CN116457467A - 表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡、其制造方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡、制造所述细胞外囊泡的方法及其用途。本发明提供了通过用含有编码细胞因子的基因的第一载体和含有编码抗体的基因的第二载体转化免疫细胞来制造在细胞膜表面上表达细胞因子和抗体两者的免疫细胞的方法，以及由所述免疫细胞制造在表面上表达细胞因子和抗体两者的细胞外囊泡的方法。通过组合第一载体和第二载体从而可以根据靶细胞表达特定细胞因子或特定抗体，本发明提供了可以诱导细胞中期望的细胞因子应答的细胞外囊泡，所述细胞可被特定抗体靶向，并且所述细胞外囊泡对人体安全，同时表现出优异的抗癌作用。本发明提供了新的癌症治疗手段，该治疗手段通过在细胞外囊泡内封装对癌症具有治疗作用的药物或生理活性物质，从而可被用于将药物或生理活性物质递送到特定的癌细胞。

Description

表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡、其制造方法及其用途

技术领域

本公开涉及表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡、制造所述细胞外囊泡的方法及其用途。

背景技术

细胞外囊泡(EV)是指来源于细胞的纳米尺寸的囊泡，根据分泌形式和大小分为外泌体、微囊泡、核外颗粒体(ectosomes)、微粒、膜囊泡、纳米囊泡、外膜囊泡等。细胞外囊泡是细胞之间交流的主要手段，包含作为细胞主要成分的核酸和蛋白质。

最近，据报道，癌症患者中细胞外囊泡分泌增加，并在癌症患者中特异性表现的某些蛋白方面观察到了改变，因此值得注意的是，细胞外囊泡可能被用作诊断癌症的标志物。此外，由于细胞外囊泡在体内高度稳定而不诱导免疫应答，因此将药物封装在其中可以使药物能选择性地递送到体内的靶细胞，并且由于容易从各种细胞中分离和纯化细胞外囊泡，正在进行关于使用细胞外囊泡作为药物递送体的研究。

另一方面，癌症是由细胞异常生长引起的疾病，据报道，癌症患者的死亡率很高，它在韩国的死因中排名第一。存在数十种的癌症类型，主要根据来源组织进行分类。癌症分为良性肿瘤和恶性肿瘤，其中良性肿瘤具有相对慢的生长速度，并且几乎不显示出从肿瘤的原发部位向其它组织的转移，而恶性肿瘤由于通过浸润入远离原发部位的其它组织中而快速生长，由此威胁生命。

手术、化疗和放疗被应用于癌症的治疗方法，尽管已有长期研究，但据报道，接受过治疗的癌症患者中多于50％死亡。尽管应用了各种治疗方法，但癌症仍难以治疗的原因是，即使通过手术切除癌症来治愈癌症患者，癌症也会因癌细胞转移到患者的其它组织而复发，或者，尽管在初始治疗阶段由于抗癌药物的作用，肿瘤的大小减小，但由于癌细胞在治疗期间或治疗后对抗癌药物表现出耐药性，癌症的预后急剧恶化。

尤其是，作为常用的化疗剂的抗癌药物主要通过抑制癌细胞增殖的机制而显示出抗癌作用，并且已开发出约60种不同类型的抗癌药物。然而，由于大多数抗癌药物非选择性地作用于正常细胞以及癌细胞，将导致严重的副作用，如脱发、极度疲劳、呕吐、恶心、皮肤和指甲变色以及神经***的副作用。

为了克服传统抗癌药物的问题，靶向抗癌药物和使用免疫细胞的抗癌疗法已经被开发为特异性作用于癌细胞的治疗方法。然而，这些治疗方法根据患者的特征而显示出治疗效率的差异，以至于该问题仍然没有解决，例如由于免疫***的过度激活而导致急性炎症性疾病的发展。因此，需要开发对癌细胞而言特异的新的治疗方法。

[现有技术文献]

[专利文献]

韩国专利第10-1820264号(于2018年1月12日登记)

发明内容

技术目标

本公开的目的是提供细胞外囊泡作为治疗癌症的新手段，所述细胞外囊泡的细胞因子和抗体在膜的表面上表达。

本公开的另一个目的是提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，药物组合物包含细胞外囊泡作为活性成分。

