CN116410152A - 一种抑制asct2的小分子化合物、其衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种抑制ASCT2的小分子化合物，所述化合物的分子式为C35H39N3O3，其结构式为：
Figure DDA0004176828610000011
，本发明中的化合物C35H39N3O3及其衍生物对谷氨酰胺摄取具有抑制作用，能够显著抑制癌细胞摄取谷氨酰胺，能够显著抑制ASCT2蛋白的表达，诱导乳腺癌细胞发生氧化应激和自噬，具有良好的抗肿瘤作用，尤其在对乳腺癌细胞具有优异的抑制细胞增殖的作用。

Description

一种抑制ASCT2的小分子化合物、其衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及ASCT2靶向抑制剂技术领域，具体涉及一种抑制ASCT2的小分子化合物、其衍生物及其应用。
背景技术
Na+依赖性谷氨酰胺载体2(alanine-ser-ine-cysteine transporter 2,ASCT2)是由SLC1A5基因编码的Na+依赖的转运体，它是一种中性氨基酸转运体，谷氨酰胺要发挥其生物学功能，首先需要经由ASCT2进入细胞内。ASCT2主要分布在细胞膜，介导谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等中性氨基酸的转运，为快速生长的肿瘤细胞提供重要底物。癌细胞中谷氨酰胺分解的增加与介导谷氨酰胺细胞摄取的膜转运蛋白的表达增加有关，相比正常组织，非小细胞肺癌、乳腺癌及肝癌等肿瘤组织中ASCT2高度表达，癌细胞对谷氨酰胺的需求大幅增加，用来支持代谢需求，产生ATP和合成蛋白质、核酸等大分子物质。抑制ASCT2蛋白表达，阻止胞内谷氨酰胺的摄入是一种新的肿瘤治疗方式，并已经在黑色素瘤肿瘤细胞,***癌,乳腺癌和急性髓性白血病上证明其有效性。目前针对ASCT2功能的研究多集中在肿瘤增殖方面，研究发现抑制前列癌、乳腺癌细胞、黑色素瘤中的ASCT2可降低谷氨酰胺摄取，激活mTORC1通路、细胞生长和细胞周期进程收到抑制，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
因为ASCT2能在非小细胞肺癌、乳腺癌及肝癌等肿瘤组织中表达异常或过度表达。同时，文献报道ASCT2与临床患者生存期紧密相关，所以我们认为ASCT2是具有潜力的抗肿瘤代谢靶点。最先开发出的ASCT2抑制剂是GPNA，它是一种谷氨酰胺结构类似物，可以抑制包括ASCT2在内的钠离子依赖的氨基酸转运体。由于其抑制ASCT2转运功能所需要的药物浓度高达mM级别，目前仅作为工具药应用于肿瘤基础研究领域。V-9302是首个针对谷氨酰胺转运体ASCT2的强力小分子抑制剂，主要通过与ASCT2变构区域结合，来抑制ASCT2转运功能，最终产生良好的抗肿瘤增殖效果，V-9302能显著抑制结肠癌细胞的增殖，增加氧化应激损伤，促进肿瘤细胞的死亡。该研究为开发靶向ASCT2的抑制剂，针对谷氨酰胺代谢的靶向疗法开创了先例。然而，有文献通过实验证实V-9302并非ASCT2特异性抑制剂，其作用靶点并非单一的ASCT2转运体，还作用于其他的转运体LAT1等。
发明内容
本发明目的在于提供一种靶向抑制ASCT2的小分子化合物及其衍生物，能抑制ASCT2的谷氨酰胺摄取能力，使胞内谷氨酰胺摄取减少之后，能够诱导肿瘤细胞自噬和氧化应激，抑制肿瘤细胞生长，最终显著抑制肿瘤的增殖。
本发明另一目的在于提供上述靶向抑制ASCT2的小分子化合物及其衍生物的应用。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种抑制ASCT2的小分子化合物，其特征在于：所述化合物的分子式为C35H39N3O3，其结构式为：
Figure BDA0004176828590000021
进一步，上述抑制ASCT2的小分子化合物有多种衍生物，分子式分别为C34H39N4O3、C33H39N5O3、C32H39N6O3。
进一步，上述衍生物分子式为C34H39N4O3时，其结构式包括：
Figure BDA0004176828590000022
Figure BDA0004176828590000031
中任意一种。
进一步，上述衍生物分子式为C33H39N5O3时，其结构式包括：
Figure BDA0004176828590000032
Figure BDA0004176828590000033
任意一种。
进一步，上述衍生物分子式为C32H39N6O3时，其结构式包括：
Figure BDA0004176828590000034
Figure BDA0004176828590000035
中任意一种。
上述化合物及其衍生物具有很好的谷氨酰胺摄取抑制作用，尤其对乳腺癌癌细胞具有肿瘤生长抑制作用，进一步研究发现在不同浓度下，上述化合物对乳腺癌细胞具有促进氧化应激水平、诱导自噬的作用，从而达到抑制癌细胞增殖的效果。
上述化合物及其衍生物的应用，其特征在于：在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述肿瘤为乳腺癌。
本发明具有如下技术效果：
本发明中的化合物C35H39N3O3及其衍生物对谷氨酰胺摄取具有抑制作用，能够显著抑制癌细胞摄取谷氨酰胺，能够显著抑制ASCT2蛋白的表达，诱导乳腺癌细胞发生氧化应激和自噬，具有良好的抗肿瘤作用，尤其在对乳腺癌细胞具有优异的抑制细胞增殖的作用。
附图说明
图1：本发明中化合物ZR-001的核磁氢谱图。
图2：本发明中化合物ZR-001的液相色谱图。
图3：本发明中衍生物Y1的核磁氢谱图。
图4：本发明中衍生物Y1的液相色谱图。
图5：本发明中衍生物Y4的核磁氢谱图。
图6：本发明中衍生物Y4的液相色谱图。
图7：本发明中衍生物Y6的核磁氢谱图。
图8：本发明中衍生物Y6的液相色谱图。
图9：本发明中化合物ZR-001及其衍生物与ASCT2结合抑制ASCT2转运功能。
图10：本发明中化合物ZR-001对ASCT2基因和蛋白的影响。
图11：本发明中化合物ZR-001能抑制体外乳腺癌细胞的增殖。
图12：本发明中化合物ZR-001衍生物能抑制体外乳腺癌细胞的增殖。
图13：本发明中化合物ZR-001诱导乳腺癌细胞发生氧化应激。
图14：本发明中化合物ZR-001诱导乳腺癌细胞发生自噬。
图15：本发明中化合物ZR-001能抑制体内乳腺肿瘤的增殖。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：
化合物C35H39N3O3的合成：
向金刚烷-1-甲酸(300mg，1.664mmol)的DCM(3mL)溶液中加入草酰氯(0.211mL，2.496mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(0.013mL，0.166mmol)，所得混合物在室温下搅拌3h，在减压下浓缩反应混合物，得到黄色固体金刚烷-1-羰基氯(330mg，收率99.79％)，将2-(4-氨基苯基)-1,3-苯并恶唑-5-胺(4g，17.758mmol)和三乙胺(7.405mL，53.274mmol)加入THF(200mL)中，形成的溶液在室温下加入到金刚烷-1-羰基氯(8.82g，44.395mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中，所得混合物在氮气保护下室温搅拌12h，然后过滤混合物，得到黄色固体。黄色固体用(MeOH:H2O＝1∶1)打浆3次，过滤，固体真空干燥，得到白色固体N-{2-[4-(金刚烷-1-酰胺基)苯基]-1,3-苯并恶唑-5-基}金刚烷-1-甲酰胺(8.63g，14.933mmol，产率84.09％)。HPLC纯度：95.1％。ESI-MS：m/z＝550.1[m+1]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),9.24(s,1H),8.12-8.10(m,3H),7.94-7.92(m,2H),7.66-7.60(m,2H),2.04-2.02(m,6H),1.97-1.93(m,12H),3.69-3.63(m,3H),1.73-1.71(m,12H)。
