细胞对靶细胞杀伤。

B细胞恶性肿瘤主要包括多种类型的白血病和淋巴瘤，目前除了少数接受异体造血干细胞移植的病人，大多数成年慢性淋巴细胞白血病和套淋巴细胞瘤患者无法被目前临床上常用的治疗手段治愈，因此新的治疗方法尤其是生物免疫治疗的开发对于B细胞恶性肿瘤极其重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向CD19的人源化抗体。

本发明的另一目的是提供靶向CD19的人源化抗体的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种靶向CD19的抗体的重链可变区，所述重链可变区选自下组：

(1a)氨基酸序列如SEQ ID NO:4、5、2或3所示的重链可变区；

(1b)将SEQ ID NO:4、5、2或3所示的氨基酸序列经过至少一个(如1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸残基的取代、缺失、修饰和/或添加而形成的，且具有(1a)所述重链可变区功能的重链可变区。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：4、5、2或3所示。

在本发明的第二方面，提供了一种靶向CD19的抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区。

在另一优选例中，所述抗体的重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。

在本发明的第三方面，提供了一种靶向CD19的抗体的轻链可变区，所述轻链可变区选自下组：

(2a)氨基酸序列如SEQ ID NO:7、8、9或10所示的轻链可变区；

(2b)将SEQ ID NO:7、8、9或10所示的氨基酸序列经过至少一个(如1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸残基的取代、缺失、修饰和/或添加而形成的，且具有(1a)所述轻链可变区功能的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:7、8、9或10所示。

在本发明的第四方面，提供了一种靶向CD19的抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体的轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。

在本发明的第五方面，提供了一种靶向CD19的抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述抗体包括单链抗体(scfv)或双链抗体。

在另一优选例中，所述的单链抗体依次包括轻链可变区、接头和重链可变区，或依次包括重链可变区、接头和轻链可变区。

在另一优选例中，所述的接头为(G4S)n，其中n为1-5的整数。

在另一优选例中，所述接头的序列如SEQ ID NO:19所示。

在另一优选例中，所述的抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；且所述的抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或

所述的抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；和所述的抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的单链抗体的序列如SEQ ID NO:12或13所示。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体包括单特异性、双特异性、或三特异性抗体。

在另一优选例中，所述抗体为人源化抗体。

在本发明的第六方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，所述嵌合抗原受体融合蛋白从N端到C端包含：

(i)如本发明第五方面所述的抗体，

(ii)跨膜结构域，

(iii)至少一个共刺激结构域，和

(iv)激活结构域。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体融合蛋白具有下式I所示结构：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

scFv为如本发明第五方面所述的抗体；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

L为任选的信号肽序列。

在另一优选例中，所述的scFv包含如SEQ ID NO.12或13所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的H为选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述的H包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD8、CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，所述的TM包括CD8来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述的TM包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

在另一优选例中，所述的C包括4-1BB来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述的C包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的CD3ζ包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的L的信号肽为CD8。

在另一优选例中，所述的L包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在本发明的第七方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；以及；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

在本发明的第八方面，提供了一种抗体药物偶联物，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)如本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的CAR融合蛋白；以及

(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

在本发明的第九方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明第六方面所述的嵌合抗原受体融合蛋白；

(3)如本发明第七方面所述的重组蛋白。

在本发明的第十方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第九方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

在本发明的第十一方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第十方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第九方面所述的多核苷酸、或表达如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的CAR融合蛋白。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞或NK细胞，较佳地为(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在本发明的第十二方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第六方面所述的CAR融合蛋白，包括以下步骤：将本发明第九方面所述的核酸分子或本发明第十方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

在本发明的第十三方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的CAR融合蛋白、或本发明第十方面所述的载体、或本发明第十一方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在本发明的第十四方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、或本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的CAR融合蛋白、或本发明第十一方面所述的细胞的用途，用于制备预防和/或治疗CD19相关的癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述CD19相关的癌症或肿瘤为实体瘤。

在另一优选例中，所述CD19相关的癌症或肿瘤选自下组：B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。

在本发明的第十五方面，提供了一种用于制备如本发明第十一方面所述细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于所述容器内的本发明第九方面所述的核酸分子、或本发明第十方面所述的载体。

在本发明的第十六方面，提供了一种治疗与CD19分子相关的病症的方法，包括给需要治疗的对象施用适当的本发明第八方面所述的细胞、或本发明第十三方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述CD19相关的癌症或肿瘤为实体瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A-1E为鼠源CD19抗体人源化后不同VL-Linker-VH蛋白组合的ELISA bindingEC50及FACS binding检测。

