CN116459175A - 一种细叶萼距花精致组分和单体化合物的制备方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents

一种细叶萼距花精致组分和单体化合物的制备方法及其在化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于化妆品技术领域，具体公开了细叶萼距花提取物及其在制备化妆品中的应用，所述提取物指细叶萼距花精致组分和7种单体化合物。精致组分是细叶萼距花中抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性以及抑制基质金属蛋白酶活性最强的组分；7种单体化合物是细叶萼距花乙醇提取物经大孔树脂柱层析、甲醇‑水溶液梯度洗脱、羟丙基葡聚糖凝胶柱层析、十八烷基硅烷键合硅胶柱层析、高效液相色谱乙腈水溶液梯度洗脱所得。本发明的细叶萼距花提取物能够应用于皮肤抗氧化、美白和抗衰老方面，并进一步用于制备含有所述提取物的化妆品组合物。

Description

一种细叶萼距花精致组分和单体化合物的制备方法及其在化 妆品中的应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体地涉及细叶萼距花精致组分、细叶萼距花单体化合物，以及两者在制备美白抗衰化妆品中的应用。
背景技术
年龄老化、长期暴露在不利的环境中、营养不良、疲劳等因素，会导致细胞和皮肤组织新陈代谢功能的降低，皮肤血液循环的减少，皮肤水分缺失，结构和功能缺陷的累积，内分泌失调，皮肤自身修复能力的降低，最终引起皮肤外观、生理功能及肌理的变化。皮肤老化最明显的改变包括细纹、皱纹的出现，皮肤失去弹性，皮肤下垂、松弛、失色，出现色斑等。
细胞代谢过程中产生的氧自由基会对细胞内生物大分子产生累积性损伤，引起细胞衰老与增殖能力丧失，这种氧化与抗氧化体系的失衡被认为是引起皮肤衰老的重要诱因。酪氨酸酶又称多酚氧化酶，是一种广泛存在于动植物、微生物及人体中的氧化还原酶，是黑色素合成的关键限速酶，与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生密切相关。近年来对其在医药、美容、食品和环保等领域的应用，引起了国内外的广泛关注。市场上的美白剂大多基于对酪氨酸酶的抑制从而达到美白效果。
外界因素引起的体内基质金属蛋白酶(MMPs)的激活，可导致支撑皮肤结构的胶原蛋白和弹性蛋白被过度降解，从而出现皮肤皱缩、无弹性等衰老症状。在正常发育过程中，MMPs负责降解存在于骨骼、软骨和皮肤中的胶原、弹性蛋白、明胶、基质糖蛋白和蛋白多糖等细胞外基质(ECM)。其中，基质金属蛋白酶-1(MMP-1)是一种钙、锌依赖的脊椎动物胶原酶亚类，是MMP家族中能够高效降解I型和III型间质胶原的成员，参与肿瘤、心血管疾病、多发性硬化症和皮肤衰老等一系列生理和病理过程。通过抑制MMP-1的表达或活性，可减少细胞外基质成分的特异性降解。因此，消除生命活动中过度的自由基损伤，抑制胶原酶活性从而减少胶原蛋白的降解流失，被认为能有效延缓皮肤衰老。
随着消费者对用于美白抗氧化、延缓皮肤老化的化妆品需求日益增长，源自植物的美容功效成分已被广泛应用于化妆品产业中。这些活性成分来源于植物的各部位，例如根、茎、叶、树皮、种子、果实、愈伤组织、原生质体及分生组织，以纯或半纯组分，固体或液体提取物或衍生物等不同形式掺入化妆品中。植物化妆品以其崇尚自然、温和、安全性高等特点深受消费者的喜爱，打造植物源化妆品已成为化妆品行业发展的必然趋势。
细叶萼距花(Cuphea hyssopifolia Kunth)为千屈菜科萼距花属植物，一年或多年生，叶对生，叶色浓绿，四季常青且具有光泽。花精巧，边孕蕾边开花，花期长，有较强的观赏价值和园林绿化功能。现在我国广东、广西、云南、福建、北京等省区已引种栽培并广泛应用于园林绿化中。本发明是发明人在自己的前期研究成果(详细内容请参见在先申请CN102525860A)基础上所获得的进一步研发成果，主要涉及细叶萼距花精致组分、单体化合物及其在抗氧化、美白及抗衰老方面的应用。
发明内容
为克服现有技术中存在的缺点，本发明的发明目的是提供具有抗氧化、美白及抗衰老功效的细叶萼距花有效成分，所述有效成分为细叶萼距花经提取、分离而得，其包括7种化合物，所述7种化合物的成分明确。
为实现上述目的，本发明首先获得细叶萼距花(Cuphea hyssopifolia Kunth)精致组分，所述精致组分的制备方法如下：
将干燥的细叶萼距花和80％(v/v)乙醇溶剂按料液比1g：5mL～1g：50mL混合(可分多次加入)，在20～30℃下静置提取合计9-21天(优选为15天)，提取后经过滤分离，滤液在50℃下减压浓缩干燥，得到细叶萼距花粗提取物；
将细叶萼距花粗提取物加水稀释，在20-30℃下依次用石油醚、乙酸乙酯溶剂进行萃取，所获得的萃取部分和水液部分在50℃下减压浓缩干燥，得到细叶萼距花粗提取物的萃取组分和水层成分，具体为石油醚层组分、乙酸乙酯层组分及水层组分。
所述制备细叶萼距花精致组分的方法，还包括以下步骤：
(1)柱层析一次分离：
细叶萼距花粗提取物依次经石油醚、乙酸乙酯萃取得到的所述水层组分，采用D101大孔树脂柱层析进一步纯化：依次用甲醇-水(v/v)0：100、50：50、100：0梯度洗脱，洗脱液在50℃下减压浓缩干燥依次得到组分Ⅰ、组分Ⅱ和组分Ⅲ。
(2)柱层析二次分离(相对于在先申请CN102525860A的进一步分离)：
将经步骤(1)柱层析一次分离后收集的所述组分Ⅱ采用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析进一步纯化，依次采用甲醇-水(70：30，v/v)溶液和氯仿-甲醇(50：50，v/v)溶液洗脱，甲醇-水(70：30，v/v)溶液和氯仿-甲醇(50：50，v/v)溶液各洗脱3-5个柱体积，洗脱完成后分别回收两部分洗脱溶液。其中甲醇-水(70：30，v/v)溶液洗脱部分为有效成分，氯仿-甲醇(50：50，v/v)溶液洗脱部分为杂质成分；
以上述柱体积的洗脱液洗脱，能够最大限度获得有效成分并去除杂质。
(3)柱层析三次分离：
将经所述柱层析二次分离后收集的甲醇-水(70：30，v/v)溶液洗脱部分采用十八烷基硅烷键合硅胶柱层析进行纯化，流速为20mL/min，以甲醇-水溶液梯度洗脱，具体洗脱条件：用于梯度洗脱的甲醇-水溶液中甲醇和水的体积比依次为0：100、20：80、40：60、60：40、80：20、100：0，每个体积比的洗脱液都为5个柱体积。其中，甲醇和水的体积比为20：80、40：60的甲醇-水溶液洗脱获得的洗脱液，分别收集后再混合，所得混合液在50℃下减压浓缩干燥得到细叶萼距花精致组分。
本发明还提供了所述细叶萼距花精致组分含有的7种单体化合物，获得7种单体化合物的方法如下：
