CN116463455B - 分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的方法及相关引物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分析鉴定马铃薯S‑RNase基因型的方法及相关引物。所述的引物包括由37对引物对组成的引物对组。本发明的引物能够简单便捷且快速、准确地鉴定马铃薯品种自交不亲和相关基因S‑RNase的基因型，在马铃薯育种亲本选择及杂交研究方面具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于马铃薯S-RNase基因型鉴定技术领域，特别涉及一种分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的方法及相关引物。
背景技术
马铃薯是茄科（Solanacea）茄属（Solanum）中具有可食用块茎的部分物种的总称，原产南美洲安第斯山系。目前，已发现马铃薯有235个种，其中有包括普通栽培种和原始栽培种在内的7个栽培种，228个野生种。这些物种的倍性也比较复杂，有二倍体（如S.phureja）、三倍体（如S. juzepczukii）四倍体（如S.tuberosum）和五倍体（如S.curtilobum）等，且多为二倍体。各材料间能否杂交结实是自交或杂交育种成功的先决条件。
自交不亲和（self-incompatibility，SI）普遍存在于被子植物中，通过蛋白之间的互作作用抑制花粉管在其柱头的延伸或花粉的萌发，由一个高度特异性的S位点控制。尽管不同的S位点之间具有相似的形态学和遗传表现，但他们的机制却是独立进化的，基于不同细胞群体的作用，每个机制有一个独立的S基因。
SI通常分为两种类型：孢子体型（Sporophytic self-incompatibility，SSI）和配子体型（Gametophytic self-incompatibility，GSI），蔷薇科（Rosaceae）、茄科（solanaceae）、车前科（plantaginaceae）属于配子体型。在配子体型的自交不亲和体系中，高度特异性的S位点上存在的两个独立的基因为：S-RNase基因和S-locus F-Box(SLF)基因，其中，S-RNase基因决定了雌蕊特异性；SLF基因决定了雄蕊的特异性。马铃薯是配子体型自交不亲和，S-RNase基因编码一个T2 RNase，与花粉中的SLF作用，识别花粉的来源。
S-RNase基因有多个同源基因，组成了一个基因家族。早在1990年，马铃薯野生二倍体材料S.chacones中的S-RNase S2和S3就得到了克隆研究（Xu et al, 1990）。2016年，Dzidzienyo等设计引物研究16份野生马铃薯二倍体材料的S-RNase（Dzidzienyo et al,2016）。2021年Ma等设计了一套针对野生二倍体马铃薯S-RNase的cDNA全长扩增引物，得到了14个S-RNase的全长cDNA，在GenBank中登录号MZ561404.1~MZ561417.1（Ma et al,2021）。现有的S-RNase基因克隆引物虽也可用于分析检测，但因为仅测的是编码区序列，每种针对S-RNase基因只有一对引物，如果编码基因的引物结合部位出现变异，就可能无法得到扩增产物出现假阴性结果。且许多真核基因都有内含子，使用克隆引物也可能会因为检测反应时间的设置或内含子过大，如S-RNase 9（表1），对基因组DNA进行PCR检测，就不能扩增出条带，从而产生假阴性结果。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的方法及相关引物。旨在全面准确快速地鉴定分析马铃薯材料的S-RNase家族成员。一方面，通过将已报道马铃薯材料的全基因组序列与已报道14个S-RNase mRNA全序列进行序列比对，确定其含有的S-RNase基因型的全基因序列（包括内含子序列在内），并据此设计有针对性的引物。另一方面，对于上述材料中不含有的S-RNase基因型，在保存的种质资源中以Ma等（Ma, et al,2021）报道的该S-RNase基因型mRNA全序列引物对总DNA进行扩增，以及对扩增产物进行测序，进而获得该S-RNase基因型的全基因序列，并据此设计有针对性的引物。整体上，除S-RNase 4和S-RNase13未得到全基因序列外，其它S-RNase均设计了针对不同位置、扩增产物500 bp以内的2~5对不等，合计37对引物，可用于快速、准确的鉴定分析马铃薯S-RNase的种类。
本发明的第一方面，提供一种用于分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的引物对组，包括用于鉴定马铃薯S-RNase1基因、S-RNase2基因、S-RNase3基因、S-RNase5基因、S-RNase6基因、S-RNase7基因、S-RNase8基因、S-RNase9基因、S-RNase10基因、S-RNase11基因、S-RNase12基因以及S-RNase14基因的37对如下所示的引物对：
1）用于鉴定S-RNase 1基因的引物对S-RNase 1-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：1和 SEQ ID NO：2所示的前向引物和后向引物；
2）用于鉴定S-RNase 1基因的引物对S-RNase 1-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：3和 SEQ ID NO：4所示的前向引物和后向引物；
3）用于鉴定S-RNase 2基因的引物对S-RNase 2-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：5和 SEQ ID NO：6所示的前向引物和后向引物；