图2为人源化后SEQ ID NO:13(KQ-1-1)和SEQ ID NO:12(KQ-1-2)序列的蛋白平衡解离常数(KD值)检测。

图3为T在病毒感染CD19-CAR慢病毒后第8天、11天检测CD19-CAR-T后的阳性率的变化。

图4为人源化后的KQ-1-1，KQ-1-2和人源化之前CD19(FMC63)-CART WT对H929-CD19-Luc细胞在效靶比为2:1和1:2时的杀伤结果。

图5为人源化后的KQ-1-1，KQ-1-2和人源化之前CD19(FMC63)-CART WT对H929-CD19-Luc细胞和K562细胞在效靶比为1:1时候的白介素2的释放水平。

图6为为人源化后的KQ-1-1，KQ-1-2和人源化之前CD19(FMC63)-CART WT对H929-CD19-Luc细胞和K562细胞在效靶比为1:1时候的干扰素γ的释放水平。

图7为CAR-T细胞经过2轮H929-CD19肿瘤细胞刺激后CAR-T细胞体外增殖情况。

图8为KQ-1-1-CAR结构质粒图谱。

图9为KQ-1-2-CAR结构质粒图谱。

图10为CD19-CAR结构模式图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地获得了高特异性和高亲和力的CD19人源化抗体。实验表明，本发明的CD19人源化抗体可以延长CAR-T细胞存续时间，降低由CD19抗原抗体产生的免疫反应，提升CD19-CAR-T的疗效。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。

CD19

CD19是B细胞表达的一种CD分子(即白细胞分化抗原)，属于Ig超家族。除浆细胞外的所有B细胞系，恶性B细胞与FDC都会表达该分子。它是参与B细胞增殖、分化、活化及抗体产生的重要膜抗原，还可促进BCR的信号转导。

嵌合抗原受体(CAR)

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域、与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域起作用的任何寡肽或多肽。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。

如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。较佳地，接头为柔性接头，例如，所述接头为(G4S)n，其中n为1-4。

本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与41BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原CD19的抗体，较佳地为单链抗体。

在本发明中，本发明的scFv还包括其保守性变异体，指与本发明scFv的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。

载体

本发明还提供了编码本发明CAR序列的DNA构建物。

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中***本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的***，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递***的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因***载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒***在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因。合适的表达***是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因***哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散***，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体***为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递***的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在使用非病毒递送***的情况下，示例性地使用基因组编辑技术来完成本发明，例如CRISPR-Cas9、ZFN或TALEN。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

DNA构建物进一步包含信号肽编码序列。优选地，该信号肽序列连接在抗原结合结构域的核酸序列上游。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞。转导的T细胞可以诱导CAR介导的T细胞反应。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞经基因修饰以表达本发明的CAR，并且将CAR-T细胞输注给需要的受体。输注的细胞能够杀死受体体内的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括抗CD19 scFv、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可被治疗的适应疾病包括CD19相关的癌症或肿瘤，例如CD19阳性肿瘤或癌症。CD19相关的癌症或肿瘤可以包括实体瘤，特别是肝细胞癌、黑素瘤、卵巢癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌或其组合。

用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常，如本文所述的激活和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR修饰的T细胞用于CCL的治疗。在某些实施方案中，本发明的细胞用于治疗有患CCL风险的患者。因此，本发明提供治疗或预防CCL的方法，包括向需要的受试者施用治疗有效量的本发明的CAR修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，***或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，GC76BBζ细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的靶向CD19人源化抗体能够高特异性地结合CD19抗原，具有较高的亲和力和生物活性，结构稳定，对CD19阳性肿瘤细胞具有显著的杀伤效果，提高CD19-CAR-T的治疗效果。

(b)本发明采用CD19人源化抗体，低的免疫原性，降低由CD19抗原抗体产生的免疫反应，减低排斥反应，可以延长CAR-T细胞存续时间，提升CD19-CAR-T的疗效。

(c)本发明采用CD19人源化高亲和力抗体，成药性良好，可以降低CAR-T细胞回输量，降低细胞因子释放等副作用的发生，提高安全性。

(d)本发明可以显著地增加CAR-T细胞释放体内所必须的细胞因子，保持CAR-T细胞在体内持续扩增，进一步提高治疗效果。

(e)本发明产品，降低CAR-T细胞回输量，缩短CAR-T细胞生产制备时间，缩短病患等待时间。

(f)本发明产品，降低CAR-T细胞回输量，缩短CAR-T细胞生产制备时间，降低生产成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1CD19人源化

