CN116426691A

CN116426691A - 多靶点检测HIV-1的crRNA、CRISPR-Cas12a***和检测方法

Info

Publication number: CN116426691A
Application number: CN202310216989.9A
Authority: CN
Inventors: 金聪; 张鑫
Original assignee: NATIONAL CENTER FOR AIDS/STD CONTROL AND PREVENTION CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: NATIONAL CENTER FOR AIDS/STD CONTROL AND PREVENTION CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2023-03-08
Filing date: 2023-03-08
Publication date: 2023-07-14

Abstract

本发明公开了检测HIV‑1的CRISPR‑Cas12a用crRNA、包含该crRNA的CRISPR‑Cas12a***、以及HIV‑1RT‑RAA/CRISPR检测方法及试剂盒。本发明的检测方法具有亚型通用性广、灵敏度高、特异性高等特点，适用于HIV‑1的多种常见和非常见亚型的检测。本发明能够在35分钟内完成HIV‑1核酸扩增及检测，因此可成为HIV‑1的现场快速检测方法。

Description

多靶点检测HIV-1的crRNA、CRISPR-Cas12a***和检测方法

技术领域

本发明涉及艾滋病的检测领域。更具体地，本发明涉及扩增HIV-1核酸的重组酶介导扩增用引物组、多靶点检测HIV-1核酸的CRISPR-Cas12a用crRNA、CRISPR-cas12a***、以及HIV-1RT-RAA/CRISPR检测方法及试剂盒。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的慢性传染性疾病。终结艾滋病流行的一个关键环节在于检测发现HIV感染者，既往研究发现，未被诊断发现的HIV感染者，特别是急性期感染者是导致HIV感染传播的重要原因。及早发现感染者并在感染早期进行抗病毒治疗可以有效提高抗病毒治疗效果，并通过抑制病毒在体内复制有效降低传播风险。因此，尽早诊断HIV感染对于预防HIV传播具有重要的公共卫生意义。

迄今为止，全球流行的HIV可以分为两种基因型，HIV-1和HIV-2。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界艾滋病流行的主要病原体。HIV-1型可进一步分为M、N、O、P组，其中M组毒株是导致全球艾滋病流行的主要病毒株，至少包括A、B、C、D、F、G、H、J、K和L 10个不同的亚型以及多种流行重组型(circulating recombinant form，CRF)和独特重组型(uniquerecombinant form，URF)。我国以HIV-1为主要流行株，主要亚型包括CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B等，近年来不断发现新的流行重组型(例如CRF55_01B、CRF85_BC等)和独特重组型(例如0107、01B、01BC、01C等)，不同HIV-1亚型间的基因序列多样性可能导致检测试剂出现漏检的情况发生。

现基于不同的技术已经有多种商品化HIV-1核酸检测试剂盒，例如逆转录PCR技术(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术、分枝DNA(branched DNAsignal amplification，bDNA)技术、实时荧光PCR定量技术(Quantitative real-timePCR，qPCR)等，但这些检测试剂通常实验操作流程较复杂、依赖于变温设备、成本较高，并且检测时间通常需要3个小时以上，这些因素使得HIV-1核酸检测通常在大型医院或实验室中开展，限制了HIV-1核酸检测在资源有限的基层医疗机构推广应用。

因此，本领域需要一种亚型通用性广、灵敏度高、特异性高、检测时间短的HIV-1核酸检测方法。

发明内容

为了解决现有检测方法所存在的缺陷，本发明人经过反复研究，提出了一种将逆转录-重组酶介导扩增(Reverse transcription recombinase aided amplification，RT-RAA)与CRISPR-Cas12a检测***相结合的多靶点检测HIV-1的方法—HIV-1RT-RAA/CRISPR。本发明的检测方法兼具了亚型通用性广、灵敏度高、特异性高、检测时间短等特点。由此，得到本发明。

因此，在第一方面，提供了一种用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a用crRNA，所述crRNA从5’端到3’端依次为重复序列和靶向特异性序列，其中所述靶向特异性序列包含选自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的核酸序列：

SEQ ID NO.25：GGGUUUAUUACAGRGACARCAGAGA；

SEQ ID NO.26：UAUGUCUGUUGCUAUUAURUC；

SEQ ID NO.27：CCCUGCACUGUACCCCCCAAUCC。

在第二方面，提供了一种用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a***，包括：Cas12a蛋白、以及第一方面的crRNA中的一个、两个或三个。

在第三方面，提供了第一方面的用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a用crRNA或第二方面的CRISPR-Cas12a***用于制备艾滋病诊断试剂的用途。

在第四方面，提供了一种检测HIV-1的方法，包括以下步骤：

(1)提供HIV-1核酸样本；

(2)配制CRISPR-Cas12a检测混合液，包括：

a)Cas12a蛋白、以及第一方面的crRNA中的一个、两个或者三个，或者

b)第二方面的用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a***；

(3)对所述HIV-1核酸样本进行扩增反应，得到扩增产物；

(4)使所述扩增产物与所述CRISPR-Cas12a检测混合液混合并反应，并通过荧光淬灭报告分子的荧光发光情况来确定是否存在HIV-1。

在第五方面，提供了一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)第一方面的CRISPR-Cas12a用crRNA和Cas12a蛋白，或第二方面的CRISPR-Cas12a***；

b)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明书；以及

c)任选地，用于扩增HIV-1核酸的引物组：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)，以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)；

d)任选地，荧光淬灭报告分子。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种将RT-RAA与CRISPR-Cas12a检测技术结合检测HIV-1的方法—HIV-1RT-RAA/CRISPR，并使用HIV-1重组质粒和临床样本对本发明的检测方法的检测性能进行初步评价。首先，本发明筛选出能够用于CRISPR-Cas12a的多条靶向特异性crRNA，并利用crRNA的组合实现多靶点检测，避免因HIV-1序列多样性导致漏检的情况发生。其次，本发明将两种技术所用的试剂整合在同一反应管中，无需开盖，检测过程更加简单。

与现有技术相比，本发明的HIV-1RT-RAA/CRISPR检测方法具有亚型通用性广、灵敏度高、特异性高、快速完成检测等优势，并且能够在35分钟内完成HIV-1核酸扩增及检测，因此可作为现有HIV-1检测方法的有益补充。该方法有助于快速确认HIV-1感染者，与现有核酸检测技术相比更适于在资源有限的基层医疗机构推广使用，为促进HIV-1感染者早检测、早发现提供了有力的检测工具。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示出了CRISPR-Cas12a***识别及检测靶核酸的原理示意图。

