CN116471938A - 具有来自青霉属的热稳定amg变体的烘焙和部分烘焙产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生产烘焙或部分烘焙产品的方法，所述方法包括第一步：提供面团，该面团包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少70％同一性的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体；和第二步：烘焙或部分烘焙该面团以生产烘焙或部分烘焙产品，以及包含所述变体的烘焙组合物和所述变体的用途。
Description
序列表的引用
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技术领域
本发明涉及生产烘焙或部分烘焙(par-baked)产品的方法，所述方法包括第一步：提供面团，该面团包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少70％同一性的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体；和第二步：烘焙或部分烘焙该面团以生产烘焙或部分烘焙产品，以及包含所述变体的烘焙组合物和所述变体的用途。
背景技术
世界范围内的含糖烘焙产品(面包、饼干等)是最受欢迎的产品类别(productsegment)之一。配方糖量典型地为面粉总重量的1％-25％。
然而，因为糖的市场价格上涨、世界某些地区的糖供应不足以及健康问题，所以需要在不牺牲烘焙产品质量甚至可能改善烘焙产品质量的情况下生产添加糖量减少的烘焙产品的方法。
WO 2019/238423(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦)披露了生产添加糖量减少的面团的方法，这些方法包括向面团成分中添加生淀粉降解α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
发明内容
诸位发明人发现，某些葡糖淀粉酶的热稳定变体在烘焙或部分烘焙产品的保鲜或抗老化方面表现出极大改善的性能。热稳定变体的另一个改善的性能是它们增加了产品的甜度或甜味，从而减少了传统配方中的添加糖量。
因此，在第一方面，本发明涉及生产烘焙或部分烘焙产品的方法，所述方法包括：
a)提供面团，该面团包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8具有至少70％同一性的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体；以及
b)烘焙或部分烘焙该面团以生产烘焙或部分烘焙产品。
本发明的第二方面涉及烘焙组合物，这些烘焙组合物包含如第一方面中所定义的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体。
本发明的其他方面涉及第二方面的烘焙组合物用于以下的用途：在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中替代糖、增加烘焙或部分烘焙产品的甜度、在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中减少面团中的糖的量和/或在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中延长烘焙或部分烘焙产品的保质期，以及其在如第一方面中所定义的方法中的用途，由此与不添加任何葡糖淀粉酶制成的对照相比，最终全烘焙(bake-off)后的烘焙或部分烘焙产品当冷却至室温、包装在密封容器中并在室温下储存直至分析时，具有降低的初始坚度(firmness)和/或增加的初始弹性，和/或在1、7或14天后具有降低的坚度增加和/或更高的弹性。
优选地，本发明的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少71％同一性，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8具有例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。
附图说明
图1示出了以下成熟蛋白的氨基酸序列的多重比对：
-SEQ ID NO:1的来自草酸青霉(Penicillium oxalicum)的野生型AMG(PoAMG)
-SEQ ID NO:2的表示为“AMG NL”的PoAMG变体
-SEQ ID NO:3的表示为“AMG anPAV498”的PoAMG变体
-SEQ ID NO:4的表示为“AMG JPO001”的PoAMG变体
-SEQ ID NO:5的表示为“AMG JPO124”的PoAMG变体
-SEQ ID NO:6的表示为“AMG JPO172”的PoAMG变体
-SEQ ID NO:7的来自米克青霉(Penicillium miczynskii)的野生型AMG(PoAMG)
-SEQ ID NO:8的来自罗氏青霉(Penicillium russellii)的野生型AMG(PoAMG)
-SEQ ID NO:9的来自光孢青霉(Penicillium glabrum)的野生型AMG(PoAMG)
具体实施方式
定义
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277，优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-非简化(no brief)选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即，取代、***和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且***意指邻近于并且紧跟着占据某一位置的氨基酸之后添加一个或多个氨基酸。氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
增加的强度：术语“面团的增加的强度”在本文中定义为面团的如下特性，其与对照相比通常具有更大的弹性特性和/或需要更多的工作输入以模制和成型。
增加的弹性：术语“面团的增加的弹性”在本文中定义为面团的如下特性，其与对照相比在经受一定的物理应力后具有更高的恢复其原始形状的趋势。
面团的增加的稳定性：术语“面团的增加的稳定性”在本文中定义为面团的如下特性，其与对照相比不易受机械损伤影响，因此更好地保持其形状和体积，并且通过与在正常和/或延长醒发之后面包的截面的高度:宽度之比进行评估。
面团的降低的粘性：术语“面团的降低的粘性”在本文中定义为面团的如下特性，其例如在面团生产机器中与对照相比具有更低的粘附表面的趋势，并且由熟练的测试面包师依靠经验评估或使用本领域已知的质地分析器(例如TAXT2)来测量。
改善的拉伸性：术语“面团的改善的拉伸性”在本文中定义为面团的如下特性，其与对照相比可以经受增加的应力或拉伸而不破裂。
改善的机械能力：术语“面团的改善的机械能力”在本文中定义为面团的如下特性，其与对照相比通常具有较小粘性和/或更紧实和/或更有弹性。
烘焙产品的增加的体积：术语“烘焙产品的增加的体积”是如与对照相比对给定面包条的体积进行测量。体积可利用本领域已知的方法测定。
烘焙产品的改善的瓤结构：术语“烘焙产品的改善的瓤(crumb)结构”在本文中定义为烘焙产品的如下特性，其与对照相比瓤中具有更精细的孔室和/或更薄的孔室壁，和/或瓤中有更均匀/均一的孔室分布，并且其通常通过熟练面包师从视觉上或通过本领域已知的数字图像分析(例如，C-孔室(C-cell)，国际精密控制有限公司(Calibre ControlInternational Ltd)，阿普尔顿(Appleton)，沃灵顿(Warrington)，英国)评估。
烘焙产品的改善的柔软度：术语“烘焙产品的改善的柔软度”与“坚度”相反，并且在本文中定义为烘焙产品的如下特性，其与对照相比更容易被压缩，并且由熟练的测试面包师依靠经验评估或例如使用本领域已知的质地分析器(例如，来自英国萨里的稳定微***公司(Stable Micro Systems Ltd)的TAXT2或TA-XT Plus)来测量。
烘焙产品的感官属性：感官属性可以使用在烘焙行业中已很好地确立的程序来评估，并且可以包括例如使用一组受过训练的味觉测试者。
热稳定性改善：以OC为单位的热稳定性改善(Td)是在相同条件下变体相对于其亲本葡糖淀粉酶在热稳定性方面改善了多少的量度，如本文例示的那样所测定的。
本发明的第一方面涉及生产烘焙或部分烘焙产品的方法，所述方法包括：
a)提供面团，该面团包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8具有至少70％同一性的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体；以及
b)烘焙或部分烘焙该面团以生产烘焙或部分烘焙产品。
本发明的第二方面涉及烘焙组合物，这些烘焙组合物包含如第一方面中所定义的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体。
本发明的其他方面涉及第二方面的烘焙组合物用于以下的用途：在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中替代糖、增加烘焙或部分烘焙产品的甜度、在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中减少面团中的糖的量和/或在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中延长烘焙或部分烘焙产品的保质期，以及其在如第一方面中所定义的方法中的用途，由此与不添加任何葡糖淀粉酶制成的对照相比，最终全烘焙后的烘焙或部分烘焙产品当冷却至室温、包装在密封容器中并在室温下储存直至分析时，具有降低的初始坚度和/或增加的初始弹性，和/或在1、7或14天后具有降低的坚度增加和/或更高的弹性。
优选地，本发明的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少71％同一性，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8具有例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。
面团
如本文所用，“面团”意指用于制备烘焙产品(特别是面包)的面团。
根据本发明，用来制备烘焙产品的面团可以由任何适合的包含面粉的面团成分制成。
面粉可以来自本领域已知的任何烘焙谷物，如小麦粉、玉米粉、黑麦粉、大麦粉、燕麦粉、大米粉、高粱粉、马铃薯粉、大豆粉及其任何组合(例如，小麦粉与其他面粉来源之一的组合；或大米粉与其他面粉来源之一的组合)。
在优选的实施例中，面粉是小麦粉。
在优选的实施例中，总面粉含量的至少10％(w/w)或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少15％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少20％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少25％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少30％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少35％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少40％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少45％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少50％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少55％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少60％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少65％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少70％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少75％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少80％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少85％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少90％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的至少95％或更多是小麦粉，例如，总面粉含量的100％是小麦粉。
本发明的面团通常是经发酵的面团或将要经受发酵的面团。该面团可以各种方式来发酵，如通过添加面团成分如化学膨松剂(例如碳酸氢钠)或通过添加发酵剂(发酵面团)，但优选的是通过添加适合的酵母培养物如酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)(面包酵母)的培养物(例如可商购的酿酒酵母菌株)来发酵该面团。
本发明的面团典型地可以包含一定的添加糖，因为虽然根据本发明的方法能够减少添加糖的量，但正常情况下只能部分减少糖的量。
在一个实施例中，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少10％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少20％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少30％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少40％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少50％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少60％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少70％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少80％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少至少90％(w/w)，例如，与原配方中添加至面团的糖的量相比，所添加糖的量减少100％(w/w)。
