CN116463258B - 一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27及菌剂、制备方法和应用 - Google Patents

一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27及菌剂、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27及菌剂、制备方法和应用。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)King27于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25556，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株能够有效抑制引起宠物腹泻的常见病原菌。同时经试验验证，将凝结芽孢杆菌King27制成的菌剂添加至宠物的饲喂饲料，可以有效预防宠物受凉导致的季节性腹泻和乳糖不耐受引起的腹泻，大大降低宠物腹泻率，对于日常维持宠物健康、预防宠物腹泻具有重要意义。

Description

一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27及菌剂、制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27及菌剂、制备方法和应用。
背景技术
犬和猫是现在最常见的家庭宠物，但其消化***非常脆弱和敏感，许多细小因素都会引起肠道内环境的紊乱，导致宠物出现腹泻、呕吐等症状。日常生活中，引起宠物腹泻的常见原因包括以下几种：1、宠物断奶后换宠物奶粉，乳糖不耐受导致腹泻；2、环境温度改变导致的肠胃受凉，出现季节性腹泻；3、饮食或环境导致细菌侵入肠胃***，细菌感染导致腹泻。
目前治疗宠物腹泻以口服抗生素药物为主，主要治疗细菌感染引起的腹泻，但是抗生素容易造成宠物肠道菌群失调，抗生素在宠物肠道内会造成宠物肠道的菌群失调使病后的宠物很难完全康复。抗菌药物的使用同样存在生态安全、药物残留、耐药性、抗生素相关性腹泻等弊端，近年来，世界各国都在推进饲料“禁抗”模式，因此寻求安全有效的抗生素替代品迫在眉睫。
中国专利CN114437993A公开了一种罗伊氏乳杆菌及其在制备预防猫腹泻制剂中的应用，对于沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和志贺氏菌等常见致猫腹泻的致病菌有抑菌效果。中国专利CN113057253B涉及一种调理肠胃的复合益生菌宠物食品，通过自制益生菌添加剂，并配合特定的中药提取物和儿茶素，相互之间协同发生作用，从而可以对宠物肠道中的有益微生物实现增殖，而对肠道中有害菌起到抑制效果，最终改善宠物肠道中微生物种群结构和数量，有效调节了宠物肠胃。市面上已有或者已报道的用于预防、治疗宠物肠道疾病的益生菌制剂或复合益生菌制剂，主要针对有害菌侵染引起的宠物腹泻，功能较为单一，对于宠物日常生活中出现的冷凉泻、乳糖不耐受性腹泻有预防效果的益生菌产品未见报道。
发明内容
针对现有用于预防或治疗宠物腹泻的益生菌制剂功能单一、防治效果达不到预期的问题，本发明提供一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27及其代谢制剂、应用，该菌种不仅可以较强地抑制肠道病原菌，还能够预防宠物季节性腹泻和宠物断奶后换宠物奶粉导致的乳糖不耐受腹泻。
第一方面，本发明提供一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)King27于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25556，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。凝结芽孢杆菌能够形成芽孢，与其他不产乳酸的芽孢杆菌相比，有利于恢复胃肠道的微生态平衡。凝结芽孢杆菌芽孢发酵后产生大量抗菌凝固素，能有效抑制需氧致病菌生长。
第二方面，本发明提供一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27菌剂，包括上述凝结芽孢杆菌King27的菌体浓缩液。
第三方面，本发明提供上述凝结芽孢杆菌King27菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)取冷冻保存的凝结芽孢杆菌King27菌株进行活化，将活化后的单一菌落接种于MRS液体培养基中，40～45℃、200r/min培养18～24h，获得种子液；
(2)将种子液接种进入一级发酵培养基，通气、40～45℃、200r/min摇床培养22～26h后，得到一级发酵液；将一级发酵液移种进入二级发酵培养基，通气、40～45℃、200r/min摇床培养45～50h后，得到二级发酵液；
(3)将二级发酵液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15％(w/w)的复原脱脂乳中，获得悬浊液；将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
(4)将菌粉与葡萄糖混合，制成菌剂。
进一步的，步骤(1)中活化的具体操作为：取冷冻保存的凝结芽孢杆菌King27菌株，在MRS平板培养基上进行划线培养，42℃、有氧培养48h。
