CN116421733B - 可用于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的疫苗耐热保护剂 - Google Patents

可用于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的疫苗耐热保护剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及疫苗保护剂技术领域，尤其涉及可用于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的疫苗耐热保护剂。按重量份计，疫苗耐热保护剂包括如下组分：海藻糖3~5份、明胶3~5份、胰蛋白胨5~8份、L‑赖氨酸盐酸盐1~3份、L‑天冬氨酸1~2份、甘氨酸1~2份、以及肌醇3~6份。本发明提供的疫苗耐热保护剂可以保证使用其制备的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗能够稳定长期保存，且有效抑制其中活菌数滴度的下降，从而保证猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的免疫效力，同时使得疫苗产品具有良好的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。

Description

可用于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的疫苗耐热保护剂
技术领域
本发明涉及疫苗保护剂技术领域，尤其涉及可用于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的疫苗耐热保护剂。
背景技术
猪多杀性巴氏杆菌病即猪巴氏杆菌病，临床主要表现为最急型、急性型和慢性型等症状。猪巴氏杆菌病，是由多种杀伤性巴氏杆菌所引起的一种急性传染病，带有很强的传染性。通常天气突变、多雨湿冷或高温高湿、转群转栏、饲料改变等应激因素会诱发该病发生。猪巴氏杆菌为细小球杆菌，宽0.25～0.4µm，长0.5～1.5µm。单个存在，有时成双排列。革兰氏染色为阴性。无鞭毛不形成芽孢，无运动性。在血液和组织中的病原菌，用美蓝、瑞氏或姬姆萨液染色镜检，菌体两端着色深，中央着色较浅，呈明显的两极着色特点。新分离的强毒菌株具有荚膜，但在培养基培养时，荚膜迅速消失。
急性猪多杀性巴氏杆菌病主要表现为肺炎症状，体温升高到41℃以上，精神差，食欲减少或废绝，初为干性短咳，后变湿性痛咳，鼻孔流出浆性或脓性分泌物，触诊胸壁有疼痛感，听诊有啰音或摩擦音，呼吸困难，张口吐舌，结膜发绀，皮肤上有红斑，初便秘，后腹泻，消瘦无力，卧地不起，大多4~7天死亡，如不死亡常转为慢性，且本病的发生，无明显的季节性，一年四季都可发生，但以秋末春初及气候骤变的时候发病较多，在南方大多发生在潮湿闷热及多雨季节。猪只的饲养管理不当、卫生条件恶劣、饲料和环境的突然变换及长途运输等，都是本病的诱因。据多年观察，在华北地区，特别是北京地区，很少见有流行性猪肺疫发生，大多呈零星散发，且大多为慢性经过，更多见于继发于其他传染病，如慢性猪瘟、仔猪副伤寒和气喘病的继发病等。
目前对猪多杀性巴氏杆菌病的防治主要依靠疫苗和抗生素，但由于抗生素滥用导致药物耐受，及药物残留影响肉品安全，所以使用抗生物防治猪多杀性巴氏杆菌病措施越来越不可行，疫苗免疫接种被认为是防控猪多杀性巴氏杆菌病最经济及最有效手段，商品化疫苗的推广应用为有效防控猪多杀性巴氏杆菌病发挥了重要作用。为保证疫苗抗原的品质，尤其是减小在生产、运输过程中由于温度快速变化而带来的损耗，发展耐热保护技术则是保证疫苗品质稳定的关键，其中采用合适的耐热保护剂是能够保证疫苗在冷藏条件下得到良好的保存的关键步骤，疫苗耐热保护剂不仅为疫苗的冷链运输和贮藏提供了便利，其关键在于提升了疫苗的效力。
目前，主要使用的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗保护剂成分包括明胶、蔗糖、脱脂奶粉和水，保护剂的组份简单、配制简便，随着疫苗保存环境温度的变化，常常会导致疫苗效力下降或失效，造成免疫失败。此外，现有技术中，CN107929749A公开了一种猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗保护剂，该保护剂由以下重量份的组分制成：明胶30~50份、酪蛋白50~80份、乳糖140~180份、烟酸1~5份和水800~1200份。选用该耐热保护剂配方制成的冻干疫苗在2~8℃条件下放置24个月，以及在37℃条件下保存15天后活菌数量超过原来的90%以上，但是其仅使用家兔进行安全性检验，并没有在实验猪上验证疫苗保护剂的安全性，因此，该疫苗保护剂在实际应用于猪的免疫时的安全性仍然有待检验。