其化学结构为：
Figure BDA0004176828590000051
命名为ZR-001。其氢谱图和液相色谱图如图1和图2所示。
实施例2
衍生物Y1的制备：
步骤(1)：将5-硝基-2-吡啶羧酸(3g,17.8mmol)溶于氯化亚砜(25mL)中，搅拌下滴加DMF(0.028mL,0.357mmol)。升温至80℃，回流搅拌8h。完成后，将混合物在真空中浓缩，得黄色目标化合物5-硝基-2-吡啶羧酸：
Figure BDA0004176828590000052
步骤(2)：称2-氨基-4-溴苯酚(2g,10.6mmol)，加入DMF(20mL)溶解，加入TEA(7.39mL,53.2mmol)，再分批加入5-硝基-2-吡啶羧酸(2.18g,11.7mmol)，在20℃下搅拌3h。然后将混合物倒入200mL水中，用HOAc酸化至pH＝5，搅拌并过滤。滤饼在真空中干燥，得黄色粉末N-(5-溴-2-羟基苯基)-5-硝基吡啶-2-羧酰胺：
Figure BDA0004176828590000061
(3)向N-(5-溴-2-羟基苯基)-5-硝基吡啶-2-羧酰胺(3.5g,10.4mmol)和B2Pin2(9.20g,36.2mmol)的IPA(40mL)溶液中加入tBuOK(2.67g,23.8mol)，然后在90℃下搅拌反应5h，再用HOAc将混合物酸化至pH＝5.5，用水稀释(80mL)，用EA(2x 100mL)提取。有机层用盐水(150mL)洗净，在真空中浓缩。浓缩物通过反相纯化得到白色固体5-氨基-n-(5-溴-2-羟基苯基)吡啶-2-羧酰胺：
Figure BDA0004176828590000062
(4)向5-氨基-n-(5-溴-2-羟基苯基)吡啶-2-羧酰胺(800mg,2.60mmol)的TsOH(1.12g,6.49mmol)二甲苯溶液(20mL)中加入TsOH(1.12g,6.49mmol)的反应液，在140℃下搅拌反应12h，反应结束后在真空中浓缩，通过反相纯化，得到白色固体6-(5-溴-1,3-苯并恶唑-2-基)吡啶-3-胺：
Figure BDA0004176828590000063
(5)向6-(5-溴-1,3-苯并恶唑-2-基)吡啶-3-胺(250mg，0.862mmol)的Py(10mL)溶液中加入金刚烷-1-羰基酰氯(514mg,2.59mmol)。在20℃下搅拌反应12h，完成后，混合物用MeOH(0.5mL)淬火，在真空中浓缩，再通过反相纯化得到白色固体N-[6-(5-溴-1,3-苯并恶唑-2-基)吡啶-3-基]金刚-1-羧酰胺：
Figure BDA0004176828590000064
(6)将N-[6-(5-溴-1,3-苯并恶唑-2-基)吡啶-3-基]金刚-1-羧酰胺(200mg,0.442mmol)、金刚-1-羧酰胺(159mg,0.884mmol)、Cs2CO3(432mg,1.33mmol)、Xantphos(51.2mg,0.088mmol)和Xantphos-pd-G2(78.6mg,0.088mmol)混合，加入甲苯(10mL)，用N2脱气3-4分钟，然后在100℃下搅拌反应12h。完成后，将混合物在真空中浓缩，用硅胶层析纯化(DCM/MeOH＝50/1)，粗产物再用DCM/MeOH(1/1；10毫升)打浆，搅拌1h，过滤，滤饼在真空中干燥，得到白色固体状的衍生物：
Figure BDA0004176828590000071
MS(ESI)m/z＝551.5[M+1]+。该衍生物
Figure BDA0004176828590000072
记为Y1，其对应的其对应的氢谱图和液相色谱图分别如图3和图4所示。
实施例3：
衍生物Y2的制备：
(1)将6-氯吡啶甲酸(1.8g)、2-氨基-4-硝基苯酚(1.5g)和50mL二氯甲烷(DCM)混合，在冰浴中搅拌，然后滴加二环己基碳二亚胺(DCC)(3.3g)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(0.62g)的DCM溶液，在室温下继续反应6h。反应完成后，抽吸过滤反应溶液，收集滤液，旋转干燥，用石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂通过柱纯化，干燥得到6-氯-N-(2-羟基-5-硝基苯基)吡啶甲酰胺，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000073
(2)将6-氯-N-(2-羟基-5-硝基苯基)吡啶甲酰胺(7.2g)、偶氮二甲酸二异丙酯(11.3mL)、三苯基膦(6.0g)和THF(50mL)混合后在60℃下搅拌2h，将得到的反应混合物冷却至室温，并在减压下浓缩，加入乙醇，过滤收集所得固体，为2-(6-氯吡啶-2-基)-5-硝基苯并[d]恶唑，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000081
(3)向2-(6-氯吡啶-2-基)-5-硝基苯并[d]恶唑(2.1g)和(3S，5s)-金刚烷-1-甲酰胺(1.2g)在甲苯(30mL)中的溶液中加入Cs2CO3(4.5g)和XantPhos Pd G2(423mg)。用N2吹扫3分钟后，将混合物加热至110℃并搅拌16h。残余物通过快速色谱法纯化，用甲醇在二氯甲烷(1r，3R，5S)中洗脱，得到白色固体形式的N-(5-(5-硝基苯并[d]恶唑-2-基)吡啶-2-基)金刚烷-1-甲酰胺(350mg)，反应是如下：
Figure BDA0004176828590000082
(4)将200mg(1r，3R，5S)-N-(6-(5-硝基苯并[d]恶唑-2-基)吡啶-3-基)金刚烷-1-甲酰胺在含有5％w/w Pd-C(10％)的10mL MeOH/THF(1:1)中的溶液进行氢化(1个大气压，气球)过夜。将***内容物通过短的硅藻土垫并用EtOAc洗涤。减压蒸发滤液，得到130mg固体的粗(1r，3R，5S)-N-(5-(5-氨基苯并[d]恶唑-2-基)吡啶-2-基)金刚烷-1-甲酰胺，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000083
(5)室温下，向(1r，3R，5S)-N-(6-(5-氨基苯并[d]恶唑-2-基)吡啶-3-基)金刚烷-1-甲酰胺(105mg)在二氯甲烷(10mL)、EDCl(89mg)、DMAP(25mg)中的溶液中加入1-AdaMantyl羧酸(45mg)，硅胶柱色谱，得到黄色固体(1r，3R，5S)-N-(5-(5-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)苯并[d]恶唑-2-基)吡啶-2-基)金刚烷-1-甲酰胺(34mg)。MS(ESI)m/z＝551.2(m+H+)，其结构式如下：
Figure BDA0004176828590000084
记为Y2。
实施例4
衍生物Y3的制备：
按照Y2相同的制备路线，将6-氯吡啶甲酸更换为5-氯吡嗪-2-羧酸，最终制备得到黄色固体(1r，3R，5S)-N-(5-(5-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)苯并[d]恶唑-2-基)吡嗪-2-基)金刚烷-1-甲酰胺(27mg)。MS(ESI)m/z＝552.2(m+H+)。其结构式如下：
Figure BDA0004176828590000091
记为Y3。
实施例5
衍生物Y4的制备：
步骤(1)、将4-氨基苯甲酸(2g，14.584mmol)在SOCl2(20mL)中的溶液在80℃下搅拌12h。完成后，将混合物真空浓缩得到4-氨基苯甲酰氯(2200mg，14.141mmol，96.96％)，为黄色固体4-氨基苯甲酰氯，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000092
步骤(2)、向2,5-二溴吡啶-3-胺(3g，11.909mmol)在吡啶(30mL)中的溶液中加入4-氨基苯甲酰氯(2.22g，14.291mmol)。然后将混合物在20℃下搅拌2h。将混合物倒入水中(300mL)，搅拌并过滤。真空干燥滤饼，得到黄色固体4-氨基-N-(2，5-二溴吡啶-3-基)苯甲酰胺(3.2g，8.625mmol，72.42％)。
