CN116482367A - 一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法。所述检测方法联合mSEPT9检测进行,通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,并从差异蛋白中寻找结直肠癌筛查分子标志物,将结直肠癌筛查分子标志物与mSEPT9检测进行结直肠癌联合检测,根据联合检测检出结直肠癌患者。该检测方法通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,寻找包括CLNS1A、EPDR1和RPL15在内的生物标志物,并与mSEPT9检测进行联合检测,可显著提高结直肠癌患者检出的特异度和敏感度。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别是一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法。
背景技术
结直肠癌(CRC)的发生发展大多遵循“腺瘤-癌”序列,从癌前病变进展到癌一般需要5-10年时间,早发现、早诊断和早治疗可有效降低CRC发病率与死亡率,给患者带来明显好处。此外,流行病学调查表明,结直肠癌的预后与诊断分期紧密相关,I期结直肠癌的5年相对生存率超90%,而发生远期转移的IV期结直肠癌,5年相对生存率在15%以下;美国自1980年左右接受肠镜筛查的人口逐渐增加,起初受筛查影响更多病人被发现,结直肠癌发病率有所提高,但之后美国结直肠癌发病率与死亡率显著下降,因此进行CRC早筛对人民健康福祉十分重要。但由于经济、时间、宗教信仰等因素,许多患者对肠镜筛查的依从性较差,肿瘤标志物如CEA等的升高对CRC虽然有一定的提示作用,但其低特异度均可能会给患者带来严重的精神及经济负担甚至损害患者健康,导致许多患者尤其是肠镜筛查依从性差的人群发现CRC时往往都是晚期,因此寻找能保证高特异度的同时较前提高灵敏度的诊断试验对结肠癌患者早期诊断及生存时间延长很有意义。
Septin9与CRC发生密切相关,在癌组织中呈高度甲基化,是CRC发生发展过程中重要的分子特征。Septin9甲基化(mSEPT9)检测CRC具有高敏感性和特异性。一项在中国北方四家医院进行到针对中国人mSEPT9试验机会性筛查(有症状高危人群)的RESEPT研究指出mSEPT9试验的敏感性为76.6%,特异性为95.9%,且在Ⅰ期和Ⅱ期CRC患者敏感性64.9%和72.7%,证明mSEPT9适用于定期肠镜筛查依从性差的CRC一般风险及高危人群的筛查。此外还有大量研究表明Septin9单独或与其他指标与联合运用与结直肠癌的组织分级、分化程度、临床分期、治疗预后相关,可用来指导CRC分期,作为肿瘤进展及治疗效果的标志物,癌前病变的筛查等,市场前景广阔。但mSERP9受人种、年龄、昼夜节律和诸如糖尿病、关节炎等其他疾病诸多因素影响,随着患者年龄增加,mSERP9的灵敏度、特异度均降低,这对随着年龄增加患病率逐步上升的CRC的临床应用有影响,限制了其进一步推广运用。因此应寻找方法改进mSEPT9的诊断试验以提高其灵敏度及特异度。
理论上,诊断试验的灵敏度和特异度是相悖的。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题,提供一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,该检测方法通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,寻找包括CLNS1A、EPDR1和RPL15在内的生物标志物,并与mSEPT9检测进行联合检测,可显著提高结直肠癌患者检出的特异度和敏感度。
Septin9基因是一个抑癌基因,位于17q25.3,含有17个外显子,Septin9蛋白有多个亚型,如SEPT9-v1、v2、v3、v4,与染色体分离、DNA修复、迁移、凋亡等细胞功能有关。
甲基化SEPT9(mSEPT9)检测作为结直肠癌(CRC)筛查或疾病早期发现的检测手段已获FDA、欧盟和CFDA批准。目前院内对CRC高危人群筛查多采用粪便免疫化学试验(FIT)和mSEPT9试验。一些初步研究提示mSEPT9检测还可以检测肝细胞癌(HCC),表明mSEPT9具有检测其他消化***肿瘤的潜力。
为了解决上述现有技术问题,本发明的技术方案如下:
一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,所述检测方法联合mSEPT9检测进行,通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,并从差异蛋白中寻找结直肠癌筛查分子标志物,将结直肠癌筛查分子标志物与mSEPT9检测进行结直肠癌联合检测,根据联合检测检出结直肠癌患者;
所述结直肠癌筛查分子标志物包括CLNS1A、EPDR1、RPL15在内的一种或多种生物标志物;
所述联合检测包括平行试验和系列试验,平行试验是同时做若干个试验,只要有一个试验阳性,即判定为阳性,平行试验能增加灵敏度,系列试验为依次相继的若干个试验,需要所有试验阳性才可作出阳性判定,系列试验能增加特异度;
所述检测方法包括检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15表达水平的试剂在制备诊断结直肠癌或评估结直肠癌治疗疗效的产品中的应用方法,所述试剂包括检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的mRNA表达水平的试剂、检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的蛋白表达水平的试剂、检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达程度的试剂;
所述评估结直肠癌治疗疗效是指评估受试者对某种治疗方法或治疗药物的疗效,在本发明的具体实施方案中,主要是指CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15对mSEPT9检测阳性或阴性的癌及癌旁正常组织的诊断,进一步评估得出受试者对某种治疗方法或治疗药物的疗效,具有较好的临床应用前景。