将经所述柱层析三次分离得到的细叶萼距花精致组分，采用高效液相色谱进行纯化，采用乙腈浓度为10％(v/v)～30％(v/v)的乙腈水溶液进行梯度洗脱，流动相流速为4mL/min，收集得到细叶萼距花精致组分中7种单体化合物，经鉴定分别为：Myricitrin(1)、Tellimoside(2)、Myricetin 3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside(3)、Myricetin(4)、Desmanthin 1(5)、Penta-O-galloyl-β-D-glucose(6)、Quercetin 3-O-β-(2”-O-galloylxylopyranoside)(7)；上述7种单体化合物在所述精致组分中含量分别为1(8.75％)、2(7.33％)、3(6.42％)、4(18.75％)、5(7.42％)、6(7.83％)、7(8.75％)，总量之和占精致组分干重的65.25％(大于50％)。
本发明还体现所述细叶萼距花精致组分及其所含的7种单体化合物在抗氧化、对酪氨酸酶和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)抑制方面具有显著效果。其中，在抗氧化方面，细叶萼距花精致组分和7种单体化合物的抗氧化IC50值都在1μg/mL-5μg/mL范围内，表明均具有良好的抗氧化能力；在抑制酪氨酸酶和基质金属蛋白酶-1方面，细叶萼距花精致组分和7种单体化合物都表现出良好活性，其中，细叶萼距花精致组分更佳。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、首次从细叶萼距花提取物中，分离鉴定出单体化合物Myricitrin(1)、Tellimoside(2)、Myricetin 3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside(3)、Myricetin(4)、Desmanthin 1(5)、Penta-O-galloyl-β-D-glucose(6)、Quercetin 3-O-β-(2”-O-galloylxylopyranoside)(7)。
2、首次公开了细叶萼距花精致组分在抗氧化、对酪氨酸酶和基质金属蛋白酶-1抑制方面具有显著活性，并获得体外活性筛选、动物模型及人体的功效研究结果。
3、首次公开了7种单体化合物中Myricetin 3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside(3)和Quercetin 3-O-β-(2”-O-galloylxylopyranoside)(7)对酪氨酸酶和基质金属蛋白酶-1抑制方面具有显著活性，以及Desmanthin 1(5)对基质金属蛋白酶-1抑制方面具有显著活性、Quercetin 3-O-β-(2”-O-galloylxylopyranoside)(7)的抗氧化性。
4、本发明所报道的细叶萼距花精致组分，组成非常明确，主要含有7种单体化合物，并且7种单体化合物的总量超过所述细叶萼距花精致组分干重的50％，具有良好的开发前景。
5、根据发明人的酶学实验所得，细叶萼距花精致组分比细叶萼距花单体化合物表现出更强的酪氨酸酶和基质金属蛋白酶-1抑制活性，这能够降低药物可能存在的不良反应，提高产品的安全性。此外，细叶萼距花精致组分的制造成本较低，性价比较单体化合物具有优势。
6、本发明的细叶萼距花精致组分和7种单体化合物，都是从植物中提取、分离、纯化获取，全部生产过程无化学污染，绿色环保。
附图说明
图1为细叶萼距花精致组分的HPLC分析图谱；
图2为实施例2制备得到的单体化合物1的氢谱图(600MHz,MeOD)；
图3为实施例2制备得到的单体化合物1的碳谱图(150MHz,MeOD)和DEPT图；
图4为实施例2制备得到的单体化合物2的氢谱图(600MHz,MeOD)；
图5为实施例2制备得到的单体化合物2的碳谱图(150MHz,MeOD)和DEPT图；
图6为实施例2制备得到的单体化合物3的氢谱图(600MHz,MeOD)；
图7为实施例2制备得到的单体化合物3的碳谱图(150MHz,MeOD)和DEPT图；
图8为实施例2制备得到的单体化合物4的氢谱图(600MHz,MeOD)；
图9为实施例2制备得到的单体化合物4的碳谱图(150MHz,MeOD)和DEPT图；
图10为实施例2制备得到的单体化合物5的氢谱图(600MHz,MeOD)；
图11为实施例2制备得到的单体化合物5的碳谱图(150MHz,MeOD)和DEPT图；
图12为实施例2制备得到的单体化合物6的氢谱图(600MHz,MeOD)；
图13为实施例2制备得到的单体化合物6的碳谱图(150MHz,MeOD)和DEPT图；
图14为实施例2制备得到的单体化合物7的氢谱图(600MHz,MeOD)；
图15为实施例2制备得到的单体化合物7的碳谱图(150MHz,MeOD)和DEPT图；
图16为细叶萼距花精致组分中7种主要单体化合物和6种微量成分指认；图17为细叶萼距花精致组分中7种主要单体化合物EJH-1～7的紫外吸收图谱；
图18为细叶萼距花精致组分中6种微量成分A～F的紫外吸收图谱；
图19为细叶萼距花精致组分及7种单体化合物对ABTS自由基的清除效果；
图20为细叶萼距花精致组分和α-熊果苷对酪氨酸酶的抑制作用；
图21为细叶萼距花精致组分及EJH-4、EJH-5、EJH-6、EJH-7对基质金属蛋白酶-1的抑制作用；
图22为豚鼠背部皮肤组织H&E染色图；
图23为豚鼠背部皮肤组织Fontana-Masson银染图；
图24为含1％细叶萼距花精致组分的面霜的皮肤功效实验；
图25为含1％细叶萼距花精致组分的面霜对某名受试者皮肤各项指标的影响，特征分数指超过同龄人的百分数。
具体实施方式
为使本申请的发明目的、发明内容呈现得更加清楚，下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的细叶萼距花原料均为：采摘于云南昆明的新鲜细叶萼距花地上部分。
下述实施例中的减压浓缩均是通过旋转蒸发仪实现。
实施例1：细叶萼距花精致组分的制备方法
1、细叶萼距花的乙醇提取
取细叶萼距花原料，干燥后取25kg粉碎，采用80％v/v乙醇在20～30℃下浸泡提取三次，料液比(料是25kg，液是每次加入的80％v/v乙醇体积)依次为1g：10mL、1g：6mL、1g：6mL，提取时间依次为7天、5天、3天，合并三次滤液，滤液在50℃下减压浓缩至无乙醇味，干燥得到总浸膏(即粗提取物)1.4kg。
2、萃取
将步骤1所得1.4kg总浸膏用纯水溶解完全，所用纯水体积为2.5L，后在20～30℃下依次、每次用等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，石油醚、乙酸乙酯各萃取3次；合并后的石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分和水液部分在50℃下减压浓缩干燥分别得到石油醚层组分、乙酸乙酯层组分和水层组分。
3、柱层析一次分离