Figure BDA0004176828590000093
步骤(3)、将4-氨基-N-(2,5-二溴吡啶-3-基)苯甲酰胺(2g，5.390mmol)和Cs2CO3(3.51g，10.781mmol)在DMSO(80mL)中的悬浮液在130℃下搅拌12h。完成后，将混合物倒入水中(500mL)，用EA(2X200mL)萃取。有机层用盐水(200mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，滤液真空浓缩。残余物用MeOH(10mL)研制，亚硫酸盐化，滤饼真空干燥，得到黄色固体的4-{6-溴-[1,3]恶唑并[5,4-b]吡啶-2-基}苯胺(700mg，2.413mmol，44.76％)，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000101
步骤(4)、向4-{6-溴-[1,3]恶唑[5,4-b]吡啶-2-基}苯胺(300mg，1.034mmol)的溶液中加入吡啶(6mL)，金刚烷-1-羰基氯(308.17mg，1.551mmol)，然后将混合物在20℃下搅拌2h。将混合物倒入水中(60mL)，搅拌并过滤；真空干燥滤饼，得到呈黄色固体的N-(4-{6-溴-[1,3]恶唑并[5,4-b]吡啶-2-基}苯基)金刚烷-1-甲酰胺(420mg，0.743mmol，71.83％)。
Figure BDA0004176828590000102
步骤(5)、将N-(4-{6-溴-[1.3]恶唑[5,4-b]吡啶-2-基]苯基]苯基)金刚烷-1-甲酰胺(300mg，0.663mmol)、金刚烷-1-甲酰胺(237.77mg，1.326mmol)，Cs2CO3(540.21mg，1.658mmol)和RuPhos Pd G2(10.30mg，0.013mmol)以及二氧六环(0.8mL)的混合物用N2置换3-4次，然后将混合物在100℃下搅拌2h。将混合物真空浓缩。残余物用水(50mL)稀释，用DCM/MeOH(20/1；3x50mL)萃取。有机层用盐水(100mL)洗涤，真空浓缩。残余物通过反相(CH3CN/水(含0.1％FA))纯化，得到呈黄色固体的N-{4-[6-(金刚烷-1-酰胺基)-[1,3]恶唑并[5,4-b]吡啶-2-基]苯基}金刚烷-1-甲酰胺：
Figure BDA0004176828590000103
MS(ESI)m/z＝551.1(m+H+)，衍生物
Figure BDA0004176828590000104
记为Y4。其对应的氢谱图和液相色谱图如图5和图6所示。
实施例6
衍生物Y5的制备：
步骤(1)、按照Y4的合成路线，将4-氨基苯甲酸更换为4-溴苯甲酸，2,5-二溴吡啶-3-胺更换成2-氯-5-碘吡啶-4-胺，制备得到黄色固体4-溴-N-(2-氯-5-碘吡啶-4-基)苯甲酰胺：
Figure BDA0004176828590000111
步骤(2)、4-溴-N-(2-氯-5-碘吡啶-4-基)苯甲酰胺(2.3g)和Cs2CO3(3.8g)、1,10-菲咯啉(230mg)和CuI(120mg)形成悬浮液。在130℃下搅拌DMSO(80mL)溶液12h，经Y4中相同的需求、洗涤、真空浓缩、干燥得黄色固体的2-(4-溴苯基)-6-氯恶唑并[5,4-c]吡啶：
Figure BDA0004176828590000112
步骤(3)、向2-(4-溴苯基)-6-氯恶唑[5,4-c]吡啶(150mg)和(3S，5s)-金刚烷-1-甲酰胺(120mg)在甲苯(5mL)中的溶液中加入Cs2CO3(500mg)和XantPhos Pd G2(45mg)。用N2吹扫3分钟后，将混合物加热至110℃并搅拌12h。残余物通过制备TLC纯化，用甲醇在二氯甲烷1:10(v/v)中洗脱得到白色固体(1r，3R，5S)-N-(4-(6-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)恶唑[5,4-c]吡啶-2-基)苯基)金刚烷-1-乙酰胺：
Figure BDA0004176828590000113
衍生物
Figure BDA0004176828590000114
记为Y5。
实施例7
衍生物Y6的制备：
步骤(1)：在0℃下，向4-硝基苯甲酸(0.8g，4.787mmol)在DCM(10mL)中的溶液中加入DMF(0.037mL，0.479mmol)和二氯化草酸(0.527mL，6.223mmol)，混合物在室温下搅拌12h。然后在减压下浓缩混合物，得到残余物。将残余物溶解于DCM(10mL)中。在0℃下向6-氯-3-碘吡啶-2-胺(1.22g，4.787mmol)在吡啶(5mL)中的溶液中加入上述溶液，并将混合物在25℃下搅拌2h。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取。合并的有机提取物用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用乙酸乙酯在石油醚0-20％(v/v)中洗脱。得到呈黄色固体的N-(6-氯-3-碘吡啶-2-基)-4-硝基-N-(4-硝基苯甲酰基)苯甲酰胺(0.6g，1.086mmol，22.68％)，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000121
反应产物对应的氢谱图如图7所示。
步骤(2)：向N-(6-氯-3-碘吡啶-2-基)-4-硝基-N-(4-硝基苯甲酰基)苯甲酰胺(600mg，1086mmol)在THF(6mL)和MeOH(6mL)中的溶液中加入1MNaOH(6mL)，将混合物在25℃下搅拌1h。将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取。合并的有机提取物用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。残余物直接用于下一步，得到黄色固体的N-(6-氯-3-碘吡啶-2-基)-4-硝基苯甲酰胺(400.00mg，0.991mmol，91.30％)，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000122
反应产物氢谱图如图7所示。
步骤(3)：向N-(6-氯-3-碘吡啶-2-基)-4-硝基苯甲酰胺(400mg，0.991mmol)在THF(4mL)、MeOH(4mL)和H2O(1mL)的混合溶剂中的溶液中，将混合物加热至80°并搅拌12h。混合物用硅藻土过滤，并用乙酸乙酯洗涤。减压除去溶剂。将水和乙酸乙酯加入到所得残余物中。合并的有机提取物用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。残余物直接用于下一步。得到白色固体的4-氨基-N-(6-氯-3-碘吡啶-2-基)苯甲酰胺(210.00mg，0.562mmol，56.76％)，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000131
步骤(4)：向4-氨基-N-(6-氯-3-碘吡啶-2-基)苯甲酰胺(210mg，0.562mmol)在甲苯(1mL)中的溶液中加入K2CO3(233.08mg，1.686mmol)、1,10-菲咯啉(121.56mg，0.675mmol)和CuI(117.76mg，0.628mmol)。用N2吹扫3分钟后，将混合物加热至110℃并搅拌12h。反应结，浓缩混合物以得到残余物，然后加入水和二氯甲烷。合并的有机提取物用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到残余物。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用甲醇在二氯甲烷0-5％(v/v)中洗脱。得到黄色固体的6-{5-氯-[1,3]恶唑[4,5-b]吡啶-2-基}吡啶-3-胺(60mg，0.243mmol，43.27％)，其反应式如下：
Figure BDA0004176828590000132
反应产物的氢谱图如图7所示。