面团还可以包含其他常规的面团成分，例如蛋白质，如奶粉、面筋和大豆；蛋(全蛋、蛋黄或蛋白)；氧化剂，如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸，如L-半胱氨酸；盐，如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠、硫酸钙；稀释剂(如二氧化硅)和不同来源的淀粉。其他常用成分还包括水胶体，如CMC、瓜尔胶、黄原胶、槐树豆胶等。
面团成分典型地可包含脂肪(甘油三酯)和/或油和/或起酥油，特别是油，如葵花籽油或菜籽油。
面团可采用任何常规混合工艺制作，如连续混合工艺、直接发酵(straight-dough)工艺或中种发酵(sponge and dough)方法。
本发明特别有用于在工业化工艺中制备面团和烘焙产品，其中用来制备烘焙产品的面团是使用自动化或半自动化的设备以机械方式制备的。
制备面包的工艺通常涉及以下顺序步骤：制作面团，对该面团进行压片(sheeting)或分割、成形或滚压(rolling)、以及醒发(proofing)，这些步骤在本领域中是熟知的。
如本文所用，“烘焙产品”意指任何类型的烘焙产品，包括多种面包类型，如模制面包(pan bread)、吐司面包、敞口式面包(open bread)、带盖和不带盖的模制面包、小圆面包、菲诺面包(Fino bread)、哈玛姆面包(Hammam bread)、萨莫利面包(Samoli bread)、长棍面包、布里欧面包(brioche)、汉堡包用小圆面包、面包卷(roll)、黑面包、全麦面包、高油糖面包(rich bread)、麸皮面包、扁平面包、玉米粉圆饼(tortilla)，饼干及其任何品种。根据本发明，烘焙产品还可以是蛋糕或本领域已知的任何糕点产品。
生淀粉降解α-淀粉酶
如本文所用，“生淀粉降解α-淀粉酶”是指可以在淀粉的糊化温度之下直接降解生淀粉颗粒的酶。
生淀粉降解α-淀粉酶的实例包括在WO 2005/003311、美国专利公开号2005/0054071和美国专利号7,326,548中披露的那些。实例还包括美国专利号7,326,548中实例的表1-5中和美国专利公开号2005/0054071(第15页表3)中披露的那些酶，以及WO 2004/020499和WO 2006/06929和WO 2006/066579中披露的酶。
在一个实施例中，生淀粉降解α-淀粉酶是GH13_1淀粉酶。
在一个实施例中，生淀粉降解α-淀粉酶与欧洲专利号2981170(诺维信公司)中所示的生淀粉降解α-淀粉酶具有至少70％，例如至少71％、例如至少72％、例如至少73％、例如至少74％、例如至少75％、例如至少76％、例如至少77％、例如至少78％、例如至少79％、例如至少80％、例如至少81％、例如至少82％、例如至少83％、例如至少84％、例如至少85％、例如至少86％、例如至少87％、例如至少88％、例如至少89％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。
在一个实施例中，可以0.01-10mg酶蛋白/kg面粉的量，例如0.1-5mg酶蛋白/kg面粉的量，将根据本发明的生淀粉降解α-淀粉酶添加到面粉或面团中。
葡糖淀粉酶
葡糖淀粉酶也称为淀粉葡糖苷酶和葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)，更通常它们被称为AMG。
根据本发明，不同类型的淀粉葡糖苷酶可以用作产生热稳定淀粉葡糖苷酶变体的亲本，例如，淀粉葡糖苷酶可以是由以下编码的多肽：在曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、或篮状菌属(Talaromyces)或青霉属的真菌菌株中发现的DNA序列；优选地在青霉属的真菌菌株中发现的DNA序列，甚至更优选地在尖孢青霉(Penicilliumoxysporum)、草酸青霉、米克青霉、罗氏青霉或光孢青霉的真菌菌株中发现的DNA序列。优选地，亲本葡糖淀粉酶来自青霉属的物种，优选地来自草酸青霉、米克青霉、罗氏青霉或光孢青霉。
其他适合的真菌的实例包括黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、戴尔根霉(Rhizopus delemar)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、米根霉(Rhizopus oryzae)和埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)。
以下示出了图1中比对的AMG氨基酸序列之间的同一性％，并且也在序列表中提供：
在一个实施例中，可以以0.01-1,000mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，优选地0.01-500mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，甚至更优选地0.1-100mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，将根据本发明的葡糖淀粉酶添加到面粉或面团中。
已经产生了PoAMG的热稳定变体(参见下表2)。在优选的实施例中，本发明的成熟热稳定葡糖淀粉酶变体包含下表2中列出的氨基酸取代的一个或多个或全部组合。
在优选的实施例中，本发明的成熟变体在对应于SEQ ID NO:1中的位置1、2、4、6、7、11、31、34、65、79、103、132、327、445、447、481、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含至少一个氨基酸修饰；优选地该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的位置1、2、4、11、65、79和327的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的R1A、P2N、P4S、P11F、T65A、K79V和Q327F的一个或多个或全部位置处包含取代；或优选地该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的位置1、6、7、31、34、79、103、132、445、447、481、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的R1A、G6S、G7T、R31F、K34Y、K79V、S103N、A132P、D445N、V447S、S481P、D566T、T568V、Q594R和F595S的一个或多个或全部位置处包含取代；或优选地该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的位置1、6、7、31、34、50、79、103、132、445、447、481、484、501、539、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的R1A、G6S、G7T、R31F、K34Y、E50R、K79V、S103N、A132P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、N539P、D566T、T568V、Q594R和F595S的一个或多个或全部位置处包含取代。
表2中变体的热稳定性改善(Td)列于表3中，其中表示为“anPAV498”(亲本)的PoAMG变体的Td设置为零。在优选的实施例中，本发明的成熟热稳定变体相对于其亲本具有至少3℃，优选地至少4℃、5℃、6℃、7℃或8℃的热稳定性改善(Td)，优选地如本文例示的那样所测定的。
在另一个优选的实施例中，本发明的成熟热稳定变体与其亲本相比在91OC具有至少150，优选地至少200，更优选地至少250，最优选地至少300的相对活性。
优选地，成熟热稳定变体葡糖淀粉酶以0.01-1,000mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，优选地0.01-500mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，甚至更优选地0.1-100mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量包含在面团中。
淀粉酶
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
α-淀粉酶中的多种被称为TermamylTM和“TermamylTM-样α-淀粉酶”，并可从例如WO90/11352、WO 95/10603、WO 95/26397、WO 96/23873和WO 96/23874中了解。
另一组α-淀粉酶被称为FungamylTM和“FungamylTM-样α-淀粉酶”，它们是与衍生自WO 01/34784中披露的米曲霉的α-淀粉酶有关的α-淀粉酶。
根据本发明的适合的市售α-淀粉酶组合物包括例如BAKEZYME P 300(可购自帝斯曼公司(DSM))和FUNGAMYL 2500SG、FUNGAMYL 4000BG、FUNGAMYL 4000SG、FUNGAMYL 800L、FUNGAMYL ULTRA BG和FUNGAMYL ULTRA SG(可购自诺维信公司)。
在一个实施例中，可以以0.01-1,000mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，优选地0.01-500mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，甚至更优选地0.1-100mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，将根据本发明的α-淀粉酶添加到面粉或面团中。
另外的酶
任选地，一种或多种另外的酶(如α-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、β淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素分解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶)可以与根据本发明的酶组合物一起使用。
一种或多种另外的酶可以是任何来源的，包括哺乳动物来源的、植物来源的、和微生物(细菌、酵母或真菌)来源的。
产麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)可以来自芽孢杆菌属(Bacillus)。来自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)菌株NCIB 11837的产麦芽糖α-淀粉酶是从诺维信公司在商标名下可商购的。
产麦芽糖α-淀粉酶还可以是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的产麦芽糖α-淀粉酶的变体，如在例如WO 1999/043794、WO 2006/032281或WO 2008/148845中所披露的，例如3D。
用于本发明的抗老化淀粉酶还可以是来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonassaccharophilia)的淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60))或其变体，如在WO 1999/050399、WO 2004/111217或WO 2005/003339中披露的任何淀粉酶。
葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(如可购自诺维信公司)。
木聚糖酶可以是微生物来源的，例如衍生自细菌或真菌如曲霉属(特别是棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、泡盛曲霉或塔宾曲霉(A.tubigensis))的菌株，衍生自木霉属(Trichoderma)(例如，里氏木霉(T.reesei))的菌株，或衍生自腐质霉属(Humicola)(例如，特异腐质霉(H.insolens))的菌株。
用于本发明的适合的可商购的木聚糖酶制剂包括PANZEA BG、PENTOPAN MONO BG和PENTOPAN 500BG(可购自诺维信公司)、GRINDAMYL POWERBAKE(可购自丹尼斯科公司(Danisco))、以及BAKEZYME BXP 5000和BAKEZYME BXP 5001(可购自帝斯曼公司)。
蛋白酶可以来自芽孢杆菌属，例如解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。适合的蛋白酶可以是可购自诺维信公司的
磷脂酶可以具有磷脂酶A1、A2、B、C、D或溶血磷脂酶活性；它可能有也可能没有脂肪酶活性。它可以是动物来源的，例如来自胰腺、蛇毒或蜂毒，或它可以是微生物来源的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，如曲霉属或镰孢属(Fusarium)，例如黑曲霉、米曲霉或尖孢镰孢菌(F.oxysporum)。来自尖孢镰孢菌的优选的脂肪酶/磷脂酶披露于WO 98/26057中。同样，可以使用WO 00/32758中描述的变体。
适合的磷脂酶组合物是LIPOPAN F、LIPOPAN XTRA和LIPOPAN MAX(可购自诺维信公司)或PANAMORE GOLDEN和PANAMORE SPRING(可购自帝斯曼公司)。
优选地，以0.01-1,000mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，优选地0.01-500mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，甚至更优选地0.1-100mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量添加一种或多种另外的酶。
酶组合物