因此提出一种新的可用于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的耐热保护剂成为本领域非常重要的研究课题。
发明内容
本发明提供了一种疫苗耐热保护剂，按重量份计，包括如下组分：
海藻糖3~5份、明胶3~5份、胰蛋白胨5~8份、L-赖氨酸盐酸盐1~3份、L-天冬氨酸1~2份、甘氨酸1~2份、以及肌醇3~6份。
本发明通过大量实验探究发现，选择上述组分复配形成的疫苗耐热保护剂能够针对猪多杀性巴氏杆菌的结构特点，对猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗进行稳定长期的保护，使得疫苗在37℃和2~8℃的不同存储温度下长期存储后仍然具有较高的免疫效力，同时还能够使得猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗产品具有良好的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。
在一些实施方案中，疫苗耐热保护剂还包括表面活性剂1~3份。
优选地，所述表面活性剂为聚山梨酯80。
选择表面活性剂为聚山梨酯80时，聚山梨酯80既可作为表面活性剂，又能够与肌醇配合使用以提高产品的结晶度，更有利于产品在冷冻过程中有效降低病毒或者细菌在低温条件下的冻干损失。
在一些实施方案中，疫苗耐热保护剂还包括非渗透保护剂1~3份。
优选地，所述非渗透保护剂为聚乙烯吡咯烷酮。
选择非渗透保护剂为聚乙烯吡咯烷酮时，其与海藻糖配合使用，其通过与海藻糖间的氢键作用和改变海藻糖的玻璃化温度，能够进一步提升疫苗耐热保护剂的保护效果。
在一些实施方案中，疫苗耐热保护剂还包括水95~105份；优选100份。
优选地，所述水为注射用水。
在一些实施方案中，每100mL所述疫苗耐热保护剂中，包含以下组分：
海藻糖3~5g、明胶3~5 g、胰蛋白胨5~8 g、L-赖氨酸盐酸盐1~3 g、L-天冬氨酸1~2g、甘氨酸1~2 g、肌醇3~6 g、聚山梨酯80 1~3g、以及聚乙烯吡咯烷酮1~3g。
更优选地，每100mL所述疫苗耐热保护剂中，包含以下组分：
海藻糖3~5g、明胶3~5 g、胰蛋白胨6~8 g、L-赖氨酸盐酸盐1~3 g、L-天冬氨酸1~2g、甘氨酸1~2 g、肌醇4~6 g、聚山梨酯80 2~3g、以及聚乙烯吡咯烷酮1~3g。
进一步，本发明提供了上述任一实施方案中疫苗耐热保护剂的制备方法，包括：
配制第一溶液：先将明胶溶于水中得到第一溶解液，然后将海藻糖和肌醇溶于所述第一溶解液得到第二溶解液，而后将表面活性剂和胰蛋白胨依次溶于所述第二溶解液得到所述第一溶液；
配制第二溶液：将L-天冬氨酸、非渗透保护剂、L-赖氨酸盐酸盐、甘氨酸依次溶于水中，调节溶液的pH为7.1~7.5，得到所述第二溶液；
将所述第一溶液与第二溶液混合后制得。
优选地，将所述第一溶液高压灭菌，将所述第二溶液过滤除菌之后，再将所述第一溶液与第二溶液混合。
更优选地，所述高压灭菌的条件为115~120℃灭菌20~30min。
更优选地，所述过滤除菌的滤膜为0.22μm滤膜。
进一步，本发明还提供了一种疫苗的制备方法，包括：
（1）将多杀性巴氏杆菌与上述任一方案所述的疫苗耐热保护剂混合，得到疫苗原液；
（2）将所述疫苗原液冷冻干燥后制得；其中，所述冷冻干燥的条件包括：
预冻阶段：将所述疫苗原液在20min~40min内降温至-20℃~-24℃，保持0.5~1.5h，然后在20min~40min内再次降温至-42℃~-47℃，保持3h~5h；
抽真空阶段：在15min~30min内将真空度降到100mT~130mT；
升华干燥阶段：在1h~2h内将温度升至-22℃~-26℃并维持10h~12h，再在15min~25min内将温度升至-12℃~-18℃并维持8h~10h，最后在20min~30min内将温度升至-1℃~-5℃并维持3h~5h；
解析干燥阶段：将真空度调节至8mT ~12mT，将温度在1h~2h内升高至28℃~30℃，并保温6h~8h。
优选地，步骤（1）中所述多杀性巴氏杆菌的活菌数为12.5×109CFU/mL~13×109CFU/mL。
优选地，在预冻阶段实施前，提前将冻干机预冷至0℃~5℃。
更优选地，冷冻干燥3mL疫苗原液时所述冷冻干燥的条件包括：
