CN116419967A - 长寿、热耐受酵母及其在生产发酵饮料中的用途 - Google Patents

长寿、热耐受酵母及其在生产发酵饮料中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于生产发酵饮料的酵母菌株，其中所述酵母菌株是通过选自酿酒酵母菌株Y927、菌株Y115、菌株WI011、菌株WI017和菌株WI018的单倍体孢子之间的群体接合杂交过程获得的杂合体，或者其中所述酵母菌株是所述杂合体的近交系。本发明还涉及酵母浆料、用于酿造发酵饮料的方法以及基于发酵过程获得的基于麦芽或茶的饮料。

Description

长寿、热耐受酵母及其在生产发酵饮料中的用途
技术领域
本发明涉及用于生产发酵饮料的酵母菌株，其中所述酵母菌株是通过亲本酵母菌株的单倍体孢子之间的杂交过程获得的杂合体，或者其中所述酵母菌株是所述杂合体的近交系(inbred strain)。本发明还涉及酵母浆料、用于酿造发酵饮料的方法以及基于发酵过程获得的饮料。
背景技术
发酵饮料(例如啤酒)一旦离开酿造厂，其就会经历一系列化学、物理和感官转变，这导致在味道和整体品质方面发生变化。控制这些变化并使这些变化减慢(这些变化在英语中称为“陈化(staling)”)是发酵饮料领域包括啤酒领域中的许多研究的主题。“陈化”的迹象之一是由于饮料中味道不佳组分的增加而导致的品质下降。使这些饮料的“老化(aging)”减慢即提高这些产品的保质期，并因此既具有商业优点还对产品的持久性产生积极作用。
酿造啤酒的过程可大致概括如下：第一步是麦粒发芽(malting)，其中将大麦润湿、使其发芽并随后将其干燥。这一步的结果称为麦芽(malt)。在下一步(磨碎步骤)期间，麦芽然后被碾磨(ground)，也称为研磨(milling)，并与温水混合以使麦芽暴露于酶活性。这些酶将淀粉转化为简单的糖并将蛋白质转化为肽和氨基酸。来自磨碎步骤的经溶解产物称为“麦芽汁”，并通过过滤与称为残渣的不溶性残留物(主要是大麦的糠)分离。然后将由此获得的麦芽汁在添加啤酒花(hop)的情况下煮沸。煮沸使酶失活、使麦芽汁灭菌、提取所期望的啤酒花组分并使一些蛋白质凝结。将啤酒花添加至煮沸的混合物以赋予苦味和香气。在麦芽汁冷却之后，添加酵母以在发酵期间将糖转化为醇和二氧化碳。发酵之后，收获大部分酵母，留下所谓的“嫩啤酒(green beer)”。将这种具有剩余酵母细胞的嫩啤酒在低温下储存数周，这一过程称为“贮陈(lagering)”。在贮陈即将结束时，罐中存在由酵母细胞和沉淀的蛋白质和多酚组成的沉淀物。将这种混合物过滤，并在最后将啤酒分别转移至瓶或桶灌装机并储存在瓶和桶中。
减少啤酒老化或陈化的有前景的策略是使用所谓的“瓶内加工(bottleconditioning)”，其中在包装啤酒之前将酵母细胞接种到啤酒中。确切的机制是未知的，但预期活酵母细胞的还原代谢一方面去除了瓶中剩余的氧气、阻止了氧化降解反应，并在另一方面确保了“陈化”组分的化学转化，例如将“陈化”醛转化为其相应且味道较不负面的醇。
这些醛中的一种是糠醛，其是可被酵母还原成糠醇的组分。糠醛通常用作醛指示剂，并用于预测和/或确定饮料的老化和品质。酵母菌株在发酵饮料中保持存活的时间越长，其可对抗糠醛和其他醛的形成的时间越长，饮料的味道和品质保持良好的时间将越长，并且保质期将越长。
然而，饮料瓶中的环境条件例如运输期间的高温和高酒精百分比，对酵母细胞而言是极具压力的，其导致细胞死亡并因此逐渐降低抗陈化特性。
本发明的一个目的是提供耐受至少一些这些环境条件的酵母菌株，使得其可在较长时间内和较广泛的环境条件下降低啤酒的“陈化”，并提供用于通过这些酵母细胞酿造酒精发酵饮料的方法。
发明概述
本发明涉及根据权利要求1所述的用于生产发酵饮料的酵母菌株。更具体地，本发明涉及通过选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株Y927、菌株Y115、菌株WI011、菌株WI017和菌株WI018的单倍体孢子之间的群体接合(mass-mate)杂交过程获得的杂合体或者该杂合体的近交系。该酵母菌株是热耐受并且长寿的。在第二方面中，本发明涉及根据权利要求8所述的酵母浆料。优选实施方案分别在权利要求2至7和权利要求9至12中阐述。
在另一方面中，本发明涉及根据权利要求13所述的用于酿造发酵饮料的方法，优选实施方案在权利要求14至20中阐述。另外，本发明还涉及根据权利要求21所述的基于发酵过程获得的基于麦芽或茶的饮料，优选实施方案在权利要求22至25中阐述。
所述酵母菌株、所述酵母浆料或者其在所述方法中或在所述基于麦芽或茶的饮料中的使用由于其抗陈化特性而改善了发酵饮料的品质并延长了发酵饮料的保质期。鉴于发酵饮料的市场是全球性的以及鉴于这些饮料在多种环境条件下被运输到世界各地的方式，所述酵母菌株的长寿(longevity)以及对更极端环境条件的耐受性具有商业优势。
附图简述
图1示意性地示出了随时间推移啤酒中两种酵母菌株的活酵母细胞数目/ml。
图2示意性地示出了在0(图2a)、81(图2b)或114(图2c)天之后三种不同啤酒配制物中的糠醛量。
图3示意性地描绘了来自不同酵母菌株的独特遗传指纹。
图4示意性地示出了在不同设置下根据本发明的四种酵母菌株和参照/基准酵母菌株的针对时间绘制的啤酒中活酵母细胞数目/ml。
图5示出了用根据本发明的酵母菌株或用参照/基准酵母菌株再发酵的6个月陈酿(6-month-old)啤酒的针对味道新鲜度绘制的味道测试的结果。
图6示出了用根据本发明的酵母菌株或用参照/基准酵母菌株再发酵的新鲜啤酒与具有陈酿啤酒的对照的比较味道测试的结果。
保藏信息
本发明的酵母菌株已根据《布达佩斯条约》的条款以保藏ID号：58105和58106于2021年3月17日保藏于比利时微生物协调保藏中心(Belgian Coordinated Collection ofMicroorganism，BCCM)-天主教鲁汶大学(Universitécatholique de Louvain)-天主教鲁汶大学真菌库(Mycothèque de l’Universitécatholique de Louvain，MUCL)，比利时新鲁汶市1348南十字2号，信箱L7.05.06(Croix du Sud 2,box L7.05.06,1348 Louvain-la-Neuve,Belgium)。
发明详述
本发明涉及用于生产发酵饮料的酵母菌株、酵母浆料、用于酿造发酵饮料的方法以及基于发酵过程获得的基于麦芽或茶的饮料。
除非另有定义，否则本发明说明书中使用的所有术语均包括技术和科学术语，具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。为了更好地理解本发明的描述，明确地解释了以下术语。
在本文中，除非上下文另有预设，否则没有数量词修饰的名词是指一个/种或更多个/种。例如，“部分”是指一个或更多个部分。
当术语“大约”或“约”在本文中与可测量的量、参数、持续时间或时刻等一起使用时，则变化意指为引用值的约20％或更小、优选约10％或更小、更优选约5％或更小、甚至更优选约1％或更小、并且甚至更优选约0.1％或更小，只要这样的变化适用于所描述的发明即可。然而，必须理解的是，在使用术语“约”或“大约”时所使用的量的值本身是具体公开的。