将步骤2所得水层组分用5kg D101大孔吸附树脂柱进行柱层析，具体步骤为：首先将预处理好的大孔吸附树脂以湿法装柱填入玻璃层析柱(直径14cm，高100cm)中，确保均匀无气泡；用蒸馏水压柱至柱高度不变，停止加液；待液面降至柱面以上约5mm，关闭出液口，得到D101大孔吸附树脂柱；再将所述水层组分用纯水溶解完全后沿柱壁缓缓加入柱中，并打开出液口，控制出液速率，避免液面下降太快；当所有样品均加入层析柱后，待液面降至柱面以上约5mm时，以少量蒸馏水润洗柱壁，反复润洗2-3次至柱面上液体澄清无色为止，后缓慢将蒸馏水加满柱，同时关闭出液口，静置12h至达到吸附平衡；继而，打开出液口，控制出液速率，再依次以甲醇浓度为0％v/v(即纯水)，50％v/v和100％v/v(即无水甲醇)的甲醇-水溶液逐级洗脱，每次所用甲醇-水溶液的体积均为30L，流速为100mL/min；将上述各浓度甲醇-水溶液洗脱所得的洗脱液分别在50℃下减压浓缩干燥，得到甲醇浓度为0％v/v的甲醇-水溶液的洗脱组分(简称为组分Ⅰ，下同)650g，甲醇浓度为50％v/v的甲醇-水溶液的洗脱组分(简称为组分Ⅱ，下同)135g，甲醇浓度为100％v/v的甲醇-水溶液的洗脱组分(简称为组分Ⅲ，下同)142g。
4、柱层析二次分离
将步骤3所得135g组分Ⅱ用无水甲醇溶解后采用500g羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)柱层析进一步纯化，依次采用甲醇和水的体积比为70：30的甲醇-水溶液、氯仿和甲醇的体积比为50：50的氯仿-甲醇溶液进行洗脱，这两种溶液各洗脱4个柱体积，洗脱完成后回收洗脱液。其中，甲醇和水的体积比为70：30的甲醇-水溶液的洗脱液在50℃下减压浓缩干燥所得75g固体为有效成分，氯仿和甲醇的体积比为50：50的氯仿-甲醇溶液的洗脱液在50℃下减压浓缩干燥所得为杂质成分。
以上述柱体积的洗脱液洗脱，能够最大限度获得有效成分并去除杂质。
5、柱层析三次分离
将步骤4所得75g有效成分溶解完全后采用500g十八烷基硅烷键合硅胶(Lichroprep)柱层析纯化，具体为：将所述有效成分用无水甲醇溶解完全后加入放有100g反相硅胶(Lichroprep RP-18，粒径40-70μm，日本Fuji Silysia化学公司)的蒸发皿中吸附样品，在通风橱中静置风干，研磨成粉状，接着采用中压玻璃色谱柱(瑞典Biotage公司，C-615泵管理器，C-605泵模块，C-660馏分收集器，RP-18色谱柱)在20～30℃下分离，流速为20mL/min，压力为15MPa；以不同浓度的甲醇-水溶液梯度洗脱，具体洗脱条件：甲醇和水体积比依次为0：100、20：80、40：60、60：40、80：20、100：0的甲醇-水溶液梯度洗脱，洗脱所用的每个体积比的甲醇-水溶液都是2.5L，回收洗脱液。将收集的甲醇和水体积比分别为20：80和40：60的甲醇-水溶液的洗脱液混合，然后在50℃下减压浓缩干燥所得为细叶萼距花精致组分，其质量为45g。
对比例1：细叶萼距花经不同提取方法所得到的精致组分的提取率比较
提取方法为：
细叶萼距花原料100g，干燥粉碎，用600mL乙醇浓度为60％v/v的乙醇-水溶液在20～30℃提取，提取3次，每次的提取时长不同，依次为5天、3天、1天，提取完成后，后续处理工艺依次如下，
1、合并三次滤液，滤液在50℃下减压浓缩至无乙醇味，干燥得到总浸膏。将总浸膏加入纯水中溶解完全至150mL，依次用石油醚萃取3次(每次加150mL石油醚)、乙酸乙酯萃取3次(每次加150mL乙酸乙酯)；所获得的萃取部分分别合并后在50℃下减压浓缩干燥，得到细叶萼距花石油醚层、乙酸乙酯层和水层组分。
2、水层组分采用D101大孔树脂(50g)柱层析进一步纯化，用甲醇-水(0：100、50：50、100：0，v/v)溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱液体积为200mL，收集三个梯度的洗脱液后在50℃下减压浓缩干燥依次得到的组分Ⅰ、组分Ⅱ和组分Ⅲ。
3、将组分Ⅱ用无水甲醇溶解后采用羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20，100g)柱层析进一步纯化，采用甲醇-水(70：30，v/v)溶液进行洗脱，体积为300mL，回收洗脱液后在50℃下减压浓缩干燥得到有效成分。
4、将有效成分采用十八烷基硅烷键合硅胶(20g)柱层析进行纯化，以水-甲醇溶液梯度洗脱，具体洗脱条件：甲醇-水溶液中甲醇和水的体积比依次为0：100、20：80、40：60、60：40、80：20、100：0，每个体积比浓度的甲醇-水溶液的体积都为300mL，收集体积比分别为20：80和40：60的甲醇-水溶液的洗脱部分后合并，在50℃下减压浓缩干燥得到细叶萼距花精致组分(如图1，图1为精致组分的初步HPLC分析图谱，采用无水甲醇溶解精致组分后进样，用10％v/v的乙腈水溶液匀速变化到30％v/v梯度洗脱15min所得)。
重复上述提取方法，其中，每次的提取时长分别为7天、5天、3天。
重复上述提取方法，其中，每次的提取时长分别为9天、7天、5天。
重复上述提取方法，其中，乙醇浓度为80％v/v，每次的提取时长分别为5天、3天、1天；
重复上述提取方法，其中，乙醇浓度为80％v/v，每次的提取时长分别为7天、5天、3天；
重复上述提取方法，其中，乙醇浓度为80％v/v，每次的提取时长分别为9天、7天、5天。
重复上述提取方法，其中，乙醇浓度为100％v/v，每次的提取时长分别为5天、3天、1天；
重复上述提取方法，其中，乙醇浓度为100％v/v，每次的提取时长分别为7天、5天、3天；
重复上述提取方法，其中，乙醇浓度为100％v/v，每次的提取时长分别为9天、7天、5天。
表1细叶萼距花不同提取方法的细叶萼距花精致组分提取率
如表1所示，以乙醇浓度为80％v/v的乙醇-水溶液为提取溶剂时，提取率最高；提取时长为9天、7天、5天(共21天)和7天、5天、3天(共15天)的提取率同为最高，但考虑提取时间，最优提取工艺为乙醇浓度为80％v/v、提取时长为7天、5天、3天(共15天)。
实施例2：细叶萼距花精致组分中单体化合物的制备方法
取120mg细叶萼距花精致组分(由实施例1制备得到，下同，不赘述)，采用无水甲醇溶解后经高效液相色谱柱(柱：Agilent Zorbax SB-C18柱，规格：9.4mm×250mm)乙腈-水溶液梯度洗脱，乙腈的浓度为10～30％v/v，洗脱时间为50分钟，流动相流速为4mL/min，其中，0-40min乙腈-水比例从10：90匀速变化到30：70，40-50min乙腈-水30：70等比例洗脱；真空浓缩干燥所得到的洗脱液，制备得到单体化合物1(简称为EJH-1，黄色粉末，10.5mg，tR＝33.5min，乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为27：73)、单体化合物2(简称为EJH-2，黄色粉末，8.8mg，tR＝32.6min，乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为26：74)、单体化合物3(简称为EJH-3，黄色粉末，7.7mg，tR＝30.4min，乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为25：75)、单体化合物4(简称为EJH-4，黄色粉末，22.5mg，tR＝44.6min，乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为30：70)、单体化合物5(简称为EJH-5，黄色粉末，8.9mg，tR＝46.3min，乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为30：70)、单体化合物6(简称为EJH-6，黄色粉末，9.4mg，tR＝36.2min，乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为28：72)和单体化合物7(简称为EJH-7，黄色粉末，10.5mg，tR＝38.5min，乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为29：71)。
