CN116448996A - 一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种串珠结构的多聚酶‑抗体复合物的制备方法，（1）使用高碘酸钠将辣根过氧化物酶醛基化；（2）使用双氨交联试剂合成串珠结构的多聚辣根过氧化物酶；（3）在串珠结构的多聚辣根过氧化物酶上引入一条亲水的手臂链；（4）将抗体偶联到引入亲水手臂链的多聚辣根过氧化物酶上，最终得到串珠结构的多聚酶‑抗体复合物。制备的串珠结构的多聚酶‑抗体复合物在化学发光体外诊断试剂、Elisa检测试剂、常规石蜡切片免疫组化检测试剂、术中冰冻切片免疫组化检测试剂中具有广泛的应用，可大大提高检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法。
背景技术
组织化学(Immunohistochemistry)是利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学反应使标记了荧光素、酶、金属离子、同位素的二抗在显示剂的作用下显色，以此来对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性及相对定量检测的技术。免疫组化(IHC)染色对肿瘤的判定和用药指导有极其重要的意义，在医院病理科进行的肿瘤免疫组化分析对肿瘤分子分型至关重要，精准的肿瘤分型检测有利于指导患者精准用药，提高治疗效果，减少毒副作用。
免疫组化二抗技术的发展至今，历经了直接法、间接法、酶标链霉卵白素-生物素染色法、酶标多聚物染色法。其中，直接法和间接法由于信号放大效率弱，敏感度低，目前已很少应用；酶标链霉卵白素-生物素染色法中，ABC复合物会和细胞组织中普遍存在的生物素结合，从而产生严重的非特异性染色，很大程度上干扰了结果的判读，因此，该方法目前在临床免疫分析中已被逐步淘汰；酶标多聚物染色法是目前临床应用的主流技术，该法是将酶标记在以惰性葡聚糖、多聚赖氨酸、聚多肽、树状多聚物等为骨架的主链上，形成多聚物酶，然后再将抗体连接到多聚物酶上，得到多聚物酶-抗体复合物。每一条主链上大约可连接4-70个酶分子及1-10个抗体分子，具有极强的信号放大效果，同时由于使用非生物素检测***，从而避免了内源性生物素引起的非特异性染色，故此方法在临床上得到了广泛的应用。然而，该方法也并非完美无缺，其主要技术缺陷在于：该方法采用分子量≥50万葡聚糖聚合物骨架，连接了4-70个酶分子及1-10个抗体分子，其结构松散、流体动力学体积巨大，从而造成了极大的空间位阻，使得该聚合物对于细胞核膜的穿透力低下。因此，该聚合物对各种不同类型的抗原检测的表现参差不齐，特别是在一些细胞核内低表达抗原的检测中灵敏度不足。
此外，由于大部分二抗在制备过程中，采用带氨基的骨架将大量的辣根过氧化物酶和抗体串联，所得二抗分子量基本上都大于1000kd，这么大的二抗分子，其带有很强的电荷，同时具有极强的疏水性，很容易通过静电和疏水作用与组织切片产生非特异性的结合，从而导致非特异性的背景染色，这是二抗开发中最难解决的一大难点。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，我们不采用骨架制备多聚物酶，采用小分子双氨聚乙二醇作为交联剂来合成串珠结构的多聚酶，使得多聚物酶分子尽可能的紧凑，空间占位更小，制备得到的多聚酶-抗体复合物在做组织切片染色时具有更好的组织渗透能力，对较小的组织细胞结构具有更高的检测灵敏度；同时由于没有采用骨架，采用的是小分子亲水性的交联剂，这样既降低了二抗本身的带电性，又改善了二抗本身的亲水性，使得二抗和组织切片之间的静电和疏水结合大大减弱，有效地降低了二抗和组织切片之间由于非特异性作用造成的背景染色。