图2示出了HIV-1序列集的亚型构成情况。

图3示出了RAA引物和探针位置及长度的示意图。

图4示出了筛选RAA上游引物的检测结果。

图5示出了筛选RAA下游引物的检测结果。

图6示出了应用4种HIV-1亚型(CRF01_AE(标示为“01AE”)、CRF07_BC(标示为“07BC”)、CRF08_BC(标示为“08BC”)、B)的重组质粒筛选引物组合的检测结果。

图7示出了不同反应条件下的RT-RAA检测结果。

图8示出了crRNA位置及长度的示意图。

图9示出了crRNA验证的检测结果。

图10示出了不同浓度的Cas12a与crRNA下的检测结果。

图11示出了本发明的方法针对10种HIV亚型(CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC、B、CRF55_01B、CRF85_BC、0107、BC、01BC和01C)的检测结果。

具体实施方式

在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。

在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。

在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。

为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。

在第一方面，提供了一种用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a用crRNA，所述crRNA从5’端到3’端依次为重复序列和靶向特异性序列，其中所述靶向特异性序列包含选自SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的核酸序列：

SEQ ID NO.25：GGGUUUAUUACAGRGACARCAGAGA；

SEQ ID NO.26：UAUGUCUGUUGCUAUUAURUC；

SEQ ID NO.27：CCCUGCACUGUACCCCCCAAUCC。

在本发明中，crRNA的重复序列是Cas12a通用的序列，其通过形成独特二级结构与Cas12a蛋白结合。本领域技术人员理解，该重复序列在其二级结构不发生改变的情况下其长度和碱基是可以改变的。作为一个示例，所述重复序列可以为AAUUUCUACUCUUGUAGAU(SEQID NO.28)或UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO.29)所示的序列，但不限于此。

在一个具体的实施方案中，所述crRNA是SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ IDNO.24所示的crRNA：

SEQ ID NO.22：AAUUUCUACUCUUGUAGAUGGGUUUAUUACAGRGACARCAGAGA；

SEQ ID NO.23：AAUUUCUACUCUUGUAGAUUAUGUCUGUUGCUAUUAURUC；

SEQ ID NO.24：AAUUUCUACUCUUGUAGAUCCCUGCACUGUACCCCCCAAUCC。

根据序列比对可以知晓，这三条crRNA序列中包含的序列为SEQ ID NO.28所示的重复序列。

CRISPR/Cas检测***依赖于Ⅱ类Cas蛋白的反式切割活性，即Cas蛋白在crRNA(或gRNA)的指引识别靶序列后被激活，其在切割靶序列的同时还会以极高效率非特异性切割周围的荧光淬灭报告分子，便可通过释放荧光信号的方式实现对靶序列的检测。目前常用的Cas蛋白是Cas12和Cas13，两者区别在于Cas12识别DNA靶标，而Cas13识别RNA靶标。本发明应用Cas12a检测***，其检测原理示意图如图1所示。在本发明的上下文中提及的Cas12a蛋白可以选自Cas12a蛋白家族的多种Cas12a蛋白，例如FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a蛋白，但不限于此。

另外，在本文中，Cas12a蛋白可以与单独的一种crRNA结合使用，也可以与这三种crRNA一起结合使用。

在一个优选的实施方案中，所述CRISPR-Cas12a***包括第一方面的crRNA中的三个。

在一个更优选的实施方案中，所述CRISPR-Cas12a***包括SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的crRNA。

在SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的三种crRNA中，以SEQ IDNO.23所示的crRNA的检测效果最佳。在三种crRNA一起结合使用时，优选地，这三种crRNA以1:1:1的比例存在，可以提高最终的荧光值，并且这三种crRNA的组合可以防止因HIV-1核酸序列变异导致脱靶现象的产生，从而增加检测方法对更多HIV-1亚型的通用性。

在一个优选的实施方案中，所述crRNA或所述CRISPR-Cas12a***中包含的crRNA为等比存在的三个crRNA。

在一个更优选的实施方案中，所述crRNA或所述CRISPR-Cas12a***中包含的crRNA为等比存在的SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的crRNA。

在一个具体的实施方案中，所述crRNA或CRISPR-Cas12a***还与用于扩增HIV-1核酸的引物组联合用于制备艾滋病诊断试剂，所述引物组包括：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)、以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)。

在上述引物序列中，A代表腺嘌呤，G代表鸟嘌呤，C代表胞嘧啶，T代表胸腺嘧啶，R代表A/G，Y代表C/T，M代表A/C，K代表G/T，S代表C/G，W代表A/T，H代表A/T/C，B代表G/T/C，V代表G/A/C，D代表G/A/T，以及N代表A/T/C/G。

在采用CRISPR-Cas12a***对HIV-1核酸进行检测之前，采用上述引物组利用扩增技术对HIV-1核酸样本进行扩增，可以极大丰富样本中HIV-1核酸量，从而确保可以采用该CRISPR-Cas12a***来对HIV-1核酸进行检测。

在一个具体的实施方案中，所述引物组可以用于重组酶介导扩增反应(recombinase aided amplification，RAA)。在腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosinetriphosphate，ATP)作用下，重组酶与特异性引物形成复合物，当特异性引物在模板DNA序列中识别到与之互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白辅助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶作用下复制延伸，实现反应产物的指数级增长。HIV-1是RNA病毒，可以理解在扩增前需要逆转录过程，因此本发明采用RT-RAA技术。

等温扩增技术因在单一温度下即可完成反应，降低了核酸检测对实验条件的要求。其中RAA由于反应速度快、步骤少且易操作，并对温度波动、碱基错配有较好耐受性，近年来被广泛应用。但由于等温扩增技术缺乏类似PCR的退火过程，易出现非特异性扩增。CRISPR-Cas***作为核酸检测的新型生物传感平台，具有反应速度快和高特异性的特点，但灵敏度较低。本发明将CRISPR-Cas与核酸扩增技术结合，不仅可以有效地提高检测的灵敏度，还能够通过识别特异性扩增产物，提高检测方法的特异性。本发明将RT-RAA和CRISPR-Cas12a两种技术相结合，成功地建立了HIV-1RT-RAA/CRISPR检测方法或试剂盒。然而，不希望被理论束缚，本发明的引物组也可以用于其他多种扩增技术中，例如qPCR、RT-PCR、NASBA、bDNA、重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)、酶促重组等温扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、解旋酶依赖性扩增技术(helicase-dependent amplification，HAD)、链替代扩增技术(Strand DisplacementAmplification，SDA)、滚环核酸扩增技术(Rolling Circle Amplification，RCA)等。本领域技术人员会知道，RAA的引物与RPA、ERA等的引物是可以通用的。

