CN116426619A - 一种多重靶核苷酸检测试剂盒及方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多重靶核苷酸检测试剂盒及方法和应用，属于生物技术领域，整个反应体系包括：至少一对特异性引物对，所述特异性引物中部引入1个RNA碱基，引物3'末端被阻断；至少一条阻断探针P，所述阻断探针P 3'端被阻断，靠近3'端部分序列特异性和靶标结合，5'端部分序列是人为引入的标签序列，5'端修饰荧光基团或淬灭基团；人为引入的底物PS：3'端修饰淬灭基团或荧光基团。该方法可在单荧光通道检测3个以上靶标、单管检测十几个乃至二十几个靶标，具有设计难度低、特异性好、灵敏度高和成本较低等优势，具有极高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多重靶核苷酸检测试剂盒及方法和应用。
背景技术
多重荧光定量PCR(Multiple fluorescence quantitative PCR)技术是在荧光定量PCR技术基础上，利用不同通道荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。
Real-time qPCR的化学发光原理可以分为2大类：
一类为基于荧光染料的多重PCR技术，非特异性的荧光染料嵌入到DNA双链小沟中后，在特定的激发光激发后将会产生一定波长的荧光，以此为基础发展了熔解曲线分析法，利用不同DNA序列具有不同Tm值的特征，在PCR反应结束后，通过程序升温使双链逐渐解链成单链，当达到双链特异的解链所对应的温度时，荧光强度大幅度降低，利用这样的原理可以对PCR中不同长度的双链产物或相同长度不同GC含量的双链进行分析。
另一类是标记荧光基团的特异性探针，包括Taqman水解探针和分子信标。TaqMan水解探针(Hydrolysis probes)是多重荧光PCR体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的TaqMan水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。分子信标(Molecular beacon)是多重PCR体系中另一种常用的探针，基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理，当体系中不存在特异性的靶标时，分子信标会自发形成茎环结构，淬灭基团与荧光基团相互接近从而发生FRET，不会产生荧光。如果体系中存在特异性的靶标，在一定的条件下，茎环结构会打开并且与靶标进行复性，从而产生荧光信号。那么在同一个反应体系中加入几种靶标特异性的分子信标就能够实现对多个靶标的同时检测。
由于荧光基团本身发射的不是单一波长的荧光，而且PCR仪对不同荧光基团发射的荧光信号的区分度有限，所以现有的PCR仪只能检测4–5种不同的荧光信号。而基于荧光染料的多重PCR技术由于染料不具备特异性的识别能力，所以同一反应体系中通常只能使用一种荧光染料。因此目前基于探针法的常规RT-PCR检测试剂盒，在一管反应体系内多数产品只对最多4个靶标进行扩增检测。虽然目前也有一些多重靶标扩增的技术方法，但是通常需要在一管体系中引入多条引物及探针，同一体系中存在大量引物片段会导致引物二聚体的***性增长，同时带来非常高的非特异及假阳性检出风险，并且对引物设计和预混体系长期稳定性方面带来极大的挑战。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种多重靶核苷酸检测技术及应用，解决目前荧光定量PCR平台通量低、多重扩增引物二聚体及非特异性扩增等缺点，为临床提供一种检测通量高、多重检测能力强、特异性高和成本低廉的多重PCR检测方法，可广泛应用于各种感染性疾病的检测。
本发明的多重靶核苷酸检测方法，体系中无开放性3'末端，只有当靶标序列存在时，才能启动引物延伸，消除引物二聚体的形成，减少非特异性扩增，降低了引物设计难度并提高了整个检测流程的特异性。
本发明中，“Tm值”指dsDNA解链到一半时的温度。
本发明中，所有涉及的范围值均包括端点值。
一方面，本发明提供了一种多重靶核苷酸检测试剂盒。
所述的试剂盒为实时荧光PCR试剂盒。
所述的试剂盒中包括：
(1)至少一对特异性引物对：特异性引物的中部引入1个RNA碱基，引物3'末端被阻断；
(2)至少一条阻断探针P：3'端被阻断，靠近3'端部分序列特异性和靶标结合，5'端为标签序列，5'端修饰荧光基团或淬灭基团；
(3)人为引入的底物PS：3'端修饰淬灭基团或荧光基团。
所述的阻断为添加阻断基团。
优选地，所述的试剂盒中还包括：
(4)有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性的热稳定的Taq DNA聚合酶；
(5)特异性切割RNA和DNA杂合链的RNA碱基的核酸内切酶。
优选地，所述的Taq DNA聚合酶为从嗜热细菌水生栖热菌(thermus aquaticus)中分离出的DNA聚合酶。