本发明采用的技术方案为：
一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：使用高碘酸钠将辣根过氧化物酶醛基化：
a.称取一定量的辣根过氧化物酶溶解于缓冲溶液A中，得到一定浓度的辣根过氧化物酶溶液；
b.称取一定量的高碘酸钠溶解于纯化水中；
c.将高碘酸钠水溶液加入辣根过氧化物酶溶液中，15～40℃反应5～60分钟；
d.结束反应，过脱盐柱，得到醛基活化的辣根过氧化物酶；
步骤二：使用双氨交联试剂合成串珠结构的多聚辣根过氧化物酶：
e.将醛基活化的辣根过氧化物酶配成一定浓度；
f.加入双氨交联试剂，调整反应体系pH7.5～10.0,20～30℃反应1～16小时；
g.加入还原剂，反应1～4小时；
h.加入封闭试剂，反应2～6小时；
i.结束反应，过脱盐柱，得到串珠结构的多聚辣根过氧化物酶；
步骤三：在串珠结构的多聚辣根过氧化物酶上引入一条亲水的手臂链：
j.将串珠结构的多聚辣根过氧化物酶配成浓度为1～20mg/mL；
k.将亲水性手臂链试剂溶于适当的缓冲液中配成5～20mg/mL；
l.将亲水性手臂链试剂和多聚辣根过氧化物酶按摩尔比10:1～80:1的量混合在一起，室温反应0.5～4小时；
m.结束反应，过脱盐柱，得到含亲水性手臂链的多聚辣根过氧化物酶；
步骤四：将抗体偶联到带亲水手臂链的多聚辣根过氧化物酶上，最终得到串珠结构的多聚酶-抗体复合物：
n.将抗体溶于适当的溶液中配成1～10mg/mL；
o.将巯基化试剂溶于适当的溶液中配成0.5～10mg/mL；
p.按巯基化试剂和抗体摩尔比为1:1～20:1的比例，将二者混合在一起，室温反应0.5～3小时；
q.结束反应，过脱盐柱，得到巯基修饰的抗体；
r.按多聚辣根过氧化物酶和巯基修饰的抗体摩尔比为8～20：1的比例，将二者混合在一起，2～8℃反应12～72小时；
s.过分子筛纯化柱，收集目标峰，得到串珠结构的多聚酶-抗体复合物。
步骤一中，缓冲溶液A为柠檬酸缓冲液，pH为4.0～7.0，优选pH为5.0；
步骤一中，高碘酸钠水溶液的浓度为5～50mg/mL，优选为20～30mg/mL，辣根过氧化物酶溶液浓度为1～50mg/mL，优选为20～40mg/mL。
步骤一中，高碘酸钠与辣根过氧化物酶的摩尔比为10～400，优选摩尔比为40～100；步骤一中反应温度为15～40℃，反应时间5～60分钟；
步骤一中脱盐柱是PD-10脱盐柱。
步骤二中，双氨交联试剂化学结构如下式1所示，
式1双氨交联试剂化学结构式其中n代表聚乙二醇(PEG)的聚合度，其范围是2～100，优选范围是10～50。
步骤二中，醛基活化的辣根过氧化物酶浓度为1～40mg/mL，优选为10～30mg/mL。步骤二中，f步骤中，反应体系PH为8～10.5，优选pH为9～10，反应温度15～40℃，优选温度为25～35℃，反应时间4小时
步骤二中还原剂为硼氢化钠。
步骤二中封闭试剂包括乙二胺、1,3-丙二胺、3,3'-二氨基二丙胺、赖氨酸和式1所示的聚合度为2～5的双氨聚乙二醇中的任意一种。
