CN116426648A - 一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合及其qRCR引物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于外泌体鉴定技术领域，公开了一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合及其qPCR引物，本发明通过对干细胞外泌体进行microRNA高通量测序分析发现，干细胞外泌体中含量最丰富的microRNA为：miR125b‑1、miR‑183、miR‑17‑3p。因此该miRNA组合可以作为鉴定干细胞外泌体的miRNA组合。此三种miRNA与干细胞外泌体抗炎、抗衰老相关，提取miRNA的外泌体的用量极低(仅2E8个外泌体颗粒)。同时设计了针对该miRNA组合的qPCR引物，三个引物的特异性强，可用于qPCR方法中鉴别干细胞外泌体。
Description
技术领域
本发明属于外泌体鉴定技术领域，更具体的，涉及一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合及其qPCR引物。
背景技术
外泌体是由脂质双层组成，外泌体表面含有多种跨膜蛋白质，脂质双层膜内含有多种核酸，包括RNA和DNA。外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。
近年来，由于miRNAs在调节参与重要细胞过程的靶基因调控网络中的作用，研究已经开始强调它的重要性，包括EV分泌的miRNAs。这些miRNA是由21-24个核苷酸组成的非编码调控RNA，它们通过与目标信使RNA(mRNA)的3’非翻译区(3’UTR)结合，在转录后基因表达中发挥重要作用，从而导致mRNA降解或抑制翻译。每个miRNA都可以调节干细胞基因调节网络中的数百个mRNA靶标，并且已经显示出可以调节和控制各种干细胞的功能，包括其自我更新、分化、衰老、诱导多能性和重新编程的能力。此外，某些miRNA控制细胞命运的决定、转分化和谱系转换，因此在衰老过程中起着至关重要的作用。
目前，对于干细胞外泌体的鉴定主要通过以下几个方面体现：1、蛋白质含量：通过ELISA和十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对外泌体中特定蛋白质进行定性和定量分析。或者使用传统的BCA蛋白质测定试剂盒的方法用于蛋白质定量。2、表面标志物鉴定：利用外泌体表面标志物的抗体进行标记，然后使用流式细胞术量化来自外泌体的标志物蛋白(如CD9、CD63和CD81)，目前厦门福流生物的纳米流式仪应用较为广泛。3、外泌体的物理化学性质：如粒径和浓度和形态，可以使用NanoSight仪器或调谐阻式脉冲传感技术(TRPS)对外泌体进行浓度和粒径分析，透射电子显微镜(TEM)用来观察外泌体的形态和大小。4、内含物鉴定：利用qPCR方法鉴定外泌体内某些miRNA，多用于开发癌症早期诊断的试剂盒。
现有蛋白定量方法，只能对表面标志物进行定量分析，不同来源的外泌体，表面标志物差别不明显，外泌体质量和活性与表面标志物没有特定的关系；外泌体粒径、浓度和形态的检测灵敏度低，检测需要的外泌体量大，外泌体活性与这些指标之间也未建立标准的特定关系。外泌体miRNA内含物鉴定研究较少，尤其是针对干细胞外泌体的抗炎和衰老相关的miRNA，缺乏特异性鉴别的qPCR引物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定所述干细胞外泌体miRNA组合的引物组。
本发明的第三个目的是提供一种用于鉴定所述干细胞外泌体miRNA组合的试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合，该miRNA组合包括miR125b-1、miR-183、miR-17-3p。
本发明通过对干细胞外泌体进行microRNA高通量测序分析发现，干细胞外泌体中含量最丰富的microRNA为：miR125b-1、miR-183、miR-17-3p。因此该miRNA组合可以作为鉴定干细胞外泌体的miRNA组合。
本发明还提供一种用于鉴定所述干细胞外泌体miRNA组合的引物组，所述引物组的序列如SEQ ID NO：1-3所示。
本发明还提供一种用于鉴定所述干细胞外泌体miRNA组合的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组。
本发明还提供一种利用所述试剂盒进行qPCR的方法。
优选的，所述的方法，包括以下步骤：
S1、从干细胞外泌体重提取miRNA；
S2、以S1得到的miRNA为模板，在同一反应体系中完成加尾和反转录；所述反应体系中权利要求2所述的引物组；
S3、反转录得到的cDNA用于qPCR检测。
更优选的，S2所述反应体系为：total RNA7μL、Trans 
mi RNART EnzymeMix 1μL、2×TS miRNAReaction Mix 10μL、RNase-free Water 3μL，总体积为20μL。
更优选的，S3反转录的条件为：25℃5分钟，50℃45分钟，85℃5分钟。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对干细胞外泌体进行microRNA高通量测序分析发现，干细胞外泌体中含量最丰富的microRNA为：miR125b-1、miR-183、miR-17-3p。因此该miRNA组合可以作为鉴定干细胞外泌体的miRNA组合。此三种miRNA与干细胞外泌体抗炎、抗衰老相关，提取miRNA的外泌体的用量极低(仅2E8个外泌体颗粒)。同时设计了针对该miRNA组合的qPCR引物，三个引物的特异性强，可用于qPCR方法中鉴别干细胞外泌体。
