CN116440080A - 一种红花黄色素纳米柔性脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红花黄色素纳米柔性脂质体及其制备方法,基于薄膜水化‑探头超声法进行红花黄色素纳米柔性脂质体的制备,所得红花黄色素纳米柔性脂质体对于有机生物体的皮肤和/或黏膜具有亲和及吸收活性,用于替换注射给药途径实现红花黄色素的增效减毒给药。本发明提出了全新的技术思想和技术路径,基于人体黏膜尤其是舌下黏膜的解剖学和生理学特性并深入延拓药剂学技术手段,将中药输注给药变换为纳米柔性脂质体以在保留其高效性的同时保证其安全性,实现了红花黄色素纳米柔性脂质体制备工艺方法体系的成功研发。
Description
技术领域
本发明涉及药物改良制备相关技术领域,具体涉及一种对于有机生物体的皮肤黏膜具有高度亲和及吸收活性的红花黄色素纳米柔性脂质体新型制剂及其制备工艺。
背景技术
当前用于防治心血管病的中药数量众多,给药形式各异。其中,中药注射制剂因起效迅速、生物利用度高、疗效确切等被广泛应用。然而随着用药范围的扩大,中药注射制剂不良反应/事件逐渐增多,已引起社会各界的高度关注。《国家药品不良反应监测年度报告(2018年)》显示:不良反应/事件按药品类别统计,中药占比为14.6%,其中以静脉注射给药方式最高,达48.7%,且心血管***相关报告数量及占比呈上升趋势。不良反应/事件频发,不仅严重威胁着患者的健康和安全;而且极大阻碍了疗效确切的中药品种发挥其防治疾病的作用;另外,由于临床使用逐步被限制,中药注射制剂的生产企业将面临灾难性后果。
如何避免不良反应/事件,充分发挥中药注射制剂可靠的防治疾病作用——首先需明确不良反应/事件的起因,据文献分析,非药物因素和药物因素为主要原因,其中非药物因素包括:患者的年龄、性别及特殊体质;输注时溶媒选择不当或滴注速度较快等错误操作;不合理的联合用药或超剂量用药等,均与药物本身无关。药物因素是指制剂中含有的物质可引起过敏或类过敏反应,输注时该类成分缺乏被机体生物膜(人类进化而来的天然防御屏障)的选择性截留而迅速、直接入血而导致不良反应。针对非药物因素,加强用药指导和规范操作,可减少部分不良事件,但由于注射制剂本身剂型及给药途径的原因,该风险不能完全消除。针对后者,目前有学者对引起类过敏反应的原因及致敏物质进行大量实验,认为其可能与输注速度、剂量、制剂中辅料甚至有效成分相关。而针对过敏反应研究较少,目前也无法确认所有的致敏成分。因此,通过找到引起不良反应的物质后再解决该问题显然费时费力且不现实!另有企业采用多步精制手段获得纯度较高的活性成分用于注射,然仍未完全消除不良事件。基于此,探索提高中药注射制剂的安全性并保证其有效性的新途径,关乎患者的生命安全,关乎传统中医药的继承发展,关乎医药企业的生死存亡,无疑是一个亟待解决的复杂而重大的科学问题。
在众多的中药注射制剂中,红花注射液作为中药防治心脑血管疾病的一线药物,曾在冠心病、脉管炎、闭塞性脑血管疾病等重症急病的防治中发挥了重要作用。红花黄色素是从红花中提取的有效部位,羟基红花黄色素A(HSYA)是其含量最高的黄酮类化合物,该提取物外观为棕黄色粉末,易溶于水。多项研究表明羟基红花黄色素A具有抗氧化、抗炎、活血化瘀、抗血栓形成、抗血小板聚集等作用。
临床上常用红花注射液或注射用红花黄色素防治脉管炎等心血管***疾病,随着其临床应用的逐步扩大,出现的不良反应事件逐步增多,日益严峻的安全问题严重限制了红花注射液的使用,原本有8家生产企业之多的原研省份(山西省)目前只保留了4家。为探查不良反应的原因,本课题组前期对红花注射液中的致敏物质进行研究,发现分子量较小(40KD、26KD)的蛋白类物质可引起过敏反应,然而通过比对企业生产工艺(成品已使用截留分子量为10000的滤膜过滤),无法明确过敏物质残留的原因,但可推测,若继续减小超滤膜孔径则会失去其他可能有效的成分,进而导致临床疗效降低或丧失,且不良反应隐患仍无法避免。目前,广泛应用于临床的另一红花注射制剂——注射用红花黄色素(目前国内仅有2家生产企业:浙江永宁和山西德元堂),是通过多步柱分离技术不断精制得到的纯度较高(羟基红花黄色素A含量大于60%)的有效部位,与红花注射液相比其不良反应有所减少,但仍时有发生,由此可知,不断纯化之路难以从根本上解决红花注射制剂的安全性问题。
综上所述,开拓解决中药安全性问题的新思路及新技术路径是行业当前的重点和难点问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:基于全新的技术思想和技术路径,充分应用药剂学手段将输注给药变换为纳米柔性脂质体以在提高其安全性的同时保留其高效性,提供一种红花黄色素纳米柔性脂质体及其制备方法。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案如下。