将鼠源CD19抗体序列(SEQ IN NO:11)委托上海佑众生物技术有限公司进行人源化，其中VL人源化后序列如SEQ ID NO:7-10所示，VH人源化后序列如SEQ ID NO:2-5所示。将人源化后的抗体序列组合表达，并检测重组后的CD19抗体与CD19抗原的结合能力。

结果：如图1A-1E所示，人源化后的CD19抗体的ELISA binding实验检测结果发现序列为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13的人源化CD19抗体与亲本鼠源CD19抗体SEQ ID NO:11的EC50相当，抗体的亲和力没有显著降低。进一步的将SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和亲本SEQ ID NO:11序列蛋白检测KD值，结果显示亲和力与亲本相当。

实施例2CD19-CAR质粒构建

本实例选择人源化后的序列SEQ ID NO:12、序列SEQ ID NO:13，分别同序列SEQID NO:14～19组合，排列顺序如图8，图9所示，并命名为KQ-1-2和KQ-1-1，人源化前的序列SEQ ID NO:11组合后命名为CD19(FMC63)-CART WT。由苏州金唯智生物科技有限公司完成KQ-1-1-CART，KQ-1-2-CART和CD19(FMC63)-CART WT序列合成及慢病毒载体质粒制备。CD19-CART质粒结构如图10所示。

实施例3T细胞激活

打开水浴锅，设置温度为37℃。从液氮灌中取出冻存的PBMC，迅速放入水浴锅中并快速晃动，在1min内使细胞溶液完全溶解；取1支15ml离心管，加入5ml 1×PBS，将细胞冻存悬液加入离心管，1500rpm离心3min；用5ml 1×PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，重复洗涤一次；用3ml X-VIVO-15培养基(X-VIVO-15+5％ FBS+1％ P/S+200IU/ml IL-2)重悬细胞，用Count Star细胞计数仪器计数。计算所需的磁珠用量(磁珠：T细胞＝2:1)，取600μl激活磁珠于1.5ml EP管中并放置于磁力架上。待磁珠全部被磁力吸附，吸走溶剂，加入1ml1×PBS，离开磁力架将磁珠混匀，混匀后再次放于磁力架上，如此重复洗涤3次。将T细胞稀释到2e6个/ml，将洗涤好的磁珠加入T细胞中吹打混匀。取12孔板，每孔加入500μl混合液，T细胞铺板密度为1e6个/ml。每孔继续加入500μl培养基，轻轻摇晃12孔板，使溶液混合均匀，37℃，5％CO2培养24小时。

实验例4病毒感染

取出前一天铺好细胞的12孔板，每孔加入5μl促感试剂Polybrene(工作浓度：5μg/ml)；根据病毒滴度以及MOI＝3计算使用病毒量，设置一个对照孔(不加病毒)，每孔对应加入所需的KQ-1-1-CAR,KQ-1-2-CAR和CD19(FMC63)-CART WT病毒；每孔依次混匀，用锡箔纸包裹住12孔板避光，500g离心30min。将离心好的12孔板放入37℃，5％CO2孵育；孵育24h后，每孔更换培养液，加入新鲜培养液体积为2ml；每隔48～72h用完全培养基(培养基成分：X-VIVO-15+5％FBS+1％P/S+200U/ml IL-2)进行传代换液，CAR-T细胞传代培养密度保持在5e5个/ml～1e6个/ml；分别在培养day5、day7、day9、day12，收集CAR T细胞，用细胞计数仪计数。

实验例5CAR-T阳性率检测

取培养第7天收集CAR-T细胞，用细胞计数仪计数，计算CAR-T细胞生长速度；每孔各取200μL CAR-T细胞至1.5ml EP管中，加入1ml 1×PBS混合，1500rpm离心5min；弃上清，用100μL 1×PBS重悬，每管分别加入抗体，4℃避光孵育30min；加入1ml 1×PBS清洗细胞，1500rpm离心5min，弃上清，加入200μL1×PBS重悬，流式细胞仪上机检测。

结果如图3所示。人源化后的KQ-1-2和KQ-1-2制备CAR-T细胞，在第5天，第8天，第12天和第15天检测CAR阳性率。如图3所示，KQ-1-2分别为44.58％、36.45％、34.50％和39.60％。KQ-2-2分别为48.58％、44.40％、39.06％和35.95％。证明人源化后的KQ-2-1和KQ-2-2表现出优秀的T细胞转染效率和稳定性CAR阳性率，没有受到细胞培养时间的影响。转导CAR的T细胞扩增能力依然优秀。