本发明的成熟热稳定变体葡糖淀粉酶以及任何一种或多种另外的酶可以以任何适合的形式，如例如以液体(特别是稳定化液体)形式添加至面粉或面团中，或其可以作为基本上干的粉末或颗粒被添加至面粉或面团中。
例如，颗粒可以如在美国专利号4,106,991和美国专利号4,661,452中所披露的来生产。液体酶制剂可以例如根据已确立的程序通过添加糖或糖醇或乳酸来稳定化。其他酶稳定剂在本领域中是熟知的。
一种或多种酶可以以任何适合的方式添加至面包面团成分中，如以单独组分(分别或顺序地添加酶)添加，或在一步或一种组合物中将这些酶一起添加。
烘焙组合物
本发明进一步涉及烘焙组合物，这些烘焙组合物包含如本发明的第一方面中所定义的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体。
该烘焙组合物可包含其他面团改良和/或面包改良添加剂，例如上述任何添加剂，包括酶。
该烘焙组合物可以是例如面团组合物、面粉组合物、面粉预混物或面包改良剂。
优选地，本发明的烘焙组合物还包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：α-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、β淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素分解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
优选地，本发明的烘焙组合物还包含面粉、糖、酵母、盐和/或脂肪。
通常有利的是提供在本发明的处理中使用的酶与用于改善烘焙产品特性的其他成分的混合物。这些烘焙组合物在本领域中通常被称为“预混物”，其通常包含面粉。
因此，在另一方面，本发明涉及一种通过减少所添加糖的量来改善面团质量的面包预混物，该预混物包含本发明的酶组合。
在一个实施例中，本发明进一步涉及面包预混物，其包含本发明的酶组合和面粉，如来自谷物的面粉，如小麦粉、玉米粉、黑麦粉、大麦粉、燕麦粉、大米粉、或高粱粉，及其组合。
在另一个实施例中，本发明涉及面包预混物，其包含本发明的酶组合和面粉，如来自谷物的面粉，如小麦粉、玉米粉、黑麦粉、大麦粉、燕麦粉、大米粉、高粱、大豆粉及其组合，以及一种或多种另外的酶，如先前所描述。
该预混物可以处于颗粒或团聚粉末的形式，例如其中典型地95％(按重量计)的颗粒或团聚粉末具有在25与500μm之间的粒径。
颗粒和团聚粉末可以通过常规方法制备，例如在流化床造粒机中将这些酶喷雾于载体上来制备。该载体可以由具有适合的粒径的微粒核组成。该载体可以是可溶的或不溶的，例如盐(如NaCl或硫酸钠)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨醇)、淀粉、大米、玉米糁、或大豆。
面包特性
面包的感官品质或感官属性可以如本领域中已知的进行测量。面包的特性在本文中可以称为感官属性，其包括抗老化(面包瓤坚度/硬度(hardness))、瓤特性和口感，或更精确地，如在进食期间在口腔中检测到的面包的属性(例如，面包柔软度/咬第一口的抗性、瓤湿度、瓤咀嚼性和胶着性、以及瓤平滑度和融化特性)。
在一个实施例中，烘焙产品通过使用根据本发明的酶溶液而获得的感官属性是增加的甜度。
在一个实施例中，烘焙产品通过使用根据本发明的酶溶液而获得的感官属性是增加的瓤甜度。
在本发明的优选实施例中，与不添加任何葡糖淀粉酶制成的对照相比，最终全烘焙后的烘焙或部分烘焙产品当冷却至室温、包装在密封容器中并在室温下储存直至分析时，具有降低的初始坚度和/或增加的初始弹性，和/或在1、7或14天后具有降低的坚度增加和/或更高的弹性。
在另一个优选的实施例中，最终全烘焙后的烘焙或部分烘焙产品具有与用两倍量的成熟葡糖淀粉酶制成的对照产品至少相同的甜度或甜味，该成熟葡糖淀粉酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO:10中，优选地如本文例示的那样所测定的；优选地，最终全烘焙后的烘焙或部分烘焙产品具有比用两倍量的成熟葡糖淀粉酶制成的对照产品更高的甜度或更高的甜味，该成熟葡糖淀粉酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO:10中，优选地如本文例示的那样所测定的。
本文所描述和要求保护的发明并不局限于本文披露的特定实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本发明的几方面的例示性说明。任何等同的实施例连同这些实施例中一个或多个的组合旨在包含在本发明的范围内。
本文引用了多个参考，其披露内容通过引用以其全文并入本文。进一步通过以下实例来描述本发明，这些实例不应理解为限制本发明的范围。
实例
实例1：PoAMG文库的构建
如下构建PoAMG文库：
设计在一个或多个靶位点处具有NNK或一个或多个所希望的突变的正向或反向引物，这些靶位点彼此具有15bp的重叠。通过以下条件使用适当的模板质粒DNA(例如含有JPO-0001基因的质粒DNA)进行反向PCR，即通过反向定向引物来扩增整个质粒DNA序列。通过QIAquick凝胶提取试剂盒[凯杰公司(QIAGEN)]来纯化所得PCR片段，然后将其引入大肠杆菌ECOS感受态大肠杆菌DH5α[立邦基因股份有限公司(NIPPON GENE CO.,LTD.)]中。通过MagExtractor质粒提取试剂盒[东洋公司(TOYOBO)]从大肠杆菌转化体中提取质粒DNA，然后将其引入黑曲霉感受态细胞中。
PCR反应混合物：
PrimeSTAR Max DNA聚合酶[宝生物公司(TaKaRa)]
总计25μl
1.0μl模板DNA(1ng/μl)
9.5μl H2O
12.5μl 2x PrimeSTAR Max预混物
1.0μl正向引物(5μM)
1.0μl反向引物(5μM)
PCR程序：
98℃/2min
25x(98℃/10sec，60℃/15sec，72℃/2min)
10℃/保持
实例2：筛选更好的热稳定性
将如实例1中构建的枯草芽孢杆菌文库在含有COVE液体培养基(2.0g/L蔗糖、2.0g/L异麦芽糖、2.0g/L麦芽糖、4.9mg/L、0.2ml/L5N NaOH、10ml/L COVE盐、10ml/L 1M乙酰胺)的96孔或24孔MTP中在32℃发酵3天。然后，在几种温度下通过如下所述的pNPG测定来测量培养物上清液中的AMG活性。
pNPG热稳定性测定：
将含有所希望的酶的培养物上清液与相同体积的pH 5.0 200mM NaOAc缓冲液混合。将二十微升该混合物分配于96孔板或8联PCR管中，然后在多种温度下通过热循环仪加热30min。将那些样品与含有0.1％(w/v)pNPG[和光株式会社(wako)]的10μl底物溶液于pH5.0 200mM NaOAc缓冲液中混合，并且在70℃下孵育20min以进行酶反应。反应后，添加60μl的0.1M硼砂缓冲液以停止反应。取出八十微升的反应上清液并且通过光度计读取其OD405值以评估酶活性。
表1a.PoAMG变体与它们的亲本anPAV498或JPO-0001(anPAV498带前导肽/前肽)相比的相对活性的列表
| 名称 | 80℃/75℃下的相对活性(％) |
| AnPav498 | 13％ |
| JPO-009 | 16％ |
| JPO-011 | 15％ |
| JPO-012 | 15％ |
| JPO-013 | 17％ |
| JPO-020 | 20％ |
| 名称 | 80℃/70℃下的相对活性(％) |
| JPO-001 | 10％ |
| JPO-004 | 29％ |
| JPO-009 | 13％ |
| JPO-014 | 21％ |
| JPO-020 | 16％ |
| JPO-021 | 30％ |
| JPO-052 | 33％ |
| 名称 | 79℃/70℃下的相对活性(％) |
| JPO-001 | 23％ |
| JPO-021 | 46％ |
| JPO-022 | 39％ |
| JPO-023 | 44％ |
| JPO-025 | 51％ |
| JPO-027 | 49％ |
| JPO-029 | 37％ |
| 名称 | 77℃/70℃下的相对活性(％) |
| JPO-001 | 72％ |
| JPO-029 | 82％ |
| JPO-047 | 80％ |
| JPO-048 | 90％ |
| JPO-049 | 84％ |
| JPO-050 | 86％ |
| JPO-064 | 87％ |
| 名称 | 79℃/77℃下的相对活性(％) |
| JPO-001 | 36％ |
| JPO-029 | 51％ |
| JPO-047 | 45％ |
| JPO-048 | 81％ |
| JPO-049 | 53％ |
| JPO-050 | 58％ |
| JPO-064 | 65％ |
表1b.PoAMG变体与它们的亲本JPO-022相比的相对活性的列表
| 名称 | 77℃/70℃下的相对活性(％) |
| JPO-022 | 60％ |
| JPO-027 | 67％ |
| JPO-042 | 8％ |
| JPO-044 | 86％ |
| JPO-045 | 67％ |
| JPO-046 | 48％ |
| 名称 | 77℃/70℃下的相对活性(％) |
| JPO-022 | 76％ |
| JPO-023 | 75％ |
| JPO-025 | 80％ |
| JPO-027 | 84％ |
| JPO-058 | 92％ |
| JPO-059 | 88％ |
| JPO-060 | 86％ |
| JPO-061 | 83％ |
| JPO-062 | 87％ |
表1c.PoAMG变体与它们的亲本JPO-063相比的相对活性的列表
| 名称 | 79℃/77℃下的相对活性(％) |
| JPO-063 | 91％ |
| JPO-066 | 96％ |
| JPO-071 | 89％ |
| JPO-072 | 84％ |
| JPO-074 | 103％ |
| JPO-075 | 86％ |
| JPO-076 | 92％ |
| JPO-077 | 95％ |
| JPO-078 | 88％ |
| JPO-079 | 100％ |
| 名称 | 82℃/70℃下的相对活性(％) |
| JPO-063 | 21％ |
| JPO-093 | 43％ |
| JPO-081 | 25％ |
| JPO-088 | 39％ |
| JPO-094 | 38％ |
| JPO-096 | 38％ |
| JPO-106 | 53％ |
| 名称 | 83℃/80℃下的相对活性(％) |
| JPO-063 | 46％ |
| JPO-051 | 44％ |
| JPO-096 | 64％ |
| JPO-106 | 88％ |
| JPO-110 | 81％ |
| JPO-111 | 100％ |
| JPO-112 | 86％ |
| JPO-113 | 83％ |
| JPO-114 | 47％ |
| JPO-115 | 90％ |
表1d.PoAMG变体与它们的亲本JPO-096相比的相对活性的列表
| 名称 | 83℃/80℃下的相对活性(％) |
| JPO-051 | 20％ |
| JPO-096 | 43％ |
| JPO-109 | 51％ |
| JPO-126 | 33％ |
| JPO-129 | 48％ |
| JPO-130 | 18％ |
| JPO-131 | 51％ |
| JPO-132 | 34％ |
表1e.PoAMG变体与它们的亲本JPO-129相比的相对活性的列表
| 名称 | 84℃/80℃下的相对活性(％) |
| JPO-129 | 62％ |
| JPO-156 | 51％ |
| JPO-160 | 34％ |
| JPO-161 | 41％ |
| JPO-162 | 49％ |
| JPO-163 | 21％ |
| JPO-164 | 57％ |
| JPO-165 | 77％ |
表1f.PoAMG变体与它们的亲本JPO-166相比的相对活性的列表
| 名称 | 84℃/75℃下的相对活性(％) |
| JPO-166 | 19％ |
| JPO-167 | 66％ |
| JPO-168 | 58％ |
| JPO-169 | 53％ |
| JPO-171 | 47％ |
| JPO-172 | 98％ |
表2.PoAMG成熟序列的变体中的氨基酸取代
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实例3：黑曲霉的发酵
将黑曲霉菌株在旋转摇床上在含有100ml MU1和4ml 50％尿素的500ml带挡板的烧瓶中在220rpm，30℃下发酵。将培养液离心(10,000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物倾析分开。
实例4：PoAMG(JPO-001)变体的纯化
通过阳离子交换色谱法纯化PoAMG变体。将各自的峰级分单独合并，并用20mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)透析，然后使用离心过滤装置(Vivaspin Turbo 15，赛多利斯公司(Sartorius))浓缩样品。通过A280值确定酶浓度。
实例5：热稳定性测定(TSA)
将纯化的酶用50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司(Invitrogen))混合。将18μl的混合物溶液转移至LightCycler 480多孔板384(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))中并将板密封。TSA的设备参数：
仪器：LightCycler 480实时PCR***(罗氏应用科学部(Roche AppliedScience))
扫描速率：0.02℃/sec
扫描范围：37℃-96℃
积分时间：1.0sec
激发波长465nm
发射波长580nm
将获得的荧光信号归一化到0和1的范围内。将Td定义为信号强度为0.5的温度。热稳定性改善列于表3中，其中PoAMG变体的Td表示为anPAV498为0。
实例6：PoAMG活性测定
通过GOD-POD方法进行的麦芽糖糊精(DE11)测定
底物溶液
30g麦芽糖糊精(来自松谷化学工业公司(MATSUTANI chemical industry Co.,Ltd.)的pindex#2)
100ml 120mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0
葡萄糖CII测试试剂盒(日本和光纯药工业株式会社(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.))