进一步的，步骤(2)中，种子液接种进入一级发酵培养基的接种量为4％～6％。
进一步的，步骤(2)中，一级发酵培养基和二级发酵培养基的制备方法如下：
葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨15g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸锰0.05g/L、氯化铵4g/L、碳酸钙18g/L，培养基于121℃灭菌20min，冷却至40～45℃备用。
第四方面，本发明提供上述凝结芽孢杆菌King27在制备预防宠物肠道病原菌引起的腹泻的产品上的应用。
第五方面，本发明提供上述凝结芽孢杆菌King27在制备预防宠物受凉导致的季节性腹泻的产品上的应用。
第六方面，本发明提供上述凝结芽孢杆菌King27在制备预防宠物乳糖不耐受引起的腹泻产品上的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的凝结芽孢杆菌King27，能够有效抑制引起宠物腹泻的常见病原菌。同时经试验验证，将凝结芽孢杆菌King27制成的菌剂添加至宠物的饲喂饲料，可以有效预防宠物受凉导致的季节性腹泻和乳糖不耐受引起的腹泻，大大降低宠物腹泻率，对于日常维持宠物健康、预防宠物腹泻具有重要意义。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下列实施例中使用的各种培养基成分组成及制备方法如下：
MRS平板培养基：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温-801mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，自然pH，121℃下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温801mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL，将上述原料混合后，121℃下灭菌20min，冷却待用。
LB液体培养基：称取25.0g LB培养基干粉溶于1000mL蒸馏水，自然pH值，121℃下灭菌15min，备用；LB培养基干粉购自青岛海博生物技术有限公司。
营养琼脂平板培养基：蛋白胨10g、牛肉粉3g、氯化钠5g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，将上述原料混合后，121℃下灭菌15min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
营养肉汤培养基：蛋白胨5g、牛肉膏3g、蒸馏水1000mL，将上述原料混合后，121℃下灭菌15min，冷却待用。
一级发酵培养基和二级发酵培养基：葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨15/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸锰0.05g/L、氯化铵4g/L、碳酸钙18g/L，培养基于121℃灭菌20min，冷却至40～45℃备用。
下列实施例中使用的空肠弯曲菌ATCC 33291、大肠埃希氏菌CICC 10899、艰难梭菌ATCC 43593购于中国工业微生物菌种保藏中心。
实施例1菌种的分离鉴定
1、菌种来源：酸菜，2022年2月采集于辽宁省铁岭市昌图县。
2、菌株筛选及纯化
(1)取样：将酸菜切成小块备用；
(2)制备样品：
①取灭菌后的生理盐水(0.85％)至于无菌三角瓶中，然后将酸菜加入其中，振荡，待用；
②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用；
(3)培养：将步骤②的1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于42℃、有氧条件下培养48h；
(4)按照以下菌落特征挑选菌落：
菌落直径1～2mm，在培养基上菌落不透明，边缘完整，乳白色，有光泽，质地柔软。
(5)分离纯化
根据步骤(4)的菌落特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至步骤(3)的培养基上，于42℃、有氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。
2、鉴定
将步骤(5)分离纯化后的单菌落送去鉴定，鉴定单位：中国工业微生物菌种保藏管理中心，鉴定过程中，使用的引物序列为：
27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT
得到基因序列为：