EJH-1～7的结构鉴定：将实施例2制备所得的粉末状化合物EJH-1～7，分别加入0.5mL的氘代甲醇溶解，用200μL移液枪转移至核磁管中，在核磁共振仪(德国布鲁克AvanceIII 600MHz)上检测氢谱和碳谱(如图2-15)。上述化合物EJH-1～7的波谱信息及核磁信号归属依次如下：
Myricitrin(1)：黄色粉末,1H NMR(600MHz,CD3OD,δ,ppm,J/Hz)：6.95(s,H-2'/H-6'),6.36(d,J＝2.1,H-8),6.20(d,J＝2.1,H-6),5.32(d,J＝1.6,H-1"),4.22(dd,J＝3.4,1.6,H-2"),3.79(dd,J＝9.6,3.4,H-3"),3.34(t,J＝9.6,H-4"),3.52(dd,J＝9.6,6.2,H-5"),0.96(d,J＝6.2,H-6")。13C NMR(150MHz,δ,ppm)：178.3(C-4),164.5(C-7),161.7(C-5),158.0(C-2),157.1(C-9),145.5(C-3'/5'),136.5(C-4'),134.9(C-3),120.5(C-1'),108.2(C-2'/6'),104.5(C-10),102.2(C-1”),98.4(C-6),93.3(C-8),71.9(C-4”),70.7(C-3”),70.6(C-5”),70.5(C-2”),16.3(C-6”)。
Tellimoside(2)：黄色粉末,1H NMR(600MHz,CD3OD,δ,ppm,J/Hz)：7.78(d,J＝2.2,H-2'),7.56(dd,J＝8.4,2.2,H-6'),6.89(s,H-2"'/6"'),6.81(d,J＝8.4,H-5'),6.37(d,J＝2.0,H-8),6.17(d,J＝2.0,H-6),5.10(d,J＝7.7,H-1"),4.32(dd,J＝11.0,6.9,H-6"),4.20(dd,J＝11.0,6.0,H-6"),3.88(d,J＝3.7,H-4"),3.85(m,dd,J＝9.7,7.7H-2"),3.80(dd,J＝6.9,6.0H-5"),3.60(dd,J＝9.7,3.7,H-3")。13C NMR(150MHz,δ,ppm)：178.1(C-4),166.6(C-7”'),164.6(C-7),161.4(C-5),157.6(C-2),156.9(C-9),148.5(C-4'),144.9(C-3”'/5”'),144.3(C-3'),138.4(C-4”'),134.3(C-3),121.6(C-1'),121.4(C-6'),119.6(C-1”'),116.4(C-2'),114.7(C-5'),108.7(C-2”'/6”'),104.1(C-10),104.1(C-1”),98.6(C-6),93.4(C-8),73.6(C-5”),73.1(C-3”),71.6(C-2”),68.6(C-4”),62.3(C-6”)。
Myricetin 3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside(3)：黄色粉末,1H NMR(600MHz,CD3OD,δ,ppm,J/Hz)：7.27(s,H-2'/H-6'),7.14(s,H-2"'/6"'),6.32(d,J＝2.2,H-6),6.15(d,J＝2.2,H-8),5.78(d,J＝7.9,H-1"),5.45(dd,J＝9.9,7.9,H-2"),3.96(dd,J＝3.5,1.2,H-4"),3.85(dd,J＝9.9,3.5,H-3"),3.70(d,J＝6.1,H-6"),3.61(td,J＝6.1,1.2,H-5')。13C NMR(150MHz,δ,ppm)：177.5(C-4),166.9(C-7”'),164.3(C-7),161.7(C-9),156.8(C-5),156.6(C-2),144.9(C-3'/5'),144.8(C-3”'/5”'),138.4(C-4”'),136.5(C-4'),133.9(C-3),120.6(C-1'),120.2(C-1”'),109.2(C-2”'/6”'),108.4(C-2'/6'),104.5(C-10),99.9(C-1”),98.2(C-8),93.1(C-6),76.1(C-5”),73.2(C-2”),72.1(C-3”),69.1(C-4”),60.6(C-6”)。
Myricetin(4)：黄色粉末,1H NMR(600MHz,CD3OD,δ,ppm,J/Hz)：7.34(s,H-2'/H-6'),6.38(d,J＝2.2,H-6),6.18(d,J＝2.2,H-8)。13C NMR(150MHz,δ,ppm)：175.9(C-4),164.2(C-7),161.1(C-5),156.8(C-9),146.6(C-2),145.3(C-3'/5'),136.0(C-3),135.5(C-4'),121.7(C-1'),107.1(C-2'/6'),103.1(C-10),97.8(C-8),93.0(C-6)。
Desmanthin 1(5)：黄色粉末,1H NMR(600MHz,CD3OD,δ,ppm,J/Hz)：7.08(s,H-2"'/6"'),6.98(s,H-2'/H-6'),6.36(d,J＝2.2,H-6),6.19(d,J＝2.2,H-8),5.63(dd,J＝3.4,1.8H-2"),5.51(d,J＝1.8,H-1"),4.05(dd,J＝9.1,3.4,H-3"),3.52(dq,J＝9.1,5.8,H-5"),3.48(t,J＝9.1,H-4"),1.04(d,J＝5.8,H-6")。13C NMR(150MHz,δ,ppm)：177.9(C-4),166.1(C-7”'),164.5(C-7),161.8(C-9),158.1(C-2),157.1(C-5),145.5(C-3'/5'),145.1(C-3”'/5”'),138.5(C-4”'),136.6(C-4'),134.2(C-3),120.4(C-1'),119.8(C-1”'),108.9(C-2”'/6”'),108.2(C-2'/6'),104.5(C-10),99.1(C-1”),98.2(C-8),93.3(C-6),72.5(C-4”),72.1(C-2”),70.8(C-5”),69.3(C-3”),16.4(C-6”)。