在采用CRISPR-Cas12a***来检测HIV-1时，还需要荧光淬灭报告分子。在本文中，荧光淬灭报告分子可以是荧光报告基团和荧光淬灭基团同时标记的单链DNA，Cas12a蛋白能够对该报告分子进行非特异性切割从而使其荧光报告基团与荧光淬灭基团分开而发出荧光。因此，在一个任选的实施方案中，所述CRISPR-Cas12a***进一步与荧光淬灭报告分子联合用于制备艾滋病诊断试剂。在一个优选的实施方案中，所述荧光淬灭报告分子可以是5’端经由荧光报告基团如FAM、HEX等荧光团标记、3’端经由荧光淬灭基团如Iowa

FQ quencher标记、且包含Cas12a能够切割位点的单链DNA，如5'-TTATT-3'，但不限于此。

本发明的上下文中使用的HIV-1核酸样本可以是任何来源的，例如来自血液样本如全血、血清、血浆、干血斑等，来自体液样本如分泌物等，也可以是基于已知的核酸序列经人工合成的样本。另外，还可以理解，所述HIV-1核酸样本可以通过本领域常规的核酸提取技术来进行提取获得，并且本发明对核酸提取方法和试剂无特殊限定。

在第四方面，提供了一种检测HIV-1的方法，包括以下步骤：

(1)提供HIV-1核酸样本；

(2)配制CRISPR-Cas12a检测混合液，包括：

a)Cas12a蛋白、以及第一方面的crRNA中的一个、两个或者三个；或者

b)本发明第二方面的用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a***；

(3)对所述HIV-1核酸样本进行重组酶介导扩增反应，由此得到扩增产物；

可以理解，本发明用于检测HIV-1的方法可以用于诊断目的，也可以用于“非诊断目的”，所述“非诊断目的”包括但不限于检验检疫和疫情防控等。

可以理解，本发明的上下文中使用的HIV-1核酸样本可以是任何来源的，例如来自血液样本如全血、血清、血浆、干血斑等，来自体液样本如分泌物等，也可以是基于已知的核酸序列经人工合成的样本。另外，还可以理解，所述HIV-1核酸样本可以通过本领域常规的核酸提取技术来进行提取获得，并且本发明对核酸提取方法和试剂无特殊限定。

同样可以理解，上述方法中的步骤(1)-(4)仅仅出于区分的目的，而并非对于步骤顺序的具体限定，除非根据上下文可以判断这些步骤之间必须要按照特定顺序实施。例如，本领域技术人员可以理解，步骤(1)和(2)的实施并无顺序要求，可以依次实施，也可以同时实施，甚至可以先实施步骤(2)再实施步骤(1)。

在一个示例性实施方案中，所述Cas12a蛋白可以为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a蛋白，但不限于此。

在一个优选的实施方案中，所述CRISPR-Cas12a检测混合液包括Cas12a蛋白、以及第一方面的crRNA中的三个。

在一个优选的实施方案中，这三种crRNA的总工作浓度为0.17-0.33μM。

在一个更优选的实施方案中，所述三种crRNA等比存在，并且这三种crRNA的总工作浓度为0.17μM。

在又一个优选的实施方案中，所述Cas12a蛋白的工作浓度为0.17-0.33μM。

在一个更优选的实施方案中，所述Cas12a蛋白的工作浓度为0.33μM。

在一个具体的实施方案中，在步骤(3)的所述扩增反应中使用包括以下的引物组：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)，以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)。

在一个优选的实施方案中，在步骤(3)中，所述扩增反应可以是重组酶介导扩增反应。如前所述，HIV-1是RNA病毒，因此本发明采用RT-RAA。不希望被理论束缚，本发明的引物组也可以用于其他多种扩增技术中，例如RPA、ERA、qPCR、RT-PCR、NASBA、bDNA、LAMP、HAD、SDA、RCA等。本领域技术人员会知道，RAA的引物与RPA、ERA等的引物是可以通用的。

在采用RT-RAA扩增的情况下，可以理解，步骤(3)中使用的扩增反应体系还包括用于进行RT-RAA扩增反应的其他试剂，例如逆转录酶、RAA重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、核酸外切酶III、dNTP、RNase抑制剂、乙酸镁、缓冲液、阴性对照、阳性对照等等。本领域技术人员能够根据实际需要选择用于RT-RAA扩增反应的上述试剂，这些试剂均可以通过商购获得。例如，可以在扩增反应中使用江苏奇天基因科技有限公司RT-RAA试剂盒(货号B00R00)，其单人份RT-RAA反应单元包含逆转录酶、RAA重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、dNTP、RNase抑制剂等组分，但不限于此。

在一个具体的实施方案中，在步骤(3)中，所述扩增反应中的每种引物的工作浓度为0.2-1.0μM。

在一个优选的实施方案中，在步骤(3)中，所述扩增反应中的每种引物的工作浓度为0.4-0.8μM。

在一个更优选的实施方案中，在步骤(3)中，所述扩增反应中的每种引物的工作浓度为0.6μM。

在又一个具体的实施方案中，在步骤(3)中，所述扩增反应在37℃至41℃进行至少20分钟。在一个优选的实施方案中，所述扩增反应在41℃的温度进行。

在一个具体的实施方案中，所述方法还包括：在步骤(3)的扩增反应开始前，将所述CRISPR-Cas12a检测混合液预先放置于在步骤(3)中用于扩增反应的反应管中与扩增反应体系相分离之处，并在步骤(3)的扩增反应结束后，使所述CRISPR-Cas12a检测混合液与所述扩增产物混匀。例如，将CRISPR-Cas12a检测混合液预先放置于用于扩增反应的反应管的管盖中，当步骤(3)的扩增反应结束后，无需开盖，仅需颠倒反应管使CRISPR-Cas12a检测混合液与所述扩增产物混匀即可开始CRISPR-Cas12a检测反应。