红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,基于薄膜水化-探头超声法进行红花黄色素纳米柔性脂质体的制备,所得红花黄色素纳米柔性脂质体对于有机生物体的皮肤和/或黏膜具有亲和及吸收活性,用于替换注射给药途径实现红花黄色素的增效减毒给药。
作为本发明的一种优选技术方案,所述黏膜为具有上表皮层、固有层和基底层三层结构的动物体或人体黏膜,且其中的上表皮层由扁平致密细胞有序排列组成,构成药物吸收的主要屏障。
作为本发明的一种优选技术方案,所述黏膜为舌下黏膜。
作为本发明的一种优选技术方案,其核心工艺流程为:首先将包含红花黄色素的复配有机组合物旋转蒸发制膜,然后在所得薄膜中加入含柔软剂的水相溶液及小玻璃珠进行旋转水化,所得溶液经过特定的探头超声处理得到红花黄色素纳米柔性脂质体。
作为本发明的一种优选技术方案,其核心工艺参数为:所述复配有机组合物采用红花黄色素、蛋黄卵磷脂、胆固醇及有机溶剂进行复配制作,其中红花黄色素、蛋黄卵磷脂、胆固醇的复配用量按照如下标准设定:药脂质量比为1:20-1:150,胆脂质量比为1:2-1:40;所述含柔软剂的水相溶液中柔软剂采用1,2-丙二醇,其在水相溶液中的质量分数为10%-30%;所述探头超声处理工艺中探头超声时间为4min-6min,转速为7000r/min-9000r/min。
作为本发明的一种优选技术方案,所述药脂质量比为1:30-1:100,所述胆脂质量比为1:10-1:30。
作为本发明的一种优选技术方案,所述药脂质量比为1:50,所述胆脂质量比为1:20。
作为本发明的一种优选技术方案,所述有机溶剂为无水乙醇或二氯甲烷-甲醇,在用量上其与红花黄色素的质量比为(20-40):1;所述旋转蒸发制膜工艺的温度控制在45-50℃,旋转速度控制在65r/min-70r/min。
作为本发明的一种优选技术方案,所述小玻璃珠的用量为每3-5mL水相溶液使用1颗小玻璃珠;所述旋转水化工艺的时长控制在0.5h-1.5h。
作为本发明的一种优选技术方案,所述探头超声处理工艺中探头超声时间为5min,转速为8000r/min。
作为本发明的一种优选技术方案,精确称取1.44g蛋黄卵磷脂、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相;将油相于50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,取15mL 50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,8000r/min探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体的包封率,完成制备。
一种对有机生物体的皮肤和/或黏膜具有亲和及吸收活性的红花黄色素纳米柔性脂质体,其特征在于:通过任一项上述的方法制备,用于替换注射给药途径实现红花黄色素的增效减毒给药。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
整体上,本发明提出了全新的技术思想和技术路径,基于人体黏膜尤其是舌下黏膜的解剖学和生理学特性并深入延拓药剂学技术手段,将中药输注给药变换为纳米柔性脂质体以在保留其高效性的同时保证其安全性,实现了红花黄色素纳米柔性脂质体制备工艺方法体系的成功研发,为中药注射制剂的增效减毒提供了全新的技术思想、技术路径和技术方法。
本发明最终采用纳米脂质体技术路线,并将研究方向指向舌下黏膜,是基于诸多角度的技术考虑。从效果上看,本发明将“中药注射制剂”通过舌下给药构成了一种全新的有效、安全、便捷、经济的用于心血管病发作救治,甚或是日常预防、减缓病程的理想给药方式。从技术层面来看,脂质体是由两亲性物质(磷脂)和其他两性化合物(胆固醇等)分散在水相形成的单层或多层球面的囊泡状结构,其内水相容纳水溶性化合物,而脂质双分子层容纳脂溶性化合物;脂质体的结构类似于生物膜的囊泡,可直接进入细胞,也可吸附于靶细胞外层,能够被生物自身分解酶代谢降解,不良反应少,具有良好的生物相容性、靶向性等优点;舌下具有丰富的静脉丛毛细血管,药物通过毛细血管吸收后可经颈内静脉迅速、直接到达心脏,由于能够有效避免肝脏首过效应与胃肠道对药物吸收的不良影响,舌下给药可取得与静脉给药相当的疗效。与注射给药相比,舌下给药可避免产生不良反应/事件的大部分非药物因素:如不当溶媒、过快滴速及不合理联合用药等,且由于存在舌下黏膜的选择性吸收而减少了有害成分的入血速度和数量,可望进一步提高其安全性。同时,舌下给药操作简便,患者依从性高;与注射制剂相比,舌下给药制剂的制备和使用成本较低。
附图说明
图1为透析平衡曲线。具体步骤如下:取10mL自制脂质体溶液3份分别于三个透析袋中,将其分别置于3个100mL蒸馏水中,每隔1h取样进液相,直至HSYA含量接近恒定为止。48h左右透析外液中HSYA含量基本恒定。
图2为纳米柔性脂质体粒径分布图。具体步骤如下:取适量SY-FNL和SY-CL用蒸馏水稀释,注入马尔文粒径电位测定仪,测定脂质体微粒的粒径,每个样品测定3次。