预冻阶段：提前将冻干机预冷至0℃，将所述疫苗原液在30min内降温至-22℃，保持1h，然后在30min内再次降温至-45℃，保持4h；
抽真空阶段：在20min内将真空度降到120mT；
升华干燥阶段：在2h内将温度升至-24℃并维持10h，再在20min内将温度升至-15℃并维持10h，最后在20min内将温度升至-3℃并维持5h；
解析干燥阶段：将真空度调节至10mT，将温度在2h内升高至28℃，并保温8h。
更优选地，步骤（1）中，每100mL所述疫苗耐热保护剂中包含以下组分：
海藻糖3~5g、明胶3~5 g、胰蛋白胨5~8 g、L-赖氨酸盐酸盐1~3 g、L-天冬氨酸1~2g、甘氨酸1~2 g、肌醇3~6 g、聚山梨酯80 1~3g、以及聚乙烯吡咯烷酮1~3g；
且多杀性巴氏杆菌的活菌数为12.5×109CFU/mL~13×109CFU/mL，将多杀性巴氏杆菌与疫苗耐热保护剂按照体积比2~3:1混合，得到疫苗原液。
当采用3:1的比例将菌液与疫苗耐热保护剂混匀时，能够节约原辅料成本的同时，增加每瓶疫苗的头份数。
更进一步，本发明提供了一种疫苗，其中含有上述任一实施方案中的疫苗耐热保护剂、或任一实施方案中疫苗耐热保护剂制备方法制备的疫苗耐热保护剂；
或所述疫苗由上述任一实施方案中疫苗的制备方法制得。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明的疫苗耐热保护剂成分简单、原料易得、成本较低，用于制备猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗后使得疫苗在冻干后能够保持原有的理化特性和生理活性，细菌菌液有效成分损失很小，而且在37℃保存7天后以及2~8℃保存24个月后活菌数滴度下降均未超过1*109CFU/mL，可以有效保护猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗在冷冻干燥过程中以及在不同温度变化的运输存储环境下活菌数不被降解，从而使得疫苗能够稳定长期保存且具有较高的免疫效力，同时使得猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗产品具有良好的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。
附图说明
图1是使用实施例1疫苗耐热保护剂配制的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗分装冻干后的照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下实施例中所使用的化学物质包括海藻糖、明胶、L-赖氨酸盐酸盐、聚乙烯吡咯烷酮、L-天冬氨酸、胰蛋白胨、甘氨酸、聚山梨酯80和肌醇；其中，海藻糖购自国药集团化学试剂有限公司；明胶购自Sigma公司；L-赖氨酸盐酸盐购自国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯吡咯烷酮购自沃凯公司；L-天冬氨酸购自国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白胨购自OXOID公司；甘氨酸购自Sigma公司；聚山梨酯80购自上海和大化学品有限公司；肌醇购自国药集团化学试剂有限公司。
以下实施例中所使用到的仪器或菌种包括：高压灭菌柜，压力范围在88kPa~114kPa；菌种为猪多杀性巴氏杆菌EO630弱毒株，由成都药械厂鉴定、保管和供应。
样品的准备：菌液10倍系列稀释：稀释范围为10-1至10-8，操作如下：稀释前将菌液涡旋10秒，然后取菌液1mL，加到9mL含0.1%裂解血球全血及4%健康动物血清的改良马丁琼脂平板上，涡旋混匀10秒，即完成第一次稀释（10-1）；重复以上操作，至稀释度为10-8。释放液体时吸管与试管内壁成30度角，使液体自然放入，吸管不接触液面。每次转移液体时更换吸管。
固体培养基培养：选择适宜的连续三个稀释度（一般为10-6、10-7、10-8），分别用1mL吸管吸取稀释菌液1.0mL，每个稀释度滴3个含0.1%裂解血球全血及4%健康动物血清的改良马丁琼脂平皿。每个平皿准确滴入0.1mL，倾斜转动平皿使菌液散开，在超净台内半敞平皿盖晾干15min~30min，翻转平皿置37℃、5％CO2恒温培养箱内培养24~48h（亦可适当延长）。
菌落计数：观察菌落形态肉眼观察应为菌落较小，表面光滑，呈微蓝色，在低倍显微镜下，45度折光观察，菌落表面有不明显的波纹状结构，边缘整齐，呈不甚鲜明的蓝绿色虹彩，边缘的一部分有狭窄的红黄光带，并计数。按下列公式计算猪多杀性巴氏杆菌病菌液含量：