4）用于鉴定S-RNase 2基因的引物对S-RNase 2-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：7和 SEQ ID NO：8所示的前向引物和后向引物；
5）用于鉴定S-RNase 2基因的引物对S-RNase 2-3：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：9和 SEQ ID NO：10所示的前向引物和后向引物；
6）用于鉴定S-RNase 3基因的引物对S-RNase 3-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：11和 SEQ ID NO：12所示的前向引物和后向引物；
7）用于鉴定S-RNase 3基因的引物对S-RNase 3-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：13和 SEQ ID NO：14所示的前向引物和后向引物；
8）用于鉴定S-RNase 5基因的引物对S-RNase 5-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：15和 SEQ ID NO：16所示的前向引物和后向引物；
9）用于鉴定S-RNase 5基因的引物对S-RNase 5-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：17和 SEQ ID NO：18所示的前向引物和后向引物；
10）用于鉴定S-RNase 5基因的引物对S-RNase 5-3：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：19和 SEQ ID NO：20所示的前向引物和后向引物；
11）用于鉴定S-RNase 5基因的引物对S-RNase 5-4：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：21和 SEQ ID NO：22所示的前向引物和后向引物；
12）用于鉴定S-RNase 6基因的引物对S-RNase 6-1：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：23和 SEQ ID NO：24所示的前向引物和后向引物；
13）用于鉴定S-RNase 6基因的引物对S-RNase 6-2：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：25和 SEQ ID NO：26所示的前向引物和后向引物；
14）用于鉴定S-RNase 6基因的引物对S-RNase 6-3：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：27和 SEQ ID NO：28所示的前向引物和后向引物；
15）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-1：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：29和 SEQ ID NO：30所示的前向引物和后向引物；
16）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-2：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：31和 SEQ ID NO：32所示的前向引物和后向引物；
17）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-3：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：33和 SEQ ID NO：34所示的前向引物和后向引物；
18）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-4：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：35和 SEQ ID NO：36所示的前向引物和后向引物；
19）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-5：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：37和 SEQ ID NO：38所示的前向引物和后向引物；
20）用于鉴定S-RNase 8基因的引物对S-RNase 8-1：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：39和 SEQ ID NO：40所示的前向引物和后向引物；
21）用于鉴定S-RNase 8基因的引物对S-RNase 8-2：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：41和 SEQ ID NO：42所示的前向引物和后向引物；
22）用于鉴定S-RNase 8基因的引物对S-RNase 8-3：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：43和 SEQ ID NO：44所示的前向引物和后向引物；
23）用于鉴定S-RNase 8基因的引物对S-RNase 8-4：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：45和 SEQ ID NO：46所示的前向引物和后向引物；
24）用于鉴定S-RNase 9基因的引物对S-RNase 9-1：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：47和 SEQ ID NO：48所示的前向引物和后向引物；