步骤(5)、在0℃下，向(3S，5s)-金刚烷-1-羧酸(60mg，0.333mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入DMF(0.003mL，0.033mmol)和二氯化草酸(0.034mL，0.399mmol)，将混合物在室温下搅拌12h。然后在减压下浓缩混合物，得到残余物，将残余物溶解于DCM(3mL)得溶液，在0℃下向6-{5-氯-[1,3]恶唑[4,5-b]吡啶-2-基}吡啶-3-胺(82.11mg，0.333mmol)在吡啶(1mL)中的溶液中加入上述溶液，并将混合物在25℃下搅拌2h。LCMS显示消耗了起始材料并检测到所需质量。将混合物倒入水中，沉淀出黄色固体。过滤混合物，将固体用于下一步而不纯化。得到黄色固体的(3S，5s)-N-(4-{5-氯-[1,3]恶唑[4,5-b]吡啶-2-基}苯基)金刚烷-1-甲酰胺，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000133
步骤(6)：向(3S，5s)-N-(4-{5-氯-[1,3]恶唑并[4,5-b]吡啶-2-基}苯基)金刚烷-1-甲酰胺(100mg，0.245mmol)和(3S，5s)-金刚烷-1-甲酰胺(52.74mg，0.294mmol)在甲苯(1mL)中的溶液中加入Cs2CO3(239.63mg，0.735mmol)、XantPhos Pd G2(21.77mg，0.024mmol)以及XantphosPd G2(21.7mg，0.023mmol)。用N2吹扫3分钟后，将混合物加热至110℃并搅拌12h。残余物通过制备TLC纯化，用甲醇在二氯甲烷1:10(v/v)中洗脱。获得白色固体的(3R，5S)-N-(4-{5-[(3R、5S，7s)-金刚烷-1-酰胺基]-[1,3]恶唑[4,5-b]吡啶-2-基}苯基)金刚烷-1-甲酰胺(28.3mg，0.051mmol，20.96％)，反应式如下：
Figure BDA0004176828590000141
该衍生物
Figure BDA0004176828590000142
记为Y6。
衍生物Y6的核磁氢谱图如图7所示，液相色谱图如图8所示。
实施例8
衍生物Y7-Y15的制备：
衍生物Y7的制备：以Y5的合成路线，将5-溴吡啶甲酸替代4-溴苯甲酸，2,5-二溴吡啶-3-胺替代2-氯-5-碘吡啶-4-胺，其余步骤与Y5合成步骤相同。
最终制备获得白色固体的(1r，3R，5S)-N-(6-(6-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)恶唑[5,4-b]吡啶-2-基)吡啶-3-基)金刚烷-1-甲酰胺(29mg)。MS(ESI)m/z＝552.3(m+H+)。该衍生物的结构式如下：
Figure BDA0004176828590000143
记为Y7。
衍生物Y8的制备：
按照Y7的制备路线，以2-氯-5-碘吡啶-4-胺代替2,5-二溴吡啶-3-胺，其余步骤相同，最终制备出得到呈黄色固体的2-(5-溴吡啶-2-基)-5-氯恶唑[4,5-b]吡啶。该衍生物的结构式如下：
Figure BDA0004176828590000151
记为Y8。
衍生物Y9的制备：
按照Y7的制备路线，以6-氯-3-碘吡啶-2-胺代替2,5-二溴吡啶-3-胺，其余步骤相同，最终制备出得到呈黄色固体的2-(5-溴吡啶-2-基)-5-氯恶唑[4,5-b]吡啶。该衍生物的结构式如下：
Figure BDA0004176828590000152
记为Y9。
Y10的制备：
按照Y7制备路线，6-氯烟酸替代5-溴吡啶甲酸，其余步骤相同，制备得到白色固体的(1r，3R，5S)-N-(5-(6-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)恶唑[5,4-b]吡啶-2-基)吡啶-2-基]金刚烷-1-甲酰胺。MS(ESI)m/z＝552.2(m+H+)。该衍生物的结构式如下：
Figure BDA0004176828590000153
记为Y10。
Y11的制备：
按照Y7合成路线，将6-氯烟酸替代5-溴吡啶甲酸，2-氯-5-碘吡啶-4-胺替代2,5-二溴吡啶-3-胺，其余步骤相同，制备得到白色固体的(1r，3R，5S)-N-(5-(6-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)恶唑[5,4-c]吡啶-2-基)吡啶-2-基]金刚烷-1-甲酰胺(22mg)。MS(ESI)m/z＝552.4(m+H+)。该衍生物结构式如下：
Figure BDA0004176828590000154
Y11。
Y12的制备：
按照Y7合成路线，将6-氯烟酸替代5-溴吡啶甲酸，6-氯-3-碘吡啶-2-胺替代2,5-二溴吡啶-3-胺，其余步骤相同，制备得到白色固体(1r，3R，5S)-N-(5-(5-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)恶唑[4,5-b]吡啶-2-基)吡啶-2-基-金刚烷-2-甲酰胺(22mg)。MS(ESI)m/z＝552.3(m+H+)。该衍生物结构式如下：
Figure BDA0004176828590000161
记为Y12。
Y13的制备：
按照Y7合成路线，将5-氯吡嗪-2-羧酸替代5-溴吡啶甲酸，其余步骤相同，制备得到白色固体(1r，3R，5S)-N-(5-(6-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)恶唑并[5,4-b]吡啶-2-基)吡嗪-2-基)金刚烷-1-甲酰胺(21mg)。MS(ESI)m/z＝553.3(m+H+)。该衍生物结构式如下：
Figure BDA0004176828590000162
记为Y13。
Y14的制备：
按照Y7合成路线，将5-氯吡嗪-2-羧酸替代5-溴吡啶甲酸，2-氯-5-碘吡啶-4-胺替代2,5-二溴吡啶-3-胺，其余步骤相同，制备得到白色固体(1r，3R，5S)-N-(5-(6-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)恶唑[5,4-c]吡啶-2-基)吡嗪-2-基)金刚烷-1-甲酰胺(21mg)。MS(ESI)m/z＝553.2(m+H+)。该衍生物结构式如下：
Figure BDA0004176828590000163
记为Y14。
Y15的制备：
按照Y7合成路线，将5-氯吡嗪-2-羧酸替代5-溴吡啶甲酸，6-氯-3-碘吡啶-2-胺替代2,5-二溴吡啶-3-胺，其余步骤相同，制备得到白色固体(1r，3R，5S)-N-(5-(5-((3R，5r，7r)-金刚烷-1-甲酰胺)恶唑[4,5-b]吡啶-2-基)吡嗪-2-基)金刚烷-1-甲酰胺(23mg)。MS(ESI)m/z＝553.4(m+H+)。该衍生物结构式如下：
Figure BDA0004176828590000164
记为Y15。
上述化合物及其衍生物的效果验证，用于试验的细胞株：
SKBR3细胞：人乳腺癌细胞株，贴壁生长，购自中国科学院上海细胞库。
MDA-MB-468细胞：人乳腺癌细胞株，贴壁生长，购自中国科学院上海细胞库。
MDA-MB-231细胞：人乳腺癌细胞株，贴壁生长，购自中国科学院上海细胞库。
BT-549细胞：人乳腺癌细胞株，贴壁生长，购自中国科学院上海细胞库。
HCC-1806细胞：人乳腺癌细胞株，贴壁生长，购自上海赛百慷生物技术公司。
HCC-1937细胞；人乳腺癌细胞株，贴壁生长，购自中国科学院上海细胞库。
实施例9：ZR-001及其衍生物与ASCT2结合抑制ASCT2转运功能
实验步骤：
计算机虚拟筛选
首先PDB(http://www.rcsb.org/)下载了ASCT2蛋白(pdb：5llm)PDB文件。除去所有异质原子用于随后的分子对接。ASCT2蛋白质对接网格已最大化用于ZR-001对接。在虚拟筛选之前，将PDB文件(5llm)转换为PDBQT格式的大分子。网格(配体对接搜索空间)的位置如上所述。然后，将AutodockVina1.1.2用于后续的分子对接。使用1.7.4.5版的Pymol可以观察到蛋白质与配体的相互作用。穗蛋白接近命中配体
Figure BDA0004176828590000171
的氨基酸残基被突出显示为参与蛋白质-配体相互作用的潜在相互作用残基。
