CN116396959A - 抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用 - Google Patents

抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用，属于猪星状病毒检测技术领域。本发明的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株的制备方法包括如下步骤：1)采用pET32a‑PAstV5‑Cap‑1融合蛋白对小鼠进行免疫；2)取步骤1)中免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；3)对步骤2)制得的杂交瘤细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；4)对步骤3)筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，筛选即得。该细胞株能够稳定的分泌抗体，制得的PAstV5单克隆抗体ELISA效价可达到50万倍以上，并可应用于ELISA、WB、IFA中对PAstV5的检测。

Description

抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、 制备、应用
技术领域
本发明涉及猪星状病毒检测技术领域，更具体地说，涉及一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体及其引物、制备方法和应用。
背景技术
猪星状病毒PAstV首次由Bridger通过电镜在3周龄的乳猪腹泻粪样中观察到，PAstV感染猪后可引起腹泻、呕吐、脱水和生长迟缓等临床症状，PAstV常与冠状病毒、嵌杯状病毒、轮状病毒及其他肠道病毒混合感染造成猪急性胃肠炎。有学者认为PAstV是引起近年来仔猪病毒性腹泻疫情的主要病原之一，对断奶前仔猪侵害尤为严重，给养猪业带来了巨大影响。
星状病毒无囊膜，为单股、正链RNA病毒，基因组全长6.4–7.8kb，病毒颗粒直径大约是28–30nm。星状病毒由5’和3’非翻译区(Untranslated region，UTR)、三个开放阅读框Open reading frames(ORF1a、ORF1b、ORF2)和poly(A)组成。ORF1a和ORF1b位于基因组的5’端，在ORF1a/b的交界处有一个七核苷酸(AAAAAAC)的核糖体框架移位信号(RFS)，序列高度保守。整个ORF1编码非结构蛋白nsp1a和nsp1ab，它们通过蛋白水解加工成较小的蛋白，包括RNA依赖性RNA聚合酶，丝氨酸蛋白酶，病毒基因组相关蛋白(VPg)和其他几种功能未知的蛋白质。ORF2编码结构蛋白(衣壳蛋白CP)。在所有星状病毒中，衣壳蛋白的N末端比C末端更加保守，因为所有星状病毒的衣壳蛋白均在N端包含一个富含碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)区域，该区域被认为与病毒内部的基因组RNA相互作用。
星状病毒具有基因多型性与变异性,可以发生基因重组,使其具有不俗的适应宿主能力和跨种间传播能力,具有潜在的人畜共患风险。ORF1a区域内可以发生基因重组，除此之外，ORF1b和ORF2的重叠区是发生同源重组的高频区域，该区域内含有一个相对稳定的发夹结构，重组主要发生在这个发夹结构区域。
Jonassen等人研究发现人、猫星状病毒和PAstV遗传距离最相近，提示星状病毒在进化过程中存在种间交叉传播，有可能是猪传给猫、猫再传给人或者通过中间宿主进行传播。Ulloa等人发现，来自住在同一栋房子的人及猪腹泻样品中人星状病毒和PAstV部分基因出现重组，认为星状病毒可能存在种间交叉传播。星状病毒的多宿主性、基因差异性及其重组现象和跨种间传播及适应新宿主的能力，使得星状病毒成为潜在的新兴人畜共患病原，因此，对猪星状病毒的及时检测发现并控制具有重要的公共卫生价值。
目前已发现的猪星状病毒基因型共有5种(PoAstV1-5)，序列分析表明五种基因型之间差异很大，基因组彼此间同源性只有40％左右，这也反映出PoAstV间巨大的遗传差异，这也导致对这五种猪星状病毒的检测方法的差异性非常大，相互之间的借鉴意义很小。
在猪星状病毒的抗体检测方面，针对猪星状病毒1型的检测研究较多，例如《猪星状病毒1型衣壳蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备》(中国预防兽医学报，王蔚怡等，2021.4)公开了一种猪星状病毒1型多克隆抗体的制备方法，该方法根据PAstV-GX1株Cap蛋白Cs(aa420-aa669)基因序列设计引物，PCR扩增该片段(Cs)后克隆于pET-32a(+)原核表达载体，构建重组表达质粒pET32a-Cs，将其转化E.coli BL21感受态细胞，经终浓度1mmol/L的IPTG在37℃诱导6h后经SDS-PAGE检测表达产物，结果显示在大约47ku处出现目的蛋白，且该蛋白以可溶性形式表达。将重组Cs蛋白经Ni柱纯化后乳化，按100μg/只免疫6周龄BALB/c小鼠，三免后5d采血分离血清，经western blot和间接免疫荧光检测结果显示，获得的Cap蛋白高变区多克隆抗体可特异性识别PAstV-GX1感染的PK15细胞表达的病毒蛋白。