术语“包含”及其变化形式、“由……组成”及其变化形式、“提供有…”、“具有”及其变化形式、“包括”及其变化形式、“含有”及其变化形式是同义词并且是包括性或开放式的术语，指示其之后的内容的存在，并且不排除或阻止如从现有技术已知或在现有技术中公开的其他组分、特征、要素、成员、步骤的存在。
通过端点引用数值范围包括端点之间的所有整数、分数和/或实数，包括这些端点。
在本发明上下文中，术语“发酵”是指液体或饮料中的糖通过一种或更多种酵母的作用进行的酶促转化。在啤酒的情况下，术语“发酵”是指通过啤酒酵母(brewing yeast)中的酶将麦芽汁中的糖转化为醇(例如乙醇)和二氧化碳并形成其他发酵副产物，包括有机酸和酯。
术语“麦芽汁”是指在酿造期间如在啤酒或其他蒸馏麦芽酒或饮料的酿造中由麦芽、小麦或其他谷物产生的富含糖的未发酵液体。
术语“酵母”意指单细胞真核生物，属于真菌。酿造厂中使用的主要酵母，也称为“酵母(barm)”或“啤酒酵母(brewer’s yeast)”，是真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)(也称为卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis))和酿酒酵母。他们二者属于酵母科和酵母亚科。该亚科的特征在于子囊中出现孢子和出芽繁殖。酵母属(genusSaccharomyces，缩写为S.)的主要特征在于发生生醇发酵。这两种酵母的区别是基于发酵期间酵母是上升(rise)还是沉降(settle)。沉降的酵母被称为“低”酵母，上升的酵母被称为“高”酵母。卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)是低酵母，酿酒酵母(S.cerevisiae)是高酵母。
“再发酵”，也称为“二次发酵”、“之后发酵”或“后发酵”，意指在第一次或初级发酵步骤之后，麦芽汁的第二次或有时第三次发酵在通常是新的发酵器中继续进行。这将去除饮料中的一些酵母。在该第二次发酵期间，剩余酵母中的大部分将沉降到发酵容器的底部，产生较少浑浊的产物。这也为允许发酵饮料成熟提供了机会。通过添加酵母菌(Saccharomyces)或另外的酵母进行的再发酵将给予啤酒其特定的味道和颜色。酵母的还原特征也将阻止氧化过程。
在本发明上下文中，“杂合体”意指两种不同亲本酵母有性繁殖的结果。“杂交过程”是不同酵母杂交以形成杂合体，并且涉及三个主要步骤。首先，诱导孢子的形成(孢子形成(sporulation))，之后分离这些孢子，并且最后进行实际的杂交，这取决于这些孢子的融合或通过出芽从孢子产生的单倍体细胞的融合。
可发生两种类型的杂交，即远交和近交。
“远交”是基于一个或更多个目的特征(例如，热耐受和/或存活)选择两个亲本菌株并使其形成孢子(sporulate)。这意味着亲本酵母细胞(具有“双”DNA内容物或“二倍体”)被活化以形成仅具有原始DNA内容物的一半的细胞(“单倍体”)。将具有相反交配类型(a或α)的那些不同亲本细胞的单倍体孢子聚集在一起并融合成新的二倍体。然后，这些酵母菌株具有来自两种亲本的DNA，产生具有不同特性的细胞，其中一些比原始亲本更好：杂合体。
“近交”以相同的方式进行，但呈现仅一种亲本酵母菌株。由于单倍体形成引起DNA的重排，因此来自单个亲本的孢子将是不同的。因此，使这些孢子交配也产生了除其亲本菌株之外(并且可能比其亲本菌株更好)的其他酵母菌株。在这种情况下，这些酵母菌株被称为“近交系”。
酵母菌株具有独特的遗传指纹或独特的遗传谱。基于该谱以及两个亲本菌株的谱，可确定新的酵母菌株是近交还是远交的结果。或者，DNA测序也可用于确定发生了哪种类型的杂交。另外，还可使用如本领域技术人员已知的另一些技术。
在本发明的背景下，“长寿(long-living)”被定义为能够进行代谢和/或酶活性持续至少100天。其的一个易于测量和可视化的实例是生长和/或细胞***，但这种代谢和/或酶活性不限于生长和/或细胞***。“长寿”、“可长时间存活的……”、“长时间存活的……”以及对本领域技术人员将明显的类似术语包括在本发明上下文中的该定义中。
“基于麦芽的饮料”是其中主要成分是大麦植物的谷物或种子的发酵饮料，其在加工之前已被允许以传统方式发芽，称为“麦粒发芽”。最著名的基于麦芽的饮料是啤酒。另外，术语基于麦芽的饮料被应用于许多其他由发芽的谷物制备的风味饮料并且其中已经添加了天然或人工香料(并且有时为色素(colour))以使其尝起来是并且类似于葡萄酒、水果、可乐、天然苹果酒或其他饮料。
“基于茶的饮料”是其基底为茶的饮料。茶是通过泡制叶、果实、种子、草药或这些的组合而制成的热饮料。
基于茶的发酵饮料的一个实例是“康普茶(Kombucha)”。其是通过醋酸菌和酵母培养物发酵甜茶而产生的饮料。康普茶是通过微生物(即酵母和细菌)的共生作用产生的，为厚凝胶状、有光泽的真菌网状膜的形式，其形成酵母细胞与不同细菌的共生。康普茶主要产生了饮料中的葡萄糖醛酸、乳酸、乙酸和多种维生素。
在第一方面中，本发明涉及用于生产发酵饮料的酵母菌株，其中该酵母菌株是通过选自酿酒酵母菌株Y927、菌株Y115、菌株WI011、菌株WI017和菌株WI018的单倍体孢子之间的群体接合杂交过程获得的杂合体，或者其中该酵母菌株是所述杂合体的近交系。
酿酒酵母是具有许多目的生理特征的酵母，这使其非常适用于工业发酵。首先，这种酵母在葡萄酒、啤酒、苹果酒等的工业发酵中能够胜于大多数其他酵母。这种适应性优点可归因于数种特征，包括高应激耐受性(例如，对乙醇和高温)、快速且高效的碳代谢以及在有氧和厌氧条件下生长的能力。其次，酿酒酵母酵母菌产生许多期望的风味，例如挥发性酯和高级醇，并且只有些许异味。最后，这些酵母细胞不产生会对人有害的特定毒素，使其对于用于食品发酵是安全的，如由酿酒酵母的“公认安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)”和“安全资格认定((Qualified Presumption of Safety，QPS)”的状态所证明的。
“酿酒酵母菌株Y927”是文献(Meersman,et al.,2015)中已知的酵母菌株，其可长时间存活并且对高温具有高的耐受性。这也被称为“热耐受”。“基本热耐受”是指生物体在没有事先适应的情况下承受高温的能力。“获得性热耐受”是指在事先暴露于中等温度之后承受高温的能力。另外，该菌株高效地产生孢子并且对乙醇耐受。
“酿酒酵母菌株Y115”也是文献(Meersman,et al.,2015)中已知并且来自生物乙醇工业的酵母菌株，具有高的热耐受、长寿、对乙醇的耐受性和高效的孢子形成。
另外，从文献(Gallone,et al.,2016)已知酵母菌株“酿酒酵母菌株WI011、菌株WI017和菌株WI018”，其作为源自葡萄酒工业的酵母菌株。与之前的酿酒酵母菌株Y115和Y927一样，这三种酵母菌株也是热耐受和长寿的。
本发明的热耐受酵母菌株能够在42℃的温度下生长。
作为本发明的杂交过程的一部分，测试或测定酿酒酵母菌株Y927、Y115、WI011、WI017和WI018以产生一组杂合体酵母菌株。例如，这可以是群体接合测定。
“群体接合”意指允许多于两种孢子相互交配或杂交。
为此，使所述酵母菌株形成孢子，并收获(单倍体)孢子。这些被允许与二倍体杂合体杂交。
在此之后，可对新形成的杂合体的库(pool)进行例如高温孵育(例如，42℃持续特定的时间段)以选择具有高温耐受性的杂合体。在此可任选地添加长寿和其他应激因素以选择具有那些特征的杂合体。这些应激因素和使酵母菌株经受这些应激因素的方法是本领域技术人员已知的。可能的应激因素的非穷举列表是高温(如上已经提及的)、低温、乙醇、干燥、有氧环境、厌氧环境、营养物来源贫乏等。