将20μl的酶样品与100μl的底物溶液混合，并且在设定温度下孵育2小时。将样品在铝块上冷却3min，然后将10μl的反应溶液与590ul的1M Tris-HCl(pH 8.0)混合以停止反应。将10μl的溶液与200μl的测试试剂盒的工作溶液混合，然后在室温下静置15min。读取A505处的吸光度。活性作为表示为anPAV498的PoAMG变体的相对活性列于表3中。
表3
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实例7：AMG在面包中的保鲜效果(第1部分)
用根据表4的配方以直接发酵工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合3+7min成面团。将面团分成450g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在32℃和86％相对湿度下醒发55min。将醒发的面团在箱式烤炉中在230℃下烘焙35min。
表4.
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表5.根据表4用不同的酶添加制备七种面团处理物；AMG3300BG是用于烘焙的可商购的AMG(诺维信公司，丹麦)；AMG NL和AMG anPAV498是PoAMG的人工变体(参见表2)。
烘焙面团，并将所得面包在烘焙后2小时包装在密封塑料袋中，并且在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司(Stable microsystems)，戈德尔明(Godalmine)，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形(force-deformation)。烘焙产品的力-变形可以用40mm直径的圆柱形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将圆柱形探头下压25mm厚面包切片40％应力时，记录该圆柱形探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表6(坚度)和表7(弹性)中。
不含酶的新鲜面包(对照)具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，坚度随时间增加而弹性降低。用于烘焙应用的传统AMG(例如Goldcrust)不影响坚度或弹性。
以25或50mgEP/kg加入的AMG anPAV498以及以50mgEP/kg面粉加入的AMG NL改善(降低)初始坚度并减少坚度随时间的增加。以25或50mgEP/kg加入的AMG anPAV498以及以50mgEP/kg面粉加入的AMG NL改善(增加)初始弹性并防止弹性随时间的损失。
表6.具有根据表5的酶处理物的面包在第1、3和7天的坚度(g)
表7.具有根据表5的酶处理物的面包在第1、3和7天的弹性(g)
使用在70％EtOH中的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)从面包瓤中提取糖。将面包瓤(180mg)添加到提取缓冲液(1.8ml)中，并在混合期间在70℃下孵育20分钟。将面包瓤在离心机中以12,000rpm离心5分钟，取出500μl的上清液并使用20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)+10mg/L纤维二糖作为内标稀释200倍。在具有CarboPac PA1柱的ICS-5000HPLC***上定量提取的糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)。基于葡萄糖、果糖和麦芽糖的水平，使用甜度强度因子计算理论甜度。表8中的甜度因子基于Portmann MO,Birch G.J Sci Food Agric[食品与农业科学杂志]69(3):275-81,1995中的测定。
表8.
简单糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)的量以及基于单个糖的量计算的理论甜度可见于表9中。所有三种AMG都增加了简单糖的量。与相比，AMG NL和AMGanPAV498两者在产生葡萄糖方面更有效，从而产生更高的理论甜度。
表9.从用根据表5的酶处理的面团中提取的糖的量(g/kg面包瓤)
实例8.AMG的保鲜效果(第2部分)
用根据表10的配方以直接发酵工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合3+7min成面团。将面团分成450g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在32℃和86％相对湿度下醒发55min。将醒发的面团在箱式烤炉中在230℃下烘焙35min。
表10
表11.用不同的酶添加制备七种面团处理物
烘焙面团，并将所得面包在烘焙后2小时包装在密封塑料袋中，并且在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。
用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用40mm直径的圆柱形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将圆柱形探头在25mm厚面包切片上下压40％应力时，记录该圆柱形探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表12(坚度)和表13(弹性)中。
不含酶的新鲜面包(对照)具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，坚度随时间增加而弹性降低。用于烘焙应用的传统AMG(例如Goldcrust)不影响坚度或弹性(实例7)。
以25或50mgEP/kg加入的所有三种AMG(AMG anPAV498、JPO124和JPO172)改善(降低)初始坚度并减少坚度随时间的增加。以25或50mgEP/kg加入的所有三种AMG(AMGanPAV498、JPO124和JPO172)改善(增加)初始弹性并防止弹性随时间的损失。
表12.具有根据表11的酶处理物的面包在第1、3和7天的坚度(g)。
表13.具有根据表11的酶处理物的面包在第1、3和7天的弹性(％)。
使用在70％EtOH中的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)从面包瓤中提取糖。将面包瓤(180mg)添加到提取缓冲液(1.8ml)中，并在混合期间在70℃下孵育20分钟。将面包瓤在离心机中以12,000rpm离心5分钟，取出500μl的上清液并使用20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)+10mg/L纤维二糖作为内标稀释200倍。在具有CarboPac PA1柱的ICS-5000HPLC***上定量提取的糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)。基于葡萄糖、果糖和麦芽糖的水平，使用甜度强度因子计算理论甜度。表13中的甜度因子
基于Portmann MO,Birch G.J Sci Food Agric[食品与农业科学杂志]69(3):275-81,1995中的测定。
表14.
简单糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)的量以及基于单个糖的量计算的理论甜度可见于表1中。所有三种AMG都增加了简单糖的量并增加了计算的甜度。AMG的剂量越高，产生的葡萄糖越多，理论甜度越高。在增加葡萄糖和理论甜度方面，JPO0172和JPO124比AMG anPAV498更有效。
表15.从用根据表11的酶处理的面包中提取的简单糖(g/kg面包瓤)。
作为环境温度下面包储存时间的函数的面包瓤中糖水平的变化可见于16-20中。作为AMG的产品的葡萄糖水平(表16)随面包储存时间的推移是稳定的。从面包瓤中提取的其他糖果糖(表17)、麦芽糖(表18)、麦芽三糖(表19)和麦芽四糖(表20)的情况相同表16.作为酶处理的函数的面包瓤中葡萄糖水平(g/kg面包瓤)随时间的变化。
表17.作为酶处理的函数的面包瓤中麦芽糖水平(g/kg面包瓤)随时间的变化。
表18.作为酶处理的函数的面包瓤中果糖水平(g/kg面包瓤)随时间的变化。
表19.作为酶处理的函数的面包瓤中麦芽三糖水平(g/kg面包瓤)随时间的变化。
表20.作为酶处理的函数的面包瓤中麦芽四糖水平(g/kg面包瓤)随时间的变化。
实例9.AMG与Novamyl组合的保鲜效果
用根据表21的配方以直接发酵工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合3+7min成面团。将面团分成450g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在32℃和86％相对湿度下醒发55min。将醒发的面团在箱式烤炉中在230℃下烘焙35min。
表21.
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表22.用不同的酶添加制备七种处理物
将面包在烘焙后2小时包装在密封塑料袋中，并且在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用40mm直径的圆柱形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将圆柱形探头在25mm厚面包切片上下压40％应力时，记录该圆柱形探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表23(坚度)和表24(弹性)中。不含酶的新鲜面包(对照)具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，坚度随时间增加而弹性降低。
AMG anPAV498改善初始坚度和弹性，并减少坚度和弹性随时间的变化。
3D不影响初始坚度或弹性。然而，/>3D减少坚度和弹性随时间的变化。
与没有酶或单独使用3D相比，AMG anPAV498和/>3D的组合改善了初始坚度和弹性，以及坚度和弹性随时间的变化。该组合使面包在储存7天后具有最佳的坚度和弹性。
表23.具有根据表22的酶处理物的面包在第1、3和7天的坚度(g)。
表24.具有根据表22的酶处理物的面包在第1、3和7天的弹性(％).