优选地，所述的核酸内切酶为耐热RNase HII，来源于人工改造后的嗜热细菌(Thermus thermophilus、Pyrococcus abyssi)。根据反应温度不同，可以使用不同的RNaseHII。在一些实施方式中，反应温度为50℃-70℃，优选55℃-65℃。
优选地，所述的核酸内切酶的工作浓度为0.5mU/uL-20mU/uL。
所述的阻断探针P与靶标序列结合的位置在特异性引物对之间，且与靶标序列特异性结合的Tm值高于特异性引物。
所述的标签序列在靶标序列存在情况下被聚合酶切割下来，并与底物PS结合并进行延伸，生成熔解曲线分析中与底物PS Tm值相关的特征熔解峰。
所述特异性引物序列长度介于16bp-30bp包括端点值，Tm值介于45℃-65℃包括端点值。优选地，所述的特异性引物序列长度介于17bp-30bp、18bp-30bp、19bp-30bp、20bp-30bp、23bp-30bp、25bp-30bp、28bp-30bp、16bp-18bp、16bp-20bp、16bp-25bp；Tm值介于45℃-55℃、55℃-65℃、50℃-65℃、50℃-60℃、48℃-62℃、52℃-63℃、52℃-60℃、55℃-63℃或45℃-65℃。
所述阻断探针P与靶标结合的序列长度介于20bp-35bp包括端点值，Tm值介于55℃-75℃包括端点值。优选地，所述的阻断探针P与靶标结合的序列长度介于20bp-35bp、22bp-35bp、23bp-35bp、25bp-35bp、28bp-35bp、32bp-35bp、20bp-28bp或22bp-26bp；Tm值介于60℃-75℃、65℃-75℃、70℃-75℃、68℃-75℃、55℃-65℃、55℃-70℃、58℃-66℃或62℃-73℃。
所述阻断探针P带有的标签序列长度在5bp-25bp包括端点值，Tm值介于20℃-45℃包括端点值。优选地，所述阻断探针P带有的标签序列长度在8bp-25bp、10bp-25bp、12bp-25bp、15bp-25bp、19bp-25bp、22bp-25bp、24bp-25bp、5bp-15bp、8bp-29bp或17bp-19bp；Tm值介于25℃-45℃、28℃-45℃、32℃-45℃、35℃-45℃、38℃-45℃、20℃-38℃、26℃-40℃、28℃-38℃、28℃-32℃或30℃-32℃。
所述底物PS的序列长度介于10bp-70bp包括端点值，Tm值介于50℃-90℃包括端点值。优选地，所述的底物PS的序列长度介于20bp-70bp、30bp-70bp、40bp-70bp、50bp-70bp、60bp-70bp、10bp-20bp、10bp-50bp、20bp-50bp或30bp-40bp；Tm值介于60℃-90℃、70℃-90℃、80℃-90℃、50℃-60℃、50℃-70℃、50℃-80℃、55℃-85℃、68℃-82℃、75℃-80℃或78℃-83℃。
优选地，所述阻断探针P 5'端和底物PS 3'端的标记荧光基团选自FAM，VIC，TET，CAL Gold 540，JOE，HEX，TAMRA，ROX，CY3，CY5，标记的淬灭基团选自DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、ECLIPE。
优选地，所述的特异性引物和阻断探针P的3'端所标记的阻断基团选自：磷酸基，BHQ1，BHQ2，BHQ3，C3 Spacer，Spacer 9，3'C6 Spacer，dSpacer，PC Spacer或Spacer 18。
在普通扩增循环中将阻断探针的5'端标记荧光基团或淬灭基团的标签序列切割下来，切割下来的标签序列可与相应的3'端标记淬灭基团或荧光基团的底物特异性结合，并在热稳定Taq DNA聚合酶的作用下延伸，生成荧光淬灭的双链底物。
单通道中通过对应的不同Tm值的荧光淬灭的双链产物在熔解曲线中不同位置的特征峰进行不同靶标的区分。所述的熔解曲线程序为：95℃保持2min，50℃保持2min，然后在50℃-85℃以0.02℃/s-0.2℃/s的升温速度采集荧光信号。
优选地，所述的试剂盒为联合检测食源性病原菌的试剂盒，所述食源性病原菌类型包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属、小肠耶尔森氏菌中的一种或多种。
进一步优选地，所述的试剂盒中引物序列选自SEQ ID NO.1-12。
进一步优选地，所述的试剂盒中探针P的序列选自SEQ ID NO.13-18。
进一步优选地，所述的试剂盒中底物PS的序列选自SEQ ID NO.19-24。
优选地，所述的试剂盒为联合检测下呼吸道病原菌的试剂盒，所述下呼吸道病原菌包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌中的一种或多种。
进一步优选地，所述的试剂盒中的引物序列选自SEQ ID NO.25-36。
进一步优选地，所述的试剂盒中探针P的序列选自SEQ ID NO.37-42。
进一步优选地，所述的试剂盒中底物PS的序列选自SEQ ID NO.43-48。
另一方面，本发明提供了一种多重靶核苷酸检测方法。
所述的检测方法通过前述的试剂盒完成。
所述的检测方法中PCR反应程序设置如下：