25）用于鉴定S-RNase 9基因的引物对S-RNase 9-2：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：49和 SEQ ID NO：50所示的前向引物和后向引物；
26）用于鉴定S-RNase 10基因的引物对S-RNase 10-1：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：51和 SEQ ID NO：52所示的前向引物和后向引物；
27）用于鉴定S-RNase 10基因的引物对S-RNase 10-2：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：53和 SEQ ID NO：54所示的前向引物和后向引物；
28）用于鉴定S-RNase 10基因的引物对S-RNase 10-3：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：55和 SEQ ID NO：56所示的前向引物和后向引物；
29）用于鉴定S-RNase 11基因的引物对S-RNase 11-1：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：57和 SEQ ID NO：58所示的前向引物和后向引物；
30）用于鉴定S-RNase 11基因的引物对S-RNase 11-2：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：59和 SEQ ID NO：60所示的前向引物和后向引物；
31）用于鉴定S-RNase 12基因的引物对S-RNase 12-1：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：61和 SEQ ID NO：62所示的前向引物和后向引物；
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34）用于鉴定S-RNase 14基因的引物对S-RNase 14-1：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：67和 SEQ ID NO：68所示的前向引物和后向引物；
35）用于鉴定S-RNase 14基因的引物对S-RNase 14-2：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：69和 SEQ ID NO：70所示的前向引物和后向引物；
36）用于鉴定S-RNase 14基因的引物对S-RNase 14-3：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：71和 SEQ ID NO：72所示的前向引物和后向引物；
37）用于鉴定S-RNase 14基因的引物对S-RNase 14-4：包括核苷酸序列分别如SEQID NO：73和 SEQ ID NO：74所示的前向引物和后向引物。
本发明的另一方面，提供一种马铃薯S-RNase基因型的全基因序列，其选自如SEQID NO：75、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77之一所示的全基因序列。
本发明的另一方面，提供用于扩增或检测前述马铃薯S-RNase基因型的全基因序列的特异性引物。
本发明的另一方面，提供一种用于分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的试剂盒，其包含前述的引物对组。
本发明的另一方面，提供一种分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的方法，所述的方法包括：
1）提取待测样本的总DNA；
2）分别采用如前所述的引物对组中的引物对对提取的总DNA进行PCR扩增；
3）对PCR扩增产物进行分析判断。
进一步地，所述待测样本为二倍体马铃薯或四倍体马铃薯。
进一步地，所述PCR反应体系以20 μL计，包括：2×Taq Master Mix 10 μL、前向引物0.5 μL、后向引物0.5 μL、DNA 1 μL、ddH2O 8 μL；
PCR反应程序为：95 ℃预变性3 s；94 ℃ 25 s、50~65 ℃ 25s、72℃ 15s进行32个循环；最后72 ℃延伸5 min。进一步地，对PCR扩增产物进行分析判断的方法包括：使用电泳检测PCR扩增产物，根据电泳图谱中出现条带数及大小判定结果。
本发明的另一方面，提供所述的马铃薯S-RNase基因型的全基因序列在马铃薯S-RNase基因型检测中的用途，所述的用途包括用于核酸杂交检测、分子标记或制备检测试剂盒。
本发明的另一方面，提供所述的马铃薯S-RNase基因型的全基因序列在制备免疫组化检测试剂中的应用。具体的，将S-RNase编码序列与载体链接，表达并纯化蛋白后，将这些蛋白作为抗原以常规的抗体制备方法制备抗S-RNase蛋白的抗体，并利用这些抗体蛋白检测S-RNase蛋白的种类。
本发明的另一方面，提供一种马铃薯杂交育种方法，包括如下步骤：（1）鉴定候选材料S-RNase基因型；（2）根据S-RNase基因型鉴定结果选择亲本组合以及选择合适的育种路线；（3）获得满足预期目标的新品系。
进一步地，所述育种路线选自自交纯系制作、轮回杂交选育或分解育种。
与Ma等（Ma, et al, 2021）针对S-RNase编码区的cDNA（mRNA）进行分析鉴定相比，使用本发明的引物对组分析鉴定马铃薯S-RNase基因型具有如下优势：1、检测结果更准确。本发明建立在仔细分析S-RNase基因序列的基础上，设计的同一S-RNase多对引物检测，结果间具有交叉验证的特性，检测的结果更准确和令人信服。2、实验技能要求更低。由于RNA的稳定性较差，需要的实验技能较高，实验技能不够容易产生假阴性结果，而本发明针对的是核基因，也就是DNA序列，不需提取RNA。3、操作步骤更简单。提取RNA后要反转录成cDNA，而本发明提取DNA后可直接进行检测。