遗传指纹或测序可用于确定二倍体是来自相同亲本还是来自两个不同亲本菌株的交配细胞的结果。这允许选择由酿酒酵母菌株Y927、Y115、WI011、WI017和WI018的远交产生的二倍体。这些是本发明的“杂合体”。
然后如本领域技术人员已知的可使这些杂合体再进行允许这些菌株的孢子交配的群体接合测定或任何其他测定。在这种情况下，通过遗传指纹、测序或本领域技术人员已知的其他技术，选择由近交产生的二倍体。这些是本发明的“杂合体的近交系”。
本发明的酵母菌株的优点是其具有两个亲本菌株(杂合体)的特征的组合或比一个亲本杂合体菌株(近交系)更强的特征。这些特征包括热耐受、长寿、高效的孢子形成、乙醇耐受、快速且高效的碳代谢、在有氧和厌氧条件下生长的能力、产生许多期望的风味和些许异味和/或不产生对人有害的毒素。
与亲本菌株Y927、Y115、WI011、WI017和/或WI018一样，该酵母菌株是长寿且热耐受的。
如之前所指示的，本发明背景下的“长寿”或类似术语被定义为能够进行代谢和/或酶活性持续至少100天。其的一个易于测量和可视化的实例是生长和/或细胞***，但这种代谢和/或酶活性不限于生长和/或细胞***。
长寿和热耐受提供了一些优点，尤其是在所得产品的保质期方面。例如，啤酒市场是全球性的，并且长的保质期以及对更极端环境条件的耐受性是重要的。
在一个实施方案中，本发明的酵母菌株能够在营养物丰富的环境中在42℃的温度下生长并且持续至少5天的时间。
在另一个实施方案中，这种营养物丰富的环境由固体培养基组成，所述固体培养基由水、酵母提取物(1％w/v)、细菌蛋白胨(2％w/v)、葡萄糖(2％w/v)和琼脂(2％w/v)组成。
在另一个优选实施方案中，将106个细胞接种在这样的培养基上并孵育5天以观察生长。
在一个实施方案中，酵母菌株能够将醛转化为其相应的醇。醛因其对饮料(例如啤酒)的味道的强烈影响而出名并且某些醛例如甲基丙醛和苯甲醛的过量通常与味道不佳有关。因此可避免某些醛的形成或积累。醛可被转化为其相应的醇。
在一个实施方案中，通过酵母菌株的还原特性醛糠醛被该菌株转化。例如，糠醛被还原成糠醇。
糠醛是在啤酒中形成的醛并且尤其用于预测和/或确定饮料的年份。因此，糠醛也被称为年份指示剂，并且因此可用于确定保质期。饮料中存在的糠醛越多，饮料中存在的其他醛就越多，这通常导致味道不佳。
在“磨碎”和“用啤酒花调味(hopping)”过程(啤酒酿造过程的一部分)期间产生了显著量的糠醛。然而，几乎所有糠醛都在发酵过程期间被酵母还原。在啤酒或其他酒精发酵饮料的储存和成熟期间再次产生糠醛。
普遍认为，如果酵母菌株能够将糠醛转化为另一种化合物(例如通过还原成相应的醇)，则该酵母菌株也能够还原一些其他的醛并且因此消除了相关的不佳的味道。这样的酵母菌株的长的寿命很重要，因为其可在较长时间段内抵抗糠醛和其他醛的积累，并且因此将对饮料的保质期产生积极作用。
糠醛含量可通过萃取步骤然后是气相色谱步骤和质谱步骤来测量。例如，该组分可通过固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)然后是气相色谱和质谱来测量。
更详细地，对于啤酒，啤酒化学物质在固相微萃取期间将附着于纤维。然而，该纤维首先用例如五氟苄基羟胺(pentafluorobenzylhydroxylamine，PFBHA)涂覆，因为这有助于醛的检测。由于醛以非常低的浓度存在，因此这是必要的。然后，气相色谱分离吸附到纤维上的化合物。最后，可通过质谱检测隐藏的化合物，包括糠醛。
存在用于检测和测量糠醛的另一些技术并且本领域技术人员将知晓这些技术。
在本发明的一个实施方案中，酵母菌株在富含醇的环境(例如啤酒)中具有至少100天的寿命。
在本发明背景下，“富含醇的环境”意指其中醇含量为至少0.2％(v/v)的环境。富含醇的环境中的醇优选为乙醇。
在这种情况下，“寿命”被定义为在其期间菌株能够进行代谢和/或酶活性的时间。所述代谢和/或酶活性可以是生长和/或细胞***，但不必限于生长和/或细胞***。本发明的酵母的寿命是普通商业(啤酒)酵母菌株的平均存活时间(或因此代谢和/或酶活性时间)(50至60天)的两倍长。如果酵母菌株存活更长时间，则如前所述其可持续更长时间地降低味道不佳的组分，使得味道和品质持续更长时间地保持良好，并且因此延长饮料的保质期。当该酵母菌株也热耐受时(如上已描述的)，酵母菌株仍然可在较高的温度下(例如在整个全球市场的运输期间)发挥功能，并保持较高的饮料品质持续更长时间。
在本发明的一个实施方案中，如上在前述实施方案之一中所述的酵母菌株是以保藏ID No.58105和58106保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)-天主教鲁汶大学-天主教鲁汶大学真菌库(MUCL)的酵母菌株。
在本发明的一个实施方案中，酵母菌株是以保藏ID No.58105和58106保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)-天主教鲁汶大学-天主教鲁汶大学真菌库(MUCL)的菌株的突变体。优选地，该突变体酵母菌株仍然能够在营养物丰富的环境中在42℃的温度下生长并且持续至少5天的时间。同样优选地，该突变体酵母菌株仍然能够将醛转化为其相应的醇。
在本发明的一个实施方案中，所述酵母菌株表现出与以保藏ID No.58105和58106保存于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)-天主教鲁汶大学-天主教鲁汶大学真菌库(MUCL)的酵母菌株的至少95％序列同一性。优选地，所述酵母菌株与以保藏ID No.58105和58106保存于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)-天主教鲁汶大学-天主教鲁汶大学真菌库(MUCL)的酵母菌株具有至少95.5％、更优选96％、更优选96.5％、更优选97％、更优选97.5％、更优选98％、更优选98.1％、更优选98.2％、更优选98.3％、更优选98.4％、更优选98.5％、更优选98.6％、更优选98.7％、更优选98.8％、最优选98.9％、更优选99.0％、更优选99.1％、更优选99.2％、更优选99.3％、更优选99.4％、更优选99.5％、更优选99.6％、更优选99.7％、更优选99.8％、最优选99.9％基因组序列同一性。优选地，该酵母菌株仍然能够在营养物丰富的环境中在42℃的温度下生长并且持续至少5天的时间。同样优选地，该酵母菌株仍然能够将醛转化为其相应的醇。