进一步,所述检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的mRNA表达水平的试剂包括特异性扩增CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的引物、特异性识别CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的探针,所述检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的蛋白表达水平的试剂包括特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的抗体、特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的亲和性蛋白,所述检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达程度的试剂包括通过免疫组化实验检测CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达程度的试剂;
所述引物是指包含5-100个核苷酸的核酸片段,优选地,所述引物包含能起始酶促反应的15-30个核苷酸,所述起始酶促反应包括酶促扩增反应;
所述探针是指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子,探针能通过互补碱基配对与另一多核苷酸或靶多核苷酸结合的多核苷酸探针,多核苷酸也称靶多核苷酸,根据杂交条件的严格性,探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合,所述杂交方式包括但不限于溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本发明中的示例性探针包括基因特异性DNA寡核苷酸探针,例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
杂交反应的严格性可以由本领域普通技术人员容易的确定,而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言,较长的探针要求较高的温度以正确退火,而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高,可使用的相对温度也越高。结果是,推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格,而较低温度也就较不严格。
所述特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的试剂包括但不限于:抗体、亲和性蛋白,还包括与CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白特异性结合的肽、适配体和/或化合物,所述抗体是本领域众所周知的,是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。本发明中所述的抗体是指与本发明所述的CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白特异性结合的抗体,可以根据本领域中的常规方法来制造抗体。抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白,以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子,只要该抗体表现出所需的生物学结合活性即可。
所述肽具有与靶物质(本发明所述的CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白)高度结合的能力,并且在热处理或化学处理期间不会发生变性。而且,由于其尺寸小,可以通过将其附接到其它蛋白上而用作融合蛋白。具体而言,因为可以特异性地附接到高分子蛋白链上,其可以用作诊断试剂盒和药物递送物质。
所述适配体是指一种由特定类型的单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)组成的多核苷酸,所述单链核酸自身具有稳定的三级结构,并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子(本发明所述的CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白)结合的特性。如上所述,由于适配体可以像抗体那样特异性结合抗原性物质,但比蛋白更稳定、具有更简单的结构,并且是由易于合成的多核苷酸组成,因此可以代替抗体来使用。
所述通过免疫组化实验检测CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达程度的试剂包括但不限于任何通过免疫组化实验检测CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达强度所需的试剂,例如,固定剂、缓冲液、显色液、粘附剂、封固剂、酶消化液、蔗糖溶液。其中,所述固定剂包括但不限于:甲醛、戊二醛、多聚甲醛、乙醇、HneFIX、丙酮;所述缓冲液包括但不限于:PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、EDTA缓冲液、TBS缓冲液;所述显色液包括但不限于:DAB显色液、4-氯-1-20萘酚(4-Cl-1-Naphthol)显色液、3-氨基-9-乙基卡唑(3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)显色液、TMB显色液、NBT显色液;所述粘附剂包括但不限于:明胶、树脂胶、多聚赖氨酸、商品化粘附剂;所述封固剂包括但不限于:脱脂奶粉、BSA、血清以及Fab片段单链二抗;所述酶消化液包括但不限于:胰蛋白酶消化液、胃蛋白酶消化液。