图3为纳米柔性脂质体电位分布图。具体步骤如下:取适量SY-FNL和SY-CL用蒸馏水稀释,注入马尔文粒径电位测定仪,测定脂质体微粒的电位,每个样品测定3次。
图4为原料药溶液与脂质体的黏膜累积透过量。具体步骤参见实施案例7。
图5为脂质体透射电镜图(×100000左)及扫描电镜图(×5000右)。具体步骤如下:将SY-FNL适量置于铜载网上,晾干后用磷钨酸(1.5%)进行负染色,采用透射电子显微镜(TEM)观察;将SY-FNL用导电胶固定喷金后,采用扫描电子显微镜(SEM)观察。可以看出SY-FNL是圆球或椭球形,具有层状结构。
图6为荧光探针在脂质体中的激光共聚焦显微镜图(10×100)。图中,水溶性探针(右)和脂溶性探针(左)都能均匀的分布于整个柔性脂质体的空间。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品,均能够通过市场购买直接获得。如在本申请说明书和所附权利要求书中所使用的那样,术语“如果”可以依据上下文被解释为“当...时”或“一旦”或“响应于确定”或“响应于检测到”。类似地,短语“如果确定”或“如果检测到[所描述条件或事件]”可以依据上下文被解释为意指“一旦确定”或“响应于确定”或“一旦检测到[所描述条件或事件]”或“响应于检测到[所描述条件或事件]”。另外,在本申请说明书和所附权利要求书的描述中,术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述,而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此,在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例,而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”,除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”,除非是以其他方式另外特别强调。
实施例1、舌下黏膜
基于现代医学,舌下黏膜的结构分为三层:黏膜上表皮层、固有层和基底层,其中黏膜上表皮层由扁平致密的细胞有序排列组成,厚度约150μm,是药物吸收的主要障碍。作为类脂性屏障膜,脂溶性低或分子量较大的药物不易透过舌下黏膜吸收,而中药注射制剂所含有效成分大多为水溶性物质。因此,高效促进药物通过黏膜上表皮层是成功构建其舌下给药的关键。
实施例2、磷脂相关研发
种类1:采用卵磷脂制备红花黄色素纳米柔性脂质体。精确称取1.44g蛋黄卵磷脂、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相。将油相在50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,干燥1h,取15mL 50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体的包封率。
种类2:采用大豆磷脂(供注射用)制备红花黄色素纳米柔性脂质体。精确称取1.44g大豆磷脂(供注射用)、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相。将油相在50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,干燥1h,取15mL 50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体的包封率。
种类3:采用大豆磷脂(供口服用)制备红花黄色素纳米柔性脂质体。精确称取1.44g大豆磷脂(供口服用)、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相。将油相在50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,干燥1h,取15mL 50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体的包封率。
三种磷脂制备的红花黄色素纳米柔性脂质体的包封率结果见下表。
磷脂种类 | 包封率 |
种类1 | 55.79% |
种类2 | 30.35% |
种类3 | 45.54% |
可见本发明采用的蛋黄卵磷脂具有明显的技术优势。
实施例3、药脂比研发
精确称取24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,分别按药脂比为1:10、1:20、1:50、1:100、1:150精密称取一定量的蛋黄卵磷脂,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;另取1,2-丙二醇3mL加入16mL蒸馏水混合均匀,得水相。将油相在50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,取50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相,利用鱼精蛋白凝聚法-HPLC法测定脂质体的包封率。不同药脂比制备的红花黄色素纳米柔性脂质体的包封率结果见下表。