但是，对其他型的猪星状病毒的抗体检测还未见报道，特别是对猪星状病毒5型的检测，难度更大一些，这主要是跟猪星状病毒5型的结构有关系。
2011年在加拿大养猪场成年猪盲肠内粪便标本中发现一种新型PAstV，这种PAstV无法用病毒通用引物检测，因为这株病毒并没有在多种病毒内均存在的高度保守的s2m茎环结构。对毒株进行***发育分析，发现其在哺乳动物病毒科中形成了一个独特的谱系，这株PAstV与经典型的PoAstV-1仅有25％-30％的氨基酸同源性，且与其他三种PAstV基因型均存在一定的遗传距离，于是将其命名为PAstV-5。
中国国内第一株PAstV-5(KP747574)序列是2015年在健康家养仔猪中检测到的，且中国最早发现的三株PoAstV-5并不分布在同一进化枝上，呈现较为复杂的分布，PoAstV-5的遗传性多样且复杂。因此，如何开发一种与PAstV5血清特异性结合效果好且效价较高的酶标抗体具有重要的意义。
发明内容
为了提高抗体与PAstV5血清特异性结合效果，本申请提供一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体及其引物、制备方法和应用。
一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用PCR引物，所述引物的核苷酸序列如下：
P1:5’-ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt-3’；
P2:5’-aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg-3’。
一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC N0:C2022393的杂交瘤细胞株产生。
一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC N0:C2022393。
一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：
1)采用pET32a-PAstV5-Cap-1融合蛋白对小鼠进行免疫；
2)取步骤1)中免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；
3)对步骤2)制得的杂交瘤细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；
4)对步骤3)筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，筛选得到所述单克隆抗体细胞株。
步骤3)中采用间接ELISA方法筛选。
上述pET32a-PAstV5-Cap-1融合蛋白利用上述引物扩增、克隆、重组、融合、纯化得到。
利用上述引物进行PCR扩增时以仔猪粪便为模板。仔猪粪便中含有猪星状病毒五型。PCR反应体系为：Primer STAR 25uL、DNA模板(cDNA)2uL、上游引物(10μmol/L)1uL、下游引物(10μmol/L)1uL、双蒸水21uL。总体积为50uL。PCR反应程序为：98℃5min、98℃30s、61.6℃30s、72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
对PCR扩增产物克隆时，是对扩增产物进行培养，得到单克隆。采用通用引物进行菌液PCR鉴定，获得阳性克隆。
其中，通用引物序列如下：
P1：5’-cgaacgccagcacatggaca-3’；
P2：5’-tgctagttattgctcagcgg-3’；
PCR反应体系为：
rTaq 12.5uL、DNA模板(菌液)2uL、上游引物(10μmol/L)0.5uL、下游引物(10μmol/L)0.5uL、双蒸水9.5uL。总体积为25uL。
PCR反应程序为94℃5min，94℃30s，61.6℃30s，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸5min。
重组时，将上述得到的阳性克隆经过扩大培养，提取质粒pET32a-PAstV5-Cap-1，菌液PCR鉴定后进行测序。将测序正确的阳性质粒pET32a-PAstV5-Cap-1转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)，并进行PCR鉴定，获得重组表达菌株pET32a-PAstV5-Cap-1/BL21(DE3)。