进一步,所述表达水平是指本发明中所述CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的绝对量或相对量,可以通过本领域技术人员熟知的多种技术确定本发明中所述CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的表达水平,特别地,可以通过使用本领域技术人员熟知的免疫组化检测方法对本发明中所述的CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的绝对量或相对量进行检测。
所述样本是指获自或衍生自目标受试者的组合物,其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体。该样本可以获自受试者的血液和生物来源的其他流体样本及组织样本,如活检组织样本或从其衍生的组织培养物或细胞。组织样本的来源可以是实体组织,如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样本、活检组织或吸出物;血液或任意血液组分;体液;来自个体妊娠或发育的任何时间的细胞;或血浆。术语样本包括在其获得后以任何方式处理过的生物样本,如经试剂处理、稳定化、或针对某些成分(如蛋白质或多核苷酸)富集、或包埋在用于切片目的的半固体或固体基质中。
所述样本包括但不限于以下物质的一种或多种:组织、血液、血清、血浆、血液来源的细胞、淋巴液、滑膜液、脑脊髓液、胸膜液、腹腔液、膀胱冲洗液、分泌物、口腔冲洗液、拭子、触碰准备物、细针穿刺物、细胞提取物,在本发明的具体实施方案中,所述样本优选为受试者20来源的组织样本,更优选为受试者来源的结直肠样本。
本发明还提供一种用于诊断结直肠癌或评估结直肠癌治疗疗效的产品,所述产品包括检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15表达水平的试剂,所述产品包括检测试剂盒、生物芯片;
所述检测试剂盒包括特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的引物、探针;
所述生物芯片包括固相载体、附着在固相载体上的特异性识别CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的探针。
进一步,所述检测试剂盒还包括选自以下组的一种或多种物质:容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂;
所述检测试剂盒包括:RT-PCR检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、蛋白芯片检测试剂盒、快速检测试剂盒、DNA芯片检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、或MRM(多反应监测)检测试剂盒;
所述检测试剂盒可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件;
所述RT-PCR检测试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物,所述引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的核苷酸,其长度可为约7至50bp,更特别为约10-39bp。
进一步,所述检测试剂盒可进一步包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物;
所述RT-PCR检测试剂盒还可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液(不同pH值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、酶(例如Taq聚合酶和反转录酶)、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水、和无菌水。
所述检测试剂盒可包含用于操作DNA芯片所必需的元件,所述DNA芯片试剂盒可包含与基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶,所述底物可包含对照基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸。
在一些实施方案中,本发明公开的检测试剂盒可包含用于进行ELISA所必需的元件。所述ELISA检测试剂盒可包含特异性针对蛋白(本发明所述的CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白)的抗体。所述抗体具有针对标记物蛋白的高选择性和亲合力,与其他蛋白无交叉反应性,并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外,所述ELISA检测试剂盒可包含特异性针对对照蛋白的抗体。此外,所述ELISA检测试剂盒可进一步包含能够检测被结合的抗体的试剂,例如,标记的第二抗体、发色团、酶(例如,与抗体缀合)、及其底物或能够结合所述抗体的物质。
所述生物芯片也称为阵列,指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列,也称为微阵列,通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列,所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面,或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列,从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。微阵列是杂交阵列原件有序排列在基质上,所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质,例如,玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质,例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。本发明中,所述生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片;所述基因芯片包括固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体,以及固定在固相载体上的CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的特异性抗体或配体。