药脂比 | 包封率 |
1:10 | 15.74% |
1:20 | 55.91% |
1:50 | 71.37% |
1:100 | 60.36% |
1:150 | 58.75% |
根据上述结果,一定范围内,红花黄色素纳米柔性脂质体的包封率随着蛋黄卵磷脂用量的增加而增加,增加到一定程度反而会降低,其原因可能是:脂质体为热力学不稳定体系,当蛋黄卵磷脂增加到一定程度时,脂质体小颗粒间的碰撞机率增大易发生融合和析出。
实施例4、胆脂比研发
精确称取24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,分别按胆脂比为1:2、1:5、1:10、1:20、1:50精密称取一定量的蛋黄卵磷脂,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;另取1,2-丙二醇3mL加入16mL蒸馏水混合均匀,得水相。将油相在50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,取50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相,利用鱼精蛋白凝聚法-HPLC法测定脂质体的包封率。不同胆脂比制备的红花黄色素纳米柔性脂质体的包封率结果见下表。
胆脂比 | 包封率 |
1:50 | 12.47% |
1:20 | 71.46% |
1:10 | 68.10% |
1:5 | 57.10% |
1:2 | 57.67% |
根据上述结果,胆固醇用量的增加使得较多的胆固醇掺入磷脂分子中,与磷脂分子间隔排列,使脂质体内水相体积增大,而使水溶性成分的包封率增加;同时胆固醇在一定程度上可增加磷脂表面黏度,降低磷脂膜对水溶性药物的透过性,减少脂质体的聚集和融合,增加其稳定性。
实施例5、1,2-丙二醇相关研发
精确称取50mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药、1g卵磷脂,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;分别配制质量分数为10%、15%、20%、25%、30%的1,2-丙二醇水溶液20mL,混合均匀,得水相。将油相在50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,干燥1h,取50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相,利用鱼精蛋白凝聚法-HPLC法测定脂质体的包封率。
不同质量分数丙二醇制备的红花黄色素纳米柔性脂质体的包封率结果见下表。
根据上述结果,丙二醇掺入到脂质体的磷脂双分子层增加了其水溶性,使部分水溶性分子进入脂质体的内水相增加其包封率,当丙二醇质量分数增加到一定程度时,由于磷脂膜的柔软性过大可以形成粒径更小的脂质体,在相同磷脂的用量下,小粒径脂质体会使内水相体积减少而降低其包封率;丙二醇用量过多也会使得脂质体膜材的稳定性降低,导致部分脂质体被破环造成脂质体药物的泄露,包封率下降。
实施例6、对比试验
分别采用本发明的制备方法(方法1)及其他四种制备方法(方法2-方法5)制备红花黄色素纳米柔性脂质体。
方法1:采用薄膜水化-探头超声法制备红花黄色素纳米柔性脂质体。精确称取1.44g蛋黄卵磷脂、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相。将油相于50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,取15mL 50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,8000r/min探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体的包封率。
方法2:采用乙醇注入法制备红花黄色素纳米柔性脂质体。精确称取1.44g蛋黄卵磷脂、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将卵磷脂、胆固醇置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相,于50℃条件下,减压旋转蒸发除去有机溶剂;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相。取水相15mL溶解红花黄色素,置于磁力搅拌器上,将油相缓缓注入其中,搅拌5min后,8000r/min探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体包封率。