使用在70％EtOH中的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)从面包瓤中提取糖。将面包瓤(180mg)添加到提取缓冲液(1.8ml)中，并在混合期间在70℃下孵育20分钟。将面包瓤在离心机中以12,000rpm离心5分钟，取出500μl的上清液并使用20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)+10mg/L纤维二糖作为内标稀释200倍。在具有CarboPac PA1柱的ICS-5000HPLC***上定量提取的糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)。基于葡萄糖、果糖和麦芽糖的水平，使用甜度强度因子计算理论甜度。表25中的甜度因子基于Portmann MO,Birch G.J Sci Food Agric[食品与农业科学杂志]69(3):275-81,1995中的测定。
表25.
从面包中提取的不同糖的量和基于糖量的理论计算的甜度可见于表26中。AMGanPAV498的剂量越高，面包中的葡萄糖越多。3D的剂量越高，面团中的麦芽糖和麦芽三糖越多。AMG anPAV498和/>3D的组合增加葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。计算的甜度的主要因素是AMG anPAV498的剂量，因为葡萄糖比麦芽糖和麦芽三糖对甜度的影响更大。
表26.从用根据表22的酶处理的面包中提取的简单糖(g/kg面包瓤)。
实例10.AMG NL的剂量反应(部分糖替代)
用根据表27的配方以直接发酵工艺烘焙面包。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合3+7min成面团。将面团分成450g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在32℃和86％相对湿度下醒发55min。将醒发的面团在箱式烤炉中在230℃下烘焙25min。
表27.4000SG是用于烘焙的可商购的真菌淀粉酶(诺维信公司，丹麦)，/>BG是用于烘焙的可商购的细菌木聚糖酶(诺维信公司，丹麦)。
表28.用不同的酶添加制备八种处理物，AMG是用于烘焙的可商购的AMG(诺维信公司，丹麦)，JA126是生淀粉降解淀粉酶(诺维信公司，丹麦)。
由受过训练的面包师评估面团特性，并使用食品体积测定仪(Volscan profiler)(稳定微***公司，戈德尔明，英国)测定面包的体积。评估结果可见于表29中。含有44.6和53.6mgEP/kg面粉的AMG NL的面团(面团5和6)具有与含有112.5mgEP/kg面粉的AMG的面团相似的体积、相同的拉伸性和弹性，但面团的粘性和柔软性略低。
表29.
| 面团 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 粘性 | 5 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| 柔软度 | 5 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| 拉伸性 | 5 | 3 | 3 | 3 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 弹性 | 5 | 6 | 6 | 6 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 比容ml/g | 4.4 | 4.3 | 4.2 | 4.2 | 4.3 | 4.2 | 4.1 | 4.1 |
使用在70％EtOH中的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)从面包瓤中提取糖。将面包瓤(180mg)添加到提取缓冲液(1.8ml)中，并在混合期间在70℃下孵育20分钟。将面包瓤在离心机中以12,000rpm离心5分钟，取出500μl的上清液并使用20mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)+10mg/L纤维二糖作为内标稀释200倍。在具有CarboPac PA1柱的ICS-5000HPLC***上定量提取的糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)。基于葡萄糖、果糖和麦芽糖的水平，使用甜度强度因子计算理论甜度。表30中的甜度因子基于Portmann MO,Birch G.J Sci Food Agric[食品与农业科学杂志]69(3):275-81,1995中的测定。
表30.
糖的量(g/kg面包瓤)和理论甜度可见于表31中。基于这些糖水平，可以计算出含有44.6mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的AMG NL的面团比含有112.5mgEP/kg面粉的AMG的面团具有更高的理论甜度，并且含有53.6mgEP/kg面粉AMG NL的面团比含有112.5mgEP/kg面粉的AMG/>的面团产生更多的葡萄糖。
表31.
实例11.AMG anPAV498的剂量反应(部分糖替代)
用根据表32的配方以直接发酵工艺烘焙面包。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合3+7min成面团。将面团分成450g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在32℃和86％相对湿度下醒发55min。将醒发的面团在箱式烤炉中在230℃下烘焙25min。
表32.
表33.用不同的酶添加制备八种处理物
由受过训练的面包师评估面团特性，并使用食品体积测定仪(稳定微***公司，戈德尔明，英国)测定面包的体积。评估结果可见于表34中。所有的面团都具有相似的面团特性并生产出具有相似体积的面包。
表34.
| 面团 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 粘性 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 柔软度 | 5 | 5 | 5 | 5 | 6 | 6 | 6 | 6 |
| 拉伸性 | 5 | 5 | 5 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
| 弹性 | 5 | 6 | 6 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 平均比容ml/g | 4.3 | 4.4 | 4.3 | 4.3 | 4.3 | 4.2 | 4.2 | 4.2 |
| 比容指数％ | 100 | 101 | 100 | 99 | 100 | 97 | 98 | 96 |
使用在70％EtOH中的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)从面包瓤中提取糖。将面包瓤(180mg)添加到提取缓冲液(1.8ml)中，并在混合期间在70℃下孵育20分钟。将面包瓤在离心机中以12 000rpm离心5分钟，取出500μl的上清液并使用20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)+10mg/L纤维二糖作为内标稀释200倍。在具有CarboPac PA1柱的ICS-5000HPLC***上定量提取的糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)。基于葡萄糖、果糖和麦芽糖的水平，使用甜度强度因子计算理论甜度。表35中的甜度因子基于Portmann MO,Birch G.J Sci Food Agric[食品与农业科学杂志]69(3):275-81,1995中的测定。
表35.
糖的量(g/kg面包瓤)和理论甜度可见于表36中。基于这些糖水平，可以计算出含有24.1mgEP/kg面粉的AMG anPAV498的面团比含有112.5mgEP/kg面粉的的面团产生更高的理论甜度，并且含有27.1mgEP/kg面粉AMG anPAV498的面团比含有112.5mgPE/kg面粉的/>的面团产生更多的葡萄糖。
表36.
实例12./>与AMG NL和AMG anPAV498的甜度的感官比较(部分糖替代)
用根据表37的配方以直接发酵工艺烘焙面包。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合3+8min成面团。将面团分成350g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在35℃和85％相对湿度下醒发85和115min。将醒发的面团在箱式烤炉中在230℃下烘焙25min。
表37.
| 烘焙物％ | |
| 面粉 | 100 |
| 水 | 57 |
| 新鲜酵母 | 3 |
| 盐 | 1 |
| 糖 | 5 |
| 抗坏血酸 | 0.06 |
| Fungamyl 4000SG | 7ppm |
| Panzea BG | 25ppm |
表38.用不同的酶添加制备三种处理物
表39.面团特性
| 面团 | 1 | 2 | 3 |
| 平均比容ml/g | 7.1 | 7.0 | 7.2 |
| 比容指数％ | 100 | 99 | 102 |
使用在70％EtOH中的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)从面包瓤中提取糖。将面包瓤(180mg)添加到提取缓冲液(1.8ml)中，并在混合期间在70℃下孵育20分钟。将面包瓤在离心机中以12 000rpm离心5分钟，取出500μl的上清液并使用20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)+10mg/L纤维二糖作为内标稀释200倍。在具有CarboPac PA1柱的ICS-5000HPLC***上定量提取的糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)。基于葡萄糖、果糖和麦芽糖的水平，使用甜度强度因子计算理论甜度。表40中的甜度因子基于Portmann MO,Birch G.J Sci Food Agric[食品与农业科学杂志]69(3):275-81,1995中的测定。
表40.
糖的量(mg/g面包瓤)及其理论甜度可见于表41表316中。AMG产生更多的葡萄糖，而AMG NL和AMG anPAV498的麦芽糖水平更高。然而，52.2mgEP/kg面粉的AMGNL和23.6mgEP/kg面粉的AMG anPAV498的计算的甜度实际上与124.3mgEP/kg面粉的高得多的剂量的/>的甜度相似(表32)。
表41.
| 面团 | 1 | 2 | 3 |
| 葡萄糖，mg/g | 18.9 | 17.7 | 15.9 |
| 果糖，mg/g | 8.8 | 8.3 | 7.9 |
| 麦芽糖，mg/g | 4.8 | 8.6 | 11.5 |
| 麦芽三糖，mg/g | M | M | M |
| 甜度计算* | 19.3 | 18.9 | 18.2 |
感官评估方法
为每个感官评估者提供每种面包类型的2片(第1天)。以盲态、3位数编码和随机顺序提供样品。有7名评估者参与了评估。在从弱到极强的1-9分强度量表上评估面包瓤甜味的强度。
样品之间的甜度没有显著差异，并且样品之间也没有发现其他显著差异。
表42.