附图说明
图1为S-RNase10测序峰图与已报道序列比对结果；上：S-RNase10测序峰图；下：已报道序列；
图2为部分四倍体马铃薯材料中S-RNase检测验证结果；
图3为KM群体部分材料中S-RNase 9-1检测结果；样品顺序：1:50 bp Marker；2:阳性对照；3:阴性对照；4:km-3；5:km-4；6:km-6；7:km-7；8:km-8；9:km-10；10:km-12；11:km-13；12:km-15；13:km-16；14:km-17；15:km-19；16:km-22；17:km-23；18:km-25；19:km-27；20:km-29；21:km-30；22:km-31；
图4为DL群体部分材料中S-RNase 6-2检测结果；样品顺序：上：1:MK；2:阳性对照；3:阴性对照；4:DL-1；5:DL-3；6:DL-4；7:DL-6； 8:DL-7；9:DL-8；10:DL-9；11:DL-10；12:DL-13；13:DL-19；14:DL-20；15:DL-22；16:DL-23；17:DL-24；18:DL-26；19:DL-27；20:DL-31；21:DL-33；22:DL-34；23:DL-36；24:DL-37；25:DL-39；下：1:MK；2:阳性对照；3:阴性对照；4:DL-40；5:DL-41；6:DL-42；7:DL-43；8:DL-44；9:DL-45；10:DL-46；11:DL-48；12:DL-49；13:DL-50；14:DL-51；15:DL-52；16:DL-53；17:DL-54；18:DL-55；19:DL-56；20:DL-57；21:DL-58；22:DL-61；23:DL-65。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 用于分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的引物对组序列设计
1. 序列获得：
1.1 获得S-RNase1、2、3、5、7、8、9、12和14基因的全基因序列：
从GeneBank中下载S-RNase1~14编码区全序列（登录号：MZ561404.1～MZ561417.1），与“合作88”、“Atlantic” 、“DM 1-3 516 R44”和S.candolleana（下载地址见表2）全基因组序列进行比对分析，发现上述4个材料中的S-RNase组成分别为S-RNase 2/5/8/12、S-RNase 1/2/7/14、S-RNase 3和S-RNase 9，并从相应基因组中挖掘获得S-RNase1、2、3、5、7、8、9、12和14基因的全基因序列。
1.2 获得S-RNase6、10和11基因的全基因序列：
以Ma等报道的S-RNase6、10和11的引物（Ma, et al, 2021），对保存的野生二倍体马铃薯进行PCR检测，并将阳性条带测序。将测序结果与MZ561409.1（S-RNase 6 mRNA）、MZ561413.1（S-RNase 10 mRNA）、MZ561414.1（S-RNase 11 mRNA）进行比对，发现得到的S-RNase 6基因序列比GeneBank中的相应mRNA序列多了110 bp的内含子，起始密码前多了54bp的上游序列、终止密码后多了32 bp的下游序列；S-RNase 10基因序列比已登录序列多了80 bp的内含子，起始密码前多了53 bp的上游序列、终止密码后多了78bp的下游序列；S-RNase 11基因序列比MZ561414.1多了86 bp内含子、68 bp的上游序列、终止密码后多了147bp的下游序列。以上3个S-RNase的序列均未见报道。经分析，发现扩增序列具有S-RNase的特征，即扩增产物就是相应的S-RNase。即获得了S-RNase6、10和11基因的全基因序列，分别如下所示：
>S-RNase 6
ATGTTTAAATCACAGGTCACATCAGTTATTTTCATGTTGCTTCTTGCTCTTTCTCCAACCTATGGTCATTTCGAGTATTTCCAACTAGTTTTAACATGGCCACCATGTTTTTGCCACAGAGACTCCAGAATTCGGAAATGTTTCTATAATCCGGTTCCCAACAACTTCACAATTCATGGTCTTTGGCCAGATAACAAATCCATGCGTTTGAATAACTGTGATCCCAATTTTAACTATCGGATCATCCCGGTAATTACAATATTAATTTTTCAAGCGCTTACAAATTTTCCTATTCATTTTTTTTTTCCTATTCAGTCTATTCGTTTTCATCTAATGCTGTCTTTTCCTATTGTTAACAGGAGGGTGATAAACGCTTCAATCTTGACAAGCGCTGGCCTCAGTTAGAAAATACCAAAGAATTTGCTTTGGCAAAGCAACCATTCTGGGAAAAGGAATATAAAAGGCATGGAACGTGTTGCAAAAATCTGTATAACCAAGCAACATACTTTGATTTGGCCATGAATTTAATAGACAAGTTTGATGTTTTGACAATTCTCAGAGATCAGGGAATCATCCCTGGAACGTACTATGTCGTTAAAAAAGTAGAAGATGCCATCAAGAAAGTTACCCATCAACTTCCTAAGCTCAACTGCGTAGTCAATAATATTGTAGGACAGGAACTAAGTGAGATAGTCATATGTTTCGAACCTAATGGAAAGTATGTGGATAGTTGTCGTCGACCTGGGTCATGCAACCAAAATGGAAATATGGAAAGGATTTTTTTTCGATGA
>S-RNase 10
