CN116463362B - 一种细胞***抑制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞***抑制剂的制备方法，步骤如下：步骤一、关键合成酶的合成和载体构建；步骤二、关键合成酶的表达和预处理；步骤三、酶促反应体系的搭建；步骤四、将步骤三得到的反应液调节至pH=1，然后向其中加入1 L乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，洗脱得到橙红色产物即得到细胞***抑制剂。本发明具有以下有益效果：1.反应步骤少；2.以廉价且生物亲和性良好的L‑色氨酸和L‑组氨酸为底物，提高原子利用率、减小化学污染和可能引入的毒副作用；3.实现克级产物的合成，节约后续此类药物制造的成本，降低药物价格。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种细胞***抑制剂的制备方法。
背景技术
近年来，二聚氨基酸类活性天然产物因其普遍具有的良好生物活性而受到药学届的广泛关注。以天然来源的DDM-A （Didemnidine A）为代表的色氨酸-组氨酸异源二聚体在抑制细胞***G2期检查点等方面表现出了突出活性，同时其还具有一定的拓扑异构酶I和蛋白激酶C抑制作用，上述生物活性使其成为了抗癌、抗疟等药物的理想分子模型和成药前体。DDM-A的结构式如下：
。
目前，天然来源的DDM-A主要来自于海洋中的脊索动物——海鞘，DDM-A在自然界中的主要功能是对潜在的掠食者起到警示和防御的作用。近年来，由于海洋资源的过度开发和环境污染，造成DDM-A的自然来源的产量极其有限。
目前常用化学合成的方式制备DDM-A及其衍生物，其合成路线如下：
但上述技术方案存在以下不足之处：1、制备路线较长，方法为多步反应，较为复杂与繁琐，每步反应结束后均需要单独进行分离纯化；2、反应原料和反应副产物常具毒性，容易造成化学污染，生物安全性存疑；3.合成DDM-A的效率不高，整体回收产率普遍低于50%，且反应规模通常为百毫克级别，无法量产。
发明内容
发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明公开了一种细胞***抑制剂的制备方法，其能够通过一锅两步法直接制备作为细胞***抑制剂的DDM-A。
技术方案：一种细胞***抑制剂的制备方法，具体步骤如下：
步骤一：关键合成酶的合成和载体构建
（11）合成用于表达关键合成酶的LAAD基因片段、VioB基因片段、MarC基因片段，其中：
所述LAAD基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述VioB基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述MarC基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（12）利用Gibson拼接克隆技术，将所述LAAD基因片段克隆到pET28a(+)载体中得到表达载体pET28a(+)-LAAD，将所述VioB基因片段、MarC基因片段分别克隆到pET26b载体中得到表达载体pET26b-VioB、表达载体pET26b-MarC，其中：
LAAD基因片段、VioB基因片段、MarC基因片段均位于NdeI和HindIII限制性酶切位点之间；
（13）将构建好的表达载体pET28a(+)-LAAD、表达载体pET26b-VioB、表达载体pET26b-MarC 分别转化到感受态细胞BL21(DE3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；
步骤二：关键合成酶的表达和预处理
（21）制备LAAD蛋白粗制裂解液
（211）取10 uL的pET28a(+)-LAAD菌种溶液，加入到5 mL 的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET28a(+)-LAAD种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（212）将步骤（211）得到的pET28a(+)-LAAD种子液全部加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至含LAAD表达载体的菌液浓度OD600 = 1.1-1.3为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的IPTG，使得IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、5 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎得到破碎后的菌液，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到LAAD蛋白粗制裂解液；
（22）制备VioB蛋白粗制裂解液
（221）取10 uL的pET26b-VioB菌种溶液，加入到5 mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-VioB种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（222）将步骤（221）得到的pET26b-VioB种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含VioB表达载体的菌液浓度OD600 = 0.7-0.9为止，随后将试验容器并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（223）向经过步骤（222）处理的菌液中分别加入适量的硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40 uM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25 mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（224）将经过步骤（223）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、15 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（225）利用超生破碎仪将步骤（224）得到的菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（226）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到VioB蛋白粗制裂解液。
（23）制备MarC蛋白粗制裂解液
（231）取10 uL的pET26b-MarC菌种溶液，加入到5 mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-MarC种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（232）将步骤（231）得到的pET26b-MarC种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含MarC表达载体的菌液浓度OD600 = 0.9-1.1为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（233）向经过步骤（232）处理的菌液中分别加入硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40 uM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（234）将经过步骤（233）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、15 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（235）利用超生破碎仪将菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（236）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液即得到MarC蛋白粗制裂解液；