实验例6CAR-T细胞因子释放能力检测

1、效应细胞处理

取未转导T细胞、KQ-1-1-CART、KQ-1-2-CART、CD19(FMC63)-CART WT细胞分别置于15ml离心管中，各加入5ml 1×PBS，1500rpm离心3min；用5ml1×PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；重复上一步骤，洗涤两次；用3ml含1％FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count Star计数仪计数，调整细胞密度为1e6个/ml，备用。

2、靶细胞准备

收集生长状态良好的靶细胞和非靶细胞于15ml离心管中，1000rpm离心3min，弃上清；用稀释缓冲液1×PBS将细胞洗涤两次，1000rpm离心3min，弃上清；以含1％ FBS的X-VIVO-15重悬细胞，用Count Star计数并检测细胞活率，将细胞稀释到1e6个/ml浓度，备用。

3、效靶细胞混合

将处理好的效应细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养：将100μL靶细胞和100μLCAR-T细胞1:1混合加入96孔板中；按照CAR-T细胞：靶细胞为1:1共培养(每个样品2个重复)，放入37℃、5％ CO2培养箱中共同培养20～24小时；取适量1.5ml EP管，每管分别加入50μL各组相应的细胞共培养上清，1000rpm离心5min，收集30μL上清检测细胞因子释放情况。

4、细胞因子检测

按照CBA检测试剂盒说明书要求，确定好需要检测的细胞因子及样品个数，准备捕获珠：取出待检测的细胞因子捕获珠瓶，用力混匀，每种珠子取出(待检测样品数+阴性对照数)x10μl/6的捕获珠子量，并将每种珠子进行涡轮震荡混匀；取n个1.5ml EP管(n＝样品数+对照数)向每管(样品、阴性对照)中加入10μl混合珠子；向各管中加入相应待测试剂(样品、对照)10μl；向各管中加入10μl PE检测试剂，充分混合均匀后，避光室温孵育3小时；孵育结束后，每个样品加入500μl洗涤缓冲液，充分混匀后，500g离心5min，弃上清；用200μl洗涤缓冲液重悬，500g离心5min洗涤，弃上清，用150μl洗涤缓冲液悬样品；流式上机检测。

结果如图5和图6所示。如图5所示，当CAR-T细胞与肿瘤细胞H929-CD19孵育后，有足够的IL-2细胞因子产生，说明CAR-T细胞和肿瘤细胞之间发生充分的免疫反应。与阳性对照FMC-63CAR-T比较，人源化后的KQ-1-1和KQ-1-2CAR-T细胞产生释放的IL-2更多。IL-2是CAR-T细胞在体内持续扩增所必须的，说明人源化后的KQ-1-1和KQ-1-2CAR-T细胞持续扩增的能力会更优秀。

如图6所示，当CAR-T细胞与肿瘤细胞H929-CD19孵育后，有明显释放IFN-γ的能力。IFN-γ是CAR-T细胞实现清除肿瘤细胞所必须的细胞因子，证实人源化后的KQ-1-1和KQ-1-2CAR-T细胞可以通过IFN-γ有效地清除肿瘤细胞。

实验例7CAR-T细胞杀伤能力检测

1.效应细胞准备

取未转导T细胞、KQ-1-1-CART、KQ-1-2-CART、CD19(FMC63)-CART WT细胞分别置于15ml离心管中，各加入5ml 1×PBS，1500rpm离心3min；用5ml1×PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；重复步骤(2)，洗涤两次；用3ml含1％FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count star计数，调整CAR-T细胞密度为4e5个/ml、1e5个/ml,效靶比为2:1、1:2(根据CAR-T阳性细胞来计算)，备用。

2.靶细胞准备

收集生长状态良好的靶细胞H929-CD19-Luc于15ml离心管中，1000rpm离心3min，弃上清；用稀释缓冲液1×PBS将细胞洗涤两次，1000rpm离心3min，弃上清；以含1％ FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count star细胞计数仪计数并检测细胞活率，最终将细胞密度稀释到2e5个/ml，备用。

3.效靶细胞混合

将处理好的效应细胞分别与靶细胞和非靶细胞共培养：将50μL靶细胞和50μLCAR-T细胞混合加入96孔板中；37℃5％CO2共同培养18小时；培养结束后，每孔加入100μlONE-Glo TM luciferase Assay System检测底物，混匀后，静置5min。TECAN酶标仪上机检测(波长560nm)。