GATGGAGGACTATTATATATACTAGGATGAAAATAAATTCTTTAAACTGCAAAATGTTTAAACCACAAGTCACATCAGCACTCTTCATTGTACTTTTTCTTTCTCCCACTTATGGGAATTTCGATCAATTGCAACTGGTATTGACATGGCCAGCATCATTTTGCCACGCCAATAATTGTAAGCGGATAGCTCCAAAAAACTTTACGATTCACGGGCTTTGGCCGGATAAAGAGGGAACACTGCTGCAGAACTGCAAGCCATTACCTACGTATATACATTTCGCGGTAAAGTATTATTTTCTGCAGAACCTGTACCTCTTCTATCTGTCAATTTACTGAAAAGATTCTTTTCTAAATACTTACAGGATAAGATGCTCAATGATCTTGACAAAAACTGGATTCAATTGAAGTATCCAGAACGTTTTGCTCGAAAGGAACAACCTTTATGGCTATATCAATATCTAAAGCATGGATCCTGTTGTCAGAAAGTTTACGATCAAAACACGTATTTTAGTCTAGCTTTGCGCTTAAAAGACAGGTTTGATCTTCTGAGAACTCTCCAATTACATCGAATTGTTCCTGGATCAAGTTATACATTTAAAGAAATCTTTGATGCCGTCAAGACAGTTAGTCAAACAGATCCTGACGTCAAGTGTACAAAAGGAGCACAGGAACTATATGAGATAGGCATATGTTTCACCCCAAATGCAGATAGTCTGATTCCTTGTCGTCAAAGTGAAACATGTGACAAATCGAAAGAAATCTTTTTTCGTAGATGAACAATTCCATTCGTTTTTATTTTATATATGTTAAGTGTTATGAAGTACAAAACTTACAGAATAAAGTGTTATGAAATG
>S-RNase 11
CCAACCCTGTGGGTCCTCAAAATGCTTATAATCTATGGATAGCTTTAGATTATACTGTAGGTTTTGTACTTCATAACACTTTGTTCCGTAGGTTTTGTACTTTATTACACTTGCCATAAATAAAATATAAAGCAATGAAAGTCGTTCAACTACGGAAAAATATGTCTTTCGATTTGTCGCATGTATCACTTTGACGACAAGGAATCAGACTATCTGCATTTGGGGTGAAACATATGCCTATCTCATATAGTTCCTGTGCTCCTTTTGTACACTTGACGTCAGGATCTGTTTGAGTAACTGTCTTGACCGCATCAAGGATTTCTTTAAATGTATAACTTGATCCAGGAACAATTCGATGTATTTGGAGAGTCCTCAGAAGATCAAACCTGTCTTTTAAGCGCAAAGCTAGACTAAAATACCTGTTTTGATCATAAACTTTCTGACAACAGGATCCATGCTTTAGATATTGATATTGCCATAAAGGTTGTTGATTTCGAGCATAATCTTCTGGATACTTCAATTGAATCCAGTTTTTGTCAAGATTATTGAGCATCTTATCCTGTAAGCATTTCGAAAAGAACCAATTCAGTAAATTGAACAGATAGAAATGGTACAGGTTCTGCAGAAAATAATGTTGTTGTTTACCCCGAAATTTCTATAATTAGGTTTTGGCTTGCAGTACTGCAGCAGCGTTCCCTCTTTATCCGGCCAAAGCCCGTGAATCGTAAAGTTGTTTGGAGCTATTCGCTCACAATTATTGAGGTAGCAAAATGATGCTGGCCATGTTAATACCAGTTGCAATGAATCGAAATCCCCATAAGTGGGAGATAGAACAAAAAGCACAATGAAGAGAGCTGATCTGATTTGTGGTTTAAACATTTTGAAGTTTGAACAATTTATTTTCATCCCTAGTATATATAATAGCTCTCTATGGGCCACCTGGG。
2. 引物设计：
2.1方法：针对获得的12个S-RNase基因的全基因序列分别设计引物；
2.2 引物设计原则：每对引物的扩增产物尽量控制在500 bp以内，使实验时间便于统一；每个S-RNase设计至少2对以上引物；
2.3 结果：得到37对引物对，如表3所示。
表3 S-RNase检测引物
3. 验证：分别以改良CTAB法提取二倍体野生马铃薯和部分四倍体栽培种马铃薯的总DNA，对上述设计出的S-RNase检测引物进行验证。
3.1 二倍体材料验证：对8份野生二倍体马铃薯中进行了上述37对引物的PCR扩增，发现产物大小与预期一致。对PCR产物测序，发现与已报道序列基本一致或多了内含子序列，如S-RNase 10，测序拼接的序列比NCBI中登录的MZ561413.1多出80bp的内含子，如图1所示。
3.2 四倍体材料验证：以GeneBank中登记的14条S-RNase序列与已公布的四倍体马铃薯品种“合作88”（C88）、“大西洋”（DXY）基因组进行序列比对分析，发现前者携带S-RNase 2、5、8和12，后者携带S-RNase 1、2、7和14，并以上述37对引物对云南师范大学薯类作物种质资源库保存的四倍体材料进行PCR检测，部分结果整理如图2所示。检测结果证实C88和DXY中的S-RNase构成与在基因组分析结果一致。其余的如在PB06中含有S-RNase 9，材料5号中携带S-RNase 10等。以上结果表明这套引物同样适用于四倍体材料。
实施例2 引物对组用于分析鉴定马铃薯S-RNase基因型
1、材料：马铃薯KM群体24份材料；
2、方法：
2.1 总DNA提取：DNA提取使用CTAB改良法，详细步骤参考李金璐等（2013）的方法（李金璐,王硕,于婧,王玲,周世良.一种改良的植物DNA提取方法[J].植物学报,2013,48(1):72-78.）；