本发明通过将扩增反应如RT-RAA扩增与CRISPR-Cas12a检测整合至同一反应管中，省略了在扩增与检测反应期间开/关盖以添加试剂这样的步骤，这样的设计不仅使得检测过程更加简明，也避免了在复杂的现场检测条件下在开关反应管盖的操作中引入不必要的污染物导致假阳性的情况发生。

在又一个具体实施方案中，在步骤(4)的检测体系中还包括荧光淬灭报告分子。不希望被理论束缚，该荧光淬灭报告分子可以预先置于步骤(3)的扩增反应体系中，并在步骤(4)与扩增产物、CRISPR-Cas12a检测混合液相互作用，进而使得能够通过比较荧光淬灭报告分子的荧光发光情况和荧光阈值来确定是否存在HIV-1。例如，所述荧光淬灭报告分子可以是5’端经由荧光报告基团如FAM、HEX等荧光团标记、3’端经由荧光淬灭基团如Iowa

在第五方面，提供了一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)第一方面的CRISPR-Cas12a用crRNA和Cas12a蛋白，或者第二方面的CRISPR/Cas12a***；

b)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明书；以及

c)任选地，用于扩增HIV-1核酸的引物组：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)，以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)；

d)任选地，荧光淬灭报告分子。

同样地，作为示例，所述Cas12a蛋白可以为FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a蛋白，但不限于此。

在一个优选的实施方案中，在步骤c)中，所述扩增可以是重组酶介导扩增反应。

然而，不希望被理论束缚，本发明的引物组也可以用于其他多种扩增技术中，例如RPA、ERA、qPCR、RT-PCR、NASBA、bDNA、LAMP、HAD、SDA、RCA等。本领域技术人员会知道，RAA的引物与RPA、ERA等的引物是可以通用的。

在本发明的上下文中，所述试剂盒可以用于将反转录-重组酶介导扩增(RT-RAA)与CRISPR-Cas12a***结合以用于检测HIV-1核酸。因此，可以理解，所述试剂盒还包括与引物组结合使用的用于进行RT-RAA扩增反应的其他试剂，例如逆转录酶、RAA重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、dNTPs、RNase抑制剂、乙酸镁、缓冲液、阴性对照、阳性对照等，这些试剂是本领域技术人员熟知的并且可以通过商购获得的(例如，购自江苏奇天基因科技有限公司的RT-RAA试剂盒，货号B00R00)，本文对此并无特别限定。

在一个任选的实施方案中，所述试剂盒还包括荧光淬灭报告分子。例如，所述荧光淬灭报告分子可以是5’端经由荧光报告基团如FAM、HEX等荧光团标记、3’端经由荧光淬灭基团如Iowa

实施例

在下述实施例中，示出了本发明的HIV-1的检测方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。

材料

1.主要仪器

表1：主要仪器与设备及相关品牌和型号

2.主要试剂与耗材

(1)QIAamp Viral RNA Mini Kit(Cat#5290)：QIANGEN；

(2)丽珠全自动核酸提取试剂盒(Cat#01070028)：珠海丽珠试剂股份有限公司；

(3)RT-RAA核酸扩增试剂盒(Cat#B00R00)：江苏奇天；

(4)Cas12a(Cpf1)核酸酶(Cat#32104)：上海吐露港生物科技有限公司；

(5)RNase inhibitor(Cat#N8080119)：英潍捷基；

(6)引物、探针、荧光猝灭报告分子(ssDNA-FQ)、crRNA和质粒均合成自生工生物工程(上海)股份有限公司；

3.实验样本

本研究中使用的HIV-1感染者血浆样本、8E5细胞、HIV-1B亚型毒株、HBV感染者血浆样本、HCV感染者血浆样本、TP感染者血浆样本均来自国家艾滋参比实验室样本库。

实施例1：HIV-1重组酶介导扩增用引物的设计和筛选

用Los Alamos数据库里中国地区的HIV-1基因序列，建立我国HIV-1基因序列集，如图1所示。序列集中共纳入610条HIV-1全基因序列，包含34种亚型，不仅涵盖我国常见HIV-1亚型，如CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC和B亚型，还包含C亚型、G亚型、多种CRF(CRF55_01B、CRF85_BC、CRF57_BC、CRF59_01B、CRF62_BC、CRF64_BC、CRF65_cpx、CRF67_01B、CRF68_01B等)和多种URF(0107、BC、01BC、01B、01C等)。使用BioEdit软件对序列进行清理并分析，对比找出不同亚型序列的保守序列。

针对HIV-1的保守序列，按照以下原则设计RAA引物：

(1)靶标区域GC含量在40-60％，尽量不含有正向或反向重复序列和回文序列；

(2)引物长度为30-35个碱基；

(3)引物序列：

1)5’端(前3-5个碱基)避免出现重复G，最好为C或T；

2)3’端(后3个碱基)最好有G和C；

3)GC含量不要大于70％或小于30％；

4)引物间避免形成二级结构、引物二聚体；

(4)产物长度：扩增产物长度不超过500bp，理想长度为100-200bp。

基于筛选RAA引物并进一步优化RT-RAA扩增反应参数的目的，按照以下原则进行荧光探针的设计：

实时荧光RAA的探针长度一般为46-52个碱基，3’端进行阻断基团修饰，阻止DNA聚合酶的复制延伸。探针内部设计可供核酸外切酶切割的四氢呋喃(THF)修饰位点，THF修饰位点距离5’端至少30个碱基，距离3’端至少15个碱基，且THF修饰点两侧标记荧光基团和猝灭基团。当探针与模板结合时，核酸外切酶III切割THF残基，荧光基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。

HIV-1序列具有高度变异性，难以在HIV-1基因组找到长度较长，适合作为RAA扩增靶标的保守序列，并且在确定的保守序列区难以设计多组完全符合上述原则的引物和探针。本发明经过大量实验发现即使不完全符合上述原则的引物仍可得到扩增效果良好，并优于符合原则的引物组合。因此，在上述RAA设计原则的基础上，本发明进行了优化设计和筛选。经过前期大量实验验证，在HIV-1保守区(pol区)初步得到了6条候选上游引物(F1-F4)，4条候选下游引物(R1-R4)及1条荧光探针(P)。它们的位置、长度和序列信息如图3和下表2所示。

表2：RAA引物和探针位置、长度和序列信息

HIV-1序列具有高度变异性，如果RAA引物与病毒核酸序列不能完全匹配可能会影响扩增效率。为了得到与中国地区HIV-1亚型序列匹配度更高的HIV-1特异性引物，本发明进一步通过使用多种不同亚型的HIV-1模拟样本进行多轮筛选，综合考虑扩增曲线起峰时间和终荧光值选取引物。