每毫升菌液中菌落单位（CFU/ mL）=同一稀释度三次重复的菌落平均数×10×稀释度M。
冻干疫苗活菌滴度测试通过琼脂平板计数法进行测定。
冻干疫苗先用含0.1%裂解血球全血的马丁肉汤稀释成1mL/头份，再稀释成M倍（M=2~9），涡旋混匀10秒使猪多杀性巴氏杆菌病菌液分散，然后进一步作10倍系列稀释。每次稀释前再次涡旋混匀。其余操作参照上述菌液测定方法。
实施例1
本实施例提供了一种疫苗耐热保护剂，制备方法如下：
步骤S1、第一溶液的配制：按照如下表1所示的耐热保护剂的成分含量（其中％表示质量体积百分比含量，即g/100mL，下同），分别精密称取所需量的明胶于定量注射用水中，期间置60℃水浴加热并不停搅拌至完全溶解，得到第一溶解液；再称取海藻糖、肌醇加入第一溶解液中至完全溶解，得到第二溶解液；再向第二溶解液中加入所需量的聚山梨酯80至完全溶解，得到第三溶解液；随后精密称取胰蛋白胨加入第三溶解液中，置60℃水浴加热并不停搅拌将其溶解，获得第一溶液。
步骤S2、第二溶液的配制：按照下表1所示的各耐热保护剂的成分含量，分别精密称取L-天冬氨酸溶于注射用水中，同时不停晃动直至完全溶解，得到第四溶解液；再精密称取所需量的聚乙烯吡咯烷酮于第四溶解液中使其完全溶解，得到第五溶解液；再向第五溶解液中分别加入L-赖氨酸盐酸盐至完全溶解得到第六溶解液，随后向第六溶解液中加入甘氨酸至完全溶解，置60℃水浴，同时不停晃动将其溶解，并利用7.5%碳酸氢钠溶液将pH调整至7.1~7.5，获得第二溶液。
步骤S3、将第一溶液定容后在高压灭菌柜中灭菌（116℃高压20~30min），将第二溶液定容后过滤除菌（0.22μm滤膜），再将第一溶液和第二溶液按1:1比例混合，获得耐热保护剂。
需要说明的是：配制耐热保护剂时，采取单溶每一种试剂，在单溶时逐渐增加溶质的量，避免出现过饱和现象，以及避免出现溶解不彻底的情况。
将配制好的耐热保护剂置于37℃下保存备用。
实施例2~5
本实施例提供了一种疫苗耐热保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：按照表1中的配方制备疫苗耐热保护剂。
表1 疫苗耐热保护剂配方
对比例1
本对比例提供了一种疫苗耐热保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：将L-赖氨酸盐酸盐替换为等量的L-精氨酸盐酸盐。
对比例2
本对比例提供了一种疫苗耐热保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：将甘氨酸替换为等量的色氨酸。
对比例3
本对比例提供了一种疫苗耐热保护剂，制备方法仅与实施例1不同的是：将肌醇替换为等量的叔丁醇。
试验例1 配制猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗
利用上述实施例和对比例中制备好的疫苗耐热保护剂作为猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的耐热保护剂，配制猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗，具体方法包括以下步骤：
步骤T1、制备疫苗原液
步骤T1-1、猪多杀性巴氏杆菌病菌液的制备
步骤T1-1-1、一级种子繁殖：将冻干菌种接种于含0.1%裂解血球全血的马丁肉汤中，36~37℃培养 24 小时，培养特性本菌接种在含0.1%裂解血球全血及4%健康动物血清的改良马丁琼脂平板上，36~37℃培养16~22小时，肉眼观察，菌落较小，表面光滑，呈微蓝色，在低倍显微镜下，45度折光观察，菌落表面有不明显的波纹状结构，边缘整齐，呈不甚鲜明的蓝绿色虹彩，边缘的一部分有狭窄的红黄光带，属 Fg 菌落型，选5个以上典型菌落，接种鲜血琼脂斜面若干支，36~37℃培养 24 小时，经检验纯粹合格后，作为一级种子。在2~8℃保存，应不超过14 日。在血斜培养基上传代，不得超过5代(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》)。
步骤T1-1-2、二级种子繁殖：取一级种子接种于含0.1%裂解血球全血的马丁肉汤中，置36~37℃培养 24 小时，取用马丁琼脂作纯粹检验合格后，置2~8℃保存，使用期应不超过3日。
步骤T1-1-3、制苗用培养基为马丁肉汤，调整pH值为7.3±0.2。
步骤T1-1-4、猪多杀性巴氏杆菌病制苗用菌液制备，按培养基总量的1%~2%接种二级种子液，加入0.1%裂解血球全血及适量消泡剂，以逐渐增大通气量的方法在36~37℃培养16~20小时左右，当活菌数达到最高峰时，停止培养。