融合时，将上述重组表达菌株进行诱导，即得。诱导时的诱导剂(操纵子)为IPTG，使用时采用终浓度为100mmol/L的IPTG液。诱导条件为37℃、220rpm。得到的融合蛋白为38kD。
纯化时，采用超声对诱导表达后的蛋白进行破碎。
一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的制备方法，利用保藏编号为CCTCCN0:C2022393的杂交瘤细胞株在小鼠腹腔内进行诱生增殖，制得所述抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体。
一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的在检测猪星状病毒五型方面的应用。
所述应用为ELISA检测、WB检测或IFA检测。
所述应用是制备猪星状病毒五型PAstV5间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒包含上述的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本发明表达纯化的PAstV5 Cap蛋白能与PAstV5阳性血清反应，具有良好的免疫原性；将纯化好的蛋白免疫小鼠，筛选单克隆抗体，杂交瘤细胞株能够稳定的分泌抗体。本发明制备的单克隆抗体ELISA效价可达到50万倍以上，并可应用于ELISA、WB、IFA中对PAstV5的检测。
附图说明
图1为实施例1的PAstV5 Cap蛋白421-921bp片段的PCR扩增电泳图。
图2是实施例3中pET32a-PAstV5-Cap蛋白诱导表达鉴定的考马斯亮蓝染色图。其中，泳道M为蛋白质分子质量标准，泳道1为pET32a-BL21(DE3)空载体诱导对照，泳道2为pET32a-PAstV5-Cap-1/BL21(DE3)蛋白诱导前全菌，泳道3为IPTG诱导pET32a-PAstV5-Cap-1/BL21(DE3)菌体裂解物；
图3是实施例4中Westen blot鉴定融合蛋白在大肠杆菌中的表达。其中，泳道M为蛋白质分子质量标准，泳道1为pET32a-BL21(DE3)空载对照，泳道2为pET32a-PAstV5-Cap-1/BL21(DE3)菌体裂解物；
图4是实施例5中分析融合蛋白的表达形式的考马斯亮蓝染色图。其中，泳道M为蛋白质分子质量标准，泳道1为pET32a-BL21(DE3)空载对照，泳道2为沉淀，泳道3为上清,泳道4为全菌。
图5是实施例5中Westen blot分析融合蛋白的表达形式。其中，泳道M为蛋白质分子质量标准，泳道1为pET32a-BL21(DE3)空载对照，泳道2为沉淀，泳道3为上清。
图6是实施例5中SDS-PAGE分析纯化前后的融合蛋白。其中，泳道M为蛋白质分子质量标准，泳道1为pET32a-BL21(DE3)空载对照，泳道2为纯化前融合蛋白，泳道3为纯化后融合蛋白。
图7是实施例6中SDS-PAGE分析纯化前后的融合蛋白。其中，泳道M为蛋白质分子质量标准，泳道1为pET32a-BL21(DE3)空载对照，泳道2为纯化前融合蛋白，泳道3为纯化后融合蛋白。
图8是实施例6中间接免疫荧光方法对单克隆抗体进行鉴定结果。其中，b为蓝色荧光为核，a为绿色荧光为PAstV5 Cap蛋白。
图9是实施例6中间接免疫荧光方法对单克隆抗体进行鉴定结果。其中，b为蓝色荧光为核，a为绿色荧光为PAstV5 Cap蛋白。
图10是实施例6中间接免疫荧光方法交叉试验验证单克隆抗体的特异性。其中，b为蓝色荧光，a为绿色荧光。
图11是实施例6中Westen blot方法验证单克隆抗体的特异性。
图12、图13是实施例1中PAstV5 Cap蛋白的抗原性、亲水性分析及胞内、胞外分布预测，经预测，均为胞外区，无跨膜螺旋区。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本申请作进一步详细说明。
PAstV5 Cap蛋白是唯一的结构蛋白，决定病毒毒力、细胞嗜性和致病性的主要因素；作为星状病毒唯一的结构蛋白，cap蛋白免疫原性较好，且N端保守性较高，可作为血清学检测的靶区域。
实施例1(PAstV5-Cap-1基因的PCR扩增)
从NCBI中获取PAstV5-Cap-1的基因序列，根据表达用质粒pET32a和基因序列分析，选取BamHI和HindIII为酶切位点，设计引物序列如下：
P1:5’-ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt-3’；
P2:5’-aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg-3’；