所述抗体明确包括嵌合抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而重链和/或轻链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性。
所述配体可包含能够特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的肽、抗体或其片段、或适配体或寡核苷酸。本发明中使用的针对CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的抗体以最广义使用,具体涵盖例如单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体,多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的,人源化的,人的和合成的。只要所述片段能够保留与CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的结合能力即可。
通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,并从差异蛋白中寻找结直肠癌筛查分子标志物,所述结直肠癌筛查分子标志物包括CLNS1A、EPDR1、RPL15在内的一种或多种生物标志物,具体过程如下:
一.临床样本采集
将手术切除或活检取得的结直肠癌组织按照标准方式进行石蜡包埋后统一保存于储存室。
二.蛋白组学分析
选取10例符合纳入及排除标准的结直肠癌患者的标本进行蛋白质谱分析,采用Label-free定量蛋白质组学技术开展研究,经过蛋白质提取、肽段酶解、色谱分级、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据采集、数据库检索步骤,获得各样本结直肠癌及癌旁正常组织的蛋白表达信息;
通过10例(mSEPT9阴性及阳性各5例)结直肠癌及癌旁正常组织蛋白质谱分析,分别获得了mSEPT9阴性组及阳性组癌与癌旁正常组织的差异表达蛋白质以及mSEPT9阴性组癌及阳性组癌的差异表达蛋白质,通过合并分析,最终将哺乳动物室管膜相关蛋白1(Mammalian ependymin-related protein 1,EPDR1)及60S核糖体蛋白质L15(60Sribosomal protein L15,RPL15)以及甲基化体亚单位pICln(Methylosome subunitpICln,CLNS1A)拟为结直肠癌的肿瘤标志物,并通过免疫组化验证。
三.免疫组化验证
选取60例符合纳入及排除标准的结直肠癌及癌旁正常组织(mSEPT9阴性及阳性各30例)对EPDR1、RPL15、CLNS1A进行免疫组化验证,并将其表达强度半定量分析,分析其诊断价值,具体步骤如下:
(1)免疫组化步骤
1.石蜡组织按2.5微米切片后在48℃摊片机中展开,干燥63℃后烤片1小时;
2.组织脱蜡水化(脱蜡液Ⅰ浸泡15分钟→脱蜡液Ⅱ浸泡15分钟→无水乙醇Ⅰ浸泡5分钟→无水乙醇Ⅱ浸泡5分钟→95%乙醇浸泡2分钟→80%乙醇浸泡1分钟→蒸馏水洗3遍);
3.0.01M磷酸盐缓冲液(以下简称PBS)浸泡5分钟浸泡3遍;
4.高压锅热抗原修复
1)使用柠檬酸缓冲液(ph6.0)进行修复;
2)预热至沸腾;
3)将切片放入相应的高压锅内,待EDTA喷气后计时3min,柠檬酸喷气后计时2.5min;
4)室温冷却20分钟;
5)用0.01M PBS浸泡5分钟,重复3遍;
6)用3%H2O2浸泡10分钟;
7)再次用0.01M PBS浸泡5分钟,重复3遍;
8)加入一抗后将切片放入保湿盒37℃恒温箱孵育过夜;
9)用0.01M PBS浸泡5分钟,重复3遍;
10)加入二抗后将切片放入保湿盒孵育37℃,计时30分钟;
11)用0.01M PBS浸泡5分钟,重复3遍;
12)DAB显色(镜检);
13)苏木素复染5分钟后放入玻璃缸内用水洗3遍;
14)分色液分色后放入玻璃缸内水洗3遍;
15)反蓝液反蓝后放入玻璃缸内水洗3遍;
16)镜检,观察细胞核着色情况;
17)上行脱水、透明(80%乙醇浸泡1分钟→95%乙醇Ⅰ浸泡2分钟→95%乙醇Ⅱ浸泡2分钟→无水乙醇Ⅰ浸泡5分钟→无水乙醇Ⅱ浸泡5分钟→透明液Ⅰ浸泡1分钟→透明液Ⅱ浸泡5分钟→透明液Ⅲ浸泡5分钟);
18)中性树胶封片、镜检。
(2)免疫组化结果分析
将免疫组化玻片依此置于光学显微镜下,随机选择3-5个高倍视野,并采集图像,随后使用Image Pro Plus 6.0软件分别计算RPL15、EPDR1及CLNS1A的平均光密度值。
(3)ROC曲线
根据RPL15、EPDR1及CLNS1A于mSEPT9阴性组及阳性组癌与癌旁正常组织的结果绘制ROC曲线,评判RPL15、EPDR1及CLNS1A结直肠癌中的诊断价值,根据结果可见RPL15、EPDR1及CLNS1A在mSEPT9检测阴性组中诊断价值良好,有着较高的敏感性及特异度。
进一步,所述检测方法还包括结合结直肠癌诊断试剂或试剂盒寻找结直肠癌筛查分子标志物,所述结直肠癌筛查分子标志物包括CLNS1A、EPDR1、RPL15在内的一种或多种生物标志物,在免疫组化过程中分别加入CLNS1A、EPDR1、RPL15的一抗后将切片放入保湿盒37℃恒温箱孵育过夜,并通过光学显微镜观察以及高倍视野下采集图像,并对其表达结果进行半定量分析;