| 面团 | 1 | 2 | 3 |
| 甜味 | 5.6 | 6.0 | 5.6 |
实例13.感官评估，全糖替代
吐司面包(模制面包，敞口式)-面团中未添加蔗糖
表43.配方，％(w/w)：
*)酶溶液：
对照(＝无淀粉降解酶和葡糖淀粉酶)
酶溶液A：0.35mg生淀粉降解α-淀粉酶(JA126)蛋白/kg面粉和112.5mg葡糖淀粉酶蛋白/kg面粉/>
酶溶液B：0.35mg生淀粉降解α-淀粉酶(JA126)蛋白/kg面粉，和53.6mg AMG NL葡糖淀粉酶蛋白/kg面粉
酶溶液C：0,35mg生淀粉降解α-淀粉酶(JA126)蛋白/kg面粉，和21.1mg AMGanPAV498葡糖淀粉酶蛋白/kg面粉
表44.烘焙程序
| 程序 | 时间，min |
| 低速/高速(17rpm/35rpm)混合 | 3/7 |
| 混合后温度，℃ | 25.3-26.2 |
| 地板时间(floor time) | 20 |
| 在烘焙烤盘中称量320g | 10 |
| 工作台静置/板凳时间(bench time) | 15 |
| 在32℃下的发酵时间，min | 80 |
| 在230℃的温度下烘焙 | 25 |
感官评估方法
为每名评估者提供每种面包类型的2片(第1天)。以盲态、3位数编码和随机顺序提供样品。通过手工来评估湿润度和柔软性，通过品尝面包瓤来评估甜味。在从弱到极强的1-9分强度量表上评估感官属性。有4名经过培训的评估者参与了评估。进行了两次重复的感官评定。
结果：
面团具有相同的粘性和柔软度。AMG-NL提供了拉伸性更好，弹性更差的面团(表45)。
表45.面团参数
| 对照 | A | B | C | |
| 粘性 | 5 | 6 | 6 | 6 |
| 柔软度 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 拉伸性 | 5 | 5 | 6 | 5 |
| 弹性 | 5 | 5 | 4 | 5 |
表45中显示的数据表明，溶液C提供了最湿润和最柔软的面包，而甜味没有显著差异。在样品之间没有发现其他差异。面包比容没有显著差异(表46)。
表46.比容指数，％
| 对照 | A | B | C |
| 100 | 101 | 102 | 103 |
表47.烘焙后1天，酶面包的平均感官评分。
| 感官属性 | A | B | C | p值 |
| 湿润度 | 5.1AB | 5.0B | 5.8B | 0.0338 |
| 柔软性 | 5.1B | 5.1B | 6.6A | 0.002 |
| 甜味 | 4.0 | 3.6 | 4.0 | 0.7998 |
Tukey HSD：感官属性内的平均值(后面有不同字母)在样品之间有显著差异(P<0.05)
使用在70％EtOH中的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)从面包瓤中提取糖。将面包瓤(180mg)添加到提取缓冲液(1.8ml)中，并在混合期间在70℃下孵育20分钟。将面包瓤在离心机中以12 000rpm离心5分钟，取出500μl的上清液并使用20mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)+10mg/L纤维二糖作为内标稀释200倍。在具有CarboPac PA1柱的ICS-5000HPLC***上定量提取的糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和麦芽三糖)。
使用B和C的面包中的葡萄糖水平略高于使用A的(表48)，这意味着与对照A相比，B和C的甜度有所提高。使用B和C的比使用A的麦芽糖更高。
表48.面包中的糖水平(mg/g面包瓤)
实例14.AMG在美国中种发酵配方中的保鲜效果
用根据表49的配方以中种发酵工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将酵头(sponge)的成分在针式混合器中分别以50rpm和150rpm混合2+1min成面团。将酵头在27℃和75％rH下醒发2小时。将酵头与面团的其余成分一起放入针式混合器中，并分别以50rpm和150rpm混合1+3分钟成面团。
将面团分成400克的块，弄圆，压片并放入带盖的烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在43℃和80％相对湿度下醒发60min。将醒发的面团在旋转式烤炉(revolving oven)中在215℃下烘焙20min。
表49.配方
表50.用不同的酶添加制备七种处理物
将面包在烘焙后2小时包装在密封塑料袋中，并且在室温下储存直至分析。用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用40mm直径的圆柱形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将圆柱形探头在25mm厚面包切片上下压40％应力时，记录该圆柱形探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。质地评估的结果分别可见于表46和表47中。
对照面包的坚度随着储存时间增加(表51)并失去弹性(表52)，也称为面包老化。
令人惊讶的是，该研究中测试的所有三种AMG都具有抗老化效果，表现为随储存时间坚度的增加较少-表46。AMG对弹性也有积极效果，其从较高水平开始，并且在储存14天后，AMG面包比对照具有更高的弹性-表47。
表51.随储存时间的坚度
表52.随储存时间的弹性
实例15.热稳定AMG在蛋糕应用中的用途
使用市售蛋糕混合物(Tegral Satin Creame Cake Neutral SG，焙乐道(Puratos)，英国)，使用袋上的配方烘焙松饼。
表53.松饼配方。
表54.用不同的酶添加制备九种松饼处理物：
1.空白
2.JPO124 100mgEP/kg蛋糕混合物
3.JPO124 900mgEP/kg蛋糕混合物
4.JPO172 100mgEP/kg蛋糕混合物
5.JPO172 900mgEP/kg蛋糕混合物
6.OC50 1250MANU/kg蛋糕混合物(6.25mgEP/kg蛋糕混合物)
7.OC50 2500MANU/kg蛋糕混合物(12.5mgEP/kg蛋糕混合物)
8.OC50 3750MANU/kg蛋糕混合物(18.75mgEP/kg蛋糕混合物)
9.OC50 5000MANU/kg蛋糕混合物(25mgEP/kg蛋糕混合物)表55.松饼制作工艺：
1.将根据表48的蛋、油和水添加到搅拌碗中。
2.将根据表49的单个处理物添加到每个面团中
3.将蛋糕混合物添加到搅拌碗中，并用手动混合器以速度1混合1min成蛋糕面糊。
4.使用裱花袋将蛋糕面糊置于松饼罐中(每个罐50g面糊)。
5.将松饼在箱式烤炉中烘焙28分钟，顶部温度为200℃，底部温度为180℃，并且托盘倒置在烤炉底部。
6.使松饼冷却1h，并将其置于具有气调的密封塑料袋中，并在室温下储存直至分析。
使用进行质构分析(TPA)的质地分析仪来分析松饼的质地特性。在对松饼的分析中，在与松饼罐相同的高度处切掉松饼的顶部，留下3cm的松饼。将松饼置于质地分析仪上，并以1mm/s的恒定向上和向下速度将25mm直径的圆柱形探头向下压入松饼中两次至7mm深度，两次压缩之间间隔5秒。记录作为时间(秒)和距离(mm)的函数的力(克)。
·第一次压缩的峰值力对应于松饼的硬度(克)。
·第二次压缩的力-距离曲线下方的面积除以第一次压缩的力-距离曲线下方的面积对应于黏聚性，以％表示。
·第一次向上移动的力-距离曲线下方的面积除以第一次向下移动的下方的面积对应于回弹性，以％表示。
下表56说明了在松饼中使用JPO172和JPO124的益处。用JPO124和JPO172处理的松饼具有令人惊讶地改善的(更高的)回弹性和黏聚性；甚至高于其他已知的用于改善蛋糕新鲜度的解决方案。
表56.不同酶处理的松饼的质地特性。
实例16.AMGAMG NL、AMG AnPAV498、JP172和Novamyl/>的新鲜度感官比较
用根据表57的配方以直接发酵工艺烘焙面包。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合3+6min成面团。将面团分成450g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在32℃和86％相对湿度下醒发55min。将醒发的面团在箱式烤炉中在230℃下烘焙35min。
表57.
| 烘焙物％ | |
| 面粉 | 100 |
| 水 | 57 |
| 新鲜酵母 | 4.5 |
| 盐 | 1.5 |
| 糖 | 1.5 |
| 丙酸钙 | 0.25 |
| 抗坏血酸 | 0.04 |
| Fungamyl 4000SG | 7ppm |
| Panzea BG | 25ppm |
表58.用不同的酶添加制备处理物
*)注：本实验将AMG AnPAV498错误地过量添加了十倍；其应为50mgEP/kg，但为500mgEP/kg。
感官评估方法
在第1天和第8天进行感官评估。在评估之前举行训练课程，确定相关属性和程序(表59)。通过手工来评估质地。有4-5名经过培训的评估者参与了评估。为每名评估者提供每种面包类型的2片(不带外皮)。以盲态、3位数编码和随机顺序提供样品。在从弱到极强的1-9分强度量表上评估感官属性的强度。在每个评估日进行两次重复的感官评定。
表59.感官属性、程序和评估的描述
感官结果
对于第1天和第8天的所有评估的新鲜度属性(湿润度、柔软性和可折叠性)，JPO172和AMG AnPAV498评分最高。AMG与对照无差异。
表60.第1天面包感官评分的平均值。
表61.第8天面包感官评分的平均值.
实例17.前24小时AMG的保鲜效果
用根据表62的配方以直接发酵迷你烘焙工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将成分在螺旋混合器中以90rpm混合4分钟成面团。将面团分成20g的块，弄圆，并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在36℃和80％相对湿度下在传送带上醒发55min。将醒发的面团在小型隧道式烤炉中在210℃下烘焙12min。
表62.
表63.用不同的酶添加制备十种面团处理物
1.对照(空白)
2.Datem 0.5％
3.JPO172 50mgEP/kg面粉
4.Opticake 50BG 200MANU/kg
5.JPO124 50mgEP/kg面粉
6.Novmayl 3D 440MANU/kg面粉
7.SSL 0.5％
8.蒸馏的单甘油酯0.5％
9.Novamyl 10 000BG 750MANU/kg
10.Lipopan Extra 200LU/kg
烘焙面团，并将所得面包在烘焙后0.5小时包装在密封塑料袋中，并且在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。
用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用20mm直径的球形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将探头在25mm厚面包切片上下压40％应力时，记录该探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表64(坚度)和表65(弹性)中。
不含酶的新鲜面包(对照)具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，坚度随时间增加而弹性降低。用于烘焙应用的传统AMG(例如AMG)不影响坚度或弹性(参见实例7)。
以50mgEP/kg加入的本文中的两种AMG(JPO124和JPO172)改善(降低)坚度随时间的增加。以50mgEP/kg加入的两种AMG(JPO124和JPO172)均改善(增加)初始弹性并防止弹性随时间的损失。
表64.具有根据表63的酶处理物的面包在烘焙后2、5和24小时的坚度(g)。
表65.具有根据表63的酶处理物的面包在烘焙后2、5和24小时的弹性(g)。
实例18.高剂量AMG的保鲜效果
用根据表66的配方以直接发酵迷你烘焙工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将成分在螺旋混合器中以90rpm混合4分钟成面团。将面团分成20g的块，弄圆，并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在36℃和80％相对湿度下在传送带上醒发55min。将醒发的面团在小型隧道式烤炉中在210℃下烘焙12min。
表66.