GTGCGCACCTTTTAAAAGCTTGCTTTTAAAAGGTTAGCGGCGCACGCGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATCGGGATAACGCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAGTTTTTTCCTCCGCATGGAGGAAAAAGGAAAGACGGCTTTTGCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGCCGGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAACAGGGCGGCGCCTTGACGGTACCCGGCCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTCTTAAGTCTGATGTGAAATCTTGCGGCTCAACCGCAAGCGGTCATTGGAAACTGGGAGGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACCTCCCTGGAGACAGGGCCTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCGAGACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCAGAAAACCATTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACCCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCT
鉴定结果：该菌株被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，推测为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
将鉴定后的菌株命名为凝结芽孢杆菌King27，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏信息如下；
菌株名称：凝结芽孢杆菌King27；分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans；保藏日期：2022年8月19日；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏编号：CGMCC No.25556。
实施例2凝结芽孢杆菌King27发酵液的抑菌能力实验
一、测试凝结芽孢杆菌King27发酵液对3种导致腹泻的常见病原菌(空肠弯曲菌ATCC 33291、大肠埃希氏菌CICC 10899、艰难梭菌ATCC 43593)的抑菌能力。
实验步骤：
(1)从-80℃超低温冰箱中取出凝结芽孢杆菌King27菌株，在MRS平板培养基上进行划线培养，42℃、有氧培养48h；从长出菌落的培养皿中挑取单一菌落并无菌操作接种于MRS液体培养基中，42℃、200r/min培养18h。
(2)将活化后的凝结芽孢杆菌King27接种于MRS液体培养基中，42℃、200r/min摇床培养24h后，得到凝结芽孢杆菌King27发酵液。
(3)将空肠弯曲菌ATCC 33291、大肠埃希氏菌CICC 10899、艰难梭菌ATCC 4359按2％的接种量分别接种到营养肉汤培养基中，37℃恒温静置培养24h，然后将空肠弯曲菌ATCC 33291、大肠埃希氏菌CICC 10899、艰难梭菌ATCC 43593接种于LB液体培养基，42℃、200r/min摇床培养8h后得到指示菌菌液。
(4)抑菌效果的评价采用牛津杯法，用无菌生理盐水分别将空肠弯曲菌ATCC33291指示菌溶液、大肠埃希氏菌CICC 10899指示菌溶液、艰难梭菌ATCC 43593指示菌溶液梯度稀释成约1×108CFU/mL的备用，吸取0.1mL菌悬液溶液于营养琼脂平板培养基上，用无菌涂布棒涂布均匀。待平板表面的指示菌菌液全部涂布均匀并吸收后，在平板培养基表面放置无菌牛津杯，并在杯中加入0.2mL凝结芽孢杆菌King27发酵液，在4℃冰箱中扩散培养4h，再在37℃下恒温有氧培养24h，测定抑菌圈直径。其中牛津杯内径约为6mm，每组3个重复，用抑菌圈平均直径来评价抑菌活性大小，结果如表1所示。
表1凝结芽孢杆菌King27发酵液对3种指示菌的抑菌圈直径(mm)
结论：凝结芽孢杆菌King27发酵液对空肠弯曲菌ATCC 33291、大肠埃希氏菌CICC10899、艰难梭菌ATCC 43593均有较强的抑制能力，其中对空肠弯曲菌ATCC 33291和大肠埃希氏菌CICC 10899的抑制效果最强。
二、对凝结芽孢杆菌King27发酵液的抑菌性能进行进一步研究，排除一些酸性代谢物质(乳酸、乙酸等)、过氧化氢等对抑菌效果的影响，并对其代谢产物抑菌物质进行初步判断。
(1)不同预处理pH值对凝结芽孢杆菌发酵液抑菌能力的影响
用0.5mol/L盐酸和0.5mol/L氢氧化钠调节凝结芽孢杆菌King27发酵液的pH值，分别为2、6、10，为避免不同pH值对指示菌的影响，在37℃下处理1h后再回调pH值至6，做牛津杯抑菌试验，采用指示菌进行试验，观察抑菌圈直径的大小，考察不同pH值预处理后对凝结芽孢杆菌King27发酵液抑菌能力的影响，结果如表2所示。
表2不同预处理pH值下King27发酵液的抑菌圈直径(mm)
结论：在不同pH值条件预处理下，凝结芽孢杆菌King27的发酵液对3种不同指示菌的抑菌圈大小有不同影响。当预处理的pH值为6时，凝结芽孢杆菌King27发酵液对3种指示菌的抑菌圈直径最大，pH值过高或过低，均会使发酵液中的抑菌物质结构遭到破坏，影响其抑菌效果。
(2)不同温度对凝结芽孢杆菌King27发酵液抑菌能力的影响
将凝结芽孢杆菌King27发酵液分别在不同温度梯度(-20℃、4℃、37℃、80℃、121℃)条件下处理30min后，进行牛津杯抑菌试验测定抑菌能力，通过观察抑菌圈直径的大小，考察不同温度条件对凝结芽孢杆菌King27发酵液抑菌能力的影响，结果如表3所示。