进一步,所述检测方法还包括结合结直肠癌分期预测试剂或试剂盒寻找结直肠癌筛查分子标志物,所述结直肠癌筛查分子标志物包括CLNS1A、EPDR1、RPL15在内的一种或多种生物标志物。
本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,其有益效果有:
1、该检测方法基于mSEPT9检测技术进行,通过对比发生与未发生mSEPT9结直肠癌的基因序列寻找一种新型结直肠癌筛查分子标志物,与mSEPT9联合可提高结直肠癌检出率,特异度及敏感度均较高,能够早期识别出结直肠癌患者且诊断效率高,能够实现结直肠癌的快速筛查;
2、该检测方法解决了现有技术对结直肠癌检测的敏感度与特异度偏低以及因各种原因导致患者依从性差等问题,为结直肠癌的筛查与防治带来了便利,能够作为结直肠癌的潜在靶点,在诊断、治疗以及判断结直肠癌预后方面发挥综合作用。
附图说明
图1,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的CLNS1A免疫组化染色图片;
图2,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的CLNS1A表达半定量分析柱状图;
图3,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的CLNS1A免疫组化半定量分析结果及其诊断结直肠癌的ROC曲线;
图4,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的RPL15免疫组化染色图片;
图5,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的RPL15表达半定量分析柱状图;
图6,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的RPL15蛋白免疫组化半定量分析结果及其诊断结直肠癌的ROC曲线;
图7,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的RPL15免疫组化染色图片;
图8,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的RPL15表达半定量分析柱状图;
图9,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的RPL15蛋白免疫组化半定量分析结果及其诊断结直肠癌的ROC曲线;
图10,本发明一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法中的CLNS1A、EPDR1、RPL15蛋白免疫组化半定量分析结果进行联合诊断的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实验样本的选择:
本研究的样本均为2019-2022年间手术切除的结直肠癌石蜡包埋组织。所有样本均由病理科医师确诊为结直肠癌,且患者无其他恶行肿瘤,术前未行任何抗肿瘤治疗,mSEPT9检测均为术前检测。本研究获得医院医学伦理委员会的批准和所述受试者或受试者家属(监护人)的知情同意筛选出的10例CRC患者根据mSEPT9结果进行分组(mSEPT9阳性组及阴性组各5例),其中mSEPT9阴性的结直肠癌标记为T1,其癌旁正常组织标记为N1;mSEPT9阳性的结直肠癌标记为T2,其癌旁正常组织标记为N2。
蛋白质组学研究-蛋白质谱分析:
本研究采用Label-free定量蛋白质组学技术开展研究,质谱实验分析流程主要包括蛋白质提取、肽段酶解、色谱分级、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)数据采集、数据库检索等步骤,步骤如下。
(1)蛋白质提取和肽段酶解
脱蜡:将二甲苯加入各EP管中浸泡30分钟后用移液枪吸去二甲苯,该步骤重复三次,接下来各EP管依次加入梯度酒精(90%,80%,70%),每梯度各30分钟,随后用移液枪吸去酒精,水化3次,每次10分钟,负80度低温保存等待质谱分析。每组各取200ul通过SDS-PAGE法评估石蜡标本的蛋白总量,蛋白量满足后续实验后,可以进行后续实验。
蛋白质的裂解和定量:样品从-80℃取出后,用SDT(4%(w/v)SDS,100mM Tris/HClpH7.6,0.1MDTT)裂解法提取蛋白质。离心后收集上清,采用BCA法测定蛋白质浓度。
蛋白质肽段酶解:每例样品取适量蛋白质,使用Filter aidedproteomepreparation(FASP)方法进行胰蛋白酶酶解。
(2)LC-MS/MS数据采集:
使用纳升流速的HPLC液相***Easy nLC将每份样品分离。其中缓冲液A液为0.1%甲酸水溶液,B液使用0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。色谱柱用95%的A液平衡,样品由自动进样器上样到上样柱,经过分析柱分离,流速为300nL/min。样品经色谱分离后用Q-Exactive系列质谱仪进行质谱分析。
(3)蛋白质鉴定和定量分析:
质谱分析原始数据为RAW文件,采用MaxQuant软件进行查库鉴定及定量分析。根据定量结果,按照差异表达倍数(Fold change,FC)和显著性差异分析(P value)的原则筛选出各比较组之间的显著差异表达的蛋白质,并对其进行聚类分析、亚细胞定位分析、结构域分析以及GO和KEGG等富集分析。
蛋白质鉴定及定量结果
进行蛋白质谱分析之前,首先对样本进行质控,符合样本检测要求后进行下一步操作。
通过10例(mSEPT9阴性及阳性各5例)结直肠癌及癌旁正常组织蛋白质谱分析,我们分别获得了mSEPT9阴性组及阳性组癌与癌旁正常组织的差异表达蛋白质以及mSEPT9阴性组癌及阳性组癌的差异表达蛋白质。通过合并分析,最终将哺乳动物室管膜相关蛋白1(Mammalian ependymin-related protein 1,EPDR1)及60S核糖体蛋白质L15(60Sribosomal protein L15,RPL15)以及甲基化体亚单位pICln(Methylosome subunitpICln,CLNS1A)拟为结直肠癌的肿瘤标志物,并通过免疫组化验证。