表67.用不同的酶添加制备十种处理物
1.对照
2.Opticake 50BG 200MANU/kg
3.JPO124 50mgEP/kg面粉
4.JPO124 100mgEP/kg面粉
5.JPO124 300mgEP/kg面粉
6.JPO124 500mgEP/kg面粉
7.JPO172 50mgEP/kg面粉
8.JPO172 100mgEP/kg面粉
9.JPO172 300mgEP/kg面粉
10.JPO172 500mgEP/kg面粉
烘焙面团，并将所得面包在烘焙后0.5小时包装在密封塑料袋中，并且在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。
用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用20mm直径的球形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将探头在25mm厚面包切片上下压40％应力时，记录该探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表68(坚度)和表69(弹性)中。
不含酶的新鲜面包(对照)具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，坚度随时间增加而弹性降低。用于烘焙应用的传统AMG(例如AMG)不影响坚度或弹性(参见实例7)。
两种新的AMG(JPO124和JPO172)改善(降低)初始坚度和坚度随时间的增加。剂量越高，坚度随时间的增加越低。两种AMG(JPO124和JPO172)均改善(增加)初始弹性并防止弹性随时间的损失。AMG的剂量越高，初始弹性越高，并且弹性随时间的损失越低。
表68.具有根据表67的酶处理物的面包在第1天和第7天的坚度(g)。
表69.具有根据表67的酶处理物的面包在第1天和第7天的弹性(％)。
实例19.AMG与Lip182组合的保鲜效果
用根据表10的配方以直接发酵迷你烘焙工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将成分在螺旋混合器中以90rpm混合4分钟成面团。将面团分成20g的块，弄圆，并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在36℃和80％相对湿度下在传送带上醒发55min。将醒发的面团在小型隧道式烤炉中在210℃下烘焙12min。
表70.
表71.用不同的酶添加制备各种处理物
烘焙面团，并将所得面包在烘焙后0.5小时包装在密封塑料袋中，并且在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。
用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用20mm直径的球形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将探头在25mm厚面包切片上下压40％应力时，记录该探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表72(坚度)和表73(弹性)中。
不含酶的新鲜面包(对照)具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，坚度随时间增加而弹性降低。用于烘焙应用的传统AMG(例如AMG)不影响坚度或弹性(参见实例7)。
AMG JPO172改善(降低)初始坚度和坚度随时间的增加。与对照面包相比，单独使用脂肪酶Lip182对坚度没有影响。Lip182和JPO172的组合产生在第1天和第7天均具有最低坚度的面包。
AMG JPO172改善(增加)初始弹性并防止弹性随时间的损失。脂肪酶Lip182具有与对照相似的弹性，并且JPO172和Lip182的组合与单独使用JPO172相似。
表72.具有根据表71的酶处理物的面包在第1天和第7天的坚度(g)。
表73.具有根据表71的酶处理物的面包在第1天和第7天的弹性(％)。
/>
实例20.AMG与Gluzyme Fortis组合的保鲜效果
用根据表74的配方以直接发酵迷你烘焙工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将成分在螺旋混合器中以90rpm混合4分钟成面团。将面团分成20g的块，弄圆，并放入烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在36℃和80％相对湿度下在传送带上醒发55min。将醒发的面团在小型隧道式烤炉中在210℃下烘焙12min。
表74.
表75.用不同的酶添加制备各种处理物.添加另外的水以获得相似的面团流变性。/>
烘焙面团，并将所得面包在烘焙后0.5小时包装在密封塑料袋中，并且在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。
用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用20mm直径的球形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将探头在25mm厚面包切片上下压40％应力时，记录该探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表76(坚度)和表77(弹性)中。
不含酶的新鲜面包(对照)具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，坚度随时间增加而弹性降低。用于烘焙应用的传统AMG(例如Goldcrust)不影响坚度或弹性(实例7)。
AMG JPO172改善(降低)初始坚度和坚度随时间的增加。与对照面包相比，单独使用葡萄糖氧化酶(Gluzyme Fortis)在一定程度上降低坚度。葡萄糖氧化酶和JPO172的组合产生在第1天和第7天均具有最低坚度的面包。
AMG JPO172改善(增加)初始弹性并防止弹性随时间的损失。单独使用葡萄糖氧化酶(Gluzyme Fortis)具有与对照相似的弹性，并且JPO172和葡萄糖氧化酶的组合与单独使用JPO172相似。
表76.具有根据表75的酶处理物的面包在第1天和第7天的坚度(g)。
表77.具有根据表75的酶处理物的面包在第1天和第7天的弹性(％)。
实例21.AMGAMG NL、AMG AnPAV498和JPO124在中种发酵配方中的保鲜效果的感官比较
用根据表78的配方以中种发酵工艺烘焙面包。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将酵头的成分在针式混合器中分别以50rpm和150rpm混合2+1min成面团。将酵头在27℃和75％rH下醒发2小时。将酵头与面团的其余成分一起放入针式混合器中，并分别以50rpm和150rpm混合1+3分钟成面团。
将面团分成400克的块，弄圆，压片并放入带盖的烘焙烤盘中。将装有面团的烤盘在43℃和80％相对湿度下醒发60min。将醒发的面团在旋转式烤炉中在215℃下烘焙20min。
表78.配方
表79.用不同的酶添加制备处理物
/>
感官评估方法
在第1天和第7天进行感官评估。在评估之前举行培训课程，确定相关属性和程序(表80)。通过手工来评估质地。有5名经过培训的评估者参与了评估。为每名评估者提供每种面包类型的2片。以盲态、3位数编码和随机顺序提供样品。在从弱到极强的1-9分强度量表上评估感官属性的强度。在每个评估日进行两次重复的感官评定。
表80.感官属性、程序和评估的描述
感官结果
对于第7天的湿润度、柔软性和可折叠性，JPO124评分最高，其次是AMG AnPAV498。
表81.第1天面包感官评分的平均值.
表82.第7天面包感官评分的平均值.
实例22.JPO172在低pH黑麦/小麦混合酸面团面包中的保鲜效果
用根据表83的配方以直接发酵工艺烘焙面包。根据表84进行了九种不同的处理。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合6+4min成面团。将面团分成650g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。最终面团的pH是4.3。将面包在有盖的烤盘中烘焙以使所有面包的体积相同。将装有面团的烤盘在32℃和85％相对湿度下醒发60min。将醒发的面团在箱式烤炉中在225℃下烘焙20min。
表83.配方
表84.处理。
烘焙后，使面包冷却2小时，并将其放入密封塑料袋中。将面包在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用40mm直径的圆柱形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将圆柱形探头下压时，记录该圆柱形探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在40％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表85(坚度)和表86(弹性)中。
未经任何处理的新鲜面包(对照)具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，面包变得更坚硬并失去弹性。具有JPO172的面包在烘焙后的坚度较低，并且具有较高的弹性。与对照面包相比，硬度和弹性随时间的变化也减少，使得具有JPO172的面包在第7天比对照面包在第1天更不坚硬且更有弹性。
表85.各种处理对坚度的影响
| 处理 | 第1天 | 第3天 | 第7天 |
| 对照 | 1316 | 2331 | 3040 |
| 12.5mgEP/kg面粉JPO172 | 1012 | 1592 | 2072 |
| 25mgEP/kg面粉JPO172 | 872 | 1217 | 1668 |
| 50mgEP/kg面粉JPO172 | 858 | 1129 | 1312 |
| 100mgEP/kg面粉JPO172 | 879 | 992 | 1097 |
表86.各种处理对弹性的影响。
| 处理 | 第1天 | 第3天 | 第7天 |
| 对照 | 55.4 | 44.9 | 43.6 |
| 12.5mgEP/kg面粉JPO172 | 61.9 | 54.0 | 48.2 |
| 25mgEP/kg面粉JPO172 | 64.6 | 60.6 | 54.6 |
| 50mgEP/kg面粉JPO172 | 65.4 | 63.1 | 61.1 |
| 100mgEP/kg面粉JPO172 | 66.2 | 65.6 | 65.0 |
实例23.JPO172在玉米粉圆饼中的保鲜效果
使用表87中的配方制作玉米粉圆饼，根据表88添加不同的酶溶液。将成分在针式混合器中分别以低速和高速混合1+6分钟。使面团静置2分钟。将面团分成30g的块并做成卷状。以两步法烘焙玉米粉圆饼，其中首先使面团块在160℃下通过热机烘烤6秒，其次将玉米粉圆饼烘焙20秒，翻转并再烘焙20秒。
表87.配方。
| 成分 | 量，％ |
| 面粉 | 100.0 |
| 水 | 54 |
| 烘焙粉末 | 3.0 |
| 甘油 | 4.5 |
| 盐 | 2.0 |
| 糖 | 2.00 |
| 柠檬酸 | 0.40 |
| 丙酸钙 | 0.50 |
| DMG | 0.50 |
| SSL | 0.25 |
| 瓜尔胶 | 0.30 |
| 葵花籽油 | 6.00 |
表88.用不同的酶添加制备各种处理物。
烘焙后，使玉米粉圆饼冷却30分钟，并将其放入密封塑料袋中，在室温下储存直至分析。
使用玉米粉圆饼/油酥糕点爆裂装置(Tortilla/Pastry Burst Rig)(HDP/TPB)，用质地分析仪(稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估玉米粉圆饼的质地特性。在测试程序中，将样品保持在两个板之间，并驱动1"球形探头穿过中心。测量拉伸样品的力和距离，并分别用作“变形阻力”和“拉伸性”的指示。
玉米粉圆饼典型地用作包裹物，其中玉米粉圆饼包裹在不同类型的馅料周围。一个重要的参数是描述抗破裂性的拉伸性。新鲜的玉米粉圆饼是可拉伸的。然而，如表90所示，它在储存时很快失去这种拉伸性。JPO172的添加产生在28天后具有与新鲜烘焙的玉米粉圆饼相似的拉伸性的玉米粉圆饼。
表89.玉米粉圆饼的变形阻力，g
| 处理 | 剂量 | 第1天 | 第14天 | 第28天 |
| JPO172，mgEP/kg面粉 | 0 | 663 | 482 | 333 |
| 400 | 727 | 634 | 492 | |
| 2000 | 868 | 616 | 498 | |
| Sensea Wrap，ppm | 0 | 663 | 482 | 333 |
| 200 | 649 | 543 | 420 | |
| 400 | 689 | 542 | 445 |
表90.玉米粉圆饼的延伸性(mm)
实例24.JPO172在布里欧面包中的保鲜效果
用根据表91的配方以直接发酵工艺烘焙面包。根据表92进行了八种不同的处理。将成分在螺旋混合器中分别以17rpm和35rpm混合4+8min成面团。将面团分成420g的块，弄圆，压片并放入烘焙烤盘中。将面团在30℃和75％rH下醒发2.5小时。将面包在175℃下烘焙34分钟。
表91.配方。
表92.处理