以河南省内2021年冬春季节2月龄内仔猪粪便为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系为：
Primer STAR 25uL、DNA模板(cDNA)2uL、上游引物(10μmol/L)1uL、下游引物(10μmol/L)1uL、双蒸水21uL。总体积为50uL。
PCR反应程序为：98℃5min、98℃30s、61.6℃30s、72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，获得501bp大小的条带，结果如图1所示。
图1为PAstV5 Cap蛋白421-921bp片段的PCR扩增电泳图。其中，第一泳道为DNA标准2K plusⅡMaker,第2泳道为阴性对照，第3泳道为PAstV5 Cap蛋白421-921bp片段。表明成功获得了大小正确的片段。
实施例2(重组表达载体和表达菌株的构建)
将实施例1扩增获得的PAstV5-Cap-1基因和质粒pET32a分别进行双酶切，凝胶回收，连接、转化后涂布LB/Amp平板，37℃温箱中倒置培养。挑取LB/Amp平板上的单克隆，摇菌后利用通用引物进行菌液PCR鉴定，获得阳性克隆pET32a-PAstV5-Cap-1；
其中，通用引物序列如下：
P1：5’-cgaacgccagcacatggaca-3’；
P2：5’-tgctagttattgctcagcgg-3’；
PCR反应体系为：
rTaq 12.5uL、DNA模板(菌液)2uL、上游引物(10μmol/L)0.5uL、下游引物(10μmol/L)0.5uL、双蒸水9.5uL。总体积为25uL。
PCR反应程序为94℃5min，94℃30s，61.6℃30s，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸5min。
阳性克隆pET32a-PAstV5-Cap-1经扩大培养，提取质粒pET32a-PAstV5-Cap-1，菌液PCR鉴定后进行测序。
将测序正确的阳性质粒pET32a-PAstV5-Cap-1转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)，并进行PCR鉴定，获得重组表达菌株pET32a-PAstV5-Cap-1/BL21(DE3)。
实施例3(融合蛋白的诱导表达)
利用终浓度为100mmol/L的IPTG在37℃、220rpm条件下对重组表达菌株pET32a-PAstV5-Cap-1/BL21(DE3)经诱导获得约38KD的融合蛋白，大小符合预期；空载没有获得蛋白条带，结果如图3所示。
实施例4(Western blot验证)
为了进一步验证融合蛋白表达，对融合蛋白进行针对表达标签的His的Westernblot鉴定。
诱导表达后，收集菌体，煮样后进行SDS-PAGE，同时设置空载对照组。利用PVDF膜转膜75min后抗体孵育：取出PVDF膜，再使用5％脱脂奶37℃封闭2h；取出PVDF膜，使用5％脱脂奶稀释的鼠源His标签单抗隆抗体(1:5000稀释)，4℃摇床孵育过夜，采用PBST洗膜4次，每次清洗5min；显影、曝光。结果如图4所示，表明所表达的蛋白为目的蛋白。
实施例5(融合蛋白表达形式鉴定和蛋白纯化)
诱导表达后收集菌体，加入PBS重悬，超声裂解菌体，并分离上清和沉淀，SDS-PAGE、Western blot分析表达形式。经验证表达产物为包涵体表达，结果如图5所示，因此进行包涵体纯化。
蛋白诱导表达后，采用超声破碎，在4℃、12000g离心力的条件下离心10min；弃上清，将沉淀重悬于TRIS Buffer中，离心并弃上清，重复两次，直至包涵体沉淀呈洁净的乳白色。弃上清，加入浓度为8mol/L尿素变性液，4℃摇床过夜，使包涵体溶解。在4℃、12000g离心力条件下离心30min，将上清倒入煮好的透析袋中，夹子验漏，然后将透析袋置于含1L浓度为6mol/L的尿素复性液的量筒中，在4℃条件下利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h。然后更换浓度为4mol/L的尿素复性液。在4℃条件下利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h。然后更换浓度为2mol/L的尿素复性液，在4℃条件下利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h；然后更换浓度为0mol/L尿素复性液，在4℃条件下利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h。然后更换TRIS buffer，在4℃条件下，利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h。