步骤二中，得到串珠结构的多聚辣根过氧化物酶中，辣根过氧化物酶的串联个数为6-32个，优选为10-20个。
步骤三中，亲水性手臂链试剂化学结构如下式2所示,
式2亲水性手臂链试剂化学结构式其中n代表聚乙二醇(PEG)的聚合度，其范围是6～50，优选范围是10～30。
步骤三中串珠结构的多聚辣根过氧化物酶浓度为1～40mg/mL，优选10～20mg/mL；亲水性手臂链试剂的浓度为10～50mg/mL，优选浓度为20～40mg/mL，缓冲液是10mM PBS缓冲液，pH 5.0～8.0，优选pH为7.0～8.0
多聚辣根过氧化物酶与亲水性手臂链试剂的摩尔比为1:10～1:60，优选为1:15～1:30。
反应时间1.5小时，反应温度15～25℃。
步骤四中，抗体浓度1～10mg/mL，溶解抗体的溶液是10mM PBS，10mM EDTA，pH8.0，巯基化试剂浓度1mg/mL，适当的溶液是10mM PBS，10mM EDTA，pH8.0步骤四中，得到的串珠结构的多聚酶-抗体复合物中，辣根过氧化物酶与抗体的摩尔比为6:1～20:1，优选为6:1～12:1。
步骤四中，所指的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、Fab片段、Fab′2片段，其中单克隆抗体包括但不仅限于(CK PAN，CK19，MUC1 CK5/6，p63，Calponin CK19，TPO，CD56 MUC-1TPO MC CK34βE12 Galectin-3CT CEA SYN CgA TTF-1Napsin A Ki-67 PMS2 P16 CD34S100 DESMIN P53)；多克隆抗体包括但不仅限于山羊抗兔和山羊抗鼠；Fab片段和Fab′2片段包括但不仅限于上述列举的单克隆抗体和多克隆抗体的Fab片段和Fab′2片段。
上述方法制备得到的串珠结构的多聚酶-抗体复合物，串联个数为6-32个，结构特征如下式3所示，HRP先通过小分子双氨聚乙二醇作为交联剂使得HRP串联成多聚HRP酶；然后再通过长手臂链的亲水***联剂将抗体或者抗体片段连接在多聚HRP上，使得多聚物酶分子尽可能的紧凑，空间占位更小，制备得到的多聚酶-抗体复合物在做组织切片染色时具有更好的组织渗透能力，对较小的组织细胞结构具有更高的检测灵敏度；同时由于没有采用骨架，采用的是小分子亲水性的交联剂，这样既降低了二抗本身的带电性，又改善了二抗本身的亲水性，使得二抗和组织切片之间的静电和疏水结合大大减弱，有效地降低了二抗和组织切片之间由于非特异性作用造成的背景染色。
所述串珠结构的多聚酶-抗体复合物在术中冰冻切片免疫组化，常规石蜡切片免疫组化、化学发光体外诊断等方面具有非常广泛的的应用。
式3.串珠结构的多聚酶-抗体复合物结构示意，其中圆圈代表辣根过氧化物酶，Y代表抗体。
本发明所述串珠结构的多聚酶-抗体复合物在化学发光体外诊断试剂、Elisa检测试剂、常规石蜡切片免疫组化检测试剂、术中冰冻切片免疫组化检测试剂中具有广泛的应用，可大大提高检测的灵敏度。
有益效果：
与相关技术相比较，本发明提供的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备及应用具有如下优势：
(1)不采用大分子的葡聚糖、树枝状聚合物等骨架，而是采用小分子双氨聚乙二醇作为交联剂来合成串珠结构的多聚酶，使得多聚物酶分子尽可能的紧凑，空间占位更小；