本公开的另一个目的是提供用于递送药物或生物活性物质的组合物作为癌症治疗的新手段，该组合物包含细胞外囊泡，其中封装有对癌症表现出治疗作用的药物或生物活性物质。

技术方案

本公开提供了在其表面上表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡。

此外，本公开提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含细胞外囊泡作为活性成分。

此外，本公开提供了用于递送药物或生物活性物质的组合物，所述组合物包含细胞外囊泡，其中所述药物或生物活性物质封装在细胞外囊泡中。

此外，本公开提供了制造细胞外囊泡的方法，所述方法包括制备第一载体，所述第一载体包含编码细胞因子的基因、编码连接子的连接子结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域；制备第二载体，所述第二载体包含编码抗体的基因、编码连接子的连接子结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域；利用慢病毒用第一载体和第二载体转化细胞；以及从培养基中分离细胞外囊泡，所述培养基中培养了转化有第一载体和第二载体的细胞。

有益效果

根据本公开，通过用包含编码细胞因子的基因的第一载体和包含编码抗体的基因的第二载体转化免疫细胞，可以制备在细胞膜表面上表达细胞因子和抗体两者的免疫细胞，并从免疫细胞制备在表面上表达细胞因子和抗体两者的细胞外囊泡，其中，通过组合第一载体和第二载体从而可以根据靶细胞表达特定细胞因子或特定抗体，细胞外囊泡可以诱导可用特定抗体靶向的细胞中的期望的细胞因子应答，并因此可作为对人体安全并且表现出优异抗癌作用的新抗癌药物而被提供。

此外，本公开的细胞外囊泡作为癌症治疗的新手段而被提供，所述细胞外囊泡通过在其中封装对癌症表现出治疗作用的药物或生物活性物质，从而可用于将药物或生物活性物质递送至特定的癌细胞，。

附图说明

图1为示出了以下的图：用于制造本公开的细胞外囊泡的载体的组成以及制造细胞外囊泡的方法。

图2示出了从血液样品中分离免疫细胞并用流式细胞仪分析其特征的结果，所述免疫细胞待用于制造本公开的细胞外囊泡。

图3示出了鉴别细胞因子和/或抗体是否在免疫细胞中表达的结果，该免疫细胞被转化为表达细胞因子和/或抗体以制造本公开的细胞外囊泡。

图4示出了对根据本公开制造的细胞外囊泡的癌细胞特异性细胞毒性进行评价的结果。

图5示出了评价细胞因子IL-2的细胞毒性的结果。

图6示出了基于根据本公开制造的细胞外囊泡的表面上表达的抗体评价癌细胞特异性的结果。

图7示出了验证根据本公开制造的细胞外囊泡的抗体特异性的结果。

图8示出了通过“荧光、发光和计算机断层活体光学成像***”和“共聚焦荧光显微术”在用荧光染色的细胞外囊泡对非小细胞肺癌细胞(A549)移植小鼠进行处理后对癌细胞特异性靶向的鉴别。

具体实施方式

考虑到本文中的功能，本文中使用的术语已尽可能地从当前广泛使用的通用术语中选择，但这些术语可能会根据本领域技术人员的意图或先例、新技术的出现等而变化。此外，在特定情况下，存在由申请人任意选择的术语，并且在这种情况下，将在本公开的说明书中详细描述其含义。因此，本文中使用的术语不应通过术语的简单名称来定义，而应基于术语的含义和本公开的整体内容。

除非另有定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术术语或科学术语)，具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如在常用词典中定义的术语应被解释为具有与相关领域的情况下的含义一致的含义，并且除非在本申请中明确定义，否则不应被解释为理想的或过于正式的含义。

数值范围包括上述范围内定义的数值。本文给出的所有最大数值限值包括所有较低的数值限值，如对较低的数值限值所清楚说明的。本文给出的所有最小数值限值包括所有较高的数值限值，如对较高的数值限值所清楚说明的。本文给出的所有数值限值将包括处于较宽数值范围内的所有更好的数值范围，如对更窄的数值限值所清楚说明的。