图9-A结果表明，ZR-001与ASCT2蛋白中的GLY220，CYS175，VAL218，LEU179，SER197，MET221，ASN222，ILE223，ILE183，PHE176，LEU224，VAL429氨基酸位点产生相互作用。
表面等离子共振(surface Plasmon resonance,SPR)
原理：Biacore是基于表面等离子共振(surface Plasmon resonance,SPR)原理开发的新型生物分析传感技术。该技术的3个核心部分是传感器芯片，SPR光学检测***和微射流卡盘。实验时，将一种生物分子固定在传感器的葡聚糖表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过的芯片表面。SPR检测器能根据跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化，记录成一张传感图，并提供动力学和亲和力数据。Biacore技术由于具有无需标记，高灵敏度，检测快速，并能实时定量测试等优势，已广泛用来研究蛋白质、核酸、多肽、小分子化合物等生物分子的相互作用。我们使用目前在分子互作领域比较权威的Biacore T200，对ZR-001与ASCT2蛋白进行亲和力检测。
使用Biacore T200进行ASCT2蛋白和化合物ZR-001表面等离子互作检测。
1)ASCT2泛素化标记蛋白使用SA芯片偶联，ASCT2标签蛋白使用CM5芯片偶联，用1通道作为对照通道，2号通道偶联目的蛋白；
2)选择多循环动力学检测的方法，使用含有5％DMSO的PBS-P做Running Buffer，结合和解离时间设置为90s，50％DMSO冲洗通道内残留的小分子化合物；
3)每个小分子的浓度范围为0.15625μM-10μM(从10μM开始2倍稀释，共设置6个浓度梯度)，另加3个零浓度验证重复性。每个化合物的检测重复三遍。
图9-B结果表明ASCT2蛋白与ZR-001的结合的KD值为9.93μM，表明ZR-001可以与ASCT2蛋白稳定结合。
谷氨酰胺摄取的测定
(1)同位素的摄取
培养乳腺癌细胞，待细胞数目足量时将细胞1×105cell/well接种在24孔板中，贴壁过夜；MEM培养基配置同位素溶液5μCi/mL[3H]-L-glutamine(Perkin Elmer)，再将配好的同位素溶液加入24孔板，37℃孵育15min，完成孵育后将同位素溶液去除，此过程中需要严格控制同位素溶液加入和去除的时间，使每个孔中的细胞孵育的时间为精确的15min。药物预处理组提前处理后再点板孵育；然后用1×PBS溶液将24孔板洗三遍，洗第一遍时需要严格控制1×PBS溶液加入和去除的时间，第二遍和第三遍不需要控制时间；如果不能立即进行下一步实验操作，应将24孔板在-20℃的条件下保存。
(2)检测放射性
在24孔板的每孔中分别加入220μL浓度为1N的NaOH溶液将细胞裂解30min，裂解完成后从每孔中取出20μL用于BCA定量；取出20μL之后，每孔中加入200μL浓度为1N的HCL溶液进行中和；中和完毕后每孔中加入2mL的闪烁液，充分混匀之后转移至96孔板中，之后便可以进行放射性的检测。即可得到谷氨酰胺摄取的绝对值。
(3)BCA蛋白定量
首先用酶标仪在595nm的条件下测量空白的96孔酶标板各孔的吸光度；将蛋白标准品配置8种浓度，分别0、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL；将检测放射性时裂解完成后从每孔取出的蛋白溶液和蛋白标准品分别加入96孔酶标板；在酶标板中分别加入Brandford孵育30min，然后用酶标仪在595nm下测吸光度。根据蛋白标准品得到标曲，再根据标曲计算各样品的蛋白浓度。最终放射性绝对值/蛋白浓度即可得到各个样品的谷氨酰胺摄取的相对值。
图9C-D结果表明，与没有给药的对照组相比，其中乳腺癌SKBR3细胞株在ZR-001给药分别为1μM和10μM的抑制率为5％和34％，而V9302给药分别为1μM、10μM的抑制率为36％、46％；与对照组相比，乳腺癌MDA-MB-468细胞在ZR-001给药为1μM和10μM抑制率分别为28％和38％，而V-9302给药分别为1μM和10μM的抑制率为21％和44％。结果表明ZR-001对乳腺癌细胞的谷氨酰胺摄取具有浓度依赖性的抑制作用。
图9E-F结果表明，与对照组相比，在乳腺癌细胞株SKBR3及MDA-MB-468中，10μMZR-001的衍生物Y1-Y15对谷氨酰胺摄取具有抑制作用。
实施例10：ZR-001对ASCT2基因及蛋白表达的影响实验
实验步骤：
实时定量PCR
(1)总RNA提取
弃去六孔板培养基，并沿六孔板侧壁缓慢加入预冷的1×PBS洗涤两次，将残留的PBS弃去后加入1mL/孔的Trizol裂解液，冰浴10min，将裂解后的细胞碎片用移液器小心吹下来，吸取裂解液加入到提前准备好的无酶1.5mL的EP管中，-80℃保存留用。从-80℃取出裂解液，每管加入200μL的氯仿，涡旋振摇30s，使得混合溶液成乳浊液，冰上静置5min；在预设温度为4℃离心机12000g/min离心15min，轻轻取出EP管，管内溶液出现明显的分层：上层为无色的RNA萃取液，中间层为白色DNA析出，下层为粉红色蛋白质萃取液，小心吸取上清液500μL，并加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀10次，室温静置10min；于12000g/min条件下4℃离心10min，EP管的管底通常可以见白色沉淀，弃去上清；加入1mL的DEPC水配制75％乙醇，轻轻颠倒，洗涤沉淀，使沉淀飘起但不要使其分散，然后小心吸弃75％乙醇，将EP管室温敞口干燥20min至底部沉淀至透明色，然后加入20μL DEPC处理水，50℃金属浴溶解10min，充分混匀后检测RNA浓度。
(2)RNA逆转录
将总RNA溶解均匀后，使用NanoDrop 2000测定RNA浓度，并用DEPC处理水将其稀释至0.5μg/μL。按照DEPC处理水10μL、RNA稀释液2μL和4×gDNA 4μL体系加入PCR八连管，封口，瞬时离心混匀后放入Bio-Rad My Cycler PCR仪中按照表1所示程序进行逆转录得到cDNA。
表1：逆转录反应程序
温度 时间
25℃ 10min
42℃ 30min
85℃ 5min
4℃ ∞
(3)实时荧光定量PCR
将20μL逆转录得到的cDNA用DEPC水稀释至250μL配制成cDNA稀释液混匀待用。取无酶PCR板，以每孔SYBR Green Master Mix(预混ROX Reference Dye 1)11.4μL、引物(浓度为5μM)1μL以及cNDA稀释液8.6μL加入，配制成体积为20μL每孔的聚合酶链式反应体系，每个样品进行三复孔加入；利用荧光定量PCR光学封板膜封闭复孔，瞬时离心混合体系。按照表2设置PCR反应程序，将样品上机反应检测。
表2
Figure BDA0004176828590000211
图10A-B结果表明ZR-001对SLC1A5的mRNA的表达水平没有影响，表明ZR-001不影响SLC1A5基因的转录。
Western Blot(免疫印迹试验)：
(1)蛋白样品制备
首先将细胞均匀点在6孔板中，待细胞贴壁以后加入不同浓度的ZR-001处理48h；将细胞样品从二氧化碳培养箱中取出，于显微镜下观察细胞密度状态，吸弃培养基后，用4℃预冷的1×PBS缓冲液洗涤两次。悬浮细胞先离心，再用4℃预冷的1×PBS缓冲液洗涤两次。加入100μL预混磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，平稳的放在冰上裂解20min。用干净的刮刀将细胞刮下后，收集到的1.5mL的离心管中，在高速冷冻离心机中以12000rpm转速4℃的条件下离心15min，然后用枪将细胞裂解液移至1.5mL离心管中。整个操作尽量在冰上进行，并用移液器对裂解液体积定量。悬浮则在1.5mL的离心管中直接裂解。将离心后的上清分装离心管中放于-20℃保存。
(2)蛋白定量(BCA法蛋白定量)