取适量透析后蛋白，加入5×蛋白电泳SDS Buffer煮样，SDS-PAGE分析，结果如图6所示，得到了纯度较高的融合蛋白。
实施例6(杂交瘤细胞株2A11单克隆抗体的制备)
6.1动物免疫
1)第一次免疫：将上述纯化的pET32a-PAstV5-Cap-1蛋白作为抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，按照25μg/只对小鼠进行皮下注射，小鼠为6周龄BALA/c雌性小鼠。
2)第二次免疫：与第一次免疫间隔14天后，将纯化的pET32a-PAstV5-Cap-1蛋白作为抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，按照25μg/只对雌性小鼠进行皮下注射。
3)第三次免疫：与第二次免疫间隔14天后，将纯化的pET32a-PAstV5-Cap-1蛋白作为抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，按照25μg/只对雌性小鼠进行皮下注射。
4)间隔7天后，按照25μg/只腹腔注射上述纯化的蛋白。
5)3天后准备细胞融合。
6.2细胞融合
6.2.1SP2/0细胞的培养：
融合前一周，取冻存的SP2/0细胞在37℃水浴锅中快速融化，以600rpm/min转速离心10min，弃上清，将细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬后转移至T75培养瓶中，于5％ CO2、37℃培养箱中培养，待细胞长至90％时，吹散细胞，以600rpm/min转速离心10min，扩大培养至2个T75培养瓶中，待细胞长至饱满透亮状态后，更换新的培养基，准备融合。
6.2.2饲养层细胞的制备：
融合前一天，取两只健康无免疫的BALA/c小鼠，在无菌台中摘眼球采血得到阴性对照血，处死后将其浸泡在75％酒精中，紫外照射等待15min。
预先在泡沫板上包一层保鲜膜，将小鼠取出，用10mL注射器针头固定好小鼠四肢。用弯头镊子夹起小鼠腹白线位置处皮肤向上提，用眼科剪剪开一个小口，用镊子剥开腹部皮肤，使皮肤与腹膜分离，暴露腹膜，用酒精棉球消毒腹膜表面。在平皿中倒入30mL HAT培养基，取10mL注射器针管，安装好后吸取HAT培养基。
用镊子轻轻提起腹膜，注射器将培养基缓慢推进腹腔，再吸出腹腔中液体。不可吸到腹腔中器官黏膜及脂肪组织。冲洗小鼠腹腔液体后，1000rpm离心10min。
弃上清，用HAT培养基重悬细胞，将细胞铺于10个96孔板中培养，按照100μL/孔设置，放于培养箱(37℃、5％CO2)中过夜培养。
6.2.3免疫鼠脾细胞的制备：
加强免疫3天后，取实验小鼠，在无菌台中摘眼球采血得到阳性血，处死后将其浸泡在75％酒精中，紫外照射等待30min。
预先在泡沫板上包一层保鲜膜，将小鼠取出，用10mL注射器针头固定好小鼠四肢。用弯头镊子夹起小鼠腹白线位置处皮肤向上提，用眼科剪剪开皮肤及腹膜。小鼠脾脏的位置大致在小鼠左上测靠近背部，找到脾脏并钝性分离。
将脾脏放入含有无血清DMEM的培养皿中进行清洗，并剥离脾脏上面的***。取单细胞筛放于含有无血清DMEM的培养皿中，用10mL注射器的活塞将脾脏经细胞筛研磨为单个分散细胞。将研磨后的脾细胞液转至50mL离心管中以1000rpm的转速离心10min。弃上清，用DMEM清洗细胞2次，待用。
6.2.4细胞融合
取两瓶(T75)生长状态良好的SP2/0细胞，吹散细胞，于50mL无菌离心管中1000rpm/min离心10min，弃去上清，用无血清DMEM培养基再次清洗细胞，重复离心两次，弃去上清。
将单个分散的脾细胞移至含有SP2/0细胞的50mL离心管中，以1000rpm/min转速离心10min，弃上清。轻弹离心管底部，使脾细胞和SP2/0细胞混合均匀，然后将离心管放置于盛有37℃水的200mL烧杯中。
将1mL融合剂PEG1420在37℃水浴锅中预热，然后按照1s/滴的速度滴加至脾细胞和SP2/0细胞的混合物中，边滴加边旋转离心管，使融合剂与细胞混合物混匀。滴加完毕后静置90s，然后滴加无血清DMEM培养基终止融合。第1min内匀速滴加1mL，第2min内匀速滴加2mL，第3min内匀速滴加3mL，在10min内滴加至30mL。融合后的混合液1000rpm/min离心10min，弃上清，沉淀用300mL含有饲养层细胞的HAT选择培养基重悬，混匀，铺至培养有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，每孔100uL。放置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
融合3天后，观察细胞生长状态，当细胞出现明显的细胞团，且没有融合的细胞大量死亡时，用HT培养基进行半量换液。当细胞长至孔内1/10时进行第二次半量换液，隔天使用间接ELISA方法检测细胞上清效价。