Penta-O-galloyl-β-D-glucose(6)：黄色粉末,1H NMR(600MHz,CD3OD,δ,ppm,J/Hz)：7.02,6.96,6.88,6.86,6.80(5×2'/6'),6.14(d,J＝8.3Hz,H-1),5.81(t,J＝9.9Hz,H-3),5.51(t,J＝9.9Hz,H-4),5.48(dd,J＝9.9,8.3Hz,H-2),4.41(dd,J＝12.1,1.9Hz,H-6),4.32(dd,J＝4.3,1.9Hz,H-5),4.28(dd,J＝12.1,4.3Hz,H-6)。13C NMR(150MHz,δ,ppm)：166.6,165.9,165.6,165.5,164.8(5×C-7'),145.2,145.1,145.1,145.0,144.9(5×C-3'/5'),139.4,139.0,138.9,138.7,138.6(5×C-4'),119.7,119.0,118.9,118.8,118.3(5×C-1'),109.3,109.1,109.1,109.0,109.0(5×C-2'/6'),92.4(C-1),73.0(C-5),72.7(C-3),70.8(C-2),68.4(C-4),61.8(C-6)。
Quercetin 3-O-β-(2”-O-galloylxylopyranoside)(7)：黄色粉末,1H NMR(600MHz,CD3OD,δ,ppm,J/Hz)：7.61(d,J＝2.3Hz,H-2'),7.53(dd,J＝8.4,2.3Hz,H-6'),7.13(s,H-2”',H-6”'),6.84(d,J＝8.4Hz,H-5'),6.18(d,J＝2.2Hz,H-6),6.36(d,J＝2.2Hz,H-8),5.55(d,J＝5.9Hz,H-1”),5.46(dd,J＝7.6,5.9Hz,H-2”),3.50(m,H-4”),3.89(m,H-5”)。13C NMR(150MHz,δ,ppm)：177.8(C-4),166.3(C-7”'),164.4(C-7),161.7(C-5),157.1(C-2),156.9(C-9),148.4(C-4'),145.0(C-3”'/5”'),144.7(C-3'),138.6(C-4”'),133.7(C-3),121.9(C-1'),121.5(C-6'),120.0(C-1”'),115.7(C-2'),114.9(C-5'),109.1(C-2/6”'),104.4(C-10),99.5(C-6),98.4(C-1”),93.2(C-8),72.5(C-2”),70.4(C-3”),67.5(C-4”),64.8(C-5”)。
根据上述检测的结果，确认所得化合物的结构式依次如下：
实施例3细叶萼距花精致组分中7种单体化合物含量分析及微量成分的类型指认
由实施例2可知，细叶萼距花精致组分120mg，经高效液相色谱柱分离，得到Myricitrin(EJH-1,10.5mg)、Tellimoside(EJH-2,8.8mg)、Myricetin3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside(EJH-3,7.7mg)、Myricetin(EJH-4,22.5mg)、Desmanthin1(EJH-5,8.9mg)、Penta-O-galloyl-β-D-glucose(EJH-6,9.4mg)、Quercetin 3-O-β-(2”-O-galloylxylopyranoside)(EJH-7，10.5mg)；上述7种单体化合物在精致组分中含量百分比分别为：EJH-1是8.75％、EJH-2是7.33％、EJH-3是6.42％、EJH-4是18.75％、EJH-5是7.42％、EJH-6是7.83％、EJH-7是8.75％，7种单体化合物的总质量之和占精致组分干重的65.25％(大于50％)。对精致组分经HPLC分离后所得产物的紫外吸收图谱进行分析，如图16和17所示，EJH-1、2、3、4、5、7的紫外吸收图谱基本一致，最大紫外吸收峰在260和360nm左右，其类型为杨梅苷类；EJH-6的紫外吸收图谱与上述不同，最大紫外吸收峰为220和280nm，其类型为逆没食子鞣质类。另外，对精致组分中微量成分的紫外吸收图谱进行分析，如图16和18所示，发现微量成分A、B、C、E、F的最大紫外吸收峰基本为260和360nm左右，与上述杨梅苷类化合物紫外吸收相同；发现微量成分D的最大紫外吸收峰为220和280nm，与上述逆没食子鞣质类化合物紫外吸收相同。因此，判断微量成分A、B、C、E、F为杨梅苷类化合物，微量成分D为逆没食子鞣质类化合物。
实施例4：细叶萼距花提取物的抗氧化活性研究(细叶萼距花提取物是指组分Ⅰ、组分Ⅲ、精致组分、EJH-1、EJH-2、EJH-3、EJH-4、EJH-5、EJH-6、EJH-7。下同)
将7.4mmol/L ABTS溶液和2.6mmol/L K2S2O8溶液等体积混合室温避光静置16h，制备ABTS自由基储备液。用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4，10mmol/L)将ABTS自由基储备液稀释，稀释液置入多功能酶标仪(Spark 10M，Tecan)中在波长734nm处吸光度达到0.70±0.05，制得ABTS工作液。取200μL ABTS工作液与10μL磷酸缓冲溶液(pH＝7.4，10mmol/L)混合，在多功能酶标仪(Spark10M，Tecan)上测得734nm处的吸光度设为A0。用二甲基亚砜(DMSO)分别溶解组分Ⅰ(由实施例1制备得到，下同，不赘述)、组分Ⅲ(由实施例1制备得到，下同，不赘述)、精致组分(由实施例1制备得到，下同，不赘述)、EJH-1-7(由实施例2制备得到，下同，不赘述)、对照用阳性药Trolox和α-熊果苷，配置成10mg/mL的母液，再用水稀释至不同浓度的母液稀释溶液，不同浓度的母液稀释溶液用作为样品溶液。接着，将10μL所述样品溶液与200μLABTS工作液混合：对于阳性药Trolox，所得到的混合溶液的终浓度分别为0.9、1.79、3.58、7.15、10.73和14.30μg/ml；同样地，对于组分Ⅰ、组分Ⅲ、精致组分、EJH-1、EJH-2、EJH-3、EJH-4、EJH-5、EJH-6、EJH-7、阳性药α-熊果苷中的每一种，所得到的混合溶液的终浓度分别为0.78、1.56、3.13、6.25、12.50和25.00μg/mL。混合溶液室温静置10min，后置入多功能酶标仪(Spark 10M，Tecan)中于波长734nm处测量吸光度设为Ai。同时，将10μL所述样品溶液与200μL pH＝7.4、10mmol/L磷酸缓冲溶液混合，置入多功能酶标仪(Spark 10M，Tecan)中测定其在波长734nm处的背景吸光度设为Aj。每个样品浓度设置3个平行样本。