首先使用含有HIV-1B亚型缺陷前病毒的T淋巴细胞白血病细胞株(8E5细胞)提取的核酸作为模板进行引物筛选。通过采用一个正向引物筛选所有反向引物，得到扩增效果较好的候选反向引物；再用筛选出的反向引物筛选所有正向引物，得到扩增效果较好的候选正向引物。

基于国内HIV-1序列分析结果，将中国地区HIV-1主要流行的四种亚型CRF01_AE(GenBank：JX112829.1)、CRF07_BC(GenBank:KC492737.1)、CRF08_BC(GenBank:KF835534.1)、B(GenBank:KU724103.1)的pol区片段(位于HXB2 4600-5100bp)SEQ IDNO.12-15克隆至pUC57载体上，得到HIV-1重组质粒，使用NanoDrop One紫外分光光度计进行定量。

随后使用上述四种HIV-1亚型(CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B)的重组质粒作为模板，对应用8E5细胞筛选出的候选的上下游引物分别两两组合进行再次筛选。应用HIV-1重组质粒作为模板(浓度为10⁷拷贝/mL)，每组引物重复三次实验，优选得到用于后续检测的引物组合。

为了减少引物探针筛选过程中因反应批次不同造成的差异和保证不同反应条件下结果的可对比性，在此过程选择高通量的Bio-rad CFX96仪器进行检测，具体操作步骤如下：

(1)将RT-RAA荧光试剂盒(江苏奇天，F00R01)平衡至室温，该试剂盒中含有反应缓冲液V、包含冻干重组酶等反应组份的单人份反应单元和乙酸镁。配制如表3所示的反应混合液：

表3：反应混合液

(2)将42.5μL反应混合液加至反应单元中，轻柔混匀，使反应管中的冻干粉充分溶解均匀，将混匀后的反应液转移至PCR管中，进行后续反应。

(3)在PCR管盖上加入2.5μL的乙酸镁，最后向PCR管中加入5μL模板，盖上PCR管盖后，放入样本前处理***(江苏奇天，B6108)中自动振荡混匀并离心至管底，随后立即放置于Bio-rad CFX96仪器中。每次实验同时设置无核酸酶水作为阴性对照。

(4)反应条件：在39℃预反应40秒，之后每30秒读取一次荧光，设定在40次荧光读取后结束反应。

使用8E5细胞提取的核酸作为模板对设计的RAA引物进行筛选。首先使用下游引物R4与上游引物F1-F6进行组合，结果如图4所示。对上游引物的初步筛选结果显示，各引物在起峰时间上差距不明显，但终荧光值相差较大。F4、F3扩增曲线的起峰时间较早，且终荧光值较高，设为候选上游引物。使用候选上游引物F4对下游引物R1-R4进行筛选，结果如图5所示。R3与R4的扩增曲线起峰时间最早，R1虽然在扩增曲线的起峰时间上略晚于R3与R4，但终荧光值最高，将R1、R3和R4设为候选下游引物。

进一步使用高浓度(10⁷拷贝/μL)的四种HIV-1亚型的重组质粒(CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B)作为模板筛选候选引物，将候选上游引物和下游引物两两组合，对每个亚型的重组质粒重复进行三次检测，结果如图6所示。F3/R4和F4/R4组合对四种亚型的重组质粒均显示出良好扩增效果。由于扩增产物片段长度通常与扩增效率相关，以尽可能缩短扩增产物长度以提高扩增效率为标准，优选扩增片段长度较短的F3/R4组合作为后续检测使用的引物组合，但不排除F4/R4引物组合同样具备良好的检测性能。

实施例2：重组酶介导扩增反应条件的优化

在本实施例中，使用

Viral RNA Mini Kit试剂盒提取HIV-1B亚型毒株的RNA作为模板，优化RT-RAA扩增的反应体系和反应温度。为了同时设置温度梯度和比对不同反应条件下检测结果，并减少因反应批次不同造成的差异和保证结果的可对比性，在此过程同样选择高通量的Bio-rad CFX96仪器进行检测，检测方法参见实施例1。

(1)优化引物浓度

分别在实时荧光RT-RAA反应体系中加入不同体积的引物和探针的混合物(引物10μM；探针3.3μM)：1μL、2μL、3μL、4μL、5μL，重复三次实验，结果如图7所示。通过比较实时荧光扩增曲线的起峰时间和终荧光值，得到最佳引物探针浓度。由图7可知，当引物和探针终浓度分别为0.6μM和0.2μM时，扩增曲线的起峰时间最短，且终荧光值相对较高。

(2)优化反应温度

RT-RAA扩增反应的推荐温度为39℃，为优化得到最佳反应温度，基于39℃增加或减少2℃的温度区间(37℃-41℃)设置了5个温度梯度：37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，重复三次实验，结果如图7所示。检测结果显示，在37℃-41℃温度区间，扩增曲线的起峰时间随反应温度升高而缩短，当反应温度设置为41℃时起峰时间最早。

通过优化反应条件，确定在后续的RT-RAA扩增反应体系中引物终浓度为0.6μM，反应温度设置为41℃。

实施例3：HIV-1特异性crRNA的设计和筛选

针对RT-RAA扩增的靶标区域，按照以下基本原则设计crRNA:

(1)crRNA通常为40-44个碱基，包括Cas12a识别的直接重复(direct repeat，DR)序列(AAUUUCUACUCUUGUAGAU)和随后的21-25个碱基的特异性片段；

(2)GC含量不要大于80％或小于20％。

在RT-RAA引物扩增片段序列内部，按照crRNA设计原则设计多条crRNA，通过综合考虑荧光信号曲线的斜率和终荧光值，优选了以下3条检测效果良好的crRNA，位置及长度如图8和表4所示。

表4：crRNA位置、长度信息及序列信息

由于扩增和检测分别使用不同酶，因此反应所需反应缓冲液组分也不同。若简单地将两反应体系进行混合将会抑制靶序列的扩增，进而导致检测失败。本发明通过大量实验，最终确定各组分的使用比例及操作步骤，将两步整合至单一反应管中，建立HIV-1RT-RAA/CRISPR检测方法。HIV-1RT-RAA/CRISPR检测使用实施例1中筛选的RT-RAA用引物组、实施例2中的优化反应参数以及SEQ ID NO.22-24示出的crRNA。