在下文中，将对本公开进行更详细的描述。

由于需要开发对癌细胞而言特异的新治疗方法，本公开的发明人制造了细胞外囊泡，所述细胞外囊泡的激活免疫***的细胞因子和选择性靶向癌细胞的抗体在其表面上表达；并鉴别了其癌细胞特异性细胞毒性，从而提供了在表面上表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡，作为预防或治疗癌症的手段以及递送药物或生物活性物质的运载体。

本公开提供了在其表面上表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡。

细胞外囊泡可被制备为膜结合型细胞因子(MBC)平台，该MBC平台由“细胞因子或抗体编码基因-连接子结构域-跨膜结构域”组成，使得细胞因子或抗体与连接到跨膜蛋白的连接子结合，从而以附着至细胞膜的形式表达，而不是在细胞外分泌。

如图1所示，在本公开中，通过将MBC平台应用于免疫细胞来制备在细胞膜表面上表达特定细胞因子和抗体的免疫细胞，从而制造在表面上表达特定细胞因子和抗体的细胞外囊泡。

构成细胞外囊泡的磷脂双层包含通过连接子结合至细胞因子或抗体的跨膜蛋白。具体来讲，细胞因子可以是具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的IL-2，并且抗体可以是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的Erbitux的scFv，但不限于此。连接子可具有选自SEQID NO:3至SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列中的任何一个的1次-20次重复的序列。

细胞外囊泡来源于转化有载体的细胞，所述载体包含编码细胞因子或抗体的基因；编码连接子的连接子结构域；以及编码跨膜蛋白的跨膜结构域。

具体来讲，用于制造细胞外囊泡的载体包含编码作为细胞因子的白细胞介素-2(IL-2)或作为抗体的Erbitux的scFv的基因，并且该基因的末端具有连接子结构域和血小板衍生生长因子(PDGF)受体的跨膜结构域依次连接的形式，从而当通过转化有载体的细胞来表达载体时，细胞因子或抗体与连接到跨膜蛋白的连接子结合，而不是在细胞外分泌，使细胞因子或抗体以附着至经转化细胞的膜表面的形式表达。

跨膜结构域可以是选自于由如下所组成的组中的任何一种受体中包含的跨膜结构域：表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、胆囊收缩素(CCK)受体、神经营养因子(NGF)受体、肝细胞生长因子(HGF)受体、肾上腺素(Eph)受体、血管生成素受体和相关受体酪氨酸激酶(RYK)受体，但不限于此。

细胞可以是选自于由如下所组成的组中的任一种：辅助性T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、B细胞、成体干细胞、间充质干细胞、血液干细胞和诱导性多能干细胞(iPSc)，但不限于此。

细胞外囊泡可通过具有癌细胞特异性细胞毒性而表现出抗癌作用，并且可通过将药物或生物活性物质封装于其中而用作运载体。

此外，本公开提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的细胞外囊泡。

癌症可以是选自于由如下所组成的组中的任一种：黑色素瘤、结肠癌、肺癌、皮肤癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、***癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经***肿瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤，但不限于此。

药物组合物可包含药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂。运载体、赋形剂和稀释剂可选自于由如下所组成的组：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***树胶、藻酸盐/酯、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。

所述药物组合物可以通过分别按照常规方法配制为以下形式来使用：口服剂型(如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气雾剂)以及外用剂、栓剂或无菌注射溶液，并且具体来讲，配制时可以使用稀释剂或赋形剂来制备，例如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，但不限于此。此类固体制剂可以通过在上述活性成分之外混合至少一种或多种赋形剂来制备，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂(如硬脂酸镁和滑石)。除了用于口服用途的液体物质和液体石蜡外，还可以添加各种赋形剂(例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等)进行制备。用于胃肠外给药的制剂包括无菌水性溶液、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。非水性溶剂和悬浮剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、可注射的酯(如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质，可以使用Witepsol、Macrosol、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。

本公开的药物组合物的合适剂量可以根据患者的病症和体重、患病程度、药物形式和时间而变化，但可由本领域技术人员适当地选择，并且该组合物的日剂量可优选为0.001mg/kg至50mg/kg，并且可以根据需要每天以单剂量至多剂量进行给予。