计算样品对ABTS自由基的清除率公式如下：
ABTS自由基清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
如图19所示，在测试浓度范围内，细叶萼距花提取物对ABTS自由基均表现出较好的清除作用，其中精致组分的清除效果最好，而EJH-1～7中EJH-4(杨梅黄酮)和EJH-5的清除效果最好。应用Graphpad Prism 8.0软件进行非线性拟合，计算得出细叶萼距花提取物对ABTS自由基清除的IC50(half maximal inhibitory concentration)列于表2。除纯水提取得到的组分Ⅰ之外，其余细叶萼距花提取物的抗氧化IC50值都在1μg/mL-5μg/mL范围内。与此同时，作为对照用的阳性药Trolox的IC50值为4.75μg/mL、α-熊果苷的IC50值为1.52μg/mL。上述实验结果表明，组分Ⅰ、组分Ⅲ、精致组分和EJH-1～7均具有良好的抗氧化能力，大多数活性优于Trolox，与α-熊果苷相当。
表2包括单体化合物的各细叶萼距花提取物对ABTS自由基的清除能力
实施例5：细叶萼距花提取物抑制酪氨酸酶活性研究
1、溶液配制
磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH＝6.8)配制：精密称取Na2HPO4 2.84g、NaH2PO42.4g，分别用纯化水溶解定容至100mL，将两溶液等体积混合后调节pH至6.8；L-多巴溶液配制：精密称取L-多巴3.95mg，溶于10mL磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH＝6.8)中，制成2mM L-多巴溶液。酪氨酸酶溶液的配制：精密称取1mg酪氨酸酶(酶活为500U/mg)，溶于5mL磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH＝6.8)中，制成酶活力为100U/mL的酪氨酸酶溶液。样品溶液配制：用DMSO分别溶解各细叶萼距花提取物，配制成3mg/mL溶液；对照用阳性药物曲酸用磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH＝6.8)配制成1mg/mL的溶液。
2、酪氨酸酶活性测定
设置四个试验组：样品组A1，样品阴性对照组A2，酶标准组B1和酶阴性对照组B2；每个样品设置3个平行，按表3配制200μL反应体系。依次向96孔板中加入对应体积的磷酸盐缓冲溶液、待测样品溶液(终浓度0.3mg/mL)、酪氨酸酶溶液(终浓度20U/mL)以及反应底物L-多巴(终浓度1.2mM)，于37℃微孔板恒温振荡器中温育30min，随后在多功能酶标仪(SPARK10M，TECAN)中测定475nm处的吸光度。细叶萼距花精致组分对酪氨酸酶的抑制率计算公式如下：
酪氨酸酶抑制率(％)＝[1-(A1-A2)/(B1-B2)]×100％
表3酪氨酸酶活性抑制实验反应体系配制(体积/μL)
表4细叶萼距花提取物对酪氨酸酶的抑制率
如表4所示，0.3mg/mL的阳性药曲酸和α-熊果苷对酪氨酸酶的抑制率分别为97.9±1.3％和54.6±2.8％。而相同浓度条件下，细叶萼距花提取物中除组分Ⅰ外，其余种类的提取物均表现出较好的酪氨酸酶抑制活性，抑制率均在45％-75％范围内。其中，精致组分对酪氨酸酶的抑制效果最佳，达70.5±1.9％，优于各单体化合物。
为了进一步评价精致组分对酪氨酸酶的体外抑制活性，将该组分以及阳性药α-熊果苷用磷酸盐缓冲溶液稀释成不同浓度梯度。参照表3的反应体系配制，使终浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL，测定反应30min后溶液在475nm处的吸光度(多功能酶标仪(SPARK 10M，TECAN)中测定)。如图20所示，α-熊果苷和精致组分对酪氨酸酶的活性均表现出剂量依赖性的抑制作用。应用Graphpad Prism 8.0软件进行非线性拟合后计算得出精致组分以及α-熊果苷对酪氨酸酶的半抑制浓度IC50分别为0.14mg/mL和0.27mg/mL。上述实验结果表明，细叶萼距花精致组分对酪氨酸酶的抑制效果是阳性对照药α-熊果苷的近两倍。
实施例6：细叶萼距花提取物抑制基质金属蛋白酶-1活性研究
采用基质金属蛋白酶-1抑制剂筛选试剂盒(Abcam，ab118973)测定细叶萼距花提取物对基质金属蛋白酶-1活性的抑制作用。基质金属蛋白酶-1可水解特定的荧光共振能量转移(FRET)底物，释放出荧光基团，其荧光信号在Em/Ex＝480/530nm时可被检测到。而有效的MMP-1抑制剂可阻断底物的水解，降低单位时间内产生的荧光信号。
首先，对细叶萼距花提取物抑制基质金属蛋白酶-1活性进行初步筛选。按表5配制100μL反应体系，设置三个试验组：酶对照组，组分Ⅰ组、组分Ⅲ组、精致组分和EJH-1、EJH-2、EJH-3、EJH-4、EJH-5、EJH-6、EJH-7组。在黑色96孔板中依次加入对应体积的MMP-1溶液(即MMP-1酶原液)，测试缓冲液(酶对照组)，组分Ⅰ、精致组分、组分Ⅲ的初筛终浓度都为1mg/mL，EJH-1、EJH-2、EJH-3、EJH-4、EJH-5、EJH-6、EJH-7的初筛终浓度都为0.5mg/mL，每个样品浓度设置2个平行。配制的溶液震荡混匀，37℃温浴5min后加入底物，随即用多功能酶标仪(SPARK 10M，TECAN)测定各样品孔的初始荧光信号F0，并监测2.5h内荧光信号变化情况，记录反应2.5h后样品的荧光信号F1。按照下列公式计算样品作用后的相对酶活性，其中酶对照组的初始荧光信号设为F0e，反应2.5h后的荧光信号设为F1e；各样品组的初始荧光信号设为F0s，反应2.5h后样品溶液的荧光信号设为F1s。
表5测定基质金属蛋白酶-1活性的反应体系配制(单位：μL/孔)
在1mg/mL的初筛浓度下，组分Ⅰ、组分Ⅲ、精致组分对基质金属蛋白酶-1活性的抑制率大于50％。在0.5mg/mL的初筛浓度下，EJH-4、5、6和7对基质金属蛋白酶-1活性的抑制率大于50％，而EJH-1～3对基质金属蛋白酶-1活性的抑制率小于50％。
为进一步测定这些提取物抑制基质金属蛋白酶-1活性的IC50，设置不同浓度梯度。同样地，根据表5配制100μL反应体系，使得精致组分溶液的终浓度分别为0.1、1、10、100和1000μg/mL，EJH-4、5、6、7中每一种的溶液的终浓度都分别为31.2、62.5、125、250和500μg/mL。
结果如图21所示，测定的精致组分和EJH-4、5、6和7对基质金属蛋白酶-1的活性均表现出剂量依赖性的抑制作用。在浓度为100μg/mL时，精致组分对基质金属蛋白酶-1活性的抑制率达64％(**P＜0.01)。应用Graphpad Prism 8.0软件进行非线性拟合后计算得出精致组分对基质金属蛋白酶-1的半抑制浓度IC50为55.0μg/mL；EJH-4、5、6、7对基质金属蛋白酶-1的半抑制浓度IC50分别为214.6μg/mL、155.4μg/mL、60.2μg/mL和160.7μg/mL。上述实验结果表明，细叶萼距花精致组分对基质金属蛋白酶-1的抑制效果更佳，优于各单体化合物。