在第二方面中，本发明涉及酵母浆料，其包含至少106个细胞/ml的如在至少一个上述实施方案中所述的本发明的酵母菌株。优选地，所述酵母浆料包含至少2*106个细胞/ml、更优选至少3*106个细胞/ml、更优选至少4*106个细胞/ml、更优选至少5*106个细胞/ml、更优选至少6*106个细胞/ml、更优选至少7*106个细胞/ml、更优选至少8*106个细胞/ml、更优选至少9*106个细胞/ml、以及更优选至少107个细胞/ml，更优选地，所述酵母浆料包含至少2*107个细胞/ml、更优选至少3*107个细胞/ml、更优选至少4*107个细胞/ml、更优选至少5*107个细胞/ml、更优选至少6*107个细胞/ml、更优选至少7*107个细胞/ml、更优选至少8*107个细胞/ml、更优选至少9*107个细胞/ml、更优选至少108个细胞/ml。更优选地，所述酵母浆料包含至少2*108个细胞/ml、更优选至少3*108个细胞/ml、更优选至少4*108个细胞/ml、更优选至少5*108个细胞/ml、更优选至少6*108个细胞/ml、更优选至少7*108个细胞/ml、更优选至少8*108个细胞/ml、更优选至少9*108个细胞/ml、以及更优选至少109个细胞/ml的如在至少一个上述实施方案中所述的本发明的酵母菌株。本领域技术人员将理解浆料中更高浓度的酵母细胞也是可以的。该酵母浆料可用于饮料发酵过程。
在一个实施方案中，通过向麦芽汁添加细胞，特别是通过向麦芽汁接种所述酵母菌株来获得浆料。
在另一个实施方案中，给予该经接种的麦芽汁一段时间以使细胞生长和***。优选地，这是在酵母菌株生长和***的理想温度下完成的。
换句话说，酵母细胞将在麦芽汁中繁殖。“繁殖”被理解为培养酵母以在尽可能短的时间内产生大生物量的已知来源的酵母，在此的主要目的是使用其以用于发酵。已知来源暗指培养的酵母是期望的特定菌株的。优选地，麦芽汁将被加热至酵母菌株可最佳繁殖的温度。
可将本发明的酵母菌株添加至富含糖的非发酵饮料。所述非发酵饮料可以是麦芽汁。麦芽汁包含用于酵母繁殖的足够的营养物，包括糖。
在一个实施方案中，每ml饮料将添加至少106个酵母细胞。
对于本发明，在一个实施方案中，将饮料或麦芽汁预热至24℃的温度。以这种方式，酵母菌株处于用于生长的理想环境中直到达到足够数目的酵母细胞，并因此达到足够大的密度或生物量，并因此形成酵母浆料。
酵母浆料的优点是其已经包含大量浓缩的酵母细胞，从而该浆料可在发酵过程中容易地用作接种的起始培养物，例如在饮料例如啤酒中。
在一个实施方案中，酵母浆料还包含至少一种不同于所述杂合体或近交酵母菌株(inbred yeast strain)的另外的酵母菌株。
当将两种或更多种酵母菌株一起接种时，这称为共接种。因此，本发明的酵母菌株可与典型的啤酒酵母共接种。例如，典型的啤酒酵母可给予饮料其典型的特征例如味道、酒精百分比等，而本发明的酵母菌株可例如在较高温度下运输期间继续转化“陈化”组分，或者比典型的啤酒酵母可这样转化持续更长的时间。
在另一个实施方案中，酵母浆料还包含另外的酿酒酵母菌株、酒香酵母(Brettanomyce)菌株或所述酵母的混合物。
在一个实施方案中，本发明的杂合体或近交酵母菌株与另外的酵母菌株之间的比率为1:1000至1:10，使得本发明的酵母菌株占总酵母细胞的0.1％至10％。
在另一个方面中，本发明涉及用于酿造发酵饮料的方法，其中将本发明的酵母菌株或酵母浆料添加至饮料。
本领域技术人员将理解本发明的酵母菌株和/或酵母浆料可用于如上和如下所述的方法和饮料中。因此，本发明的所有方面都是相互关联的。如在涉及如上和如下二者所述的酵母菌株、酵母浆料、方法或饮料的方面中所述的所有特征和优点均可涉及这些方面中的任一个，即使在结合一个具体方面进行描述的情况下也是如此。
可将本发明的酵母菌株添加至富含糖的非发酵饮料。所述非发酵饮料可以是麦芽汁。以这种方式，酵母菌株具有足够的营养物(例如糖)以生长直到达到足够数目的酵母细胞，并因此达到足够高的密度。这产生了浓缩的酵母浆料。
饮料可以是酒精发酵饮料或非酒精发酵饮料。
在所述方法的一个实施方案中，通过接种将酵母菌株(无论是否为酵母浆料的形式)添加至饮料。
在所述方法的一个实施方案中，添加酵母菌株或酵母浆料至约102至约108个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约102个细胞/ml、或多至约2*102个细胞/ml、或多至约3*102个细胞/ml、或多至约4*102个细胞/ml、或多至约5*102个细胞/ml、或多至约6*102个细胞/ml、或多至约7*102个细胞/ml、或多至约8*102个细胞/ml、或多至约9*102个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约103个细胞/ml、或多至约2*103个细胞/ml、或多至约3*103个细胞/ml、或多至约4*103个细胞/ml、或多至约5*103个细胞/ml、或多至约6*103个细胞/ml、或多至约7*103个细胞/ml、或多至约8*103个细胞/ml、或多至约9*103个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约104个细胞/ml、或多至约2*104个细胞/ml、或多至约3*104个细胞/ml、或多至约4*104个细胞/ml、或多至约5*104个细胞/ml、或多至约6*104个细胞/ml、或多至约7*104个细胞/ml、或多至约8*104个细胞/ml、或多至约9*104个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约105个细胞/ml、或多至约2*105个细胞/ml、或多至约3*105个细胞/ml、或多至约4*105个细胞/ml、或多至约5*105个细胞/ml、或多至约6*105个细胞/ml、或多至约7*105个细胞/ml、或多至约8*105个细胞/ml、或多至约9*105个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约106个细胞/ml、或多至约2*106个细胞/ml、或多至约3*106个细胞/ml、或多至约4*106个细胞/ml、或多至约5*106个细胞/ml、或多至约6*106个细胞/ml、或多至约7*106个细胞/ml、或多至约8*106个细胞/ml、或多至约9*106个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约107个细胞/ml、或多至约2*107个细胞/ml、或多至约3*107个细胞/ml、或多至约4*107个细胞/ml、或多至约5*107个细胞/ml、或多至约6*107个细胞/ml、或多至约7*107个细胞/ml、或多至约8*107个细胞/ml、或多至约9*107个细胞/ml、或多至约108个细胞/ml的密度。
在所述方法的一个实施方案中，将至少一种不同于本发明的所述杂合体或近交酵母菌株的另外的酵母菌株接种至饮料。
因此，如上所述，本发明的酵母菌株可与典型的啤酒酵母共接种。
在另一个实施方案中，该另外的酵母菌株是酿酒酵母菌株、酒香酵母菌株或所述酵母的混合物。
在一个实施方案中，本发明的杂合体或近交酵母菌株与另外的酵母菌株之间的比率为1:1000至1:10，使得本发明的酵母菌株占总酵母细胞的0.1％至10％。
在所述方法的一个实施方案中，所述酵母菌株或酵母浆料可用于饮料的发酵。
在这种情况下，本发明的酵母菌株或酵母浆料可通过接种添加至待发酵的饮料至优选约105至约108个细胞/ml的密度。