再一方面，本发明提供了前述的试剂盒在检测食源性病原菌的应用。
所述食源性病原菌类型包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属、小肠耶尔森氏菌中的一种或多种。
优选地，所述的检测方法中多重PCR检测所需引物的序列选自SEQ ID NO.1-12。
优选地，所述的检测方法中多重PCR检测所需阻断探针P的序列选自SEQ IDNO.13-18。
优选地，所述的检测方法中多重PCR检测所需底物PS的序列选自SEQ ID NO.19-24。
优选地，所述的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌O157为同一通道检测，共用FAM荧光基团标记，单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属及小肠耶尔森氏菌为同一通道检测，共用VIC荧光基团标记。
又一方面，本发明提供了前述的试剂盒在检测下呼吸道病原菌中的应用。
所述的下呼吸道病原菌包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌中的一种或多种。
优选地，所述的检测方法中多重PCR检测所需引物的序列选自SEQ ID NO.25-36。
优选地，所述的检测方法中多重PCR检测所需阻断探针P的序列选自SEQ IDNO.37-42。
优选地，所述的检测方法中多重PCR检测所需底物PS的序列选自SEQ ID NO.43-48。
优选地，所述的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌为同一通道检测，探针5'端共用BHQ3淬灭基团标记，底物3'端共用CY5荧光基团标记；所述的流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌为同一通道检测，探针5'端共用BHQ2淬灭基团标记，底物3'端共用ROX荧光基团标记。
本发明技术原理：核酸内切酶在特异性引物和靶标序列结合时特异性切割RNA碱基，生成可延伸的特异性引物，延伸过程中热稳定的Taq DNA聚合酶将阻断探针的5'端标记荧光基团的标签序列切割下来，切割下来的标签序列3'端为游离羟基，可与相应的3'端标记淬灭基团的底物的3'端部分序列特异性结合，并在热稳定Taq DNA聚合酶的作用下延伸，生成荧光淬灭的双链底物。
然后在熔解曲线升温阶段，随着温度的升高，荧光淬灭的双链底物在其Tm值附近双链解离分开，从而荧光基团远离淬灭基团产生荧光信号，生成一个熔解曲线负特征峰，利用不同Tm值大小的熔解曲线负特征峰的位置不同，将单管检测同一荧光基团标记的不同靶标基因显著区分开来。
本发明的有益效果：
(1)本发明的多重PCR检测方法是在类似普通Taqman探针法中将探针5'端标记荧光基团或淬灭基团的标签序列切割下来，3'端带有游离可延伸的羟基，其与3'端带有淬灭基团或荧光基团修饰的底物结合生成双链淬灭产物，通过对探针和底物的特殊设计，使不同靶标之间的熔解峰得到有效区分，解决了目前荧光定量平台的通量限制问题，从而简化实验操作，降低检测成本，实现在单管中更多重的检测。
(2)本公开同一通道不同靶标区分的关键在于具有不同Tm值的底物，方案设计难度低，容易实现。
(3)本公开检测方法的特异性更强，除了有引物探针本身的特异性，还有切割下来的标签序列与对应底物的特异性，背景信号干净，判读清晰简单。
(4)本公开检测方法灵敏度高，抗干扰能力强，检测速度快时间短，60-80min内即可完成整个检测流程。
(5)本公开旨在突破荧光定量平台检测通量的瓶颈，单通道可实现3重以上靶标的检测，单管可实现十几重乃至二十几重的靶标检测。
附图说明
图1为临床样本1用传统Taqman水解探针法的测试结果图。
图2为临床样本1用本公开方法的测试结果图。
图3为本发明方法单管检测食源性病原菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属、小肠耶尔森氏菌的阳性检测结果。
图4为本发明方法单管检测食源性病原菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属、小肠耶尔森氏菌的NTC结果。
图5为本发明方法检测铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌共六个模拟样本的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种多重靶核苷酸检测方法
本实施例通过多重PCR检测食源性病原菌。
本实施例所用引物为带有RNA碱基修饰的阻断引物，探针P的3'端被阻断，探针P的5'端修饰的是荧光基团，底物PS的3'端修饰的是淬灭基团。
(1)根据沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属、小肠耶尔森氏菌的对应的基因序列，利用oligo 7.0软件设计特异性的检测引物，相关具体序列如下：