制备梯度稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品，准备干净的1.5mL的离心管，编号。精密吸取7μL蛋白样品和标准品加入超纯水稀释10倍至70μL。根据需要配置BCA工作液(工作液A：工作液B＝50:1(v/v))，混合均匀待用。将稀释后蛋白样品及标准品稀释液20μL加入到96孔板中(每个样3复孔)，再加入混合好的BCA工作液200μL，轻轻晃匀。将96孔板放置37℃烘箱中静置15min。在全波长酶标仪检测激发波长为562nm处测定OD值。建立标准曲线，并计算蛋白浓度，按照待测样品中的最低浓度调整其他样品浓度(使用细胞裂解液进行稀释)，确保所有样品的上样量均相同。样品中分别加入5×loading buffer(1/4蛋白样品体积)，涡旋混合均匀后，于100℃的金属浴中加热变性10min，变性后样品于-20℃或者-80℃保存。
(3)SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳
首先进行制胶根据目标蛋白分子量的大小，确定分离胶的浓度(如表3所示)；将配胶用玻璃板洗净，在80℃烘箱中烘干，固定于配胶架上，加入三蒸水进行检漏，若发生漏液则取下重新固定；将玻璃板中的三蒸水弃去，之后按比例配好分离胶混合液振荡混匀(如表4所示)，灌入玻璃板中至配胶夹上缘以及板口之间位置立刻用三蒸水进行液封，室温静置待其凝固，时间大概需要30min；分离胶凝固之后弃去液封使用的三蒸水，并用滤纸吸干残留的水分；再将配置好的浓缩胶轻轻震荡混匀灌入分离胶上方，迅速***梳齿，室温静置待其凝固，时间大概为15min，凝固后在三蒸水中浸泡并在4℃保存备用；电泳时取出提前配好的胶固定于电泳夹，加入新配置的1×电泳缓冲液；取出蛋白样品于室温解冻后充分涡旋、离心；拔下梳齿进行上样，上样结束后在外槽中加入回收的1×电泳缓冲液，开始进行电泳，电泳共分为两个阶段，第一阶段80V恒压电泳40min；第二阶段120V恒压电泳1h；取出-25℃保存的1×湿转液于室温下解冻。
表3：不同浓度分离胶的最佳分离范围
SDS-PAGE分离胶浓度 最佳分离范围
6％胶 50-150kD
8％胶 30-90kD
10％胶 20-80kD
12％胶 12-60kD
15％胶 10-40kD
表4：分离胶/浓缩胶配方
Figure BDA0004176828590000231
上述液体添加完毕后，在分离胶加入100μL 10％APs，10μL TEMED，浓缩胶30μL10％APs，5μL TEMED；立即混匀灌胶。
(4)湿转
电泳结束后，小心撬开玻璃板，取出电泳分离后的凝胶，根据预染Marker位置切下所需目的蛋白所在的凝胶，并按照正极(白)-海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵-负极(黑)的顺序夹好湿转夹，PVDF膜用前需置于甲醇中活化30s，夹湿转夹过程中要注意排空凝胶与PVDF膜之间的气泡，然后按照正负极对应的方向放至湿转槽中，加入提前在4℃预冷的1×湿转液和冰盒，湿转槽冰浴以维持低温状态，在0.32A恒定电流条件下转膜。根据蛋白分子量按照1min/kDa来决定湿转时间。
(5)封闭以及抗体的孵育
湿转结束后，将PVDF膜蛋白条带小心取出，置于蛋白孵育盒中，加入封闭液(5％BSA)中，与室温条件下，置于摇床封闭1h；封闭结束后，回收封闭液，加入一抗稀释液，置于摇床于4℃孵育12h；一抗孵育结束后，回收一抗稀释液，加入1×TBST，置于摇床上洗一抗，每次5min，共3次；弃去1×TBST，加入二抗稀释液，置于摇床于4℃孵育1h，二抗孵育结束后，回收二抗稀释液，加入1×TBST，置于摇床上除去未结合的二抗稀释液，每次5min，共4次；洗二抗结束后，曝光。
(6)化学发光成像
配置ECL发光液(A液：B液＝1:1(v/v))进行曝光，将PVDF膜蛋白条带小心取出，放置于Bio-Rad全自动凝胶成像仪中成像板上，打开程序，调节焦距亮度等参数，保存模板，滴加提前配置好的发光液，点击曝光，保存数据。
图10C-D结果表明，与对照组相比，其中乳腺癌MDA-MB-231细胞株在ZR-001给药分别为1μM、3μM、10μM、30μM时，ASCT2的蛋白水平逐渐下调；与对照组相比，乳腺癌BT-549细胞在ZR-001给药为0.3μM、1μM、3μM、10μM时，ASCT2的蛋白水平逐渐下调。结果表明ZR-001对能剂量依赖性诱导乳腺癌细胞株中的ASCT2蛋白水平下调。
实施例11：ZR-001及其衍生物对乳腺癌细胞增殖的影响
实验步骤：
MTT实验：
将状态良好、处于指数生长期的TNBC细胞株，用无菌1×PBS洗涤一次后，加入0.25％的胰酶(含EDTA)消化，吹落细胞并将细胞悬液转移至干净灭菌的离心管中，l000rpm，5min，弃上清，加入少量完全培养基吹悬细胞沉淀，计数并将细胞稀释至(2-4)×104个/mL；用排枪吸取细胞稀释悬液，按180μL/孔接种于96孔板上，置37℃恒温、5％CO2的培养箱中培养；在细胞接种24h后，按20μL/孔加入受试药物，每个浓度设3个复孔，继续培养96h；每孔加20μLMTT溶液，于培养箱中孵育4h；用1mL注射器小心吸去上清，每孔加150μLDMSO，振摇96孔板使结晶充分溶解；在酶标仪中测定570nm波长处的OD值，以溶剂孔为对照计算各药物浓度的细胞抑制率，绘制抑制率曲线，并计算IC50值。细胞抑制率计算公式如下：
Figure BDA0004176828590000251
图11A结果表明，其中乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞、BT-549细胞、HCC-1806、HCC-1937、MDA-MB-436、HCC-38在ZR-001给药0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM时，ZR-001能剂量依赖性抑制乳腺癌细胞的存活，且IC50分别为3.421μM、1.214μM、2.897μM、4.475μM、11.98μM、4.967μM。
平板克隆形成实验：
(1)取生长状态良好，处于对数期的细胞，进行消化、离心，细胞重悬后进行计数，取对应体积的细胞悬液于完全培养基中，吹打混匀后，将细胞悬液加入到6孔板中。每个孔2mL细胞悬液，含1000个细胞。上下左右晃匀六孔板，置于37℃恒温、5％CO2的培养箱中培养；
(2)培养24h后，更换新鲜的完全培养基，并随机分为5组：阴性对照组、给药组(低、中、高剂量)、阳性对照组；继续于敷箱中培养，每3-4天更换一次培养基，至单个细胞团块至少含有50个细胞时，终止培养；
(3)取出六孔板，弃上清，并用1×PBS清洗一次，每孔加入4％的多聚甲醛，室温固定30min，弃固定液，每孔加入1mL 0.2％的结晶紫染液，室温避光染色30min；最后用小流量的自来水冲洗六孔板板底，洗掉结晶紫染液，空气干燥后进行拍照。
图11B-C结果表明MDA-MB-231细胞在ZR-001给药分别为1μM、3μM、10μM以及阿霉素给药0.1μM的生长抑制率分别为11.5％、60.5％、100％以及100％；BT-549细胞在ZR-001给药分别为1μM、3μM、10μM以及阿霉素给药0.1μM的生长抑制率分别为78.7％、99％、100％以及100％；HCC-1806细胞在ZR-001给药分别为1μM、3μM、10μM以及阿霉素给药0.1μM的生长抑制率分别为65.2％、99％、100％以及100％；HCC-1937细胞在ZR-001给药分别为1μM、3μM、10μM以及阿霉素给药0.1μM的生长抑制率分别为54.2％、84.9％、100％以及100％。结果显示ZR-001能够显著抑制乳腺癌细胞的克隆形成能力。生长曲线实验：
(1)取生长状态良好，处于对数期的细胞，进行消化、离心，细胞重悬后进行计数，稀释成6×103个/mL，取所需体积的细胞悬液，重悬于完全培养基中，吹打均匀后，以180μL/孔，每孔1000个细胞，接种于96孔板中，置于37℃恒温、5％CO2的培养箱中培养；
(2)随机分为5组：阴性对照组、给药组(低、中、高剂量)、阳性对照组，继续于敷箱中培养；
(3)采用CCK-8试剂盒测量OD值，每24h一次，连续6天。
图11D结果表明，与对照组相比MDA-MB-231细胞在ZR-001给药分别为1μM、3μM、10μM、30μM的生长抑制率分别为16％、46％、54％、66％以及阳性药阿霉素在给药1μM的生长抑制率为74％；与对照组相比BT-549细胞在给药分别为1μM、3μM、10μM的生长抑制率为11％、44％、73％以及阿霉素在给药1μM的生长抑制率为91％。以上结果表明ZR-001能够显著抑制乳腺癌细胞的生长。