2.2 PCR扩增：
2.3 电泳检测：1.5 %的琼脂糖凝胶，电泳20 min；
2.4 结果：该群体共24份材料，其中包含9个不同的S-RNase，分别是S-RNase 1、S-RNase 2、S-RNase 5、S-RNase 6、S-RNase 7、S-RNase 9、S-RNase 11、S-RNase12、S-RNase14。有8份材料中包含4个S-RNase，7份材料中含有3个S-RNase，4份材料中包含2个S-RNase，只有1份材料中含有5个S-RNase。在24份S群体材料中，S-RNase 1是检测到最多的S-RNase，有18份材料中包含此S-RNase，S-RNase 6在材料中检测到的数量最少，有两份材料中包含S-RNase 7。在S群体的S-RNase检测结果中，S-RNase 3、S-RNase 4、S-RNase 8、S-RNase10、S-RNase 13 五个S-RNase没有被检测到，如表6、图3所示。
实施例3 引物对组用于分析鉴定马铃薯S-RNase基因型
1、材料：马铃薯DL群体42份材料；
2、方法：
2.1 总DNA提取：DNA提取使用CTAB改良法，详细步骤参考李金璐等（2013）的方法（李金璐,王硕,于婧,王玲,周世良.一种改良的植物DNA提取方法[J].植物学报,2013,48(1):72-78.）；
2.2 PCR扩增：同实施例2；
2.3 电泳检测：1.5 %的琼脂糖凝胶，电泳20 min；
2.4 结果：马铃薯种质资源DL群体共42份材料，其中包含9个不同的S-RNase，分别是S-RNase 1、S-RNase 2、S-RNase 5、S-RNase 6、S-RNase 7、S-RNase 9、S-RNase 11、S-RNase12、S-RNase 14。有18份材料中包含3个S-RNase，14份材料中含有4个S-RNase，9份材料中包含2个S-RNase，只有1份材料中含有5个S-RNase。在42份DL群体材料中，S-RNase 12是检测到最多的S-RNase，有32份材料中包含此S-RNase，S-RNase 14在材料中检测到的数量最少，仅仅有一份材料中包含S-RNase 14。在DL群体的S-RNase检测结果中，S-RNase 3、S-RNase 4、S-RNase 8、S-RNase 10、S-RNase 13五个S-RNase没有被检测到，如表7、图4所示。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的引物对组，其特征在于，包括用于鉴定马铃薯S-RNase1基因、S-RNase2基因、S-RNase3基因、S-RNase5基因、S-RNase6基因、S-RNase7基因、S-RNase8基因、S-RNase9基因、S-RNase10基因、S-RNase11基因、S-RNase12基因以及S-RNase14基因的37对如下所示的引物对：
1）用于鉴定S-RNase 1基因的引物对S-RNase 1-1：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2所示的前向引物和后向引物；
2）用于鉴定S-RNase 1基因的引物对S-RNase 1-2：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和 SEQ ID NO：4所示的前向引物和后向引物；
3）用于鉴定S-RNase 2基因的引物对S-RNase 2-1：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和 SEQ ID NO：6所示的前向引物和后向引物；
4）用于鉴定S-RNase 2基因的引物对S-RNase 2-2：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和 SEQ ID NO：8所示的前向引物和后向引物；
5）用于鉴定S-RNase 2基因的引物对S-RNase 2-3：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9和 SEQ ID NO：10所示的前向引物和后向引物；
6）用于鉴定S-RNase 3基因的引物对S-RNase 3-1：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：11和 SEQ ID NO：12所示的前向引物和后向引物；
7）用于鉴定S-RNase 3基因的引物对S-RNase 3-2：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13和 SEQ ID NO：14所示的前向引物和后向引物；
8）用于鉴定S-RNase 5基因的引物对S-RNase 5-1：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：15和 SEQ ID NO：16所示的前向引物和后向引物；
9）用于鉴定S-RNase 5基因的引物对S-RNase 5-2：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：17和 SEQ ID NO：18所示的前向引物和后向引物；
10）用于鉴定S-RNase 5基因的引物对S-RNase 5-3：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：19和 SEQ ID NO：20所示的前向引物和后向引物；
11）用于鉴定S-RNase 5基因的引物对S-RNase 5-4：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：21和 SEQ ID NO：22所示的前向引物和后向引物；