步骤三：酶促反应体系的搭建
（31）向反应容器中分别加入下列物质：
，
其中：
所述NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度为1M，pH值为8.0；
所述(NH4)2SO4储备液的浓度为2M；
（32）混匀后，震荡反应6-8h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态（即反应容器的上部氧气浓度与空气中的氧气浓度相同）；
（33）分别向反应容器中加入600 mL步骤（23）制备的MarC蛋白粗制裂解液、2.1gα-酮戊二酸、1.32 g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1 mM，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；
步骤四：产物的分离与纯化
将步骤三得到的反应液用1N稀盐酸调节至pH=1，然后向其中加入1 L乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，DCM/MeOH = 20:1条件下洗脱得到橙红色产物即得到细胞***抑制剂。
有益效果：本发明具有以下有益效果：
1.反应步骤少——在合成生物学研究成果基础上，开发了以关键酶LAAD、VioB和MarC为催化条件的2步合成方法；
2.以廉价且生物亲和性良好的L-色氨酸和L-组氨酸为底物，规避了现有方法中毒性化学品作为底物的参与，提高原子利用率、减小化学污染和可能引入的毒副作用；
3.在尽量小的反应体系内，实现克级产物的合成，并拥有高于目前化学合成手段的回收产率，节约后续此类药物制造的成本，降低药物价格。
附图说明
图1为表达载体pET28a(+)-LAAD的载体图谱。
图2为表达载体pET26b-VioB的载体图谱。
图3为表达载体pET26b-MarC的载体图谱。
图4为实施例1制备的产物的HPLC图谱。
图5为实施例1制备的产物的1H 的NMR图谱。
图6为实施例1制备的产物的13C的 NMR图谱。
图7为实施例1制备的产物在显微镜下的单晶培养图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式详细说明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
1.针对目前化学合成方法路线较长的问题，我们在合成生物学研究成果基础上，开发了以关键酶LAAD、VioB和MarC为催化条件的2步合成方法，具体反应步骤如下：
2.本方法以廉价且生物亲和性良好的L-色氨酸和L-组氨酸为底物，规避了现有方法中毒性化学品作为底物的参与，提高原子利用率、减小化学污染和可能引入的毒副作用。
3.本发明还需要解决现有技术路线中随着合成步骤增多而带来的产率过低问题，在尽量小的反应体系内，实现克级产物的合成，并拥有高于目前化学合成手段的回收产率。以节约后续此类药物制造的成本，以期降低药物价格。
实施例1
一种细胞***抑制剂的制备方法，具体步骤如下：
步骤一：关键合成酶的合成和载体构建
（11）合成用于表达关键合成酶的LAAD基因片段、VioB基因片段、MarC基因片段，其中：
所述LAAD基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述VioB基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述MarC基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（12）利用Gibson拼接克隆技术，将所述LAAD基因片段克隆到pET28a(+)载体中得到表达载体pET28a(+)-LAAD，将所述VioB基因片段、MarC基因片段分别克隆到pET26b载体中得到表达载体pET26b-VioB、表达载体pET26b-MarC，具体如图1-3所示，其中：
LAAD基因片段、VioB基因片段、MarC基因片段均位于NdeI和HindIII限制性酶切位点之间；
（13）将构建好的表达载体pET28a(+)-LAAD、表达载体pET26b-VioB、表达载体pET26b-MarC 分别转化到感受态细胞BL21(DE3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；
步骤二：关键合成酶的表达和预处理
（21）制备LAAD蛋白粗制裂解液
（211）取10 uL的pET28a(+)-LAAD菌种溶液，加入到5 mL 的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET28a(+)-LAAD种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（212）将步骤（211）得到的pET28a(+)-LAAD种子液全部加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至含LAAD表达载体的菌液浓度OD600 = 1.2时停止培养，随后将试验容器取出并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的IPTG，使得IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、5 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎得到破碎后的菌液，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到LAAD蛋白粗制裂解液；
（22）制备VioB蛋白粗制裂解液
（221）取10 uL的pET26b-VioB菌种溶液，加入到5 mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-VioB种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（222）将步骤（221）得到的pET26b-VioB种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含VioB表达载体的菌液浓度OD600 =0.8时停止培养，随后将试验容器并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（223）向经过步骤（222）处理的菌液中分别加入适量的硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40 uM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25 mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（224）将经过步骤（223）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、15 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（225）利用超生破碎仪将步骤（224）得到的菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（226）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到VioB蛋白粗制裂解液。
（23）制备MarC蛋白粗制裂解液