图12A-B结果表明，与对照组相比，ZR-001的衍生物Y1-Y15作用5天后能够显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231及BT-549细胞的生长。
EdU细胞增殖检测：
首先取生长对数期生长状态良好的细胞进行实验，将细胞在用0.25％的胰酶进行消化，用完全培养基重悬，均匀点到96孔板中，密度为2×103细胞/mL，体积为90μL/孔，然后于二氧化碳培养箱培养24h后进行药物处理。处理72h以后采用EdU标记，进行EdU染色。
(1)EdU标记
用细胞培养基按体积比为1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量30μM EdU培养基；将96孔板中的培养基置换出来，并在孵箱里培养90min。然后采用PBS清洗细胞1-2次，每次5min。
(2)细胞固定化
每孔加入50μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min，弃固定液；然后每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min后，弃甘氨酸溶液；然后每孔加入100μLPBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS；最后每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10min；PBS清洗1次，5min。
(3)Apollo染色
首先每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液(表5)，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液。然后加入100μL渗透剂(0.5％TritonX100的PBS)脱色摇床清洗2-3次，每次10min，弃渗透剂；紧接着每孔每次加入100μL甲醇清洗1-2次，每次5min；PBS清洗1次，每次5min。
表5：Apollo染色反应液
配制顺序 Apollo染色反应液 500μL
1 去离子水 469μL
2 Apollo反应缓冲液(试剂B) 25μL
3 Apollo催化剂溶液(试剂C) 5μL
4 Apollo荧光染料溶液(试剂D) 1.5μL
5 Apollo缓冲添加剂(试剂E) 5mg
(4)DNA染色
用去离子水按体积比为100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存每孔加入100μL 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；然后每孔每次加入100μL PBS清洗1-3次。
(5)拍照：采用倒置荧光显微镜进行拍照。
图11E-H果表明MDA-MB-231细胞在ZR-001给药分别为1μM、3μM、10μM、30μM以及阿霉素给药1μM的生长抑制率分别为22％、10％、42.4％、62.6％以100％；BT-549细胞在ZR-001给药分别为1μM、3μM、10μM以及阿霉素给药0.5μM的生长抑制率分别为14.6％、22％、37％以及100％。以上结果表明，ZR-001能够显著抑制乳腺癌细胞的DNA复制活性，同时对MCF10A细胞进行给药测试，在治疗用药浓度下对正常细胞的抑制作用极小。
细胞周期阻滞试验:
(1)取对数期细胞进行消化、离心重悬后进行细胞计数，调整细胞密度至5×104细胞/mL，并将其接种于六孔板中，每孔2mL完全培养基培养，置二氧化碳培养箱中培养，24h后进行药物处理；
(2)药物处理72h后，收集细胞上清液于1.5mL离心管中，用0.25％的胰酶消化细胞，将消化下来细胞收集于同一离心管中800rpm离心5min；
(3)加入1mL预冷的1×PBS重悬细胞，并收集于1.5mL的EP管中，以800rpm离心5min，弃去上清，每管加入300μL预冷的1×PBS，再加入700μL预冷的无水乙醇，使乙醇最终含量为70％，轻轻吹散细胞，置于4℃冰箱固定12h；
(4)将固定12h的细胞样品1000rpm条件下离心5min，轻轻吸弃上清，加入1mL预冷的1×PBS洗涤两遍，用移液器轻轻吹散细胞；每个样品加入500μLPI/RNaseA染色工作液(PI:RNaseA＝9:1)，室温避光染色30min；染色结束混合均匀后流式细胞仪检测。
图11I-J结果表明，与空白对照组相比，MDA-MB-231细胞在ZR-001给药10μM时G0/G1期细胞比例增加了10.8％。而G2/M期细胞比例减少了12.51％。以上结果表明ZR-001能诱导乳腺癌细胞产生G1期阻滞，从而抑制乳腺癌细胞增殖。
实施例12：ZR-001诱导乳腺癌细胞发生氧化应激
实验步骤：
活性氧检测
(1)细胞准备
将细胞均匀点在12孔板上，完全贴壁后，密度达40-50％之间，弃掉培养基，换取无血清培养基，药物处理72h之后，进行装载探针。
(2)原位装载探针
按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于12孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于500μL，37℃细胞培养箱内孵育30min。用1×PBS洗涤细胞三次。
(3)流式检测
用胰酶将细胞从12块板中消化下来于1.5mLEP管中，800rpm离心5min，弃上清，加1mL 1×PBS洗涤两次，离心弃上清，再加1mL 1×PBS于EP管中，吹打均匀后，将细胞悬液吸入流式管中，上机检测。
图13A-B结果表明MDA-MB-231细胞在ZR-001在给药分别为3μM、10μM、30μM以及阳性对照Rosup处理之后的ROS分别增加47％、65％、74％以及100％；BT-549细胞在ZR-001给药分别为0.3μM、1μM、3μM、10μM以及阳性对照Rosup处理之后的ROS分别增加2％、24％、62％、75％以及79％。结果表明ZR-001能够显著促进乳腺癌细胞氧化应激水平，同时，其对于正常细胞的氧化应激水平的促进作用较弱。
实施例13：ZR-001诱导乳腺癌细胞发生自噬
实验步骤：
透射电镜扫描
(1)取处于对数生长期的人乳腺癌癌细胞，消化，离心，以适宜的密度接种于含有12孔爬片的12孔板中，置于37℃恒温、5％CO2的培养箱培养；24h后，换新鲜的完全培养基并加入不同浓度的受试药物处理48h后弃去培养基，加入1×PBS洗两次。然后用胰酶将细胞消化下来置于1.5mL EP管中，800rpm，4℃离心5min，再用1×PBS洗一次，弃上清；
(2)加戊二醛溶液，置于4℃固定；
(3)用磷酸盐缓冲液冲洗4次，每次一h；
(4)用1％锇酸4℃固定2h；
(5)ddH2O冲洗3次，每次10min；
(6)2％醋酸铀水溶液染2h；
(7)配制梯度乙醇溶液，逐次脱水,每15min加入50％、70％、90％、100％乙醇在4℃条件下脱水15min；
(8)在100％丙酮中浸泡样品脱水2次，每次20min；
(9)100％丙酮：包埋剂(1：1)室温处理2h；
(10)准备好标签和包埋模具之后，37℃恒温箱放置12h浸泡于完全包埋液中的样品，放入包埋板后放置45℃烘箱12h，60℃烘箱保持48h进行包埋；
(11)用切片Leica EM UC7进行超薄切片；
(12)用硝酸铅染色5min冲洗3次后上电镜观察，FEI Tencai G2透射电子显微镜观察样品细胞的超微结构。
图14A结果表明，比于空白对照组，用30μM ZR-001处理MDA-MB-231细胞之后，进行透射电镜扫描，发现双层膜结构显著增多，且双层膜中包含有胞浆结构，可以确定是自噬体增多。结果表明ZR-001可以诱导自噬体的形成。
MDC染色
(1)细胞准备
取处于对数生长期的人乳腺癌癌细胞，消化，离心，以适宜的密度接种于含有12孔爬片的12孔板中，置于37℃恒温、5％CO2的培养箱培养；24h后，换新鲜的完全培养基并加入不同浓度的受试药物分别处理12h、24h、48h后弃去培养基，加入1×PBS洗两次。
(2)染核