方法3:采用逆向蒸发法制备红花黄色素纳米柔性脂质体。精确称取1.44g蛋黄卵磷脂、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将卵磷脂、胆固醇置于茄型瓶中,加50mL二氯甲烷-甲醇(5:2)混合溶剂溶解,得油相;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相。取15mL水相溶解红花黄色素,加入到油相中,水浴超声,共5min,每次持续1min,两次间歇1min,得乳状液。在50℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂至凝胶状态,振摇并高速匀质10min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体包封率。
方法4:采用复乳法测定红花黄色素纳米柔性脂质体。精确称取1.44g蛋黄卵磷脂、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将卵磷脂、胆固醇置于茄型瓶中,加50mL二氯甲烷-甲醇(5:2)混合溶剂溶解,得油相;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相;取15mL水相溶解红花黄色素,将其注入油相中,超声形成乳剂,得第一次乳化处理的W/O型乳化液,加入10mL超纯水,在相同功率下超声,得到第二次乳化处理的W/O/W型乳化液,将其转移至旋蒸瓶中,50℃减压旋蒸除去有机溶剂,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相测定脂质体包封率。
方法5:采用pH梯度法制备红花黄色素纳米柔性脂质体。精确称取1.44g蛋黄卵磷脂、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将脂质溶于50mL二氯甲烷中,旋转蒸发除去有机溶剂,脂质体混合物于瓶底形成均匀的薄膜,加pH=4的枸橼酸缓冲液15mL(取枸橼酸21g加水溶解成1000mL,备用;取磷酸二氢钠71.63g,加水溶解成1000mL,取38.55mL新配液与备用液61.45mL混合摇匀即得),充分水化1h,得空白脂质体。另取7.2mL1,2-丙二醇于38mL蒸馏水中混合均匀得水相,利用15mL水相将处方量的红花黄色素充分溶解,加入空白脂质体中,水浴孵化30min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体包封率。
五种方法制备的红花黄色素纳米柔性脂质体的包封率结果见下表。
制备方法 | 包封率 |
方法1 | 57.03% |
方法2 | 13.81% |
方法3 | 10.50% |
方法4 | 11.38% |
方法5 | 8.07% |
可见,本发明的薄膜水化-探头超声法具有明显的的技术优势和良好的应用价值。
实施例7、吸收试验及激光共聚焦显微试验
吸收试验的实验黏膜选择猪舌下黏膜,小心剥离合适大小的猪舌下黏膜,用生理盐水冲洗干净,然后置于立式双室扩散池上,黏膜侧朝向供给池。将双室扩散池固定在调温磁力搅拌器上,并以恒定的速度搅拌接收液,保持恒温在(37±0.5)℃。在供给池中分别加入原料药溶液与脂质体溶液各1mL,分别于0.5、1、2、3、4h取样2mL,并向其中注入2mL 37℃预热过的生理盐水,取出的样品经氮气吹干后用200μL纯化水溶解,14800r/min离心处理30min,取上清进样测定HSYA的含量,计算并比较两种溶液的累积渗透量。实验结果见附图4。在整个透黏膜给药过程中,红花黄色素纳米柔性脂质体(SY-FNL)的累积透过量始终高于红花黄色素普通脂质体(SY-CL)和红花黄色素(SY)原料药溶液,4h时,SY-FNL、SY-CL和SY原料药溶液中HY的累积透过量分别为(100.79±4.35)μg/cm2、(72.98±3.33)μg/cm2和(60.99±5.37)μg/cm2。表明SY-FNL更容易透过舌下黏膜结构。
激光共聚焦显微试验,将脂溶性荧光探针尼罗红(Nile Red)和水溶性荧光探针钙黄绿素(Calcein)分别加入油相和水相制备红花黄色素纳米柔性脂质体,然后用激光共聚焦显微镜(CLSM)设定Nile Red激发波长为561nm,Calcein激发波长为488nm,观察荧光分布情况并拍照记录。结果参见附图6,图中显示,水溶性探针(绿)和脂溶性探针(红)都能均匀的分布于整个柔性脂质体的空间。
实施例8、包封率测定相关研发
方法1:采用透析法-HPLC法测定红花黄素色纳米柔性脂质体包封率。精密吸取10mL自制红花黄色素脂质体于截留分子量14000的透析袋中,将透析袋两边用透析夹夹紧,置于250mL烧杯中,加入100mL 1,2-丙二醇作为透析介质,分别于0.25、0.5、1、2、4、8、10、12、24、48、72h吸取2mL透析外液并补齐等体积的1,2丙二醇,不同时间段的透析外液过0.45μm滤膜,进样测定其中羟A的含量,绘制透析平衡曲线,并测定脂质体包封率。