此外，本公开提供了用于递送药物或生物活性物质的组合物，所述组合物包含细胞外囊泡，其中，所述药物或生物活性物质封装在所述细胞外囊泡中。

所述药物可以是选自于由抗癌药物、抗炎镇痛剂、抗生素、抗菌剂和疫苗所组成的组中的任何一种，并且所述生物活性物质可以是选自于由肽、蛋白质、激素和基因所组成的组中的任何一种，但不限于此。

此外，本公开提供了制造细胞外囊泡的方法，所述方法包括制备第一载体，所述第一载体包含编码细胞因子的基因、编码连接子的连接子结构域以及编码跨膜蛋白的跨膜结构域；制备第二载体，所述第二载体包含编码抗体的基因、编码连接子的连接子结构域以及编码跨膜蛋白的跨膜结构域；利用慢病毒用第一载体和第二载体转化细胞；以及从培养基中分离细胞外囊泡，所述培养基中培养了转化有第一载体和第二载体的细胞。

实施例

在下文中，为了帮助理解本公开，将详细描述示例的实施方式。然而，以下示例的实施方式仅仅是本公开的内容的说明，并且本公开的范围不限于以下示例的实施方式。提供本公开的示例的实施方式以向本领域普通技术人员更完整地解释本公开。

实施例1.免疫细胞的分离

从血液中分离人CD8+T淋巴细胞，作为待用于制造本公开的细胞外囊泡的免疫细胞。用Ficoll处理经抗凝处理的血液样品，然后通过离心获得血沉棕黄层(buffy coat)。将分离的血沉棕黄层在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基(Hyclone)中培养一天，然后收集悬浮在培养基上清液中的细胞用于实验。根据制造商说明，使用人CD8+T细胞分离试剂盒(MACS，其为用于分离CD8+T淋巴细胞的试剂盒)从收集的细胞中分离原代CD8+T淋巴细胞。用CD3-APC、CD8-FITC和CD56-PE抗体(MACS)处理分离的原代CD8+T淋巴细胞，并通过流式细胞术发现CD8+T细胞以超过80％的准确率分离(图2)。

实施例2.细胞培养

在添加有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Hyclone)中培养HEK-293FT细胞(人胚胎肾细胞)，并在添加有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基(Hyclone)中培养A549-luc细胞(人非小细胞肺癌细胞)。在添加有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素、50IU/mL重组IL-2(R&D systems)和CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂(STEMCELL)的RPMI 1640培养基(Hyclone)中培养分离自人血的原代CD8+T淋巴细胞。

实施例3.慢病毒的制备

为制造根据本公开的在表面上表达的细胞因子和抗体的细胞外囊泡，制备了包含编码细胞因子的基因的第一载体和包含编码抗体的基因的第二载体，用慢病毒将它们各自转化至细胞中。

具体而言，第一载体包含编码作为细胞因子的IL-2的基因、连接子结构域和PDGF受体的跨膜结构域，并且第二载体包含编码Erbitux的scFv的基因、连接子结构域和PDGF受体的跨膜结构域。第一载体和第二载体各自参照论文(Proc Natl Acad Sci U S A.2013年5月14日；110(20):8099-104)制备。

通过以下方式制备慢病毒，所述慢病毒待用于用所制备的第一载体和第二载体转化细胞。将HEK-293FT细胞以5×10⁶的细胞浓度接种到含有DMEM(Hyclone)培养基的100pi平板中。将pCMVD(#PS100001；Origene)和pVSVg(#1733；Addgene)病毒载体与第一载体或第二载体以1:1:1的比例混合，并根据制造商的说明使用Turbofect(Thermo-fisherscientific)用混合物处理细胞，随后在37℃下培养过夜。培养后，除去上清液，并用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的新鲜DMEM培养基更换培养基。培养48小时后，获得培养基的包含病毒的上清液并离心，并使用无表面活性剂的乙酸纤维素(SFCA)膜过滤装置(0.45μm；Corning)以去除细胞碎片。根据制造商的说明，通过Lenti-X p24快速滴度试剂盒(#632200；Takara)测量每种慢病毒的滴度。将包含第一载体的第一慢病毒和包含第二载体的第二慢病毒各自分配并在-80℃下冷冻以储存。