(2)同时使用亲水性的双氨聚乙二醇作为交联剂，既起到了交联作用，又起到了对多聚酶的亲水性修饰作用，使得制备的多聚酶水溶性更加好，减少多聚酶本身的聚集和组织切片染色时由于疏水作用导致的染色背景；
(3)在多聚酶上引入了一条长链的亲水性手臂链，能够使得连接到多聚酶上的抗体具有更高的灵活度，利于抗体跟抗原的自由结合；同时亲水性手臂链的引入大大改善了多聚酶-抗体复合物的亲水性，减少了多聚酶-抗体复合物本身的聚集和组织切片染色时由于疏水作用导致的染色背景；
以上3点组合起来，使得多聚酶-抗体复合物在做组织切片染色时具有更好的组织渗透能力，对较小的组织细胞结构具有更高的检测灵敏度，同时可有效的降低染色背景。
附图说明
图1AR***癌左为进口二抗右为实施例5中方法制备的二抗，优势是细胞核染色强度优于进口二抗；
图2BerEP4肺腺癌左为进口二抗右为实施例5中方法制备的二抗，优势是胞浆色强度优于进口二抗；
图3CD10***左为进口二抗右为实施例6中方法制备的二抗，优势是细胞膜染色强度优于进口二抗；
图4KI67扁桃体左为进口二抗右为实施例6中方法制备的二抗，优势是细胞核染色强度优于进口二抗；
图5CK5/6肺腺癌左为实施例2方法制备的术中冰冻切片二抗，右为商品化快速冰冻试剂，优势是染色强度优于商品化术中冰冻切片二抗。
具体实施方式
实施例1根过氧化物酶串联个数为16～24个的多聚辣根过氧化物酶-CK5/6抗体复合物的制备
a.称取300mg辣根过氧化物酶溶解于100mL pH6.0的柠檬酸缓冲液中，得到10mg/mL的辣根过氧化物酶溶液；
b.称取80mg的高碘酸钠溶解于纯化水中，得到浓度为20mg/mL的高碘酸钠水溶液；
c.将高碘酸钠水溶液加入辣根过氧化物酶溶液中，37℃反应15分钟；
d.结束反应，过PD-10脱盐柱，得到醛基活化的辣根过氧化物酶；
e.将醛基活化的辣根过氧化物酶配成20mg/mL；
f.加入10mg聚合度为24的双氨基聚乙二醇，调整反应体系pH为10.0，室温反应4小时；
g.加入5mg硼氢化钠，室温反应2小时；
加入封闭试剂乙二胺0.5g，室温反应2小时；
i.结束反应，过脱盐柱，得到串珠结构的多聚辣根过氧化物酶；
j.将串珠结构的多聚辣根过氧化物酶配成15mg/mL；
k.将聚合度为8的亲水性手臂链试剂溶于10mM PBS缓冲液，pH7.6，配成20mg/mL；
l.将二者混合在一起，室温反应1.5小时；
m.结束反应，过PD-10脱盐柱，得到含亲水性手臂链的多聚辣根过氧化物酶；n.将细胞角蛋白CK5/6抗体溶于10mM PBS，10mM EDTA，pH8.0中配成6mg/mL；o.将巯基化试剂溶于10mM PBS，10mM EDTA，pH8.0溶液中，配成1mg/mL；p.将二者混合在一起，室温反应1小时；
q.结束反应，过脱盐柱，得到巯基修饰的抗体；
r.将巯基修饰的细胞角蛋白CK5/6抗体跟带亲水性手臂链的多聚辣根过氧化物酶按摩尔比1:30的比例混合，2～8℃反应24小时；
S.过分子筛纯化柱，收集第一个出来的目标峰，得到串珠结构的多聚辣根过氧化物酶-CK5/6抗体复合物。
实施例2辣根过氧化物酶串联个数为16～24个的多聚辣根过氧化物酶-Ki-67抗体复合物的制备
制备过程同实施例1，就不同之处在于将细胞角蛋白CK5/6抗体替换成Ki-67。
(图5)
实施例3辣根过氧化物酶串联个数为16～24个的多聚辣根过氧化物酶-P63抗体复合物的制备.