（231）取10 uL的pET26b-MarC菌种溶液，加入到5 mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-MarC种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（232）将步骤（231）得到的pET26b-MarC种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含MarC表达载体的菌液浓度OD600 = 1.0时停止培养，随后将试验容器取出并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（233）向经过步骤（232）处理的菌液中分别加入硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40 uM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（234）将经过步骤（233）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、15 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（235）利用超生破碎仪将菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（236）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液即得到MarC蛋白粗制裂解液；
步骤三：酶促反应体系的搭建
（31）向反应容器中分别加入下列物质：
，
其中：
所述NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度为1M，pH值为8.0；
所述(NH4)2SO4储备液的浓度为2M；
（32）混匀后，震荡反应7h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态（即反应容器的上部氧气浓度与空气中的氧气浓度相同）；
（33）分别向反应容器中加入600 mL步骤（23）制备的MarC蛋白粗制裂解液、2.1gα-酮戊二酸、1.32 g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1 mM，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；
步骤四：产物的分离与纯化
将步骤三得到的反应液用1N稀盐酸调节至pH=1，然后向其中加入1 L乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，DCM/MeOH = 20:1条件下洗脱得到橙红色产物即得到细胞***抑制剂。经过称量后，细胞***抑制剂的重量为2.65 g，产率为63.3%。
在另一个实施例中，步骤（32）中混匀后，震荡反应6h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态。
在又一个实施例中，步骤（32）中混匀后，震荡反应8h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态。
验证试验与分析
1、对实施例1制备的橙红色产物进行HPLC、核磁分析图谱分析，其结果如图4-图6所示，证实最终的橙红色产物为DDM-A。
2、将橙红色产物置于显微镜下进行观察，其结果如图7所示，图7中方形框中条状物体就是DDM-A晶体。
3、利用蛋白激酶C（PKC）活性检测试剂盒（PKC Kinase Activity Assay Kit）和蛋白激酶A（PKA）活性检测试剂盒（PKA Kinase Activity Assay Kit）分别测定实施例1制备的橙红色产物对PKC和PKA的IC50值。同时，检测实施例1制备的橙红色产物对镰状疟原虫Plasmodium falciparum以及小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制活性。所得检测结果如下：
（31）对蛋白激酶C（PKC）的抑制活性测定：利用双抗体夹心法，用纯化的人PKC抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入PKC，再与HRP标记的PKC抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，其与样品中的PKC含量呈正相关。通过标准曲线计算样品中PKC浓度。所用的DDM-A底物浓度分别为5 uM，10 uM，20 uM，50 uM，100 uM和200 uM，反应时间15 min，反应温度为37℃。
（32）对蛋白激酶A（PKA）的抑制活性测定：利用ELISA法，将待测物与生物素标记的TXA2抗体同时孵育，洗涤后，加入亲和素标记的HRP，经过洗涤后加底物TMB显色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，其与样品中的PKC含量呈正相关。通过标准曲线计算样品中PKA浓度。所用的DDM-A底物浓度分别为5 uM，10 uM，20 uM，50 uM，100 uM和200 uM，反应时间10 min，反应温度为37℃。
（33）对镰状疟原虫Plasmodium falciparum的抑制活性测定：将DDM-A溶解在DMSO中，利用测定培养基(含5% Albumax II、0.2% w/v葡萄糖、0.03% l-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基)对其进行梯度稀释并加入到微量滴定板的每个孔中。随后将培养的镰状疟原虫Plasmodium falciparum加入每个孔，各孔最终体积为100 uL(最终DMSO浓度≤0.25%)。将平板在37℃孵育48小时，并向每个孔中加入0.1μCi 3H-次黄嘌呤。将平板混匀，再培养24小时。将平板置于-80℃冰箱中终止反应。使用96孔板解冻并将细胞转移到玻璃纤维过滤垫上。使用液体Betalux闪烁计数器对结合的放射性进行计数，并计算IC50值。所用的DDM-A底物浓度分别为1 uM，2 uM，5 uM，10 uM，20 uM和50 uM。
（34）对小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制活性测定：200 uL反应体系中加入小鼠黑色素瘤细胞B16和梯度稀释的DDM-A DMSO溶液，DDM-A终浓度分别为0.1 uM，0.2 uM，0.5 uM，1uM，2 uM和5 uM。37℃震荡孵育1h后，利用MTT法测定B16细胞存活情况，并计算IC50值。
实施例2
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：
1、步骤（212）中至含LAAD表达载体的菌液浓度OD600 = 1.1时停止培养；
2、步骤（222）中至含VioB表达载体的菌液浓度OD600 =0.7时停止培养；
3、步骤（232）中至含MarC表达载体的菌液浓度OD600 = 0.9时停止培养。
实施例2最终橙红色产物即得到细胞***抑制剂。经过称量后，细胞***抑制剂的重量为2.60 g，产率为62.1%。
实施例3
与实施例1大致相同，区别仅仅在于：
1、步骤（212）中至含LAAD表达载体的菌液浓度OD600 = 1.3时停止培养；
2、步骤（222）中至含VioB表达载体的菌液浓度OD600 =0.9时停止培养；
3、步骤（232）中至含MarC表达载体的菌液浓度OD600 = 1.1时停止培养。
实施例3最终橙红色产物即得到细胞***抑制剂。经过称量后，细胞***抑制剂的重量为2.62 g，产率为62.6%。
上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (5)
1.一种细胞***抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、关键合成酶的合成和载体构建：
（11）合成用于表达关键合成酶的LAAD基因片段、VioB基因片段、MarC基因片段，其中：
所述LAAD基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述VioB基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述MarC基因片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（12）利用Gibson拼接克隆技术，将所述LAAD基因片段克隆到pET28a(+)载体中得到表达载体pET28a(+)-LAAD，将所述VioB基因片段、MarC基因片段分别克隆到pET26b载体中得到表达载体pET26b-VioB、表达载体pET26b-MarC；