实施例4.利用慢病毒转化免疫细胞

为了制造根据本公开的在表面上表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡，用实施例3中制备的慢病毒转化免疫细胞。

为了制备经转化的免疫细胞，将实施例3中制备的第一慢病毒或第二慢病毒与10μg/mL的聚凝胺一起以100感染复数(MOI)的浓度处理原代CD8+T淋巴细胞。将经每种慢病毒处理的细胞混合物在30℃下以1,200g离心90分钟，然后使之经受旋转接种，随后在37℃下过夜培养。去除多余的病毒，随后用包含10％胎牛血清的添加有10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基进行培养基更换。

将未转化的淋巴细胞C用作对照，并随后标记仅转化有包含IL-2基因的第一慢病毒的淋巴细胞I、仅转化有包含Erbitux的scFv基因的第二慢病毒的淋巴细胞E、以及转化有两种慢病毒的淋巴细胞D。

实施例5.经转化的免疫细胞中细胞因子和抗体的表达的鉴别

为了制造根据本公开的在表面上表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡，鉴别了实施例4中制备的经转化的免疫细胞中是否表达细胞因子和抗体。

在实施例4中，根据制造商的说明，使用试剂盒(mRNA提取试剂盒，#9767；TaKaRa)从转化有第一慢病毒和/或第二慢病毒的淋巴细胞中提取mRNA，并使用nanodrop(DS-11系列分光光度计；DeNovix)测量提取的mRNA的浓度。根据制造商的说明，使用试剂盒(SuperScript III第一链合成***，Ref.18080-051；invitrogen)将100ng提取的mRNA合成为cDNA。

使用如下表1所示的引物组，通过实时PCR分析各淋巴细胞中IL-2基因和/或Erbitux的scFv基因的表达水平。

表1

如图3所示，与对照相比，经转化的淋巴细胞中IL-2基因的各自的表达增加了约10⁴倍，并且Erbitux的scFv基因的表达水平增加了约10⁵倍。特别地，转化有两种慢病毒的D淋巴细胞显示出IL-2基因和/或Erbitux的scFv基因两者的表达水平的增加。

此外，通过蛋白质印迹测量每种蛋白质的表达水平，以确定IL-2和/或Erbitux在原代CD8+T淋巴细胞中的表达水平。通过SDS-PAGE分离细胞，并将其转移到硝酸纤维素膜。然后与Erbitux的一抗(R&D system，#MAB9626)、FLAG的一抗(CST，#8146)和β-肌动蛋白(CST，#4970)进行反应，随后为与HRP缀合的二抗的反应。利用增强型化学发光(ECL)检测试剂(#34095；Thermo Scientific，#RPN2209；GE Healthcare)使图像可视化。

如图3所示，仅由第一慢病毒转化的I淋巴细胞中仅IL-2表达，而在仅由第二慢病毒转化的E淋巴细胞中仅Erbitux表达，其中由两种慢病毒转化的D淋巴细胞中IL-2和Erbitux均表达。

实施例6.细胞外囊泡的分离与纯化

为制造根据本公开的在表面上表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡，从实施例4中制备的经转化的免疫细胞中分离细胞外囊泡。

将实施例4中的对照C淋巴细胞或经转化的D淋巴细胞分别以1×10⁶个细胞/mL的浓度接种在无胎牛血清的RPMI培养基中，随后培养72小时。将各细胞在其中培养的培养基的上清液依次以300g、2,500g和10,000g进行连续离心。将经离心的上清液通过0.2μm注射器过滤器过滤，并以120,000g离心以获得细胞外囊泡的团粒。将获得的团粒悬浮在PBS中，并在-80℃下冷冻保存。