RT-RAA核酸扩增试剂盒购自江苏奇天基因公司(货号B00R00)，该试剂盒中含有反应缓冲液V、包含冻干重组酶等反应组份的单人份反应单元和乙酸镁。Cas12a检测试剂购自吐露港公司，该试剂含有Cas12a蛋白和Tolo buffer。具体步骤如下：

(1)配制RT-RAA扩增反应混合液(组分如下表5所示)，将扩增反应混合液加至反应单元中，轻柔指弹使冻干粉充分重溶混匀，瞬时离心将液体收集至管底后，转移至新PCR管中。

表5：扩增反应混合液

(2)配制CRISPR-Cas12a检测混合液(组分如表6所示)，将crRNA与Cas12a蛋白预混，室温孵育10分钟(crRNA在冰上融化，用冰水稀释，冻融不要超过三次，防止crRNA降解)。

表6：CRISPR-Cas12a检测混合液

(3)向PCR管中加入5μL RNA模板，取2.5μL乙酸镁加至PCR盖上，盖上PCR管盖，混匀离心10秒后，弃掉PCR管盖；

(4)将预先配制的4μL CRISPR-Cas12a检测混合液和6μL Tolo buffer加入新PCR盖，盖上新PCR管盖后，立即放入实时荧光定量PCR仪，在41℃反应20分钟。

(5)扩增反应结束后颠倒混匀PCR管，将管盖上的CRISPR-Cas12a反应组分与RT-RAA扩增产物充分混匀，混匀离心10秒后，立即放入实时荧光定量PCR仪，在37℃进行反应，每30秒读取一次荧光，设定在20次荧光读取后结束反应，超过荧光阈值判定为检测阳性。

使用实施例1中构建的CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型四种HIV-1亚型的重组质粒作为模板(浓度为10⁷拷贝/mL)，进一步对设计的三种crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3)以及三种crRNA的等比组合(crRNA1-crRNA3)进行亚型通用性验证，结果如图9所示。图9的结果显示使用crRNA1、crRNA2、crRNA3均可有效检测出四种HIV-1亚型的重组质粒。其中，crRNA2荧光信号曲线的斜率最高，其次为crRNA1和crRNA3。将三种crRNA等比例组合后，虽然荧光信号曲线的斜率相较于crRNA2差别不大，但可以有效提高终荧光值。并且三种crRNA识别靶序列的不同位点，组合使用可以避免因序列差异导致漏检的情况发生。因此，在后续的HIV-1RT-RAA/CRISPR检测实验中使用上述三种crRNA的组合。

实施例4：CRISPR-Cas12a检测反应条件的优化

使用HIV-1B亚型毒株提取的RNA作为模板，通过改变crRNA与Cas12a蛋白的配比及终浓度，重复两次实验，通过比较荧光信号曲线的斜率和终荧光值，优化CRISPR-Cas12a检测反应体系，检测方法参见实施例3。

如图10所示，在CRISPR-Cas12a检测体系中改变Cas12a与crRNA的配比和终浓度，发现荧光信号曲线的斜率和终荧光值与Cas12a终浓度直接相关。Cas12a终浓度为0.33μM时，相较于Cas12a终浓度为0.17μM，荧光信号曲线的斜率和终荧光值都有明显升高，但改变crRNA终浓度对检测效果影响较小。综合荧光信号曲线的斜率和终荧光值确定在后续HIVRT-RAA/CRISPR的检测反应体系中crRNA终浓度为0.17μM和Cas12a终浓度为0.33μM。

实施例5：临床样本检测结果

取已知HIV-1亚型和病毒载量的25份HIV-1阳性样本(样本信息如表7所示，涉及CRF07_BC、CRF55_01B、CRF01_AE、CRF08_BC、01B五种亚型)、20份HIV-1阴性样本和9份HBV(乙型肝炎)、HCV(丙型肝炎)和TP(***)感染样本(每种病原体各3份)，使用丽珠核酸提取试剂盒搭配丽珠全自动核酸提取仪提取病毒核酸，进行HIV-1RT-RAA/CRISPR检测，检测方法参见实施例3。

表7：25份HIV-1阳性样本的病毒载量和亚型信息表

注：样本亚型通过pol区进行分型；病毒载量检测使用罗氏试剂(Cobas TaqManHIV-1v2.0)。

检测结果如下表8所示。本发明的检测方法的阳性符合率和阴性符合率均为100％(25/25，0/20)。本发明的检测方法在检测HIV-1时与常见的血源性病原体(HBV、HCV和TP)并无交叉反应，表现出针对HIV-1的高特异性。

表8：HIV-1RT-RAA/CRISPR检测临床样本的结果

实施例6：模拟样本检测

尽管在上述实施例5中，已经检测了涉及CRF07_BC、CRF55_01B、CRF01_AE、CRF08_BC、01B五种亚型的真实临床样本，但为了进一步验证本发明所提供检测方法的亚型通用性和检测灵敏度，本发明进一步对10种国内较为常见HIV-1亚型的重组质粒进行了检测，分别为CRF07_BC(GenBank:KC492737.1)、CRF08_BC(GenBank:KF835534.1)、CRF01_AE(GenBank：JX112829.1)、B(GenBank:KU724103.1)、CRF55_01B(GenBank:MN067522)、CRF85_BC(GenBank:KU992930)、0107(GenBank:KX159285)、BC(GenBank:AY967805)、01BC(GenBank:KF250407)、01C(GenBank:KY200517)，其中前四种即为实施例1中验证的四种亚型，由此克服样本限制问题。通过实施例1中所述的相同合成方法，将SEQ ID NO.12-21示出的pol区片段克隆至pUC57载体上，从而合成10种HIV-1重组质粒。具体检测方法参见实施例3。

使用紫外分光光度计对上述10种亚型的HIV-1重组质粒样本进行定量并换算拷贝数，以十倍倍比稀释后，使用各亚型的六个梯度样本进行检测(10⁰至10⁵拷贝/μL)。检测结果如图11所示。结果表明，本发明所提供的检测方法能够在35分钟内检测出但不限于以上所述10种HIV-1亚型，表现出该方法对多种HIV-1亚型的通用性。在低至10拷贝/μL浓度，上述10种亚型均能成功检出；在低至1拷贝/μL浓度，部分亚型仍可检出，表现出该方法的高灵敏度。此外，由图11的检测结果也可知，在完成RAA扩增反应后，所有检出样本在CRISPR检测反应开始后5个循环时(约5分钟内)的荧光值均已显著超过阈值，由此可知CRISPR检测反应时间可以进一步缩短为5分钟(扩增和检测全过程可缩短至25分钟内完成)，并且不会影响最终检测结果，由此可实现HIV-1的快速检测。