实施例7：小鼠急性毒性实验
用昆明鼠进行实验。精密称量400mg的组分Ⅰ、组分Ⅲ、精致组分，加入0.5mL的DMSO溶解，并用超纯水将样品稀释至200mg/mL。分别设置空白组、DMSO对照组、组分Ⅰ组、组分Ⅲ组、精致组分组。空白组和DMSO对照组一只小鼠，实验组每组两只小鼠(雌雄各半)。实验前将小鼠禁食12h，自由饮水。称量禁食后的小鼠体重，根据上-下法，以2000mg/kg经口灌胃分别给予生理盐水(0.4mL)、25％DMSO、组分Ⅰ、组分Ⅲ、精致组分，观察有无震颤、惊厥、流涎、嗜睡和昏迷等呼吸***、泌尿***、消化***和神经***变化，连续观察48h。观察期结束时，所有存活动物称重后安乐死，进行大体解剖观察，并进行组织病理学检查。
通过上述实验可得，小鼠在注射较大剂量2000mg/kg后，持续观察48h。小鼠生长良好，活动正常，毛色光泽度好，均未出现震颤、流涎、抽搐、蹬腿，嗜睡，昏迷等中毒症状。实验结束时，进行大体解剖检查，观察各脏器未见明显病理改变。空白组与实验组体重无显著差异。急性毒性实验表明，组分Ⅰ、组分Ⅲ、精致组分在2000mg/kg剂量下无明显动物毒性，小鼠最大耐受量(MTD)均大于2000mg/kg。
表6小鼠急性毒性结果
实施例8：细叶萼距花精致组分有效抑制紫外光所致的豚鼠皮肤黑色素沉积
选择20只豚鼠，重200-250g，背部有大面积棕黄色毛发，购自辽宁长生生物科技有限公司。所有豚鼠饲养在温度25℃±2℃，相对湿度为55％±15％的环境中，实行12h/12h明暗交替，所有豚鼠可以自由食用水和豚鼠专用饲料，适应性喂养7天。在紫外辐射前一天，每只豚鼠选取其棕色毛发区域，用剃须刀剃去较长毛发，再用脱毛膏均匀涂抹在剪毛区域，5min后用温水将脱毛膏洗净，动作轻柔，使豚鼠背部皮肤裸露3*3cm2的皮肤。本研究经过中南民族大学动物伦理委员会的批准。
20只豚鼠随机分为4组，每组5只。5只作为空白组，其余组用UVB紫外灯照射豚鼠，每次1h，辐射剂量：第1-7天每天辐射剂量为0.6J/cm2，第6-20天，每天辐射剂量为0.3J/cm2，连续照射20天，每次照射前使用脱毛膏对豚鼠试验区皮肤进行脱毛。
具体分组如下：
空白对照组：涂抹相同剂量的0.3％CMC-Na，不照射紫外；
模型组：涂抹相同剂量的0.3％CMC-Na，UVB照射30min；
阳性药组：涂抹1mg含0.3％CMC-Na的β-熊果苷，UVB照射30min；
实验组：涂抹2mg含0.3％CMC-Na的细叶萼距花精致组分，UVB照射30min；
连续造模给药20天，并观察其背部皮肤受UVB辐射损伤程度。实验结束后，将豚鼠安乐死，取背部皮肤组织，将其放入4％多聚甲醛固定液中固定进行后续实验。
H&E常规染色：按照常规石蜡包埋、切片；切片脱蜡至水；放入苏木精染料中染色5min，流水冲洗1次；1％盐酸酒精分化液分色15s，流水冲洗2次；1％氨水返蓝30s；1％伊红染料染色2min，自来水冲洗；70％、80％、90％、95％、100％(均为体积百分数)乙醇依次脱水，各两分钟，晾干；放入二甲苯中透明，用中性树胶封片。
Fontana-Masson银染法检测皮肤各层中黑色素含量：依据常规组织的病理学检测方法，取实验结束后豚鼠皮肤组织用4％多聚甲醛固定后脱水、石蜡包埋、切片。运用Masson-Fontana银染色法对皮肤切片进行染色，在显微镜下观察黑色素染色结果，确定细叶萼距花精致组分对紫外诱导的黑色素分布变化。
H&E染色结果如图22所示，空白组皮肤组织表皮完整，胶原纤维排列紧密，毛囊数量丰富。模型组皮肤组织明显增厚，真皮层可有淋巴细胞浸润，毛囊减少。阳性对照组豚鼠皮肤组织表皮较厚；真皮层有大量淋巴细胞浸润，胶原纤维排列稀疏，毛囊数量较少。实验组豚鼠皮肤组织表皮较厚，多量棘细胞水样变性，胞质疏松淡染；真皮层有少量粒细胞浸润，胶原纤维排列紧密，毛囊丰富。以上结果说明紫外线会导致豚鼠皮肤组织增厚，炎性细胞浸润，胶原纤维损伤，毛囊减少等。与阳性对照β-熊果苷相比，细叶萼距花精致组分可以抑制皮肤组织增厚，促进胶原纤维增生，促进毛囊增生。
黑色素含量检测结果如图23所示，空白组对照组豚鼠背部皮肤黑色素含量极少，主要集中在基底层的区域，棘层只有极少量的黑色素存在；模型组经紫外照射后黑色素明显增多，基底层、棘层都有大量黑色素表达，但主要集中在基底层；阳性对照组黑色素含量较多，主要集中在基底层，在棘层的含量较少；实验组黑色素分布对比模型组明显减少，主要集中在基底层，在棘层含量较少。以上结果说明紫外线会促进豚鼠皮肤组织黑色素分泌增加，β-熊果苷和细叶萼距花精致组分均能减少黑色素生成，细叶萼距花精致组分效果优于β-熊果苷，在美白系列化妆品中有广阔的应用前景。
实施例9安全性测试
根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)进行人体皮肤封闭型斑贴实验。共招募30名志愿者，性别随机，年龄18～60周岁，进行斑贴实验。实验方法：将1％细叶萼距花精致组分，2％乙氧基二甘醇，1％PEG-40氢化蓖麻油，2％戊二醇和94％纯水混合(上述百分比均为质量百分比)，加热溶解，冷却至室温，配制成含1％细叶萼距花精致组分的溶液。将200μL上述含1％细叶萼距花精致组分的溶液放入斑试器内，对照孔为不加1％细叶萼距花精致组分的溶液，斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的上臂，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。去除斑试器后，待压痕消失后观察皮肤反应。根据皮肤反应分级表进行打分。
表7皮肤反应分级表
试验结果表明，1％含量的细叶萼距花精致组分对人体皮肤无不良反应，仅有1人出现微弱红斑，其余29人均无明显不适。
表8皮肤安全性测试结果
实施例10含细叶萼距花精致组分的面霜皮肤功效实验
共招募30名志愿者，性别随机，年龄18～60周岁，进行左右脸对照测试。左侧使用空白面霜，右侧使用含1％细叶萼距花精致组分的面霜，按平时护肤***行偏振光)，提高了皮肤分析的可视程度。
表9面霜配方
将水相、油相原料分别混合后加热到85℃，接着将水相加入油相中乳化3min，即得空白面霜和含1％细叶萼距花精致组分的面霜。
由图24(含1％细叶萼距花精致组分的面霜皮肤功效实验)和图25(含细叶萼距花精致组分的面霜对某名受试者皮肤各项指标的影响)所示的结果可知，制备的含1％细叶萼距花精致组分的面霜可以明显改善面部皮肤整体状态，如表层斑点，棕色斑(深层次的隐性斑)等问题；同时纹理(反映皮肤的平滑度和饱满感)、紫外线色斑(反映表皮下潜在的色素斑)和紫质(反映皮肤油脂)等有显著改善。针对紫外线色斑和棕色斑14天有效改善率达到60％，且受试者均未出现任何过敏或不适等现象。表明精致组分可以减少皮肤深层的紫外线色斑和棕色斑，有效减少皮肤表层的斑点，具有美白功效；并促使皮肤平滑，减少油脂，具有良好抗光老化的功效。