将获得自未转化的淋巴细胞C的细胞外囊泡被标记为CE，并将获得自转化有第一慢病毒和第二慢病毒的淋巴细胞D的细胞外囊泡标记为DE。

实施例7.细胞外囊泡的癌细胞特异性细胞毒性的分析

为了评价根据本公开制造的细胞外囊泡的癌细胞特异性细胞毒性，分析了细胞外囊泡对癌细胞或正常细胞的细胞毒性。

将A549-luc细胞(人非小细胞肺癌细胞)和HEK细胞(正常细胞)分别在96孔板中以5×10³细胞/孔的浓度培养一天。分别以0ng/mL、10ng/mL或100ng/mL的浓度用实施例6中制造的细胞外囊泡处理细胞，培养48小时。用CellTiter 96AQueous Assay(Promega，#G5421)分析细胞死亡的程度。

如图4所示，即便在细胞外囊泡处理后，作为正常细胞的HEK细胞中也没有发生细胞死亡，但在作为癌细胞的A549-luc细胞中，在细胞外囊泡处理后发生细胞死亡。特别是，当用获得自用第一慢病毒和第二慢病毒转化的淋巴细胞D的细胞外囊泡DE处理时，与用获得自未转化的淋巴细胞C的细胞外囊泡CE处理的情况相比，癌细胞的死亡程度更大。

上述结果表明，由于本公开的细胞外囊泡表现出仅杀伤癌细胞的癌细胞特异性细胞毒性，因此可将其用作能够仅消除癌细胞而不影响正常细胞的安全的抗癌剂。

实施例8.IL-2诱导的细胞毒性的分析

为了确定实施例7中所示的细胞毒性是否由IL-2诱导，以与实施例7中相同的方式评价细胞毒性，不同之处在于用IL-2代替细胞外囊泡进行处理。

将A549-luc细胞(人非小细胞肺癌细胞)和HEK细胞(正常细胞)分别在96孔板中以5×10³细胞/孔的浓度培养一天。分别以0IU/mL、10IU/mL或100IU/mL的浓度用实施例6中制备的IL-2处理细胞，随后培养48小时。用CellTiter 96AQueous Assay(Promega，#G5421)分析细胞死亡的程度。

如图5所示，IL-2在癌细胞或正常细胞中均未诱导细胞毒性，并且实施例7中所示的细胞毒性不是由细胞外囊泡表面上表达的IL-2诱导的，而是细胞外囊泡本身显示癌细胞特异性细胞毒性。

实施例9.表面上表达有抗体的细胞外囊泡的癌细胞特异性的评价

为评价根据本公开的表面上表达有抗体的细胞外囊泡的癌细胞特异性，用荧光标记实施例6中的细胞外囊泡，以分析对癌细胞的特异性。

将A549-luc细胞(人非小细胞肺癌细胞)以及HEK细胞(正常细胞)在8孔腔室中以1×10⁴个细胞/孔的浓度培养一天。用经DID(Molecular Probes，#V-22887)染色的细胞外囊泡以100ng/mL的浓度处理所培养的细胞3小时。此后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞一次，用4％甲醛固定，用盐水洗涤三次，并用DAPI处理以染色细胞核。使用共聚焦显微镜分析经染色的细胞的图像。

此外，在12孔板中以1×10⁴个细胞/孔的浓度培养A549-luc细胞(人非小细胞肺癌细胞)和HEK细胞(正常细胞)，将经DID(Molecular Probes，#V-22887)染色的细胞外囊泡的浓度调整为100ng/mL，并以与上文相同的过程进行洗涤和固定，然后用流式细胞仪进行分析。

如图6所示，当用获取自未转化的淋巴细胞C的细胞外囊泡(Con-EV)和获取自仅转化有第一慢病毒的淋巴细胞I的细胞外囊泡(IL2-EV)进行处理时，由于细胞外囊泡未能结合至正常细胞或癌细胞，因此未进行观察。但是，当用获取自转化有第一慢病毒和第二慢病毒的淋巴细胞D的细胞外囊泡(双-EV)处理时，观察到经DID染色的细胞外囊泡仅对癌细胞结合。