表3不同温度下King27发酵液的抑菌圈直径(mm)
结论：在37℃条件下处理的凝结芽孢杆菌King27发酵液具有最高的抑菌活性，说明此温度是凝结芽孢杆菌King27拮抗其它菌株的最佳温度。
(3)不同酶对凝结芽孢杆菌King27发酵液抑菌能力的影响
用0.5mol/L盐酸和0.5mol/L氢氧化钠调节pH值至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和过氧化氢酶的最适pH值，将凝结芽孢杆菌King27发酵液与各种酶分别在37℃水浴条件下反应30min后，再调节pH值至6，以未经酶处理的凝结芽孢杆菌King27发酵液为对照组，进行牛津杯抑菌试验，通过观察对照组和试验组抑菌圈直径大小，评价凝结芽孢杆菌King27发酵液中的抑菌物质是否为蛋白类物质，结果如表4所示。
表4不同酶处理后King27发酵液的抑菌圈直径(mm)
空肠弯曲菌 大肠埃希氏菌 艰难梭菌
对照组 20 18 16
胃蛋白酶 6 7 6
胰蛋白酶 5 6 8
蛋白酶K 7 3 5
过氧化氢酶 14 17 15
采用各种蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K)对凝结芽孢杆菌King27发酵液进行处理后，处理组的抑菌圈直径明显低于对照组(P<0.05)；而采用过氧化氢酶处理后，处理组的抑菌活性与对照组差异不显著(P>0.05)。说明凝结芽孢杆菌King27发酵液中不含过氧化氢或者含量极低，能起到抑菌作用的可能是一种分泌在胞外的蛋白类的细菌素类物质。
实施例3制备凝结芽孢杆菌King27菌剂
(1)从-80℃超低温冰箱中取出凝结芽孢杆菌King27菌株，在MRS平板培养基上进行划线培养，42℃、有氧培养48h；从长出菌落的培养皿中挑取单一菌落并无菌操作接种于MRS液体培养基中，42℃、200r/min培养18h，得到种子液。
(2)将种子液按5％接种量接种进入一级发酵培养基，通气、42℃、200r/min摇床培养24h后，得到一级发酵液；将一级发酵液移种进入二级发酵培养基，通气、42℃、200r/min摇床培养48h后，得到二级发酵液。
(3)将二级发酵液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15％(w/w)的复原脱脂乳中，获得悬浊液；将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
(4)将菌粉与葡萄糖混合，制成菌剂；葡萄糖购自保龄宝生物股份有限公司；在本实施例中，制备的菌剂中菌体数量为2×107CFU/g。
实施例4制备凝结芽孢杆菌King27菌剂
(1)从-80℃超低温冰箱中取出凝结芽孢杆菌King27菌株，在MRS平板培养基上进行划线培养，40℃、有氧培养48h；从长出菌落的培养皿中挑取单一菌落并无菌操作接种于MRS液体培养基中，40℃、200r/min培养24h，得到种子液。
(2)将种子液按6％接种量接种进入一级发酵培养基，通气、40℃、200r/min摇床培养26h后，得到一级发酵液；将一级发酵液移种进入二级发酵培养基，通气、40℃、200r/min摇床培养45h后，得到二级发酵液。
(3)将二级发酵液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15％(w/w)的复原脱脂乳中，获得悬浊液；将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
(4)将菌粉与葡萄糖混合，制成菌剂；葡萄糖购自保龄宝生物股份有限公司；在本实施例中，制备的菌剂中菌体数量为1×107CFU/g。
实施例5制备凝结芽孢杆菌King27菌剂
(1)从-80℃超低温冰箱中取出凝结芽孢杆菌King27菌株，在MRS平板培养基上进行划线培养，45℃、有氧培养48h；从长出菌落的培养皿中挑取单一菌落并无菌操作接种于MRS液体培养基中，45℃、200r/min培养20h，得到种子液。
(2)将种子液按4％接种量接种进入一级发酵培养基，通气、45℃、200r/min摇床培养22h后，得到一级发酵液；将一级发酵液移种进入二级发酵培养基，通气、45℃、200r/min摇床培养50h后，得到二级发酵液。
(3)将二级发酵液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15％(w/w)的复原脱脂乳中，获得悬浊液；将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
(4)将菌粉与葡萄糖混合，制成菌剂；葡萄糖购自保龄宝生物股份有限公司；在本实施例中，制备的菌剂中菌体数量为1.5×107CFU/g。
实施例6凝结芽孢杆菌King27菌剂用于预防宠物夏季受凉引起腹泻的临床实验
夏季是宠物腹泻的高发期，季节变化，空调房和室外温差大，很容易造成宠物受凉，引发宠物季节性腹泻。
选用健康的不同品种小型犬40只、猫40只，随机分为4组，分别为对照组和益生菌1组、益生菌2组、益生菌3组，对照组正常饲喂饲料，益生菌1组、益生菌2组、益生菌3组的饲喂饲料中分别添加实施例3、实施例4、实施例5制备的凝结芽孢杆菌King27菌剂，添加量为10g/kg，在北方地区6-7月份20～35℃连续饲喂30天，试验周期为60天，记录每日每组犬猫腹泻情况。