为了进一步展示各比较组蛋白质的显著性差异,将各比较组中的蛋白质依据表达差异倍数和P value两个因素绘制火山图,表达显著下调的蛋白质以绿色标注(FC<0.60且p<0.05),表达显著上调的蛋白质以红色标注(FC>1.5且p<0.05),余蛋白质为灰色。
通过蛋白质谱分析及比较,我们分别获得了T1/N1、T2/N2以及T1/T2的显著差异表达蛋白质。其中在T1/N1及T2/N2中均出现的显著差异蛋白质共406个,阴性组中上调蛋白质有283个,下调蛋白质有123个,阳性组中上调蛋白质有282个,下调蛋白有124个。将这406个显著差异蛋白质与T1/T2的显著差异表达蛋白质相比较共筛选出7个核心差异蛋白质,其中哺乳动物室管膜相关蛋白1(Mammalian ependymin-related protein 1,EPDR1)及60S核糖体蛋白质L15(60Sribosomal protein L15,RPL15)在三组的对比中均为上调表达。另外,我们于仅在比较组内一方出现的蛋白质中发现,甲基化体亚单位pICln(Methylosomesubunit pICln,CLNS1A)仅在T1组中有定量结果。因此,我们将RPL15、EPDR1及CLNS1A拟为结直肠癌的肿瘤标志物,并通过免疫组化验证。
实施例1:
如图1~图3,一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,所述检测方法联合mSEPT9检测进行,通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,并从差异蛋白中寻找结直肠癌筛查分子标志物,将结直肠癌筛查分子标志物与mSEPT9检测进行结直肠癌联合检测,根据联合检测检出结直肠癌患者;
所述结直肠癌筛查分子标志物为CLNS1A生物标志物,图3为该实施例中CLNS1A免疫组化半定量分析结果及其诊断结直肠癌的ROC曲线,图1~10中,Sensitivity为敏感度,Specificity为特异性,Group1为Septin9基因甲基化阴性组,Group2为Septin9基因甲基化阳性组与阴性组的合并组,Group3为Septin9基因甲基化阳性组,在Septin9基因甲基化阴性组中,AUC为0.8730,约登指数为0.774,灵敏度达83.87%,特异性为93.55%;在Septin9基因甲基化阴性组与阳性组合并组中,AUC为0.5956,约登指数为0.317,其灵敏度达80.00%,特异性为51.67%;在Septin9基因甲基化阳性组中,AUC为0.6556,约登指数为0.40,其灵敏度达83.33%,特异性为56.67%。
实施例2:
如图4~图6,一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,所述检测方法联合mSEPT9检测进行,通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,并从差异蛋白中寻找结直肠癌筛查分子标志物,将结直肠癌筛查分子标志物与mSEPT9检测进行结直肠癌联合检测,根据联合检测检出结直肠癌患者;
所述结直肠癌筛查分子标志物为EPDR1生物标志物,图6为该实施例中EPDR1免疫组化半定量分析结果及其诊断结直肠癌的ROC曲线,图6中,Group1为Septin9基因甲基化阴性组,Group2为Septin9基因甲基化阳性组与阴性组的合并组,Group3为Septin9基因甲基化阳性组,在Septin9基因甲基化阴性组中,AUC为0.9289,约登指数为0.8667,此时其灵敏度达90.00%,特异性为96.67%;在Septin9基因甲基化阴性组于阳性组合并组中,AUC为0.7656,约登指数为0.60,此时其灵敏度达88.33%,特异性为71.67%;在Septin9基因甲基化阳性组中,AUC为0.5989,约登指数为0.3333,此时其灵敏度达90.00%,特异性为43.33%。
实施例3:
如图7~图9,一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,所述检测方法联合mSEPT9检测进行,通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,并从差异蛋白中寻找结直肠癌筛查分子标志物,将结直肠癌筛查分子标志物与mSEPT9检测进行结直肠癌联合检测,根据联合检测检出结直肠癌患者;
所述结直肠癌筛查分子标志物为RPL15生物标志物,图9为该实施例中RPL15免疫组化半定量分析结果及其诊断结直肠癌的ROC曲线,图9中,Group1为Septin9基因甲基化阴性组,Group2为Septin9基因甲基化阳性组与阴性组的合并组,Group3为Septin9基因甲基化阳性组,在Septin9基因甲基化阴性组中,AUC为0.910,约登指数为0.8334,其灵敏度达86.67%,特异性为96.67%;在Septin9基因甲基化阴性组与阳性组合并组中,AUC为0.850,约登指数为0.7334,此时其灵敏度达76.67%,特异性为96.67%;在Septin9基因甲基化阳性组中,AUC为0.7578,约登指数为0.6334,此时其灵敏度达66.67%,特异性为96.67%。
实施例4:
一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,所述检测方法联合mSEPT9检测进行,通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,并从差异蛋白中寻找结直肠癌筛查分子标志物,将结直肠癌筛查分子标志物与mSEPT9检测进行结直肠癌联合检测,根据联合检测检出结直肠癌患者;