序列表

SEQ ID NO.1：F1引物

GTACARATGGCAGTDTTCATHCACAATTTTAA

SEQ ID NO.2：F2引物

GCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAATT

SEQ ID NO.3：F3引物

ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA

SEQ ID NO.4：F4引物

AARACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCAC

SEQ ID NO.5：F5引物

TAARACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCAT

SEQ ID NO.6：F6引物

GCTGARCAYCTTAARACAGCAGTACARATGGCA

SEQ ID NO.7：R1引物

CTTCACCTTTCCARAGNAGYTTKGCTGGTCCTT

SEQ ID NO.8：R2引物

TACTGCCCCTTCACCTTTCCARAGNAGYTT

SEQ ID NO.9：R3引物

TGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCARA

SEQ ID NO.10：R4引物

CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA

SEQ ID NO.11：荧光探针

GGATTGGGGRRTACAGTGCAGGRGAAAGAATATAGAYATAATAGCAAC

SEQ ID NO.12：B.CN.2013.BJMP3116B的pol基因序列

TACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAGTTAAGGCTGCCTGTTGGTGGGCA

GGGATCAAGCAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAAT

CTATGAATAATGAATTAAAAAAGATTATAGGACAGGTAAGAGACCAGGCTGAACATCT

TAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATT

GGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATAGCAACAGACATACAAACT

AAGGAACTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACA

GCAGAGATCCACTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTCCTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAG

TAGTAATACAACATAACAGTGA

SEQ ID NO.13：CRF07_BC.CN.2005.pXJDC6291的pol基因序列

TTCACCAGTGCTGCAGTTAAGGCAGCCTGTTGGTGGGCAGGTATCCAACAGGAATTTG

GAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAGGGAGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAA

GAAAATTATAGGGCAGGTAAGAGATCAAGCTGAGCACCTTAAGACAGCAGTACAAAT

GGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGG

GAAAGAATAATAGATATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAA

ATTATAAAAATTCAAAATTTCCGGGTTTATTACAGAGACAGCAGAGACCCCATTTGGA

AAGGACCAGCCAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATA

GTGACATAAAGGTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGATTATGGAAAAC

AGATGGCAGGTGCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGA

SEQ ID NO.14：CRF08_BC.CN.2007.07CNYN355的pol基因序列

GCAGGTGTCCACCAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAGGGAGTAGTAG

AATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGGCAGGTAAGAGATCAAGCTGAGC

ACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGG

GATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACA

AACAAGAGAATTACAAAAACAAATTATAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGA

GACAGCAGAGACCCCATTTGGAAAGGACCAGCCAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGG

GCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAGGTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAA

ATCATTAAGGACTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAGGTAGACAGG

ATGAAGATTAGAACATGGAATAGTTTAGTAAAACACCATA

SEQ ID NO.15：CRF01_AE.CN.2007.GX070003的pol基因序列

ATCCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGGGTAGTAGAATCCATGAATAAGGAATTAAAGA

AAATCATAGGGCAGATAAGAGAGCAAGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGG

CAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGA

AAGAATAATAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAAT

TACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACCCAATTTGGAAA

GGACCAGCAAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGT

GATATAAAAGTAGTACCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATTAGGGATTATGGAAAACAG

ATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAGGATTAGAACATGGAACAGT

TTAGTAAAACATCATATGTACATCTCAAAGAAAGCTAAAA

SEQ ID NO.16：01BC(KF250407)的pol基因序列

TGCAGCCAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAGCAGGAATTTGGAATTCCCTAC

AATCCCCAAAGTCAGGGAGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAG

GGCAGGTAAGAGACCAAGCAGAGCACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCA

TTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAA

TAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAACTACAAAAACAAATTACAAAAA

TTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAACAGAGATCCACTTTGGAAAGGACCAGC

AAAGCTTCTTTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAACAGTGACATAAA

AGTAGTGCCAAGAAGAAAAGCAAAAATCATCAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGG

GGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAGAACA

SEQ ID NO.17：01C(KY200517)的pol基因序列

TGCAGTTAAAGCAGCCTGTTGGTGGGCCAATGTCCGACAGGAATTTGGAATTCCCTAC

AATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAGGAATTAAAGAAAATCATAG

GGCAGGTAAGAGAGCAAGCTGAACACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCAT

TCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGAGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAAT

AGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAACTACAAAAACAAATTACAAAAAT

TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGCA

AAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGTGATATAAAA

GTAGTACCAAGAAGAAAAGCGAAGATCATCAGAGATTATGGAAAACAGATGGCAGGT

GATGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAGAATTAGAACA

SEQ ID NO.18：CRF85_BC(KU992930)的pol基因序列

TGCAGTTAAGGCAGCCTGCTGGTGGGCAGGTATCCATCAGGAATTTGGAATTCCCTAC

AATCCCCAAAGTCAGGGGGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAG

GGCAGGTAAGAGATCAAGCTGAGCACCTTAAAACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCAT

TCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAAT

AGATATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAGATTACAAAAAT

TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGAGACAGCAGAGACCCCAGTTGGAAAGGACCAGCC

AAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAG

GTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGACTATGGAAAACAGATGGCAGGT

GCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAAGATTAGAACASEQ ID NO.19：0107(KX159285)的pol基因序列

TGCAGTTAAGGCAGCCTGTTGGTGGGCAGGTCTCCAACAAGAATTTGGAATTCCCTAC

AATCCCCAGAGTCAGGGAGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAG

GGCAGGTAAGAGATCAAGGTGAGCACGTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCAT

TCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAAT

AGACATAATAGCAACAGACATACAAAATAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAAT

CCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGAGACAGCAGAGACCCCAGTTGGAAAGGACCAGCC

AAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGTGACATAAAG

GTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGACTATGGAAAACAGATGGCAGGC

GCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAAGATTAGAACASEQ ID NO.20：BC(AY967805)的pol基因序列

TTCGGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAACAGGAATTTGGCATTCCCTAC

AATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAG

GACAGATAAGAGATCAAGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCAT

CCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGATACAGTGCAGGGGAAAGAATAGT

AGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAGAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAAT

TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACCCCATTTGGAAAGGACCAGCC

AAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAG

GTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGACTATGGAACACAGATGGCAGGT

GCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAAGATTAGAACASEQ ID NO.21：CRF55_01B(MN067522)的pol基因序列

TGCAGTCAAAGCAGCCTGTTGGTGGGTCAATGTCCAACAGGAATTTGGGATCCCCTAC

AATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAGGAATTAAAGAAAATCATAG

GACAGGTAAGAGAGCAAGCTGAACACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCAT

TCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGATACAGTGCAGGGGAAAGAATAAT

AGACATAATAGCAACAGACATGCAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAAT

TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAATTTGGAAAGGACCAGCA

AAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGTGATATAAAA

GTAGTACCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATTAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGT

GATGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAGGATTAGAACA

SEQ ID NO.22：crRNA1

AAUUUCUACUCUUGUAGAUGGGUUUAUUACAGRGACARCAGAGA

SEQ ID NO.23：crRNA2

AAUUUCUACUCUUGUAGAUUAUGUCUGUUGCUAUUAURUC

SEQ ID NO.24：crRNA3

AAUUUCUACUCUUGUAGAUCCCUGCACUGUACCCCCCAAUCC

SEQ ID NO.25：crRNA1中包括的靶向特异性序列

GGGUUUAUUACAGRGACARCAGAGA

SEQ ID NO.26：crRNA2中包括的靶向特异性序列

UAUGUCUGUUGCUAUUAURUC

SEQ ID NO.27：crRNA3中包括的靶向特异性序列

CCCUGCACUGUACCCCCCAAUCC

SEQ ID NO.28：重复序列

AAUUUCUACUCUUGUAGAU

SEQ ID NO.29：重复序列

UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU

Claims

1.一种用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a用crRNA，所述crRNA从5’端到3’端依次为重复序列和靶向特异性序列，其中所述靶向特异性序列包含选自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的核酸序列：

SEQ ID NO.25：GGGUUUAUUACAGRGACARCAGAGA；

SEQ ID NO.26：UAUGUCUGUUGCUAUUAURUC；

SEQ ID NO.27：CCCUGCACUGUACCCCCCAAUCC；

优选地，所述重复序列为SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.29所示的序列；

更优选地，所述crRNA是SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SE Q ID NO.24所示的crRNA：

SEQ ID NO.22：AAUUUCUACUCUUGUAGAUGGGUUUAUUA CAGRGACARCAGAGA；

SEQ ID NO.23：AAUUUCUACUCUUGUAGAUUAUGUCUGUU GCUAUUAURUC；

SEQ ID NO.24：AAUUUCUACUCUUGUAGAUCCCUGCACUGU ACCCCCCAAUCC。

2.一种用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a***，包括：

1)Cas12a蛋白，例如FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a蛋白，以及

2)权利要求1所述的crRNA中的一个、两个或三个，优选为三个。

3.权利要求1所述的CRISPR-Cas12a用crRNA或权利要求2所述的用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a***用于制备艾滋病诊断试剂的用途；

优选地，所述crRNA或所述CRISPR-Cas12a***中包含的crRNA为等比存在的三个crRNA，优选等比存在的SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的crRNA。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述crRNA或CRISPR-Cas12a***还与用于扩增HIV-1核酸的引物组联合用于制备艾滋病诊断试剂，所述引物组包括：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)，以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)；

优选地，所述扩增是重组酶介导扩增反应；

任选地，所述crRNA或CRISPR/Cas12a***进一步与荧光淬灭报告分子联合用于制备艾滋病诊断剂；例如，所述荧光淬灭报告分子是5’端经由荧光报告基团如FAM、HEX等荧光团标记、3’端经由荧光淬灭基团如Iowa

FQ quencher标记的单链DNA。

5.一种检测HIV-1的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：

(1)提供HIV-1核酸样本；

(2)配制CRISPR-Cas12a检测混合液，包括：

a)Cas12a蛋白，例如FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a蛋白，以及权利要求1所述的crRNA中的一个、两个或者三个，优选为三个；或者

b)权利要求2所述的用于检测HIV-1的CRISPR-Cas12a***；

优选地，所述crRNA或所述CRISPR-Cas12a***中包含的crRNA为等比存在的三个crRNA，优选等比存在的SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的crRNA；

(3)对所述HIV-1核酸样本进行扩增反应，得到扩增产物；

(4)使所述扩增产物与所述CRISPR-Cas12a检测混合液混合并反应，并通过荧光淬灭报告分子的荧光发光情况来确定是否存在HIV-1；例如，所述荧光淬灭报告分子可以是5’端经由荧光报告基团如FAM、HEX等荧光团标记、3’端经由荧光淬灭基团如Iowa

FQ quencher标记的单链DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述三种crRNA等比存在，并且其工作浓度为0.17-0.33μM，优选为0.17μM，所述Cas12a蛋白的工作浓度为0.17-0.33μM，优选为0.33μM。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，在所述扩增反应中使用以下引物组：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)，以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)；

优选地，所述扩增反应是重组酶介导扩增反应；

更优选地，所述扩增反应中的每种引物的工作浓度为0.2-1.0μM，优选0.4-0.8μM，更优选0.6μM。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，所述扩增反应在37℃至41℃、优选在41℃进行至少20分钟。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：在步骤(3)的扩增反应开始前，将所述CRISPR-Cas12a检测混合液预先放置于在步骤(3)中用于扩增反应的反应管中与扩增反应体系相分离之处如管盖中，并在步骤(3)的扩增反应结束后，使所述CRISPR-Cas12a检测混合液与所述扩增产物混匀以进行检测。

10.一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)权利要求1所述的CRISPR-Cas12a用crRNA和Cas12a蛋白(例如FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a蛋白)，或者权利要求2所述的CRISPR-Cas12a***；

b)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明书；以及

c)任选地，用于扩增HIV-1核酸的引物组：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)，以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)；

所述扩增优选为重组酶介导扩增；

d)任选地，荧光淬灭报告分子；优选地，所述荧光淬灭报告分子可以是5’端经由荧光报告基团如FAM、HEX等荧光团标记、3’端经由荧光淬灭基团如Iowa

FQ quencher标记的单链DNA。