方法2:采用鱼精蛋白凝聚法-HPLC法测定红花黄素色脂质体包封率。精密吸取0.1mL红花黄色素脂质体于5mL离心管中,加入0.1mL10mg/mL鱼精蛋白溶液,静置3min,加3mL生理盐水,置于离心机中,14800r/min离心30min,弃去上清液,沉淀加12%Triton X-100破乳,过0.45μm滤膜,进样测定其中羟A的含量,并计算脂质体包封率。
两种方法测定的红花黄色素纳米柔性脂质体包封率结果见下表。
包封率测定方法 | 包封率 |
方法1 | 63.03% |
方法2 | 61.37% |
根据上述结果,两种方法测定的脂质体包封率较为接近,但透析法中透析平衡时间达48h,耗时较长,故选择包封率测定方法为鱼精蛋白凝聚法-HPLC法。
在上述实施例中,对各个实施例的描述都各有侧重,某个实施例中没有详述或记载的部分,可以参见其它实施例的相关描述。
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:基于薄膜水化-探头超声法进行红花黄色素纳米柔性脂质体的制备,所得红花黄色素纳米柔性脂质体对于有机生物体的皮肤和/或黏膜具有亲和及吸收活性,用于替换注射给药途径实现红花黄色素的增效减毒给药。
2.根据权利要求1所述的红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:所述黏膜为具有上表皮层、固有层和基底层三层结构的动物体或人体黏膜,且其中的上表皮层由扁平致密细胞有序排列构成药物吸收的主要屏障。
3.根据权利要求1所述的红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:所述黏膜为舌下黏膜。
4.根据权利要求1所述的红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:
其核心工艺流程为:首先将包含红花黄色素的复配有机组合物旋转蒸发制膜,然后在所得薄膜中加入含柔软剂的水相溶液及小玻璃珠进行旋转水化,所得溶液经过特定的探头超声处理得到红花黄色素纳米柔性脂质体;
其核心工艺参数为:所述复配有机组合物采用红花黄色素、蛋黄卵磷脂、胆固醇及有机溶剂进行复配制作,其中红花黄色素、蛋黄卵磷脂、胆固醇的复配用量按照如下标准设定:药脂质量比为1:20-1:150,胆脂质量比为1:2-1:40;所述含柔软剂的水相溶液中柔软剂采用1,2-丙二醇,其在水相溶液中的质量分数为10%-30%;所述探头超声处理工艺中探头超声时间为4min-6min,转速为7000r/min-9000r/min。
5.根据权利要求4所述的红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:所述药脂质量比为1:30-1:100,所述胆脂质量比为1:10-1:30。
6.根据权利要求4所述的红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:所述药脂质量比为1:50,所述胆脂质量比为1:20。
7.根据权利要求4所述的红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:所述有机溶剂为无水乙醇或二氯甲烷-甲醇,在用量上其与红花黄色素的质量比为(20-40):1;所述旋转蒸发制膜工艺的温度控制在45-50℃,旋转速度控制在65r/min-70r/min。
8.根据权利要求4所述的红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:所述小玻璃珠的用量为每3-5mL水相溶液使用1颗小玻璃珠;所述旋转水化工艺的时长控制在0.5h-1.5h;所述探头超声处理工艺中探头超声时间为5min,转速为8000r/min。
9.根据权利要求4所述的红花黄色素纳米柔性脂质体的制备方法,其特征在于:精确称取1.44g蛋黄卵磷脂、24mg胆固醇、20mg注射用红花黄色素原料药,将三者置于茄型瓶中,加50mL无水乙醇充分溶解,得油相;另取1,2-丙二醇7.2mL加入38mL蒸馏水混合均匀,得水相;将油相于50℃减压旋转蒸发除去无水乙醇,得到干膜,取15mL 50℃预热过的水相倒入薄膜介质中,加入3-5颗小玻璃珠旋转水化1h,8000r/min探头超声5min,过0.22μm聚丙烯滤膜,加入剩余水相后测定脂质体的包封率,完成制备。
10.一种对有机生物体的皮肤和/或黏膜具有亲和及吸收活性的红花黄色素纳米柔性脂质体,其特征在于:通过权利要求1-9任一项所述的方法制备,用于替换注射给药途径实现红花黄色素的增效减毒给药。
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