这表明，只有表面上表达抗体的细胞外囊泡(双-EV)通过识别癌细胞来结合至癌细胞，从而具有癌细胞特异性。

实施例10.表面上表达有抗体的细胞外囊泡的癌细胞特异性的验证

为了验证根据本公开的表面上表达有抗体的细胞外囊泡的癌细胞特异性，在细胞外囊泡处理之前用竞争性抗体处理，随后分析细胞外囊泡的癌细胞特异性是否被保留。

实施例6中制备的细胞外囊泡表达Erbitux的scFv作为抗体，并且Erbitux的scFv结合至在癌细胞中过表达的表皮生长因子受体(EGFR)。因此，使用竞争性结合至EGFR的抗体来验证归因于细胞外囊泡中的抗体的癌细胞特异性。

将A549-luc细胞(人非小细胞肺癌细胞)以及HEK细胞(正常细胞)在8孔腔室中以1×10⁴个细胞/孔的浓度进行培养。用特异性结合EGFR的竞争性抗体预处理每种细胞1小时，然后以100ng/mL的浓度用经DID(Molecular Probes，#V-22887)染色的细胞外囊泡处理3小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞一次，并用4％甲醛固定。用盐水洗涤三次后，在室温下进行与识别人Fc的二抗(附着有FITC荧光)的反应1小时，然后用盐水洗涤三次。在用盐水洗涤三次后，用DAPI进行处理以对细胞核进行染色。使用共聚焦显微镜分析经染色的细胞的图像。

如图7所示，确定了表达抗体的细胞外囊泡保持了实施例9中的癌细胞特异性，但在用特异性结合EGFR的竞争性抗体预处理的癌细胞中未观察到细胞外囊泡。这意味着当癌细胞的EGFR被竞争性抗体掩蔽时，细胞外囊泡不识别癌细胞。因此，该结果表明，本公开的细胞外囊泡通过表面上表达的抗体靶向癌细胞。

实施例11.动物模型中细胞外囊泡的抗体特异性靶向的验证

为了验证附着至表面的抗体的癌细胞特异性靶向的可能性，用荧光染色的细胞外囊泡处理非小细胞肺癌细胞系(A549)移植小鼠模型。

购买BALB/c裸鼠(雄性，6周龄)并经历1周的稳定化后，将非小细胞肺癌细胞系(A549)以5×10⁶个细胞/小鼠的计数进行皮下注射，并留存直到肿瘤体积变为100mm³。肿瘤体积通过长轴×(短轴)²×0.5计算。在肿瘤体积变为100mm³后，通过小鼠尾静脉注射，注射经DID(Molecular Probes，#V-22887)染色的20μg细胞外囊泡。注射细胞外囊泡24小时后，通过颈椎脱位处死小鼠，然后使每个器官(肿瘤、心、肺、肝、脾和肾)经受解剖，以使用“荧光、发光和计算机断层活体光学成像***(IVIS)”检测荧光强度。结果，如图8中的左侧图像所示，发现更大数量的表面上表达抗体的细胞外囊泡(DE)被递送到肿瘤以发出强荧光。(PBS：磷酸盐缓冲盐水注射对照，CE：对照细胞外囊泡处理的组，DE：表达IL-2和Erbitux两者的细胞外囊泡处理的组)

此外，为了制备肿瘤冷冻切片，用4％甲醛固定肿瘤，并用PBS洗涤三次，随后在30％蔗糖溶液中孵育过夜。然后用OCT化合物在-20℃下固定肿瘤，并在冷冻切片后置于载玻片上，随后在用DAPI进行核染色后通过共聚焦荧光显微术分析荧光强度。如图8中的右图所示，发现在其表面上表达抗体的细胞外囊泡(DE)在肿瘤冷冻切片的横截面中更多地被观察到。(PBS：磷酸盐缓冲盐水注射对照，CE：对照细胞外囊泡处理的组，DE：表达IL-2和Erbitux两者的细胞外囊泡处理的组)

如上所述，详细描述了本公开的内容的具体部分，对于本领域普通技术人员来说明显的是，该具体描述只是优选实施方式，并且本公开的范围不受此限制。换言之，本公开的实质范围可以由所附权利要求及其等同物来限定。