所述结直肠癌筛查分子标志物为CLNS1A、EPDR1、RPL15三种生物标志物,图10为该实施例中CLNS1A、EPDR1、RPL15三种生物标志物免疫组化半定量分析结果及其诊断结直肠癌的ROC曲线,图10中,Group1为Septin9基因甲基化阴性组,Group2为Septin9基因甲基化阳性组与阴性组的合并组,Group3为Septin9基因甲基化阳性组,在Septin9基因甲基化阴性组中,AUC为0.9689,约登指数为0.90,其灵敏度达93.33%,特异性为96.67%;在Septin9基因甲基化阴性组与阳性组合并组中,AUC为0.9056,约登指数为0.6834,此时其灵敏度达81.67%,特异性为86.67%;在Septin9基因甲基化阳性组中,AUC为0.8278,约登指数为0.6334,此时其灵敏度达66.67%,特异性为96.67%。
以上已将本发明做一详细说明,以上所述,仅为本发明之较佳实施例而已,当不能限定本发明实施范围,即凡依本申请范围所作均等变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖范围内。
Claims (10)
1.一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,其特征在于:
所述检测方法联合mSEPT9检测进行,通过蛋白质谱分析的方式筛选Septin9基因甲基化阴性或阳性结直肠癌患者的差异蛋白,并从差异蛋白中寻找结直肠癌筛查分子标志物,将结直肠癌筛查分子标志物与mSEPT9检测进行结直肠癌联合检测,根据联合检测检出结直肠癌患者;
所述结直肠癌筛查分子标志物包括CLNS1A、EPDR1、RPL15在内的一种或多种生物标志物;
所述联合检测包括平行试验和系列试验,平行试验是同时做若干个试验,只要有一个试验阳性,即判定为阳性,平行试验能增加灵敏度,系列试验为依次相继的若干个试验,需要所有试验阳性才可作出阳性判定,系列试验能增加特异度;
所述检测方法包括检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15表达水平的试剂在制备诊断结直肠癌或评估结直肠癌治疗疗效的产品中的应用方法,所述试剂包括检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的mRNA表达水平的试剂、检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的蛋白表达水平的试剂、检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达程度的试剂;
所述评估结直肠癌治疗疗效是指评估受试者对某种治疗方法或治疗药物的疗效,所述评估结直肠癌治疗疗效是指CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15对mSEPT9检测阳性或阴性的癌及癌旁正常组织的诊断进一步评估得出受试者对某种治疗方法或治疗药物的疗效。
2.根据权利要求1所述的一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,其特征在于,所述检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的mRNA表达水平的试剂包括特异性扩增CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的引物、特异性识别CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的探针,所述检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的蛋白表达水平的试剂包括特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的抗体、特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的亲和性蛋白,所述检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达程度的试剂包括通过免疫组化实验检测CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达程度的试剂;
所述引物是指包含5-100个核苷酸的核酸片段,优选地,所述引物包含能起始酶促反应的15-30个核苷酸,所述起始酶促反应包括酶促扩增反应;
所述探针是指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子,探针能通过互补碱基配对与另一多核苷酸或靶多核苷酸结合的多核苷酸探针,多核苷酸也称靶多核苷酸,根据杂交条件的严格性,探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合,所述杂交方式包括但不限于溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法;
所述特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的试剂包括但不限于:抗体、亲和性蛋白,还包括与CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白特异性结合的肽、适配体和/或化合物;
所述抗体是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白,所述肽具有与靶物质高度结合的能力,并且在热处理或化学处理期间不会发生变性,所述适配体是指一种由特定类型的单链核酸组成的多核苷酸,所述单链核酸自身具有稳定的三级结构,并且具有能够以高亲和力和特异性与靶分子结合的特性。
3.根据权利要求2所述的一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,其特征在于,所述通过免疫组化实验检测CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达程度的试剂包括但不限于任何通过免疫组化实验检测CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15阳性表达强度所需的试剂,包括固定剂、缓冲液、显色液、粘附剂、封固剂、酶消化液、蔗糖溶液。