步骤T1-1-5、半成品检验包括纯粹检验、活菌计数均按《中国兽药典》规定的方法进行检验。
步骤T1-2、活菌滴度测定，活菌测定结果如下表2所示。
表2 活菌测定结果
步骤T1-3、按冻干后的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的每头份疫苗中猪丹毒活菌数≥3×108CFU/mL，计算出所需猪多杀性巴氏杆菌病菌液的配苗用量，按照计算出的配苗用量混合（本发明根据前期多次试验的冻干损失率，为保证疫苗质量，配苗前将冻干损失已算在其中）。经过计算，本发明中的所需猪多杀性巴氏杆菌病菌液的活菌数为12.5×109CFU/mL~13×109CFU/mL。
步骤T1-4、取上述步骤T1-3获得的疫苗菌液分别与不同的耐热保护剂按照体积比为2:1和3:1混合均匀，具体操作为：将疫苗菌液匀速加入盛放耐热保护剂的储液瓶内，人工缓慢混匀15min左右（避免产生过多的泡沫），即可获得疫苗原液。
步骤T2、将各疫苗原液进行冷冻干燥处理，获得猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗。具体操作方法如下：
用移液器将步骤T1-4获得的疫苗原液按3mL/瓶分装，即分装为3mL/瓶，随后冷冻干燥，即可配制得到猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗（冻干制剂），冷冻干燥的处理工艺选择在产品进箱后再将冻干箱降温的慢冻速率，预冻的最低温度的选择需要根据配制成混合疫苗的共晶点温度-22℃，将预冻最低温度低于此温度。冷冻干燥处理方法为：
预冻阶段：提前将冻干机预冷至0℃，将疫苗原液在30min由常温降温至-22℃，在-22℃保持1h，然后在30min内降温至-45℃，在-45℃保持4h；
抽真空阶段：在20min内将真空度降到120mT；
升华干燥阶段：在真空度降到120mT时开始加热，在2h内将温度由-45℃升至-24℃并维持10h，之后在20min内将温度由-24℃升至-15℃并维持10h，最后20min将温度由-15℃升至-3℃并维持5h；
解析干燥阶段：将真空度调节至10mT，将温度在2h升到28℃，保温8h。
需要说明的是：根据产品确定冻干箱板层最高允许温度为30℃。由于传递的热差，板层温度常比产品最高允许温度略低，本试验例取28℃。根据冻干机性能、疫苗特性及装量，将预冻时间、升华干燥阶段和解析干燥时间全过程确定为44h左右。
试验例2
1、对配制的各猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗冻干前后的活菌数进行检测，检测结果如下表3所示。
表3 猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗冻干前后活菌数检测结果
2、按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法对配制的疫苗产品进行了常规项目检测，如下表4所示。
表4 猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗成品常规检测结果
由上表3和表4检测结果可知，使用本发明的疫苗耐热保护剂配制得到的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗在冻干前后活菌率较高且外观符合要求，其中的各活菌数（滴度）下降较少，因此能够在冷冻干燥过程有效保护猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗中的各活菌数不被降解，获得效价水平较高的疫苗产品。
根据表4的检测结果可见，使用本发明的疫苗耐热保护剂配制的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗在冻干后呈淡黄色或白色海绵状疏松团块，且易与瓶壁脱离（图1示出了使用实施例1的疫苗耐热保护剂经分装（4瓶）、冷冻干燥之后获得的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗冻干产品的照片），含水量均在3.0%以下，能够迅速溶解于水中，因此配制得到的疫苗产品具有较佳的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。