制备过程同实施例1，就不同之处在于将细胞角蛋白CK5/6抗体替换成P63。
实施例4辣根过氧化物酶串联个数为16～24个的多聚辣根过氧化物酶-Calponin抗体复合物的制备
制备过程同实施例1，就不同之处在于将细胞角蛋白CK5/6抗体替换成Calponin。实施例5辣根过氧化物酶串联个数为8～12个的多聚辣根过氧化物酶-山羊抗兔多抗复合物的制备
a.称取300mg辣根过氧化物酶溶解于100mL pH6.0的柠檬酸缓冲液中，得到10mg/mL辣根过氧化物酶溶液；
b.称取80mg的高碘酸钠溶解于纯化水中，得到20mg/mL的溶液；
c.将高碘酸钠水溶液加入辣根过氧化物酶溶液中，37℃反应10分钟；
d.结束反应，过脱盐柱，得到醛基活化的辣根过氧化物酶。
e.将醛基活化的辣根过氧化物酶配成20mg/mL；
f.加入10mg聚合度为24的双氨基聚乙二醇，调整反应体系pH为10.0，室温反应4小时；
g.加入5mg硼氢化钠，室温反应2小时；
h.加入封闭试剂乙二胺0.5g，室温反应2小时；
i.结束反应，过脱盐柱，得到串珠结构的多聚辣根过氧化物酶；
j.将串珠结构的多聚辣根过氧化物酶配成15mg/mL；
k.将聚合度为8的亲水性手臂链试剂溶于10mM PBS缓冲液，pH7.6，配成20mg/mL；
l.将二者混合在一起，室温反应1.5小时；
m.结束反应，过PD-10脱盐柱，得到含亲水性手臂链的多聚辣根过氧化物酶；
n.将山羊抗兔多抗溶于10mM PBS，10mM EDTA，pH8.0中配成6mg/mL；
o.将巯基化试剂溶于10mM PBS，10mM EDTA，pH8.0溶液中，配成1mg/mL；
p.将二者混合在一起，室温反应1小时；
q.结束反应，过PD-10脱盐柱，得到巯基修饰的抗体；
r.将巯基修饰的山羊抗兔多抗跟带亲水性手臂链的多聚辣根过氧化物酶混合，按摩尔比1:20的比例混合，2～8℃反应24小时；
S.过分子筛纯化柱，收集第一个分离峰，得到串珠结构的多聚辣根过氧化物酶-山羊抗兔多抗复合物。(图1图2)
实施例6辣根过氧化物酶串联个数为8～12个的多聚辣根过氧化物酶-山羊抗鼠多抗复合物的制备
制备过程同实施例5，不同之处在于将山羊抗兔多抗替换为山羊抗鼠多抗(图3图4)。
应用举例
常规免疫组化上机流程脱蜡：脱蜡液3min*2脱蜡液1min酒精冲洗3遍TBS冲洗3遍；
修复：修复液3遍修复液10min*2修复液18min TBS冲洗4遍；
染色：阻断剂8min TBS冲洗3遍一抗18min TBS冲洗3遍一抗增强10min TBS冲洗3遍二抗20min TBS冲洗3遍纯水冲洗一遍DAB5min纯水冲洗5遍苏木素5min纯水冲洗2遍TBS冲洗两遍纯水冲洗一遍；
封片：过二甲苯与梯度酒精树脂封片；
常规免疫组化手工流程
脱蜡：二甲苯5min*3；
抗原修复：EDTA9.0，冷水下锅2200W，限气阀门喷气时计时3min；
过氧化物酶阻断：3％过氧化氢甲醇溶液+卵白素8min；
一抗选择：32°60min；
一抗增强：无；
二抗选择：HRP标记羊抗鼠或羊抗兔二抗20min；
DAB：1:19 5min；
DAB增强：无；
苏木素：30°5min；
返蓝：TBS1min；
封片：过二甲苯与梯度酒精树脂封片；
常规免疫组化示范图对比：进口二抗VS自研免疫组化二抗。
快速冰冻上机流程
快速冰冻染色：酶标一抗5min TBS冲洗3遍混合DAB5min纯水冲洗4遍苏木素2min纯水冲洗2遍TBS冲洗2遍纯水冲洗1遍
封片：过二甲苯与梯度酒精树脂封片；
快速冰冻手工流程
快速冰冻染色：酶标一抗5min DAB：1:1:5min苏木素3min返蓝TBS1min封片：过二甲苯与梯度酒精树脂封片。
Claims (10)
1.一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：使用高碘酸钠将辣根过氧化物酶醛基化：
a.称取一定量的辣根过氧化物酶溶解于缓冲溶液A中，得到一定浓度的辣根过氧化物酶溶液；
b.称取一定量的高碘酸钠溶解于纯化水中；
c.将高碘酸钠水溶液加入辣根过氧化物酶溶液中，15～40℃反应5～60min；