根据OD值计算杀伤率。

结果：如图4所示，人源化CD19 CAR-T细胞和FMC63-CART都有明显的杀伤能力。在效靶比E:T＝1：1的情况下，显示人源化后的KQ-1-1和KQ-1-2细胞的细胞杀伤能力优于FMC63-CART细胞。当效靶比E:T＝1：2时，即CAR-T细胞应对双倍的肿瘤细胞时，人源化后的KQ-1-1和KQ-1-2细胞的细胞杀伤能力要明显优于FMC63-CART细胞，说明人源化后的KQ-1-1和KQ-1-2细胞更有效清除大量的肿瘤细胞。

实验例8CAR-T细胞靶向增殖

1、效应细胞准备

取未转导T细胞、KQ-1-1-CART、KQ-1-2-CART、CD19(FMC63)-CART WT细胞分别置于15ml离心管中，各加入5ml 1×PBS，1500rpm离心3min；用5ml1×PBS重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清；重复步骤(2)，洗涤两次；用3ml含1％FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count star计数；调整细胞密度为2e5个/ml,效靶比为1:1(根据CAR-T阳性细胞来计算)，备用。

2、靶细胞准备

收集生长状态良好的靶细胞于15ml离心管中，1000rpm离心3min，弃上清；用稀释缓冲液1×PBS将细胞洗涤两次，1000rpm离心3min，弃上清；以含1％ FBS的X-VIVO-15培养基重悬细胞，用Count star细胞计数仪计数并检测细胞活率，最终将细胞密度稀释到2e5个/ml浓度，备用。

3、效应细胞与靶细胞共培养

将处理好的效应细胞和靶细胞，按上述设置的效靶比加入12孔板中，每孔加入500μl靶细胞和500μl CAR-T细胞；加样完成后，轻轻摇晃12孔板，使细胞混合均匀；细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养；

4、多轮肿瘤细胞刺激增殖

细胞共培养3～4天，待肿瘤细胞裂解完全后，分别收获CAR-T细胞，500g离心5min，细胞重悬于1ml含1％ FBS的X-VIVO-15培养基，对CAR-T细胞计数；取500μl重悬后的CAR-T细胞，与1e5个肿瘤细胞共培养进行第二轮刺激增殖，最后观察残存的肿瘤细胞并统计CAR-T细胞最终增殖倍数。

结果如图7所示。在与肿瘤细胞第一次共培养之后，KQ-1-1和KQ-1-2CART细胞和FMC63-CART细胞的扩增能力类似，说明其具有优秀的清除肿瘤细胞能力和持续扩增能力。

在与肿瘤细胞第二次共培养之后，KQ-1-1和KQ-1-2CART细胞体外增殖能力明显优于FMC63-CART细胞。这和图5中KQ-1-1和KQ-1-2CART细胞可以释放更多的IL-2细胞因子前后印证，说明KQ-1-1和KQ-1-2CART细胞具有持久的细胞扩增能力，其CAR-T细胞在清除肿瘤细胞的同时依然拥有良好的增值能力，说明其具备持久杀伤肿瘤细胞的能力。

序列表

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种靶向CD19的抗体，所述抗体具有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4或5所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单链抗体。

3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的序列如SEQ ID NO:12或13所示。

4.一种嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗原受体融合蛋白从N端到C端包含：

(i)如权利要求2所述的抗体，

(ii)跨膜结构域，

(iii)至少一个共刺激结构域，和

(iv)激活结构域。

5.如权利要求4所述的嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO.12或13所示。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的抗体；以及；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

7.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述的抗体药物偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的抗体、权利要求4所述的CAR融合蛋白；以及

8.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)如权利要求1所述的抗体；或

(2)如权利要求4所述的嵌合抗原受体融合蛋白；

(3)如权利要求6所述的重组蛋白。

9.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求8所述的多核苷酸。

10.一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有权利要求9所述的载体或基因组中整合有如权利要求8所述的多核苷酸、或表达如权利要求1所述的抗体或如权利要求4所述的CAR融合蛋白。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为工程化的免疫细胞。

12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞为T细胞或NK细胞。

13.一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达如权利要求4所述的CAR融合蛋白，包括以下步骤：将如权利要求8所述的核酸分子或如权利要求9所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

14.一种制剂，所述制剂含有如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的CAR融合蛋白、或如权利要求9所述的载体、或如权利要求10所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

15.如权利要求1所述的抗体、如权利要求4所述的CAR融合蛋白、或如权利要求10所述的宿主细胞的用途，用于制备预防和/或治疗CD19相关的癌症或肿瘤的药物，所述癌症或肿瘤选自下组：B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、多发性骨髓瘤。