烘焙后，使面包冷却2小时，并将其放入密封塑料袋中。将面包在室温下储存直至分析。
用质地分析仪(TA-XT plus，稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估每个面包的质地。面包瓤质地特性是通过烘焙产品的坚度(与“硬度”相同并与“柔软度”相对)和弹性来表征的。用于测量坚度和弹性的标准方法是基于烘焙产品的力-变形。烘焙产品的力-变形可以用34mm直径的圆柱形探头来进行。当以1mm/秒的变形速度将圆柱形探头下压25mm厚面包切片28％应力时，记录该圆柱形探头上的力。然后，将该探头在此位置保持30秒同时记录该力，然后探头返回到其初始位置。
坚度(以克计)被定义为将探头压缩至25％应力(对应于压缩6.25mm到具有25mm厚度的面包瓤切片中)所需的力。
弹性(以％计)被定义为在28％应力下压缩30秒后记录的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝40s处的力)除以将探头压入瓤中10mm所需的力(对应于具有25mm厚度的面包切片在时间＝10s处的力)乘以100。
质地分析的结果可见于表93(坚度)和表94(弹性)中。
未经任何处理的新鲜面包(对照)在烘焙后具有低坚度和高弹性，随着面包的储存，面包变得更坚硬并失去弹性。与对照相比，具有JPO172的面包在烘焙后的坚度较低，并且具有较高的弹性。当储存具有JPO172的面包时，坚度和弹性仅轻微改变，导致具有JPO172的布里欧面包在第60天具有与对照在第1天相似的坚度和更好的弹性。
表93.各种处理对坚度的影响。
表94.各种处理对弹性的影响。
| 处理 | 第1天 | 第21天 | 第39天 | 第60天 |
| 对照 | 52.3 | 42.2 | 40.4 | 40.9 |
| 50mgEP JP0172\Kg面粉 | 58.0 | 51.9 | 51.0 | 50.0 |
| 75mgEP JP0172\Kg面粉 | 59.9 | 55.5 | 54.9 | 53.1 |
| 100mgEP JP0172\Kg面粉 | 60.0 | 56.7 | 55.5 | 54.8 |
| 150mgEP JP0172\Kg面粉 | 60.3 | 57.2 | 56.5 | 55.9 |
| 200mgEP JP0172\Kg面粉 | 60.5 | 56.9 | 56.6 | 55.9 |
实例25.黎巴嫩双层扁平面包中的JPO124和JPO172
用根据表95的成分以直接发酵工艺烘焙黎巴嫩双层扁平面包。根据表96进行了七种不同的处理。将成分在螺旋混合器中以35rpm混合2.5分钟成面团。将面团在32℃和82％rH下醒发40分钟。将面团擀成2mm的厚度，并从该薄片上切下20cm的圆形面团片。将圆形面团片在室温下醒发20分钟。将面团放入750℃的烤炉中并烘焙9秒。
表95.配方。
| 成分 | 量，％ |
| 面粉 | 100.0 |
| 水 | 51 |
| 速溶干酵母 | 0.7 |
| 蔗糖 | 4.0 |
| 盐 | 0.4 |
| 丙酸钙 | 0.20 |
表96.处理。
烘焙后，使扁平面包冷却30分钟，然后将其放入密封塑料袋中，在室温下储存直至分析。
在第3天，使用玉米粉圆饼/油酥糕点爆裂装置(HDP/TPB)，用质地分析仪(稳定微***公司，戈德尔明，英国)评估黎巴嫩扁平面包的质地特性。在测试程序中，将样品保持在两个板之间，并驱动4mm球形探头穿过中心。测量拉伸样品的力和距离，并分别用作“变形阻力”和“拉伸性”的指示。
在第3天进行感官评估。在评估之前举行培训课程，确定相关属性和程序(表ZZ)。通过手工来评估质地。有4-5名经过培训的评估者参与了评估。为每名评估者提供每种面包类型的2片(不带外皮)。以盲态、3位数编码和随机顺序提供样品。在从弱到极强的1-9分强度量表上评估感官属性的强度。在每个评估日进行两次重复的感官评定。
表97.感官评估。
感官评估的结果可见于表98中，质地评估的结果可见于表99中。对于所有感官参数，没有添加任何酶的面包(对照)评分较低(2-3)。对于所有参数，具有JPO172和JPO124的扁平面包评分较高，并且剂量越高，评分越高。在感官评估中检测到的改善在质地分析中也可看出，其中与不含任何酶的扁平面包(对照)相比，具有JPO124或JPO172的面包具有更高的拉伸性。
表98.黎巴嫩扁平面包在第3天的感官评估.
表99.黎巴嫩扁平面包在第3天的质地评估.
| 韧性 | 拉伸性 | |
| 对照 | 271 | 3.8 |
| 400mgEP/kg JPO172 | 266 | 5.1 |
| 2000mgEP/kg JPO172 | 204 | 5.0 |
| 4000mgEP/kg JPO172 | 217 | 5.5 |
| 400mgEP/kg JPO124 | 323 | 4.9 |
| 4000mgEP/kg JPO124 | 268 | 6.4 |
Claims (18)
1.一种生产烘焙或部分烘焙产品的方法，所述方法包括：
a)提供面团，该面团包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少70％同一性的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体；以及
b)烘焙或部分烘焙该面团以生产烘焙或部分烘焙产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该烘焙或部分烘焙产品是一种类型的面包，优选地模制面包、吐司面包、敞口式面包、小圆面包、菲诺面包、哈玛姆面包、萨莫利面包、长棍面包、布里欧面包、汉堡包用小圆面包、面包卷、黑面包、全麦面包、高油糖面包、麸皮面包、扁平面包、玉米粉圆饼，或饼干，蛋糕或糕点。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中该亲本葡糖淀粉酶来自青霉属的物种，优选地来自草酸青霉、米克青霉、罗氏青霉或光孢青霉。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该成熟变体在对应于SEQ ID NO:1中的位置1、2、4、6、7、11、31、34、65、79、103、132、327、445、447、481、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含至少一个氨基酸修饰。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的位置1、2、4、11、65、79和327的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的R1A、P2N、P4S、P11F、T65A、K79V和Q327F的一个或多个或全部位置处包含取代。
6.根据权利要求4所述的方法，其中该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的位置1、6、7、31、34、79、103、132、445、447、481、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQ ID NO:1中的R1A、G6S、G7T、R31F、K34Y、K79V、S103N、A132P、D445N、V447S、S481P、D566T、T568V、Q594R和F595S的一个或多个或全部位置处包含取代。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQID NO:1中的位置1、6、7、31、34、50、79、103、132、445、447、481、484、501、539、566、568、594和595的一个或多个或全部位置处包含取代，优选地，该至少一个氨基酸修饰在对应于SEQID NO:1中的R1A、G6S、G7T、R31F、K34Y、E50R、K79V、S103N、A132P、D445N、V447S、S481P、T484P、E501A、N539P、D566T、T568V、Q594R和F595S的一个或多个或全部位置处包含取代。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该成熟热稳定变体相对于其亲本具有至少3℃，优选地至少4℃、5℃、6℃、7℃或8℃的热稳定性改善(Td)。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该成熟热稳定变体与其亲本相比在91℃具有至少150，优选地至少200，更优选地至少250，最优选地至少300的相对活性。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中与不添加任何葡糖淀粉酶制成的对照相比，最终全烘焙后的该烘焙或部分烘焙产品当冷却至室温、包装在密封容器中并在室温下储存直至分析时，具有降低的初始坚度和/或增加的初始弹性，和/或在1、7或14天后具有降低的坚度增加和/或更高的弹性。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中最终全烘焙后的该烘焙或部分烘焙产品具有与用两倍量的成熟葡糖淀粉酶制成的对照产品至少相同的甜度，该成熟葡糖淀粉酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO:10中。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中该成熟热稳定变体葡糖淀粉酶以0.01-1,000mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，优选地0.01-500mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，甚至更优选地0.1-100mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量包含在该面团中。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该面团还包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：α-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、生淀粉降解α-淀粉酶、β淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素分解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶；优选地，该一种或多种另外的酶以01-1,000mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，优选地0.01-500mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量，甚至更优选地0.1-100mg酶蛋白(mgEP)/kg面粉的量被包含。
14.一种烘焙组合物，其包含根据权利要求1-9中任一项所定义的亲本葡糖淀粉酶的成熟热稳定变体。
15.根据权利要求14所述的烘焙组合物，其还包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：α-淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、β淀粉酶、氨肽酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素分解酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶、葡聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、ɑ-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素分解酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
16.根据权利要求14或15所述的烘焙组合物，其还包含面粉、糖、酵母、盐和/或脂肪。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的烘焙组合物用于以下的用途：在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中替代糖、增加烘焙或部分烘焙产品的甜度、在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中减少面团中的糖的量和/或在生产烘焙或部分烘焙产品的方法中延长烘焙或部分烘焙产品的保质期。
18.根据权利要求14-16中任一项所述的烘焙组合物在根据权利要求1-13中任一项所述的方法中的用途，由此与不添加任何葡糖淀粉酶制成的对照相比，最终全烘焙后的该烘焙或部分烘焙产品当冷却至室温、包装在密封容器中并在室温下储存直至分析时，具有降低的初始坚度和/或增加的初始弹性，和/或在1、7或14天后具有降低的坚度增加和/或更高的弹性。
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2021
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