3、对上述猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法进行耐老化试验，具体为：将猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗置37℃的环境下7日，以及在2~8℃保存24个月，检测疫苗产品中各活菌数的变化情况，检测结果如下表5所示，单位CFU/mL。
表5 猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗耐老化试验活菌数检测结果
由上表5的检测结果可知，使用本发明疫苗耐热保护剂配制获得的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗无论是按照菌液:耐热保护剂为2:1还是3:1，疫苗在37℃条件下保存7天后的各活菌数滴度下降均未超过1*109CFU/mL，下降最多的也仅为0.29*109CFU/mL；该疫苗在2~8℃条件下保存24个月后的各活菌数滴度下降也均未超过1*109CFU/mL，下降最多的也仅为0.34*109CFU/mL。
因此，本发明提供的疫苗耐热保护剂可以保证使用其猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗能够稳定长期保存，且有效抑制其中各活菌数滴度的下降，从而保证猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的免疫效力。
试验例3 冻干曲线优化
采用实施例2的疫苗耐热保护剂与疫苗菌液按照1:3的体积比混合均匀，获得疫苗原液；随后将疫苗原液按照3mL/瓶分装后进行冷冻干燥处理，其中设计了多种冻干曲线，以从中筛选确定理想的适宜于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗的冻干曲线，以下列出了三种冻干曲线：冻干曲线1、冻干曲线2和冻干曲线3，不同冻干曲线制备的疫苗分别命名为猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗1、2、3。
冻干曲线1：即试验例1中步骤T2中的冷冻干燥处理方法。
冻干曲线2：以冷冻干燥3mL疫苗原液计为：
预冻阶段：将疫苗原液在1h内降温至-45℃，在-45℃保持4h；
抽真空阶段：在20min内将真空度降到120mT；
升华干燥阶段：在真空度降到120mT时开始加热，在2h内将温度由-45℃升至-30℃并维持10h，之后在20min内将温度由-30℃升至-20℃并维持10h，最后20min将温度由-20℃升至-5℃并维持8h；
解析干燥阶段：将温度在2h升到28℃，保温8h。
冻干曲线3：以冷冻干燥3mL疫苗原液计为：
预冻阶段：将疫苗原液在30min由常温降温至-25℃，在-25℃保持1h，然后在30min内降温至-45℃，在-45℃保持4h；
抽真空阶段：在20min内将真空度降到120mT；
升华干燥阶段：在2h内将温度由-45℃升至-18℃并维持10h，之后在20min内将温度由-18℃升至-10℃并维持10h，最后在20min将温度由-10℃升至-3℃并维持4h；
解析干燥阶段：将温度在2h升到28℃，保温8h。
分别对猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗1、猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗2和猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗3冻干前后各活菌数下降情况以及疫苗成品常规项目进行检测，检测结果如下表6所示。
表6疫苗冻干后活菌率下降情况和成品常规项目检测结果
根据上表6检测结果可知，猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗1中的活菌率为96.7%，并且疫苗冻干后物理性状、溶解度、剩余水分均良好。猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗2中的活菌率为81.3%，且冻干后物理性状稍差，样品出现分层、塌陷现象，不易与瓶壁脱离。而猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗3中的活菌率为73.8%，且冻干后疫苗底部发生熔化，外观出现萎缩、塌陷。