优选地，添加酵母菌株或酵母浆料多至约105个细胞/ml、或多至约2*105个细胞/ml、或多至约3*105个细胞/ml、或多至约4*105个细胞/ml、或多至约5*105个细胞/ml、或多至约6*105个细胞/ml、或多至约7*105个细胞/ml、或多至约8*105个细胞/ml、或多至约9*105个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约106个细胞/ml、或多至约2*106个细胞/ml、或多至约3*106个细胞/ml、或多至约4*106个细胞/ml、或多至约5*106个细胞/ml、或多至约6*106个细胞/ml、或多至约7*106个细胞/ml、或多至约8*106个细胞/ml、或多至约9*106个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约107个细胞/ml、或多至约2*107个细胞/ml、或多至约3*107个细胞/ml、或多至约4*107个细胞/ml、或多至约5*107个细胞/ml、或多至约6*107个细胞/ml、或多至约7*107个细胞/ml、或多至约8*107个细胞/ml、或多至约9*107个细胞/ml或多至约108个细胞/ml的密度。
在所述方法的一个实施方案中，酵母菌株或酵母浆料可用于饮料的再发酵。优选地，然后添加酵母菌株或酵母浆料多至约102至107个细胞/ml的密度。
优选地，添加酵母菌株或酵母浆料多至约102个细胞/ml、或多至约2*102个细胞/ml、或多至约3*102个细胞/ml、或多至约4*102个细胞/ml、或多至约5*102个细胞/ml、或多至约6*102个细胞/ml、或多至约7*102个细胞/ml、或多至约8*102个细胞/ml、或多至约9*102个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约103个细胞/ml、或多至约2*103个细胞/ml、或多至约3*103个细胞/ml、或多至约4*103个细胞/ml、或多至约5*103个细胞/ml、或多至约6*103个细胞/ml、或多至约7*103个细胞/ml、或多至约8*103个细胞/ml、或多至约9*103个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约104个细胞/ml、或多至约2*104个细胞/ml、或多至约3*104个细胞/ml、或多至约4*104个细胞/ml、或多至约5*104个细胞/ml、或多至约6*104个细胞/ml、或多至约7*104个细胞/ml、或多至约8*104个细胞/ml、或多至约9*104个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约105个细胞/ml、或多至约2*105个细胞/ml、或多至约3*105个细胞/ml、或多至约4*105个细胞/ml、或多至约5*105个细胞/ml、或多至约6*105个细胞/ml、或多至约7*105个细胞/ml、或多至约8*105个细胞/ml、或多至约9*105个细胞/ml的密度。添加酵母菌株或酵母浆料多至约106个细胞/ml、或多至约2*106个细胞/ml、或多至约3*106个细胞/ml、或多至约4*106个细胞/ml、或多至约5*106个细胞/ml、或多至约6*106个细胞/ml、或多至约7*106个细胞/ml、或多至约8*106个细胞/ml、或多至约9*106个细胞/ml、或多至约107个细胞/ml的密度。
如前所述，“再发酵”意指在第一次或初级发酵步骤之后，麦芽汁的第二次或第三次发酵在通常是新的发酵器中继续进行。在该第二次发酵期间，许多剩余的酵母将沉降在发酵容器的底部，产生较少浑浊的产物。这也为允许发酵饮料成熟给予了机会。通过添加酵母菌或其他酵母进行的再发酵将给予啤酒其特定的味道和颜色。酵母的还原特征也将阻止氧化过程。
通过添加活酵母(群体)来启动再发酵。当没有更多的可发酵的剩余糖时，可在称为加注(priming)的过程中添加糖或麦芽汁或者这二者。
优选地，在本发明中，添加糖以用于加注至约0.05°P至约5.0°P的密度。优选地，其为约0.07至5.0°P，更优选0.09至5.0°P、更优选0.11至5.0°P、更优选0.13至5.0°P、更优选0.15至5.0°P、更优选0.17至5.0°P、更优选0.19至5.0°P、更优选0.20至5.0°P。更优选0.05至4.5°P、更优选0.07至4.5°P、更优选0.09至4.5°P、更优选0.11至4.5°P、更优选0.13至4.5°P、更优选0.15至4.5°P、更优选0.17至4.5°P、更优选0.19至4.5°P、更优选0.20至4.5°P。更优选地，其为约0.05至4.0°P，更优选0.07至4.0°P、更优选0.09至4.0°P、更优选0.11至4.0°P、更优选0.13至4.0°P、更优选0.15至4.0°P、更优选0.17至4.0°P、更优选0.19至4.0°P、更优选0.20至4.0°P。更优选0.05至3.5°P、更优选0.07至3.5°P、更优选0.09至3.5°P、更优选0.11至3.5°P、更优选0.13至3.5°P、更优选0.15至3.5°P、更优选0.17至3.5°P、更优选0.19至3.5°P、更优选0.20至3.5°P。更优选地，其为约0.05至3.0°P，更优选0.07至3.0°P、更优选0.09至3.0°P、更优选0.11至3.0°P、更优选0.13至3.0°P、更优选0.15至3.0°P、更优选0.17至3.0°P、更优选0.19至3.0°P、更优选0.20至3.0°P。更优选0.05至2.5°P、更优选0.07至2.5°P、更优选0.09至2.5°P、更优选0.11至2.5°P、更优选0.13至2.5°P、更优选0.15至2.5°P、更优选0.17至2.5°P、更优选0.19至2.5°P、更优选0.20至2.5°P。更优选地，其为0.05至2.0°P，更优选0.07至2.0°P、更优选0.09至2.0°P、更优选0.11至2.0°P、更优选0.13至2.0°P、更优选0.15至2.0°P、更优选0.17至2.0°P、更优选0.19至2.0°P、更优选0.20至2.0°P。更优选地，添加糖至0.05至1.75°P的密度。更优选0.07至1.75°P、更优选0.09至1.75°P、更优选0.11至1.75°P、更优选0.13至1.75°P、更优选0.15至1.75°P、更优选0.17至1.75°P、更优选0.19至1.75°P、更优选0.20至1.75°P。更优选0.005至1.5°P、更优选0.07至1.5°P、更优选0.09至1.5°P、更优选0.11至1.5°P、更优选0.13至1.5°P、更优选0.15至1.5°P、更优选0.17至1.5°P、更优选0.19至1.5°P、更优选0.20至1.5°P。更优选地，其为约0.05至1.25°P、更优选0.07至1.25°P、更优选0.09至1.25°P、更优选0.11至1.25°P、更优选0.13至1.25°P、更优选0.15至1.25°P、更优选0.17至1.25°P、更优选0.19至1.25°P、更优选0.20至1.25°P。更优选地，其为约0.07至1.0°P，更优选0.09至1.0°P、更优选0.11至1.0°P、更优选0.13至1.0°P、更优选0.15至1.0°P、更优选0.17至1.0°P、更优选0.19至1.0°P、更优选0.20至1.0°P。更优选地，添加糖至0.05至0.75°P的密度。更优选0.07至0.75°P、更优选0.09至0.75°P、更优选0.11至0.75°P、更优选0.13至0.75°P、更优选0.15至0.75°P、更优选0.17至0.75°P、更优选0.19至0.75°P、更优选0.20至0.75°P。更优选0.05至0.5°P、更优选0.07至0.5°P、更优选0.09至0.5°P、更优选0.11至0.5°P、更优选0.13至0.5°P、更优选0.15至0.5°P、更优选0.17至0.5°P、更优选0.19至0.5°P、更优选0.20至0.5°P。更优选0.05至0.25°P、更优选0.07至0.25°P、更优选0.09至0.25°P、更优选0.11至0.25°P、更优选0.13至0.25°P、更优选0.15至0.25°P、更优选0.17至0.25°P、更优选0.19至0.25°P、更优选0.20至0.25°P。更优选0.05至0.22°P、更优选0.07至0.22°P、更优选0.09至0.22°P、更优选0.11至0.22°P、更优选0.13至0.22°P、更优选0.15至0.22°P、更优选0.17至0.22°P、更优选0.19至0.22°P、更优选0.20至0.22°P、最优选0.19至0.21°P。