注：序列下划线的小写字母表示该处碱基为RNA碱基，如g表示该处为碱基为G的核糖核苷酸，序列其他部分为脱氧核糖核苷酸，C3为阻断基团C3 Spacer。
(2)将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌O157靶标的荧光阻断探针5'端共同标记为FAM；将单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属及小肠耶尔森氏菌靶标的荧光阻断探针5'端共同标记为VIC；6个位点3'端共同标记C3 Spacer。且阻断探针分为两部分，靠近5'端荧光标签部分序列可以和底物靠近3'端部分序列反向互补，靠近3'端阻断标记部分序列可以和靶标序列特异性结合，且位置在靶标相应特异性引物之间，阻断探针序列如下：
(3)将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属及小肠耶尔森氏菌靶标的底物3’端共同标记BHQ1。底物靠近3'端淬灭基团部分序列可与5'端荧光标签部分序列反向互补，底物序列如下：
应当说明的是，在本实施例中，使用的荧光基团包括VIC、FAM，使用的阻断基团包括C3 Spacer，使用的淬灭基团包括BHQ1，而在其它实施例中，使用的荧光基团还可以是ROX、CY5等，使用的阻断基团还可以是Spacer 9，C6 Spacer等，使用的淬灭基团还可以是BHQ2、BHQ3、MGB等。
(4)采集临床食品样本，利用商品化的核酸提取试剂盒提取基因组DNA，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNA OD260/OD280的值应在1.8-2.0，浓度应在5-50ng/μL之间，样本DNA质检不合格不得用于检测，DNA质检合格后，在20℃条件下保存提取的样本DNA作为备用。
(5)根据待检样本数量来计算配置反应数，如样本数为n，则需做n+2个反应(包含一个阳性对照反应和一个无模板对照反应)，需要额外多配置1-2个反应，配制反应体系混合液，分装至PCR管中，每管15μL，另外加入5μL模板，具体PCR扩增反应体系如下表所示：
其中10×引物探针Mix成分如下：
(6)将PCR反应管置于实时荧光PCR仪上进行测试，反应程序设置如下表所示：
(7)根据靶标基因熔解峰的位置判定结果，各个目标熔解峰位置如下：
(8)选取一个临床样本1，分别使用传统Taqman水解探针法和本公开方法对临床样本1的食源性病原菌的检测，结果如图1和图2。结果表明：临床样本中存在两种食源性病原菌，分别是单核细胞增生性李斯特菌和弧菌，两种检测方法结果一致。然而传统Taqman水解探针法需要两管检测，而本发明检测方法可以在一管中实现6重的检测。
实施例2多重检测下呼吸道病原菌。
参照实施例1的方法对下呼吸道病原菌铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌进行试剂盒设计。
与实施例1除了应用方向不同，还有探针P的5'端修饰的是淬灭基团，底物PS的3'端修饰的是荧光基团。
(1)根据铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌的对应的基因序列，利用oligo 7.0软件设计特异性的检测引物，相关具体序列如下：
注：序列下划线的小写字母表示该处碱基为RNA碱基，如g表示该处为碱基为G的核糖核苷酸，序列其他部分为脱氧核糖核苷酸，dSpacer为阻断基团。
(2)将病原菌铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌靶标的荧光阻断探针5'端共同标记为BHQ3；将流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌靶标的荧光阻断探针5'端共同标记为BHQ2；6个位点3’端共同标记dSpacer。且阻断探针分为两部分，靠近5'端荧光标签部分序列可以和底物靠近3'端部分序列反向互补，靠近3'端阻断标记部分序列可以和靶标序列特异性结合，且位置在靶标相应特异性引物之间，阻断探针序列如下：
(3)将病原菌铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌靶标底物3'端共同标记为CY5；将流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌靶标底物3'端共同标记为ROX。底物序列如下：
(4)从生工生物工程(上海)股份有限公司合成铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌共六个模拟质粒样本，单重检测结果如图5。结果表明，本发明技术方法在下呼吸道病原菌检测上可以实现多重检测，同一个荧光通道靶标间可以明确区分。根据靶标基因熔解峰的位置判定结果，各个目标熔解峰位置如下：
以上所揭露的仅为本申请一些优选的实施例，不能以此来限定本申请之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本申请权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (14)