腹泻病例呈以下临床表现：宠物精神差，食欲不振或废绝，粘膜苍白，腹部紧张、疼痛，大便次数增多，多稀薄、水样或米汤样，不时混有蛋花，颜色黄绿色；也有大便量少，但混油黏液、脓血情况，粪便腥臭，腹痛明显，里急后重，并伴有体温发热、体温升高、脱水等症状腹泻。
根据记录计算宠物腹泻发生率，计算公式如下：
其中，试验期腹泻犬猫只数是每天腹泻犬猫只数的总和。
结果如下：
表5 6-7月份宠物腹泻发生率
0-30天 31-60天
对照组 8.0％ 9.7％
益生菌1组 3.5％ 4.2％
益生菌2组 3.7％ 3.8％
益生菌3组 4.0％ 3.7％
结论：在饲喂益生菌期间，益生菌组明显比对照组腹泻率低，有效减少了宠物的腹泻发生率，停止添加益生菌后，益生菌组腹泻率有所上升，但明显低于对照组，说明添加凝结芽孢杆菌King27菌剂可以有效降低宠物腹泻发病率，预防宠物季节性腹泻。
实施例7凝结芽孢杆菌King27菌剂用于预防乳糖不耐受引起腹泻的临床实验
乳糖不耐受症又称乳糖消化不良或乳糖吸收不良，是指在猫咪体内不产生分解乳糖的乳糖酶。断奶后会给猫咪喝奶粉，而奶粉中含有乳糖，乳糖会在猫咪肠道中由细菌分解变成乳酸，破坏肠道的碱性环境，而使肠道分泌出大量的碱性消化液来中和乳酸，最终导致腹泻的发生。
一般来说小猫可以在一个月左右断奶，但这个时候即使断了母乳，它们的胃肠还是非常脆弱和敏感的，猛然添加奶粉很容易发生乳糖不耐受引起的腹泻。乳糖不耐受会出现腹胀、腹泻、严重脱水，一般表现为喝奶粉后就会出现软便或者下痢的现象。
选用刚断奶的幼猫40只，随机分为4组，分别为对照组和试验1组、试验2组、试验3组，对照组正常饲喂奶粉，试验1组、试验2组、试验3组的饲喂奶粉中分别添加实施例3、实施例4、实施例5制备的凝结芽孢杆菌King27菌剂，添加量为5g/kg，连续饲喂28天，试验周期为28天，记录每日每组幼猫腹泻情况。
根据记录计算幼猫腹泻发生率，计算公式如下：
其中，试验期腹泻幼猫只数是每天腹泻幼猫只数的总和。
结果如下：
表6幼猫断奶后换奶粉的腹泻发生率
腹泻发生率(％)
对照组 6.25
试验1组 2.86
试验2组 2.64
试验3组 2.72
结论：试验组明显腹泻率低于对照组，添加凝结芽孢杆菌King27菌剂可以有效预防幼猫断奶后换奶粉引起的腹泻。
本发明提供的凝结芽孢杆菌King27菌剂的使用方法，除了上述实施例中所述的添加至饲养饲料或饲喂奶粉中，也可置于碗中任其自由舔食，或与少量干粮或罐头拌食，或使用40℃以下的凉白开冲水服用。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）King27，其特征在于，凝结芽孢杆菌King27于2022年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.25556，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种用于预防宠物腹泻的凝结芽孢杆菌King27菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌King27的菌粉。
3.一种如权利要求2所述凝结芽孢杆菌King27菌剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）取冷冻保存的凝结芽孢杆菌King27菌株进行活化，将活化后的单一菌落接种于MRS液体培养基中，40~45℃、200r/min培养18~24h，获得种子液；
（2）将种子液接种进入一级发酵培养基，通气、40~45℃、200r/min摇床培养22~26h后，得到一级发酵液；将一级发酵液移种进入二级发酵培养基，通气、40~45℃、200r/min摇床培养45~50h后，得到二级发酵液；
（3）将二级发酵液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（4）将菌粉与葡萄糖混合，制成菌剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中活化的具体操作为：取冷冻保存的凝结芽孢杆菌King27菌株，在MRS平板培养基上进行划线培养，42℃、有氧培养48h。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，种子液接种进入一级发酵培养基的接种量为4%~6%。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，一级发酵培养基和二级发酵培养基的制备方法如下：
葡萄糖40g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨15g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸锰0.05g/L、氯化铵4g/L、碳酸钙18g/L，培养基于121℃灭菌20min，冷却至40~45℃备用。
7.一种如权利要求1所述凝结芽孢杆菌King27在制备预防宠物犬猫肠道病原菌引起的腹泻的产品上的应用。
8.一种如权利要求1所述凝结芽孢杆菌King27在制备预防宠物犬猫受凉导致的季节性腹泻的产品上的应用。
9.一种如权利要求1所述凝结芽孢杆菌King27在制备预防宠物犬猫乳糖不耐受引起的腹泻的产品上的应用。
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