这是用于使用本发明的酵母菌株进行饮料的再发酵的理想的糖(作为酵母菌株的营养物来源)的量。
在一个优选实施方案中，发酵在瓶、桶或容器中继续进行。
瓶中的再发酵可称为“瓶发酵”、“瓶再发酵”、“瓶内加工”或“瓶
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一些发酵饮料在瓶而不是新的发酵器中进行另外的发酵。这可以是第二次和/或第三次发酵。由于瓶中的第二次发酵，饮料将充满CO2。促进泡沫产生并且这也将略微提高酒精含量。瓶内加工饮料可不经过过滤直接从发酵罐或调节罐装瓶，或者经过过滤并随后在酵母情况下重新密封。
啤酒的装瓶优选地在真空下进行，使得不会发生氧化。然后通常在酵母可在瓶中最佳地再发酵的温度下(例如20至25℃的温度下)将填充和密封的瓶放置在温暖的房间中持续数天。
当这种再发酵在桶中继续时，其被称为“桶内加工(keg conditioning)”、“桶发酵”或“桶再发酵”。另外，再发酵也可在容器中继续进行。然后我们谈到“容器调节”、“容器发酵”或“容器再发酵”。
在最后一个方面中，本发明涉及从发酵过程获得的基于麦芽或茶的饮料，其中该饮料包含根据本发明的酵母菌株。
在一个优选实施方案中，这种酒精饮料通过本发明的方法获得。
本领域技术人员将理解，本发明的酵母菌株和/或酵母浆料可用于方法和所述饮料中，并且用于生产本发明的基于麦芽或茶的饮料。因此，本发明的所有方面都是相互关联的。如在涉及如上和如下二者所述的酵母菌株、酵母浆料、方法或饮料的方面中所述的所有特征和优点均可涉及这些方面中的任一个，即使在结合一个具体方面进行描述的情况下也是如此。
包含本发明的酵母菌株的饮料可区别于在生产期间未使用该酵母菌株的饮料。该酵母菌株具有独特的遗传指纹或独特的遗传谱。另外，DNA测序也可用于鉴定饮料中的酵母菌株。
在基于麦芽或茶的饮料的一个实施方案中，本发明的酵母菌株负责饮料的发酵。
在基于麦芽或茶的饮料的另一个或另一些实施方案中，酵母菌株负责饮料的发酵。如上所述，这种再发酵可在瓶中、在桶中或在容器中继续进行。
本发明的基于麦芽或茶的饮料可以是酒精性或非酒精性的。
本发明的饮料可以是康普茶。
“康普茶”是由醋酸菌和酵母培养物发酵甜茶而产生的饮料。康普茶是通过微生物(即酵母和细菌)的共生作用产生的，为厚凝胶状、有光泽的真菌网状膜的形式，其形成酵母细胞与不同细菌的共生。康普茶主要产生了饮料中的葡萄糖醛酸、乳酸、乙酸和多种维生素。
本发明的饮料可以是啤酒。
在一个优选实施方案中，本发明的饮料是啤酒。酵母菌株优选负责饮料或啤酒的发酵。
在一个优选实施方案中，酒精饮料具有7.5％至10.5％的酒精百分比、13.0至18.0°P的原麦汁浓度(original gravity)、浅金色且小于9的EBC值以及25至45EBU的苦味。
在一个实施方案中，酒精饮料中的酒精百分比为约7.5％至10.5％、优选约8％至10.5％、更优选约8.5％至10.5％。更优选地，酒精百分比为约7.5％至10.0％、更优选约8％至10.0％、更优选约8.5％至10.0％。更优选地，酒精百分比为约7.5％至9.5％、更优选约8％至9.5％、更优选约8.5％至9.5％。
在一个实施方案中，本发明的饮料具有13.0至18.0°P的原麦汁浓度。
“原麦汁浓度”是在发酵成啤酒之前麦芽汁中的固体比例的指示。其是溶液密度的量度，并且因此说明了有关啤酒“重量”的一些方面，这就是为什么人们谈论啤酒的密度。原麦汁浓度是作为用于计算啤酒消费税的基础。麦芽汁混合物中的大部分固体是糖。到了这些糖发酵成醇的程度，原始麦芽汁含量因此也是后来酒精百分比的指示。然而，这并不完全正确，因为根据酵母和环境(温度、气压、已产生的醇的量等)，发酵程度可有所不同。原麦汁浓度目前在欧盟以在20℃下测量的Plato度(degree Plato)作为标准来表示。Plato量表是对捷克共和国(Czech Republic)传统使用的巴林比重计(Balling scale)的改进。该量表专门设计用于酿造工业并且测量麦芽汁溶液中可发酵糖的比率。
在一个实施方案中，本发明的饮料的原麦汁浓度为13.0至18.0°P。更优选地，其为13.5至18.0°P，更优选14.0至18.0°P、更优选14.5至18.0°P、更优选15.0至18.0°P。更优选地，其为13.5至17.5°P，更优选14.0至17.5°P、更优选14.5至17.5°P、更优选15.0至17.5°P。更优选地，其为13.5至17.0°P，更优选14.0至17.0°P、更优选14.5至17.0°P、更优选15.0至17.0°P。更优选地，其为13.5至16.5°P，更优选14.0至16.5°P、更优选14.5至16.5°P、更优选15.0至16.5°P。更优选地，其为13.5至16.0°P，更优选14.0至16.0°P、更优选14.5至16.0°P以及最优选15.0至16.0°P。
啤酒的品质可以以许多不同的参数来表示。除味道和味道随时间的变化之外，视觉特性例如颜色对于消费者也是一个重要特性。
“浅金色”是指EBC值小于9的内部颜色。
啤酒的颜色可用EBC值表示。EBC值的确定是通过测量特定波长(430nm)的光在通过1cm啤酒之后的衰减来完成的。在此，衰减是啤酒对光吸收的量度，并且衰减测量为入射束强度与出射束强度的比率的对数。将该比率乘以系数以获得EBC值。EBC值代表啤酒吸收谱中的单个点。用于进行EBC测量的先决条件是啤酒样品没有浊度。用于确定啤酒EBC值的另一种方法是用标准化的圆盘比较器比较啤酒颜色。对麦芽汁的着色具有主要影响的重要反应是美拉德反应(Maillard reaction)。事实上，这是在加热包含蛋白质、肽、氨基酸和具有醛或酮功能的还原糖的混合物期间发生的一系列反应。美拉德反应导致非酶棕色着色化和有机化合物的复杂性。这些有机化合物负责啤酒中的味道和气味印象。
在一个实施方案中，本发明的饮料具有其中EBC值小于9.0，优选EBC值小于8.5、优选EBC值小于8.0、优选EBC值小于7.5、优选EBC值小于7.0、优选EBC值小于6.5、优选EBC值小于6.0、优选EBC值小于5.5、优选小于5.0的颜色。
另外，“苦味”也是啤酒的一个重要特征。苦味以EBU(European Bitterness Unit，欧洲苦味单位)表示。1EBU等同于1mg异α酸/升啤酒。EBU值为5至15的啤酒被归类在轻微苦味啤酒下。强烈苦味啤酒的EBU值为40或更高。啤酒类型当然也很重要：具有苦味为25EBU的储藏啤酒(lager)已经被许多人品尝为非常苦。