12）用于鉴定S-RNase 6基因的引物对S-RNase 6-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：23和 SEQ ID NO：24所示的前向引物和后向引物；
13）用于鉴定S-RNase 6基因的引物对S-RNase 6-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：25和 SEQ ID NO：26所示的前向引物和后向引物；
14）用于鉴定S-RNase 6基因的引物对S-RNase 6-3：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：27和 SEQ ID NO：28所示的前向引物和后向引物；
15）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：29和 SEQ ID NO：30所示的前向引物和后向引物；
16）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：31和 SEQ ID NO：32所示的前向引物和后向引物；
17）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-3：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：33和 SEQ ID NO：34所示的前向引物和后向引物；
18）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-4：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：35和 SEQ ID NO：36所示的前向引物和后向引物；
19）用于鉴定S-RNase 7基因的引物对S-RNase 7-5：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：37和 SEQ ID NO：38所示的前向引物和后向引物；
20）用于鉴定S-RNase 8基因的引物对S-RNase 8-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：39和 SEQ ID NO：40所示的前向引物和后向引物；
21）用于鉴定S-RNase 8基因的引物对S-RNase 8-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：41和 SEQ ID NO：42所示的前向引物和后向引物；
22）用于鉴定S-RNase 8基因的引物对S-RNase 8-3：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：43和 SEQ ID NO：44所示的前向引物和后向引物；
23）用于鉴定S-RNase 8基因的引物对S-RNase 8-4：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：45和 SEQ ID NO：46所示的前向引物和后向引物；
24）用于鉴定S-RNase 9基因的引物对S-RNase 9-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：47和 SEQ ID NO：48所示的前向引物和后向引物；
25）用于鉴定S-RNase 9基因的引物对S-RNase 9-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：49和 SEQ ID NO：50所示的前向引物和后向引物；
26）用于鉴定S-RNase 10基因的引物对S-RNase 10-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：51和 SEQ ID NO：52所示的前向引物和后向引物；
27）用于鉴定S-RNase 10基因的引物对S-RNase 10-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：53和 SEQ ID NO：54所示的前向引物和后向引物；
28）用于鉴定S-RNase 10基因的引物对S-RNase 10-3：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：55和 SEQ ID NO：56所示的前向引物和后向引物；
29）用于鉴定S-RNase 11基因的引物对S-RNase 11-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：57和 SEQ ID NO：58所示的前向引物和后向引物；
30）用于鉴定S-RNase 11基因的引物对S-RNase 11-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：59和 SEQ ID NO：60所示的前向引物和后向引物；
31）用于鉴定S-RNase 12基因的引物对S-RNase 12-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：61和 SEQ ID NO：62所示的前向引物和后向引物；
32）用于鉴定S-RNase 12基因的引物对S-RNase 12-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：63和 SEQ ID NO：64所示的前向引物和后向引物；
33）用于鉴定S-RNase 12基因的引物对S-RNase 12-3：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：65和 SEQ ID NO：66所示的前向引物和后向引物；