用4％的多聚甲醛固定15min后，每孔加入200μL Hoechest33342染液染色30min后，用1×PBS洗涤三遍。
(3)染自噬体
以1×Wash Buffer：MDC染色液体积比＝9：1稀释染色液至工作浓度，计算一次实验所需要的染色液体积，配置MDC染色工作液，轻轻混匀；每孔加入200μLMDC染色工作液，室温避光染色30min后，弃去染色液，用1×PBS洗涤三遍。
(4)封片
载玻片滴荧光猝灭剂2.5μL，将爬片倒扣在载玻片上，放到4℃保存。
(5)拍照
用激光共聚焦显微镜进行拍照，结果如图14B-C所示，与空白对照组相比，MDA-MB-231细胞在用30μM ZR-001给药12h、24h后，MDA-MB-231细胞中核周绿色点状荧光颗粒都显著增多，且在用阳性药20μM CQ处理细胞24h后核周绿色点状荧光颗粒显著增多；与空白对照组相比，HCC-1937细胞在用30μM ZR-001给药12h、24h后，MDA-MB-231细胞中核周绿色点状荧光颗粒都显著增多，且在用阳性药20μM CQ处理细胞24h后核周绿色点状荧光颗粒显著增多。结果表明ZR-001能诱导乳腺癌细胞中自噬体增多。
Western blots(免疫印迹试验)结果如图14D-E所示，与空白对照组相比，MDA-MB-231细胞在用30μM ZR-001给药6h、12h、24h、48h后，LC-3BⅡ的蛋白水平呈时间依赖性上调，且在用阳性药20μM CQ处理MDA-MB-231细胞24h后LC-3BⅡ的蛋白水平也上调；与空白对照组相比，HCC-1937细胞在用30μM ZR-001给药12h、24h、48h后，LC-3BⅡ的蛋白水平呈时间依赖性上调，且在用阳性药20μM CQ处理HCC-1937细胞24h后LC-3BⅡ的蛋白水平也上调。结果表明ZR-001能诱导乳腺癌细胞自噬增强。
免疫荧光
(1)细胞处理
取处于对数生长期的人乳腺癌癌细胞，消化，离心，以适宜的密度接种于含有12孔爬片的12孔板中，置于37℃恒温、5％CO2的培养箱培养；24h后，换新鲜的完全培养基并加入不同浓度的受试药物分别处理12h、24h、48h后弃去培养基，加入1×PBS洗两次。(2)固定
用预冷多聚甲醛(4％)，每孔700μL，室温固定30min后，1×PBS浸洗玻片3次，每次3min。
(3)通透
用0.5％的TritonX-100透膜15min，1×PBS浸洗玻片3次，每次3min。
(4)封闭
用5％的BSA封闭1h。
(5)孵育一抗
将一抗用5％的封闭液按照1:200(请明确质量比还是体积比)的比例稀释好之后，滴20μL到膜上，将爬片倒扣在上面4℃过夜孵育后，放回12孔板，正面朝上，1×PBS浸洗玻片3次。
(6)孵育二抗
将二抗用1×PBS按照1:400(请明确质量比还是体积比)的比例稀释，同时将Hochest按1：1000(请明确质量比还是体积比)比例加入到二抗稀释液中，滴20μL到膜上，将爬片倒扣在膜上常温孵育1h后，放回12孔板，正面朝上，1×PBS浸洗玻片3次。
(7)抗荧光淬灭剂封片
载玻片滴荧光猝灭剂2.5μL，将爬片倒扣在载玻片上，放到4℃保存。
(8)拍照
用激光共聚焦显微镜进行拍照，结果如图14F-G所示，与空白对照组相比，MDA-MB-231细胞在用30μM ZR-001给药12h、24h、48h后，MDA-MB-231细胞中绿色点状荧光斑点呈时间依赖性增多，且在用阳性药20μM CQ处理MDA-MB-231细胞24h后细胞中绿色点状荧光斑点增多；与空白对照组相比，HCC-1937细胞在用30μM ZR-001给药12h、24h、48h后，HCC-1937细胞中绿色点状荧光斑点呈时间依赖性增多，且在用阳性药20μM CQ处理HCC-1937细胞24h后细胞中绿色点状荧光斑点增多。结果表明ZR-001能诱导乳腺癌细胞自噬增强。
Western blots结果如图14H-I所示，在MDA-MB-231细胞分别用30μMZR-001、20μM自噬溶酶体抑制剂CQ处理48h以及用30μM ZR-001和20μM自噬溶酶体抑制剂CQ同时处理48h之后，与单独ZR-001作用组相比，CQ可以进一步诱导LC3BⅡ的蛋白表达；在HCC-1937细胞分别用30μM ZR-001、20μMCQ处理24h以及用30μM ZR-001和20μM CQ同时处理24h之后，与单独ZR-001作用组相比，CQ可以进一步诱导LC3BⅡ的蛋白表达，以上结果表明ZR-001增加了乳腺癌细胞中的自噬潮。
实施例14：ZR-001抑制体内乳腺肿瘤的增殖
实验步骤：
裸小鼠异种移植瘤模型的构建
(1)造模、给药方法
取生长旺盛期的MDA-MB-231细胞接种，每只小鼠2.0×106/100μL细胞悬液，在无菌条件接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠异种移植肿瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100mm3后将动物随机分组。使用测量瘤体积的方法，动态观察ZR-001给药以后的效应。其中ZR-001与V9302均采用腹腔给药，紫杉醇采用尾静脉注射，ZR-001每天给药一次，V9302每周给一次，紫杉醇每周给两次。肿瘤体积的测量次数为每周3次，每次测量同时还需同时称量小鼠体重，给药第21天后将小鼠处死。V9302采用2％的DMSO生理盐水配置，ZR-001采用含有10％的DMSO的玉米油配置。
(2)检测指标及计算方法
a)肿瘤体积(tumor volume,TV)，计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长宽；
b)相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝TV1/TV0。其中TV0为分笼给药时即(d0)肿瘤体积，TVt为每一次测量时的肿瘤体积；
c)相对肿瘤增殖率T/C(％)计算公式为：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％
TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。试验结果以相对肿瘤增殖率T/C(％)作为抗肿瘤活性的评价指标；
图15A-F结果表明，与对照组相比，25mg/kg ZR-001给药组、50mg/kg ZR-001给药组与75mg/kg V-9302给药组以及10mg/kg紫杉醇给药组的瘤体积和瘤重均显著下降，与对照组相比，25mg/kg ZR-001给药组、50mg/kg ZR-001给药组、75mg/kg V-9302给药组以及10mg/kg紫杉醇给药组对肿瘤增长的抑制率分别为36％、48％、44％及87％。

Claims (6)

1.一种抑制ASCT2的小分子化合物，其特征在于：所述化合物的分子式为C35H39N3O3，其结构式为：
Figure FDA0004176828570000011
2.如权利要求1所述的抑制ASCT2的小分子化合物的衍生物，其特征在于：所述衍生物的分子式为C34H39N4O3，其结构式包括：
Figure FDA0004176828570000012
Figure FDA0004176828570000013
中任意一种。
3.如权利要求1所述的抑制ASCT2的小分子化合物的衍生物，其特征在于：所述衍生物分子式为C33H39N5O3，其结构式包括：
Figure FDA0004176828570000021
Figure FDA0004176828570000022
任意一种。
4.如权利要求1所述的抑制ASCT2的小分子化合物的衍生物，其特征在于：所述衍生物分子式为C32H39N6O3，其结构式包括：
Figure FDA0004176828570000023
Figure FDA0004176828570000031
Figure FDA0004176828570000032
中任意一种。
5.如权利要求1-4任一项所述的化合物及其衍生物的应用，其特征在于：在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的化合物及其衍生物的应用，其特征在于：所述肿瘤为乳腺癌肿瘤。
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