在一个实施方案中，本发明的饮料具有25至45EBU的苦味。优选苦味为30至45EBU，优选35至45EBU、优选40至45EBU。优选地，苦味为25至40EBU，优选30至40EBU、优选35至40EBU。优选地，苦味为25至35EBU，优选30至35EBU。
在下文中，通过举例说明本发明的非限制性实施例的方式来描述本发明，并且这些实施例不旨在并且也不应被解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：
已经表明，酵母可提供保护以免于啤酒老化和陈化。确切的机制尚不完全知晓，但认为这是由于活酵母细胞的还原代谢尤其去除了瓶中剩余的氧气、阻止了氧化降解反应并将陈化的醛转化为其相应的(味道不那么差的)醇。这种情况的一个实例是糠醛转化为糠醇。糠醛被用作啤酒的年份指示剂。啤酒中的糠醛越多，导致味道不佳的其他醛存在的也就越多。酵母将糠醛还原为糠醇并将其他醛还原为其相应的醇，通过改善味道和品质延长了啤酒的保质期。
然而，再发酵酵母不是针对在啤酒中长期存活而选择的，并且因此不能阻止啤酒的长期老化。另外，死亡或“裂解”的酵母细胞本身也可对啤酒的味道产生负面影响。
为了研究长寿酵母是否可改善再发酵啤酒的风味稳定性，在使啤酒经受高温谱的同时选择并产生可在啤酒中存活较长时间段的酵母。在日益全球化的市场中，运输期间出现的高温通常加速了老化，这负面影响了啤酒的味道并因此负面影响啤酒的品质。
重要的是，注意到在这种背景下“活的”意指酵母仍然可以进行代谢和/或酶活性。
产生了通过酿酒酵母菌株Y927和酿酒酵母菌株Y115的单倍体孢子之间的杂交过程获得的杂合体酵母菌株。另外，还产生了通过该杂合体的近交获得的近交系。
酿酒酵母菌株Y927是文献(Meersman et al.,2015)中已知的酵母菌株，其可长时间存活并且是热耐受的。另外，该菌株高效地产生孢子并且对乙醇耐受。酿酒酵母菌株Y115是文献(Meersman,et al.,2015)中已知的酵母菌株并且来自生物乙醇工业，其可长时间存活、具有高的热耐受、对乙醇耐受以及高效的孢子形成。
杂合体和该杂合体的近交系被用于啤酒再发酵，也称为二次发酵。
为此，将本发明的菌株(更具体地保藏ID No.:58106)首先在富含糖的麦芽汁(非发酵啤酒)中生长以获得足够的细胞。随后，将这种浓缩的酵母浆料接种到啤酒中至2×106个细胞/ml的密度。然后将糖添加至0.2°P(即0.2g/100g啤酒)的密度并作为用于酵母在瓶中、在桶中或在容器中再发酵的营养物来源。
作为对照，使用商业啤酒酵母的菌株，更具体地是
Figure BDA0003981776060000201
Nottingham，其商业上用于啤酒酿造过程。
在第10、43、52、64、81、93和114天评估两种菌株的存活。杂合体菌株的结果在图1中示出。尽管在第52天在对照啤酒(b)中仍发现约105个活细胞/ml(或CFU-菌落形成单位)，但在64天之后，未检测到活细胞存在于啤酒中。使用本发明的酵母菌株(保藏ID No.:58106)的啤酒(a)在81天之后仍然包含105个活细胞/ml啤酒、93之天后仍然包含104个活细胞/ml啤酒以及在114之后仍然包含多于103个活细胞/ml啤酒。(c)指示检测限。
这表明在啤酒中本发明的酵母菌株比目前在商业啤酒中使用的对照酵母菌株存活长得多的时间。
使用商业酵母菌株的对照啤酒和使用本发明的酵母菌株的啤酒也用于监测酵母菌株的糠醛转化。两种啤酒都通过添加这些酵母菌株进行再发酵。另外，添加空白啤酒作为对照，其中未向啤酒添加酵母菌株并且因此没有开始再发酵。
糠醛积累的结果在图2中示出。该图示出了在三种不同的老化时间(第0天-图2a、第81天-图2b和第114天-图2c)下的三种不同啤酒配制物(空白-无酵母菌株(c)、商业菌株
Figure BDA0003981776060000202
Nottingham(b)和本发明的菌株(保藏ID No.:58106)(a))中的糠醛量。
在老化开始(第0天)之前，所有三种啤酒的糠醛量非常类似。
在81天之后，空白啤酒中的糠醛量显著提高，而再发酵啤酒彼此之间没有显示出糠醛量的显著差异(NS)。这表明再发酵啤酒比非再发酵啤酒更加风味稳定。
在114天之后，空白啤酒的糠醛量仍然是最高的，但已用商业酵母(其在平均约第50天时死亡)再发酵的啤酒目前还具有显著的且显著高于(**：p<0.01)已用本发明的酵母菌株(其仍然存活)发酵的啤酒的糠醛量。这表明提高酵母菌株存活改善了啤酒的风味稳定性。
实施例2：
将通过初级发酵过程获得的啤酒通过由酿酒酵母菌株Y927和酿酒酵母菌株Y115的单倍体孢子之间的杂交过程获得的杂合体酵母菌株再发酵。为此，使该酵母菌株首先在富含糖的麦芽汁中生长以获得浓缩的酵母浆料。然后将该酵母浆料接种到啤酒中至2×106个细胞/ml的密度。然后将糖添加至啤酒至0.2°P(0.2g糖/100g啤酒)的密度作为酵母细胞的营养物来源。在啤酒瓶中继续进行再发酵。
实施例3：
如实施例2中获得的啤酒具有以下特性：8.5％的酒精百分比、15.5°P的原麦汁浓度、浅金色且5.7的EBC值以及32EBU的苦味。
实施例4：
如实施例2中获得的啤酒具有以下特性：9.5％的酒精百分比、15.5°P或更高的原麦汁浓度、浅金色以及40EBU的苦味。
实施例5：
包含如实施例2中所述酵母菌株的啤酒或包含该酵母菌株的另外的饮料的区别可在于饮料的生产期间未使用该酵母菌株。如图3中所示该酵母菌株具有独特的遗传指纹或谱。
该图是通过凝胶电泳分离的PCR片段的图像。在第一泳道中加载标志物(梯状物(ladder)-M)。不同PCR(聚合酶链反应)片段或标志物片段的尺寸以碱基对(base pair，bp)在凝胶左侧示出。标志物旁边的六条泳道代表来自六种酵母菌株的“interdelta”DNA的PCR片段。这是存在于酵母基因组中分散的不同转座子之间的DNA。
例如，第二泳道示出了商业上用于啤酒酿造过程的酵母菌株(
Figure BDA0003981776060000211
Nottingham)的遗传指纹。泳道3、4和5示出了如实施例2中讨论的三种不同杂合体酵母菌株(即分别为保藏ID No.:58105、杂合体_2和保藏ID No.:58106)的谱。泳道6和7分别描绘了亲本酵母菌株酿酒酵母菌株Y115和酿酒酵母菌株Y927的指纹。
如本实施例中所示，可基于饮料中的酵母菌株的遗传指纹来区分它们。或者，DNA测序也可用于鉴定饮料中的酵母菌株，从而确定整个基因组或基因组的一部分的核酸序列(核苷酸序列、DNA的构建块)。
实施例6：
本实验的目的是研究根据本发明的酵母菌株在啤酒中的寿命。
将啤酒用参照啤酒酵母菌株(基准，
Figure BDA0003981776060000221
Nottingham)接种，并任选地与本发明的酵母菌株共接种以用于在第0天再发酵。然后将啤酒在24℃下储存直至第12天，从第13天至第49天在7℃下储存并且从第50天至第237天(实验结束)在约20℃下储存。
测试了三种不同的设置，即：
-参照/基准：仅用参照菌株
Figure BDA0003981776060000222
Nottingham(106个酵母细胞/ml啤酒)进行接种，
-低共接种：用根据本发明的四种酵母菌株(杂合体_1、杂合体_2、杂合体_3或杂合体_4)之一(5*105个酵母细胞/ml啤酒)和参照菌株
Figure BDA0003981776060000223
Nottingham(106个酵母细胞/ml啤酒)进行四次共接种，以及