附图说明
图1为纳米流式仪检测外泌体粒径和浓度；
图2为干细胞外泌体的抗炎活性；
图3为qPCR检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1干细胞外泌体提取与活性验证
外泌体从脐带间充质干细胞上清中利用超速离心的方法提取，提取后外泌体用纳米流式仪检测浓度和囊泡纯度。
提取方法：
取20ml间充质干细胞上清，10000g离心30分钟后取上清液，100000g离心90分钟，弃沉淀，上清用1ml 1×PBS重悬混匀，即得到外泌体。
纳米流式仪检测条件：取50μl外泌体样品，上机检测，记录60s内的颗粒数，保存报告，软件根据浓度标准品和颗粒标准品的数据计算出外泌体样品的粒径和浓度。
结果如图1所示，左图为外泌体样品的粒径范围(干细胞外泌体的粒径基本都在50-150nm范围内)。
用得到的干细胞外泌体处理human PBMC细胞。而后收集上清，利用ELISA的手段，检测不同处理条件下，PBMC细胞分泌IFN-γ的水平。处理条件：不同浓度的干细胞外泌体与human PBMC细胞孵育24h，收集细胞上清，用ELISA检测IFN-γ分泌量。结果显示本发明得到的干细胞外泌体具有抗炎作用，能够减少IFN-γ的分泌(图2)。
实施例2建立检测干细胞外泌体质量的qPCR方法
干细胞外泌体进行microRNA高通量测序，过程如下：利用microRNA检测试剂盒提取microRNA，然后通过二代测序(NGS)实现miRNA精确定量。结果发现干细胞外泌体中含量最丰富的microRNA为：miR125b-1、miR-183、miR-17-3p。
设计并合成miR125b-1、miR-183、miR-17-3p的qPCR引物序列，如表1、表2、表3。
表1miR125b-1的qPCR引物序列
表2miR-183的qPCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'--3') |
| miR-183-1 | CCGCAGAGTGTGACTCCTGT |
| miR-183-2 | AGCAGAGACAGATCCACGA |
| miR-183-3 | CACTGTGAACAGTCTCAGTCA |
| miR-183-4 | ACTGGTAGAATTCACTGTGAAC |
表3miR-17-3p的qPCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'--3') |
| miR-17-3p-1 | GTCAGAATAATGTCAAAGTGC |
| miR-17-3p-2 | ACTGCAGTGAAGGCACTTGTA |
| miR-17-3p-3 | AAAGTGCTTACAGTGCAGGTA |
为了验证测序数据的准确性，本试验采用Poly(A)加尾和q PCR进行试验。
取1×109个干细胞外泌体样品提，利用miRNA提取试剂盒从中提取microRNA，以此为模板，在同一反应体系中用Trans
mi RNART Enzyme Mix(包含加尾酶和反转录酶)、2×TS mi RNAReaction Mix一步完成高效加尾和合成第一链cDNA。Poly(A)加尾和反转录在同一反应体系中完成。取RNA样品，按照试剂盒说明配制20μL反应体系(冰上操作)，体系轻轻混匀，37℃孵育1小时，85℃加热5s失活RT Enzyme Mix。反转录后得到的cDNA用于qPCR检测，反转录条件：25℃5分钟，50℃45分钟，85℃5分钟；反转录体系如表4所示。
表4反转录体系
表5Cq值比较
qPCR方法可以检测到干细胞外泌体中的miR125b-1、miR-183、miR-17-3p，此三种miRNA与干细胞外泌体抗炎、抗衰老相关，提取miRNA的外泌体的用量极低(仅2E8个外泌体颗粒)，由qPCR检测峰图(图3)和Cq值(表5)得出，miR125b-1-3、miR-183-4、miR-17-3p-3三种引物的特异性强，可用于qPCR方法中鉴别干细胞外泌体。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种用于鉴定干细胞外泌体的miRNA组合，其特征在于，该miRNA组合包括miR125b-1、miR-183、miR-17-3p。
2.一种用于鉴定权利要求1所述干细胞外泌体miRNA组合的引物组，其特征在于，所述引物组的序列如SEQ ID NO：1-3所示。
3.一种用于鉴定权利要求1所述干细胞外泌体miRNA组合的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组。
4.一种利用权利要求3所述试剂盒进行qPCR的方法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从干细胞外泌体重提取miRNA；
S2、以S1得到的miRNA为模板，在同一反应体系中完成加尾和反转录；所述反应体系中权利要求2所述的引物组；
S3、反转录得到的cDNA用于qPCR检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S2所述反应体系为：totalRNA7μL、Trans
miRNARTEnzymeMix1μL、2×TSmiRNAReactionMix10μL、RNase-freeWater3μL，总体积为20μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S3反转录的条件为：25℃5分钟，50℃45分钟，85℃5分钟。
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