Claims (10)

1.结构式为的化合物在制备具有抑制酪氨酸酶、抑制基质金属蛋白酶-1和美白活性中至少一种功效的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为化妆品。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为面霜。
4.含有结构式为的化合物的产品；
所述产品具有抑制酪氨酸酶、抑制基质金属蛋白酶-1和美白活性中至少一种功效。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述产品为化妆品。
6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于：所述产品为面霜。
7.一种从细叶萼距花中提取7种单体化合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
细叶萼距花的60-100％v/v乙醇提取物依次经石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚层组分、乙酸乙酯层组分及水层组分；
将所述水层组分经D101大孔树脂柱层析纯化：依次用甲醇和水的体积比为0：100、50：50、100：0的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集甲醇和水的体积比为50：50的甲醇-水溶液洗脱所得到的洗脱液，减压浓缩干燥得到组分Ⅱ；
将所述组分Ⅱ经羟丙基葡聚糖凝胶柱层析纯化：用甲醇和水的体积比为70：30的甲醇-水溶液洗脱3-5个柱体积，得到有效成分；
将所述有效成分经十八烷基硅烷键合硅胶柱层析纯化：依次采用甲醇和水的体积比为0：100、20：80、40：60、60：40、80：20、100：0的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，将甲醇和水的体积比为20：80、40：60的甲醇-水溶液洗脱获得的洗脱液分别收集后再混合，将所得混合液减压浓缩干燥，制得细叶萼距花精致组分；
将所述细叶萼距花精致组分经高效液相色谱纯化：采用乙腈浓度为10％v/v～30％v/v的乙腈-水溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液后减压浓缩干燥，获得Myricitrin、Tellimoside、Myricetin 3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside、Myricetin、Desmanthin 1、Penta-O-galloyl-β-D-glucose和Quercetin3-O-β-(2”-O-galloylxylopyranoside)7种单体化合物；
所述Myricetin 3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside的结构式为
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
步骤S1、细叶萼距花原料干燥后粉碎，采用60-100％v/v乙醇在20～30℃浸泡提取1-4次合计9-21天，干燥的细叶萼距花原料和每次提取时所加60-100％v/v乙醇的料液比为1g：5mL～1g：50mL，将提取完后固液分离所得的滤液减压浓缩干燥，得细叶萼距花乙醇提取物；
步骤S2、将细叶萼距花乙醇提取物加水溶解，在20～30℃下依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取；收集获得的石油醚萃取溶液、乙酸乙酯萃取溶液、水溶液分别减压浓缩干燥，得到细叶萼距花提取物的石油醚层组分、乙酸乙酯层组分及水层组分；
步骤S3、所述水层组分采用D101大孔树脂柱层析进一步纯化，依次以甲醇浓度为0％v/v，50％v/v和100％v/v的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，依次得到组分Ⅰ、组分II和组分III；
步骤S4、将所述组分II采用羟丙基葡聚糖凝胶柱层析进一步纯化，依次采用甲醇和水的体积比为70：30的甲醇-水溶液、氯仿和甲醇的体积比为50：50的氯仿-甲醇溶液进行洗脱，这两种溶液各洗脱3-5个柱体积，洗脱完成后回收这两种溶液的洗脱液；其中，甲醇和水的体积比为70：30的甲醇-水溶液的洗脱液减压浓缩干燥所得为有效成分，氯仿和甲醇的体积比为50：50的氯仿-甲醇溶液的洗脱液减压浓缩干燥所得为杂质成分；
步骤S5、将步骤S4中所述有效成分加甲醇完全溶解后采用十八烷基硅烷键合硅胶柱层析进一步纯化，具体方式为：将所述有效成分完全溶解后与粒径40～70μm的十八烷基硅烷键合硅胶混合，然后静置风干，随后，将吸附了样品的十八烷基硅烷键合硅胶研磨成粉状，接着将其装入中压玻璃色谱柱在室温下进行分离，流动相流速为20mL/min，压力为15MPa；以不同浓度的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，具体洗脱条件：依次采用甲醇和水体积比为0：100、20：80、40：60、60：40、80：20、100：0的甲醇-水溶液洗脱，每个体积比的洗脱液用量都为5个柱体积；回收洗脱液，将回收的甲醇和水体积比分别为20：80、40：60的甲醇-水溶液洗脱的洗脱液混合，将所得混合液减压浓缩干燥，制得细叶萼距花精致组分；
步骤S6、将所述细叶萼距花精致组分经高效液相色谱柱，采用乙腈浓度为10％v/v～30％v/v的乙腈-水溶液进行梯度洗脱，洗脱时间为50分钟，流动相流速为4mL/min；其中，0-40min时乙腈-水体积比例从10：90匀速变化到30：70，40-50min时乙腈-水30：70等比例洗脱；
0-40min时，依次洗脱出单体化合物Myricetin 3-O-(6”-O-galloyl)-β-D-glucopyranoside、Tellimoside、Myricitrin、Penta-O-galloyl-β-D-glucose、Quercetin3-O-β-(2”-O-galloylxylopyranoside)；
40-50min时，依次洗脱出单体化合物Myricetin、Desmanthin 1；
真空浓缩干燥所得到的各单体化合物的洗脱液，获得单体化合物。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于：所述步骤S1中，采用80％v/v乙醇在20～30℃浸泡提取3次合计15天。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于：所述步骤S1中，干燥的细叶萼距花原料和每次提取时所加80％v/v乙醇的料液比为1g：5mL～1g：10mL。
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