其中对于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗中同一菌液，相对于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗1来说，猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗2和猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗3中的活菌率下降均相对较多。通过测定样品共熔点拟定冻干基本参数，调整影响冻干效果的不同因素，最终确定冻干曲线。板层温度在不同阶段的设定不同，对冻干效率的影响不同。因此，本发明采用冻干曲线1不但可以减小猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗在冻干过程中活菌数滴度的损失，而且能够提高产品质量。
试验例4猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗安全性试验
将上述实施例1~4中的疫苗耐热保护剂与菌液分别按照1:2和1:3的体积比配制获得猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗，命名如表7所示。
表7 猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗命名
以上述疫苗作为免疫组、以灭菌生理盐水作为对照组；分别选用猪多杀性巴氏杆菌病抗原、抗体阴性，且体重为15-30kg的健康易感猪作为实验动物，免疫组每头猪经肌肉注射接种10头份疫苗，对照组每头猪以相同方法、相同剂量接种生理盐水，持续观察14日，结果如下表8所示，各组实验猪均无异常反应，精神食欲均表现正常，未出现猪多杀性巴氏杆菌病症状，其中，猪多杀性巴氏杆菌病疫苗4和猪多杀性巴氏杆菌病疫苗6各有2/5实验猪在免疫后6h出现体温升高，最高温度达到40.4℃；猪多杀性巴氏杆菌病疫苗8和猪多杀性巴氏杆菌病疫苗10各有1/5实验猪在免疫后6h出现体温升高，最高温度达到40.2℃；体温出现短暂性升高，但在免疫后12h各组实验猪体温均表现正常，表明本发明配制的猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗具有良好的安全性。
表8猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗安全性试验结果
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种疫苗，其特征在于，其中含有疫苗耐热保护剂和多杀性巴氏杆菌；
每100mL所述疫苗耐热保护剂中，包含以下组分：
海藻糖3~5g、明胶3~5 g、胰蛋白胨5~8 g、L-赖氨酸盐酸盐1~3 g、L-天冬氨酸1~2 g、甘氨酸1~2 g、肌醇3~6 g、聚山梨酯80 1~3g、以及聚乙烯吡咯烷酮1~3g；
所述多杀性巴氏杆菌的活菌数为12.5×109CFU/mL~13×109CFU/mL，所述多杀性巴氏杆菌与所述疫苗耐热保护剂的体积比为2~3:1。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗耐热保护剂的制备方法包括：
配制第一溶液：先将明胶溶于水中得到第一溶解液，然后将海藻糖和肌醇溶于所述第一溶解液得到第二溶解液，而后将聚山梨酯80和胰蛋白胨依次溶于所述第二溶解液得到所述第一溶液；
配制第二溶液：将L-天冬氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、L-赖氨酸盐酸盐、甘氨酸依次溶于水中，调节溶液的pH为7.1~7.5，得到所述第二溶液；
将所述第一溶液与第二溶液混合后制得。
3.一种疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的疫苗冷冻干燥后制得；其中，所述冷冻干燥的条件包括：
预冻阶段：将所述疫苗原液在20min~40min内降温至-20℃~-24℃，保持0.5~1.5h，然后在20min~40min内再次降温至-42℃~-47℃，保持3h~5h；
抽真空阶段：在15min~30min内将真空度降到100mT~130mT；
升华干燥阶段：在1h~2h内将温度升至-22℃~-26℃并维持10h~12h，再在15min~25min内将温度升至-12℃~-18℃并维持8h~10h，最后在20min~30min内将温度升至-1℃~-5℃并维持3h~5h；
解析干燥阶段：将真空度调节至8mT ~12mT，将温度在1h~2h内升高至28℃~30℃，并保温6h~8h。
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