34）用于鉴定S-RNase 14基因的引物对S-RNase 14-1：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：67和 SEQ ID NO：68所示的前向引物和后向引物；
35）用于鉴定S-RNase 14基因的引物对S-RNase 14-2：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：69和 SEQ ID NO：70所示的前向引物和后向引物；
36）用于鉴定S-RNase 14基因的引物对S-RNase 14-3：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：71和 SEQ ID NO：72所示的前向引物和后向引物；
37）用于鉴定S-RNase 14基因的引物对S-RNase 14-4：包括核苷酸序列分别如SEQ IDNO：73和 SEQ ID NO：74所示的前向引物和后向引物。
2.一种马铃薯S-RNase基因型的全基因序列，其特征在于，其选自如SEQ ID NO：75、SEQID NO：76和SEQ ID NO：77之一所示的全基因序列。
3.用于扩增或检测权利要求2所述马铃薯S-RNase基因型的全基因序列的特异性引物。
4.一种用于分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物对组。
5.一种分析鉴定马铃薯S-RNase基因型的方法，其特征在于，所述的方法包括：
1）提取待测样本的总DNA；
2）分别采用如权利要求1所述的引物对组中的引物对对提取的总DNA进行PCR扩增；
3）对PCR扩增产物进行分析判断；
所述待测样本为二倍体马铃薯或四倍体马铃薯；
所述PCR的反应体系以20 μL计，包括：2×Taq Master Mix 10 μL、前向引物0.5 μL、后向引物0.5 μL、DNA 1 μL、ddH2O 8 μL；
所述PCR的反应程序为：95 ℃预变性3 s；94 ℃ 25 s、50~65 ℃ 25s、72℃ 15s进行32个循环；最后72 ℃延伸5 min；
对PCR扩增产物进行分析判断的方法包括：使用电泳检测PCR扩增产物，根据电泳图谱中出现条带数及大小判定结果。
6.权利要求2所述的马铃薯S-RNase基因型的全基因序列在马铃薯S-RNase基因型检测中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的用途包括用于核酸杂交检测、分子标记或制备检测试剂盒。
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| CN (1) | CN116463455B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117867152B (zh) * | 2024-03-08 | 2024-05-24 | 云南英茂现代农业有限公司 | 一种用于检测青枯菌的核酸引物组、包含其的产品及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105052724A (zh) * | 2015-07-24 | 2015-11-18 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法及其应用 |
| CN109548646A (zh) * | 2018-06-14 | 2019-04-02 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种使马铃薯自交亲和的方法 |
| CN109750061A (zh) * | 2018-04-08 | 2019-05-14 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种克服二倍体马铃薯自交不亲和的方法 |
| CN110894539A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-03-20 | 云南师范大学 | 鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220025394A1 (en) * | 2018-07-16 | 2022-01-27 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Overcoming self-incompatibility in diploid plants for breeding and production of hybrids |
-
2023
- 2023-06-15 CN CN202310705631.2A patent/CN116463455B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105052724A (zh) * | 2015-07-24 | 2015-11-18 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法及其应用 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| A nonS-locus F-box gene breaks self-incompatibility in diploid potatoes;Ling Ma等;《Nat Commun》;第12卷(第1期);4142 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116463455A (zh) | 2023-07-21 |
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