（13）将构建好的表达载体pET28a(+)-LAAD、表达载体pET26b-VioB、表达载体pET26b-MarC 分别转化到感受态细胞BL21(DE3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；
步骤二、关键合成酶的表达和预处理：
（21）制备LAAD蛋白粗制裂解液；
（22）制备VioB蛋白粗制裂解液；
（23）制备MarC蛋白粗制裂解液；
步骤三、酶促反应体系的搭建：
（31）向反应容器中分别加入下列物质：
；
（32）混匀后，震荡反应6-8h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态；
（33）分别向反应容器中加入600 mL步骤（23）制备的MarC蛋白粗制裂解液、2.1g α-酮戊二酸、1.32 g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1 mM，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；
步骤四、产物的分离与纯化：
将步骤三得到的反应液用1N稀盐酸调节至pH=1，然后向其中加入1 L乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，DCM/MeOH = 20:1条件下洗脱得到橙红色产物即得到细胞***抑制剂，其中：
步骤（23）的步骤如下：
（231）取10 uL的pET26b-MarC菌种溶液，加入到5 mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-MarC种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（232）将步骤（231）得到的pET26b-MarC种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含MarC表达载体的菌液浓度OD600 = 0.9-1.1为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（233）向经过步骤（232）处理的菌液中分别加入硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40 uM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25 mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（234）将经过步骤（233）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、15 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（235）利用超生破碎仪将菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（236）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液即得到MarC蛋白粗制裂解液。
2.如权利要求1所述的一种细胞***抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（12）中的LAAD基因片段、VioB基因片段、MarC基因片段均位于NdeI和HindIII限制性酶切位点之间。
3.如权利要求1所述的一种细胞***抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（21）的步骤如下：
（211）取10 uL的pET28a(+)-LAAD菌种溶液，加入到5 mL 的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET28a(+)-LAAD种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（212）将步骤（211）得到的pET28a(+)-LAAD种子液全部加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至含LAAD表达载体的菌液浓度OD600 =1.1-1.3为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的IPTG，使得IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、5 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎得到破碎后的菌液，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到LAAD蛋白粗制裂解液。
4.如权利要求1所述的一种细胞***抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（22）的步骤如下：
（221）取10 uL的pET26b-VioB菌种溶液，加入到5 mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pET26b-VioB种子液，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（222）将步骤（221）得到的pET26b-VioB种子液加入到含1L的LB液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含VioB表达载体的菌液浓度OD600 = 0.7-0.9为止，随后将试验容器并置于冰浴中30 min，其中：
LB液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50 ug/mL；
（223）向经过步骤（222）处理的菌液中分别加入适量的硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、IPTG，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40 uM，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mM，IPTG在菌液中的浓度为0.1 mM，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16 h；
（224）将经过步骤（223）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15 min，弃上清液，沉淀表面用ddH2O清洗，随后加入30 mL上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：
所述上样缓冲液的pH值为8.0；
所述上样缓冲液包括：100 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、15 mM咪唑、10%v/v 甘油，余量为水；
（225）利用超生破碎仪将步骤（224）得到的菌体重悬液破碎，其中：
变幅杆直径为6 mm；
破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2 s、暂停时间4 s，工作总时间30 min；
（226）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到VioB蛋白粗制裂解液。
5.如权利要求1所述的一种细胞***抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（31）中所述NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液的浓度为1M，pH值为8.0；所述(NH4)2SO4储备液的浓度为2M。
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