1.一种多重靶核苷酸检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)至少一对特异性引物对：特异性引物中部引入1个RNA碱基，引物3'末端被阻断；
(2)至少一条阻断探针P：3'端被阻断，靠近3'端部分序列特异性和靶标结合，5'端部分序列为标签序列，5'端修饰荧光基团或淬灭基团；
(3)底物PS：3'端修饰淬灭基团或荧光基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应体系中还包括一个有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性的热稳定的Taq DNA聚合酶和一个热稳定的特异性切割RNA和DNA杂合链的RNA碱基的核酸内切酶。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阻断探针P与靶标序列结合的位置在特异性引物对之间，且与靶标序列特异性结合的Tm值高于特异性引物。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物序列长度介于16bp-30bp包括端点值，Tm值介于45℃-65℃包括端点值。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阻断探针P与靶标结合的序列长度介于20bp-35bp包括端点值，Tm值介于55℃-75℃包括端点值。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阻断探针P带有的标签序列长度在5bp-25bp包括端点值，Tm值介于20℃-45℃包括端点值。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述底物PS的序列长度介于10bp-70bp包括端点值，Tm值介于50℃-90℃包括端点值。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阻断探针P 5'端和底物PS 3'端标记的荧光基团为FAM，VIC，TET，CAL Gold 540，JOE，HEX，TAMRA，ROX，CY3，CY5中的一种或多种，标记的淬灭基团为DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、ECLIPE中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，特异性引物和阻断探针P的3'端所标记的阻断基团选自：磷酸基，BHQ1，BHQ2，BHQ3，C3 Spacer，Spacer 9，3'C6 Spacer，dSpacer，PC Spacer或Spacer 18。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，核酸内切酶在特异性引物和靶标序列结合时特异性切割RNA碱基，生成可延伸的特异性引物，延伸过程中热稳定的Taq DNA聚合酶将阻断探针的5'端标记荧光基团的标签序列切割下来，切割下来的标签序列可与相应的3'端标记淬灭基团的底物特异性结合，并在热稳定Taq DNA聚合酶的作用下延伸，生成荧光淬灭的双链底物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，单通道中通过对应的不同Tm值的荧光淬灭的双链产物在熔解曲线中的不同熔解峰位置进行不同靶标的区分。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，熔解曲线程序为：95℃保持2min，50℃保持2min，然后在50℃-85℃以0.02℃/s-0.2℃/s的升温速度采集荧光信号。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物选自SEQ ID NO.1-12；所述的阻断探针P的序列选自SEQ ID NO.13-18；所述的底物PS的序列选自SEQ IDNO.19-24；所述的试剂盒为联合检测食源性病原菌的试剂盒，所述食源性病原菌类型包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌O157、单核细胞增生性李斯特菌、弧菌属、小肠耶尔森氏菌中的一种或多种。
14.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物选自SEQ ID NO.25-36；所述的阻断探针P的序列选自SEQ ID NO.37-42；所述的底物PS的序列选自SEQ IDNO.43-48；所述的试剂盒为联合检测下呼吸道病原菌的试剂盒，所述下呼吸道病原菌包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎链球菌中的一种或多种。
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