本公开的范围由以下描述的权利要求所指示，并且权利要求的含义和范围以及源自其等同概念的所有改变或修改形式应被解释为包括在本发明的范围内。

<110> 大邱庆北科学技术院

庆北大学校产学协力团

<120> 表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡、

其制造方法及其用途

<130> AOP-2021-0057PCT

<160> 17

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-2

<400> 1

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E-scFv

<400> 2

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg

145 150 155 160

Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr

165 170 175

Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Leu Lys

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-1

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-2

<400> 4

Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-3

<400> 5

Ser Arg Ser Ser Gly

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-4

<400> 6

Ser Gly Ser Ser Cys

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-5

<400> 7

Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-6

<400> 8

Arg Pro Pro Pro Pro Cys

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-7

<400> 9

Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys

1 5

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-8

<400> 10

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-9

<400> 11

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-10

<400> 12

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子-11

<400> 13

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe

1 5 10

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-2-f

<400> 14

agacccaggg acttaatcag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-2-r

<400> 15

acaatggttg ctgtctcatc 20

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Erbituxc-f

<400> 16

ggcccagccg gccat 15

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Erbituxc-r

<400> 17

atttaggccc ccgaggcctt tcagctccag cttggtccca 40

Claims (14)

1.一种在其表面上表达细胞因子和抗体的细胞外囊泡，其中，所述细胞因子是具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的IL-2，并且所述细胞外囊泡源自T细胞。

2.如权利要求1所述的细胞外囊泡，其中，构成所述细胞外囊泡的磷脂双层包含通过连接子结合至所述细胞因子或抗体的跨膜蛋白。

3.如权利要求2的细胞外囊泡，其中，所述抗体是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的Erbitux的scFv。

4.如权利要求2所述的细胞外囊泡，其中，所述连接子具有选自SEQ ID NO:3至SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列中的任何一个的1次-20次重复的序列。

5.如权利要求2所述的细胞外囊泡，其中，所述细胞外囊泡源自转化有载体的T细胞，所述载体包含编码细胞因子或抗体的基因、编码连接子的连接子结构域以及编码跨膜蛋白的跨膜结构域。

6.如权利要求5所述的细胞外囊泡，其中，所述跨膜结构域是选自于由如下所组成的组中的任何一种受体中包含的跨膜结构域：表皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、胆囊收缩素(CCK)受体、神经营养因子(NGF)受体、肝细胞生长因子(HGF)受体、肾上腺素(Eph)受体、血管生成素受体和相关受体酪氨酸激酶(RYK)受体。

7.如权利要求5所述的细胞外囊泡，其中，所述T细胞是辅助性T细胞或CD8+T细胞。

8.如权利要求1所述的细胞外囊泡，其中，所述细胞外囊泡通过具有癌细胞特异性细胞毒性而表现出抗癌作用。

9.如权利要求8所述的细胞外囊泡，其中，所述细胞外囊泡被用作其中封装有药物或生物活性物质的运载体。

10.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-9中任一项所述的细胞外囊泡作为活性成分。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述癌症是选自于由以下所组成的组中的任一种：黑色素瘤、结肠癌、肺癌、皮肤癌、非小细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、胃癌、***癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、***、***癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、***癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经***肿瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤和垂体腺瘤。

12.一种用于递送药物或生物活性物质的组合物，所述组合物包含权利要求1-9中任一项所述的细胞外囊泡，其中，所述药物或生物活性物质封装在所述细胞外囊泡中。

13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述药物是选自于由抗癌药物、抗炎镇痛剂、抗生素、抗菌剂和疫苗所组成的组中的任一种，并且所述生物活性物质是选自于由肽、蛋白质、激素和基因所组成的组中的任一种。

14.一种制造权利要求1-9中任一项所述的细胞外囊泡的方法，所述方法包括：

制备第一载体，所述第一载体包含编码细胞因子的基因、编码连接子的连接子结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域；

制备第二载体，所述第二载体包含编码抗体的基因、编码连接子的连接子结构域和编码跨膜蛋白的跨膜结构域；

利用慢病毒用所述第一载体和第二载体转化细胞；以及

从培养基中分离所述细胞外囊泡，所述培养基中培养了转化有所述第一载体和第二载体的细胞。