-高共接种：用根据本发明的四种酵母菌株(杂合体_1、杂合体_2、杂合体_3或杂合体_4)之一(106个酵母细胞/ml啤酒)和参照菌株
Figure BDA0003981776060000224
Nottingham(106个酵母细胞/ml啤酒)进行四次共接种。
杂合体_1和杂合体_3分别是以保藏ID No.:58106和58105保藏的酵母菌株。
结果在图4中示出。由此清楚的是，参照菌株在约三个月之后死亡，而根据本发明的酵母菌株在约八个月之后仍然存活，即使在低共接种的情况下也是如此。
在上述条件下，本发明的酵母菌株比参照啤酒酵母菌株在啤酒中更长寿。
实施例7：
本实验的目的是研究用根据本发明的酵母菌株进行再发酵的6个月陈酿啤酒与用参照啤酒菌株进行再发酵的相同啤酒相比在味道方面可能的陈化。
20名人员的测试组比较了用根据本发明的酵母菌株(杂合体_1或杂合体_3)发酵的6个月陈酿啤酒和用参照菌株/基准发酵的相同啤酒的味道。杂合体_1和杂合体_3分别是以保藏ID No.:58106和58105保藏的酵母菌株，并且参照菌株是
Figure BDA0003981776060000231
Nottingham。
味道测试结果通过Bradley-Terry成对测试进行分析并在图5中示出(**：p值<0.01，***：p值<0.001)。大多数测试者(对于杂合体_1为17/20以及对于杂合体_3为16/20)具有这样的观点：用根据本发明的酵母菌株再发酵的啤酒比用参照菌株/基准再发酵的相同啤酒具有更新鲜的味道。
这表明用根据本发明的酵母菌株再发酵啤酒可减轻或降低啤酒的陈化和味道变质。
实施例8：
本实验的目的是进行这样的比较：尚未老化(与实施例7不同)并且用根据本发明的酵母菌株进行再发酵的啤酒与用参照啤酒菌株进行再发酵的相同啤酒的味道的比较。
建立了一个三角测试，其中33名人员的测试组必须品尝用根据本发明的酵母菌株(杂合体_1或杂合体_3)再发酵的新鲜啤酒或用参照啤酒的酵母菌株/基准再发酵的新鲜啤酒，并指出与其他产品不同的产品。杂合体_1和杂合体_3分别是以保藏ID No.:58106和58105保藏的酵母菌株且参照菌株是
Figure BDA0003981776060000232
Nottingham。
作为对照，将老化的啤酒与新鲜啤酒进行比较。当33名测试人员中超过16名鉴定出了与其他两种啤酒不同的正确的啤酒时，认为确实存在味道上的差异。
结果在图6中示出(NS：不显著，*：显著，与参照/基准相比的三角测试，α＝0.1，β＝0.05，Pd＝0.4)。这表明与用参照酵母菌株发酵的新鲜啤酒相比，用本发明的酵母菌株发酵的新鲜啤酒之间的味道没有显著差异。但是清楚地识别了老化的对照啤酒。
来自实施例7和8的实验的组合表明，用本发明的酵母菌株再发酵的新鲜啤酒具有与用参照酵母菌株再发酵的新鲜啤酒类似的味道，而在用本发明的酵母菌株再发酵的陈酿啤酒中，具有比用参照酵母菌株再发酵的陈酿啤酒更少发生的陈化或味道变质。
本发明不应被解释为受限于上述实施方案，并且可在不必重新评价所附权利要求书的情况下对所描述的实施例添加某些修改或改变。

Claims (25)

1.用于生产发酵饮料的酵母菌株，其中所述酵母菌株是通过选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株Y927、菌株Y115、菌株WI011、菌株WI017和菌株WI018的单倍体孢子之间的群体接合杂交过程获得的杂合体，或者其中所述酵母菌株是所述杂合体的近交系。
2.根据权利要求1所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株是热耐受的。
3.根据权利要求1或2所述的酵母菌株，其中所述酵母菌株能够在营养物丰富的环境中在42℃的温度下生长并且持续至少5天的时间。
4.根据前述权利要求中任一项所述的酵母菌株，其特征在于所述酵母菌株能够将醛转化为其相应的醇。
5.根据权利要求4所述的酵母菌株，其特征在于所述酵母菌株能够将糠醛转化为糠醇。
6.根据前述权利要求中任一项所述的酵母菌株，其特征在于所述酵母菌株在富含醇的环境例如啤酒中具有至少100天的寿命。
7.根据前述权利要求中任一项所述的酵母菌株，其中：
a.所述菌株的参照物已分别以保藏ID No.:58105或58106保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)-天主教鲁汶大学-天主教鲁汶大学真菌库(MUCL)，或者其中
b.所述菌株是以保藏ID No.:58105或58106保藏的酵母菌株的突变体，其中所述突变体酵母菌株仍然能够在营养物丰富的环境中在42℃的温度下生长并且持续至少5天的时间，并且其中所述突变体酵母菌株仍然能够将醛转化为其相应的醇，或者其中
c.所述酵母菌株显示出与以保藏ID No.:58105或58106保藏的菌株的至少98％序列同一性，其中所述酵母菌株仍然能够在营养物丰富的环境中在42℃的温度下生长并且持续至少5天的时间，并且其中所述酵母菌株仍然能够将醛转化为其相应的醇。
8.酵母浆料，其包含至少106个细胞/ml的根据前述权利要求中任一项所述的酵母菌株。
9.根据权利要求8所述的酵母浆料，其中所述浆料是通过将根据权利要求1至6中任一项所述的酵母菌株的细胞添加至麦芽汁并随后将其孵育至密度为至少106个细胞/ml来获得的。
10.根据权利要求8至9所述的酵母浆料，其中所述浆料还包含至少一种不同于所述杂合体或近交酵母菌株的另外的酵母菌株。
11.根据权利要求10所述的酵母浆料，其中所述酵母浆料还包含另外的酿酒酵母菌株、酒香酵母(Brettanomyce)菌株或所述酵母的混合物。
12.根据权利要求10至11所述的酵母浆料，其中所述杂合体或近交酵母菌株与所述另外的酵母菌株之间的比率为1:1000至1:10。
13.用于酿造发酵饮料的方法，其中将根据前述权利要求中任一项所述的酵母菌株或酵母浆料添加至饮料。
14.权利要求13所述的方法，其中所述发酵饮料是酒精饮料。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中将所述酵母菌株或酵母浆料通过接种的方式添加至饮料。
16.权利要求15所述的方法，其中将酵母菌株或酵母浆料接种到所述饮料中至密度为102至108个细胞/ml。
17.根据权利要求13至16所述的方法，其中所述酵母菌株或酵母浆料用于所述饮料的发酵。
18.根据权利要求13至17所述的方法，其中所述酵母菌株或酵母浆料用于所述饮料的再发酵。
19.根据权利要求18所述的方法，其中添加糖至密度为0.05至5.0°P作为所述酵母菌株的营养物来源。
20.根据权利要求18至19所述的方法，其中所述再发酵在瓶中、在桶中或在容器中继续进行。
21.基于发酵过程获得的基于麦芽或茶的饮料，其中所述饮料包含根据权利要求1至7中任一项所述的酵母菌株。
22.根据权利要求21所述的基于麦芽或茶的饮料，其中所述饮料是酒精性或非酒精性的。
23.根据前述权利要求中任一项所述的基于麦芽或茶的饮料，其中所述饮料是康普茶。
24.根据前述权利要求中任一项所述的基于麦芽或茶的饮料，其中所述饮料是啤酒。
25.根据权利要求24所述的基于麦芽或茶的饮料，其中所述啤酒具有7.5％至10.5％的酒精百分比、13.0至18.0°P的原麦汁浓度、浅金色且小于9的EBC值以及25至45EBU的苦味。
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