4.根据权利要求3所述的一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,其特征在于,所述固定剂包括但不限于:甲醛、戊二醛、多聚甲醛、乙醇、HneFIX、丙酮;
所述缓冲液包括但不限于:PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、EDTA缓冲液、TBS缓冲液;
所述显色液包括但不限于:DAB显色液、4-氯-1-20萘酚显色液、3-氨基-9-乙基卡唑显色液、TMB显色液、NBT显色液;
所述粘附剂包括但不限于:明胶、树脂胶、多聚赖氨酸、商品化粘附剂;所述封固剂包括但不限于:脱脂奶粉、BSA、血清以及Fab片段单链二抗;
所述酶消化液包括但不限于:胰蛋白酶消化液、胃蛋白酶消化液。
5.根据权利要求1所述的一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,其特征在于,所述表达水平是指本发明中所述CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的绝对量或相对量,能通过使用免疫组化检测方法对所述的CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的绝对量或相对量进行检测。
6.根据权利要求1所述的一种联合mSEPT9检测和生物标志物的结直肠癌检测方法,其特征在于,所述样本是指获自或衍生自目标受试者的组合物,其包含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的细胞实体和/或其他分子实体;
所述样本包括但不限于以下物质的一种或多种:组织、血液、血清、血浆、血液来源的细胞、淋巴液、滑膜液、脑脊髓液、胸膜液、腹腔液、膀胱冲洗液、分泌物、口腔冲洗液、拭子、触碰准备物、细针穿刺物、细胞提取物。
7.一种用于诊断结直肠癌或评估结直肠癌治疗疗效的产品,所述产品包括检测样本中CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15表达水平的试剂,所述产品包括检测试剂盒、生物芯片;
所述检测试剂盒包括特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的引物、探针;
所述生物芯片包括固相载体、附着在固相载体上的特异性识别CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的探针。
8.根据权利要求7所述的一种用于诊断结直肠癌或评估结直肠癌治疗疗效的产品,其特征在于,所述检测试剂盒还包括选自以下组的一种或多种物质:容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂;
所述检测试剂盒包括:RT-PCR检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、蛋白芯片检测试剂盒、快速检测试剂盒、DNA芯片检测试剂盒、免疫组化检测试剂盒、或MRM(多反应监测)检测试剂盒;
所述检测试剂盒可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件;
所述RT-PCR检测试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物,所述引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的核苷酸,其长度可为7至50bp,更特别为10-39bp。
9.根据权利要求8所述的一种用于诊断结直肠癌或评估结直肠癌治疗疗效的产品,其特征在于,所述检测试剂盒可进一步包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物;
所述RT-PCR检测试剂盒还可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液、脱氧核苷酸、酶、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水、和无菌水;
所述检测试剂盒可包含用于操作DNA芯片所必需的元件,所述DNA芯片试剂盒可包含与基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶,所述底物可包含对照基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸。
10.根据权利要求7所述的一种用于诊断结直肠癌或评估结直肠癌治疗疗效的产品,其特征在于,所述生物芯片也称为阵列,指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物;
所述生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片,所述基因芯片包括固相载体、以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15所示的部分或全部序列,所述蛋白芯片包括固相载体,以及固定在固相载体上的CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15编码的蛋白的特异性抗体或配体;
所述抗体明确包括嵌合抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而重链和/或轻链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段;
所述配体可包含能够特异性结合CLNS1A和/或EPDR1和/或RPL15的肽、抗体或其片段、或适配体或寡核苷酸。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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