6.3阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆
将pET32a-PAstV5-Cap-1蛋白和pET32a空载体诱导产物分别用碳酸盐溶液稀释至2μg/mL，铺于96孔酶标板中，每孔100μL，在37℃下包被2h。弃去包被液，经PBST清洗后拍干酶标板，每孔加入150μL 5％BSA封闭液，于37℃温箱中封闭1h。然后弃去封闭液，用PBST清洗后将板子拍干，小鼠血清用PBS分别按照1/100、1/1000、1/10000、1/100000、1/500000、1/1000000的比例进行稀释，同时设阴性小鼠血清对照，每孔100μL，37℃反应1h。弃去1抗，PBST清洗1次，拍干酶标板，加入1/100002％脱脂奶稀释的HRP-山羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃反应1h。弃去二抗，清洗4次，拍干酶标板，每孔加入100μL TMB单组份显色液进行显色，显色10min。每孔加入50μL 2M H2SO4终止显色。
采用酶标仪波长为450nm测定各孔OD值。
将筛选到效价较高(可根据实际情况设定筛选效价标准)的细胞孔补液，次日进行复检。选择效价较高的杂交瘤细胞株进行亚克隆。
亚克隆前取两只空白小鼠，用预冷的HT培养基制备饲养层细胞，按每株细胞株20mL准备培养基。以有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，亚克隆后都利用ELISA试验对单克隆孔进行检测，对检测效价高的细胞孔进行再次亚克隆，筛选稳定分泌的单克隆扩大培养，最终获得一株稳定分泌的单克隆抗体细胞株，命名为2A11。
该单克隆抗体细胞株的保藏信息如下：
保***:河南农业大学
保藏日:2022.12.24
培养物名称(分类命名):杂交瘤细胞株PAstV5-Cap-1-2A11
保藏编号：CCTCC N0:C2022393;
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物微生物保藏中心。
6.4Western Blot方法对单克隆抗体进行鉴定
取纯化后的蛋白液，加入5×SDS loading buffer，混匀煮沸10min。取10μL样品经12.5％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后进行转膜，将滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸依次铺平放好，轻微碾压避免气泡产生，360mA转膜70min。
将PVDF膜于5％脱脂奶中室温孵育1h，弃去封闭液，将PVDF膜浸泡在筛选到的阳性单克隆抗体上清中，室温下以40rpm摇床孵育1h。弃去一抗，采用TBST清洗4次，每次清洗5min。
然后将PVDF膜浸泡在含有商品化HRP-山羊抗鼠IgG(1:5000)的2％脱脂奶粉中，室温下以40rpm摇床孵育1h。采用TBST清洗4次，每次清洗5min。滴加ECL显色试剂显色，使用显影仪器进行显影。结果如图7所示，所制单克隆抗体能够特异性识别PAstV5 Cap蛋白。
6.5间接免疫荧光方法对单克隆抗体进行鉴定
于6孔板中培养PK细胞，待生长至70％时，弃去细胞培养液，用高压无菌的PBS清洗细胞两遍。将PAstV5接种于PK细胞上，置于5％CO2、37℃培养箱吸附2h。每隔30min轻轻摇晃一次，经高压无菌的PBS洗两遍，洗去未吸附的病毒粒子。然后补加10mLDMEM于温箱中培养，72h后，按照如下步骤进行间接免疫荧光试验：
(1)固定：用PBST轻轻洗涤细胞2遍，每孔加入1mL4％PFA(多聚甲醛)于室温固定30min。
(2)破膜：弃PFA，用PBST洗涤1次，然后加入300μL含0.1％ Triton X-100的PBS溶液，室温孵育15min。
(3)封闭：弃液，采用PBST洗涤1次，然后加入300μL含5％ BSA的PBST溶液封闭细胞，室温孵育1h。
(4)一抗：弃封闭液，用PBST洗涤细胞4次后，加入300μL筛选出的识别PAstV5蛋白的细胞株上清，室温孵育1h。
(5)二抗：弃一抗，用PBST洗涤细胞4次后，加入300μLFITC-山羊抗小鼠IgG抗体(1/500倍稀释)，室温避光孵育1h。
(6)染核：弃二抗，PBST洗涤细胞4次后，滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)室温染色细胞核10min，弃去DAPI，用PBST清洗3次。
(7)观察结果：用荧光显微镜观察染色细胞，蓝色荧光为核，绿色荧光为PAstV蛋白。结果如图8所示，可对PAstV5进行检测。
6.6交叉试验验证单克隆抗体的特异性