d.结束反应，过脱盐柱，得到醛基活化的辣根过氧化物酶；
步骤二：使用双氨交联试剂合成串珠结构的多聚辣根过氧化物酶：
e.将醛基活化的辣根过氧化物酶配成一定浓度；
f.加入双氨交联试剂，调整反应体系pH和反应温度，反应若干时间；
g.加入还原剂，反应若干时间；
h.加入封闭试剂，反应若干时间；
i.结束反应，过脱盐柱，得到串珠结构的多聚辣根过氧化物酶；
步骤三：在串珠结构的多聚辣根过氧化物酶上引入一条亲水的手臂链：
j.将串珠结构的多聚辣根过氧化物酶配成一定的浓度；
k.将亲水性手臂链试剂溶于适当的缓冲液中配成一定的浓度；
l.将二者混合在一起，室温反应若干时间；
m.结束反应，过脱盐柱，得到含亲水性手臂链的多聚辣根过氧化物酶；
步骤四：将抗体偶联到带亲水手臂链的多聚辣根过氧化物酶上，最终得到串珠结构的多聚酶-抗体复合物：
n.将抗体溶于适当的溶液中配成一定的浓度；
o.将巯基化试剂溶于适当的溶液中配成一定的浓度；
p.将二者混合在一起，室温反应若干时间；
q.结束反应，过脱盐柱，得到巯基修饰的抗体；
r.将巯基修饰的抗体跟带亲水性手臂链的多聚辣根过氧化物酶混合，反应若干时间；
s.过分子筛纯化柱，收集目标峰，得到串珠结构的多聚酶-抗体复合物。
2.根据权利要求1所述的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤一中，缓冲溶液A为柠檬酸缓冲液，pH为4.0～7.0，优选pH为5.0。
3.根据权利要求1所述的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤一中，高碘酸钠与辣根过氧化物酶的摩尔比为10～400，优选摩尔比为40～100。
4.根据权利要求1所述的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤二中，双氨交联试剂化学结构如下式1所示，
其中n代表聚乙二醇(PEG)的聚合度，其范围是2～100，优选范围是10～50。
5.根据权利要求1所述的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤二中，封闭试剂包括乙二胺、1,3-丙二胺、3,3'-二氨基二丙胺、赖氨酸和聚合度为2～5的双氨聚乙二醇中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤二中，得到串珠结构的多聚辣根过氧化物酶中，辣根过氧化物酶的串联个数为6-32个，优选为10-20个。
7.根据权利要求1所述的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤三中，亲水性手臂链试剂化学结构如下式2所示,
其中n代表聚乙二醇(PEG)的聚合度，其范围是6～50，优选范围是10～30。
8.根据权利要求1所述的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤四中，得到的串珠结构的多聚酶-抗体复合物中，辣根过氧化物酶与抗体的摩尔比为6:1～20:1，优选为6:1～12:1。
9.根据权利要求1所述的一种串珠结构的多聚酶-抗体复合物的制备方法，其特征在于，步骤四中，所指的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、Fab片段、Fab′2片段，其中单克隆抗体包括但不仅限于CK PAN，CK19，MUC1 CK5/6，p63，Calponin CK19，TPO，CD56 MUC-1TPOMC CK34βE12 Galectin-3CT CEASYN CgATTF-1Napsin AKi-67 PMS2 P16 CD34 S100DESMIN P53；多克隆抗体包括但不仅限于山羊抗兔和山羊抗鼠；Fab片段和Fab′2片段包括但不仅限于上述列举的单克隆抗体和多克隆抗体的Fab片段和Fab′2片段。
10.权利要求1至9中任意一项制备方法制备得到的串珠结构的多聚酶-抗体复合物。
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