将PAstV5在PK细胞中以DMEM培养基(添加4μg/mL胰蛋白酶)培养，将塞内卡病毒A(Seneca virus A,SVA)在PK细胞中用含10％血清DMEM培养。分别用PAstV5和SVA感染单层的PK细胞，病毒吸附2h后，弃去培养基，加入维持液，观察细胞的生长情况。同时设未感染组作为对照。
待细胞开始病变时，弃去上清，收集细胞，用细胞裂解液裂解，加入5×SDSloading buffer，进行SDS-PAGE电泳，经转膜，封闭后使用上述制备的单克隆抗体作为一抗进行WB试验，验证单克隆抗体是否能够识别PAstV5和SVA。结果如图10所示，单克隆抗体2A11对PAstV5反应较强，不能与SVA发生反应。
设置同样的试验孔，当细胞开始病变时，加入4％ PFA进行固定，用上述制备的单克隆抗体作为一抗做间接免疫荧光试验，验证单克隆抗体与PAstV5和SVA是否存在交叉反应。结果如图9所示，感染PAstV5的细胞产生明显的荧光，而SVA感染的细胞没有反应，说明单克隆抗体特异性较强。
实施例7(应用)
将上述得到的杂交瘤细胞株利用培养基培养，使其分泌抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体，然后纯化分离。培养基可以采用现有的培养基，也可以采用上述饲养细胞制备培养基。
在其他实施例中，也可以采用小鼠腹水生产方法进行生产制备：提前一周向小鼠腹腔注射腹水诱导剂，之后向小鼠腹腔内注射对数生长期的上述杂交瘤细胞株，在小鼠腹腔内进行诱生增殖，7-15天时抽取腹水，对腹水进行离心分离、纯化，即得。
在具体使用时，可以将单克隆抗体制备成检测试剂盒，本发明优选的，制备成猪星状病毒五型PAstV5间接ELISA检测试剂盒，方法可以参考现有技术中的方法。
实验例
对实施例1中的PAstV5 Cap蛋白的抗原性、亲水性分析及胞内、胞外分布进行预测，结果如图12和图13所示，可以看出，均为胞外区，无跨膜螺旋区。
本发明通过制备猪星状病毒五型PAstV5 Cap蛋白的融合蛋白，并对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白，并通过蛋白质印迹(WB)方法鉴定原核表达的Cap蛋白的免疫原性；将纯化的PAstV5蛋白免疫小鼠，取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合，通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株，并通过WB和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定单克隆抗体与PAstV5蛋白的反应性；通过对不同代次杂交瘤细胞株的抗体效价进行测定，分析细胞株所分泌抗体的稳定性。
本试验表达纯化的PAstV5 Cap蛋白能与PAstV5阳性血清反应，具有良好的免疫原性；将纯化好的蛋白免疫小鼠，筛选单克隆抗体，杂交瘤细胞株能够稳定的分泌抗体，结果显示，本发明制备的单克隆抗体能特异性识别猪星状病毒5型Cap蛋白上的N端区域(aa141-307)。本发明制备的单克隆抗体ELISA效价可达到50万倍以上，并可应用于ELISA、WB、IFA中对PAstV5的检测。

Claims (9)

1.一种抗猪星状病毒五型PAstV5抗原制备用PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：
P1:5’-ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt-3’；
P2:5’-aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg-3’。
2.一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏编号为CCTCC N0:C2022393。
3.一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCC N0:C2022393的杂交瘤细胞株产生。
4.一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，利用保藏编号为CCTCC N0:C2022393的杂交瘤细胞株分泌产生抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将所述杂交瘤细胞株培养，分泌抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体，纯化分离，即得。
6.根据权利要求4所述的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，利用所述杂交瘤细胞株在小鼠腹腔内进行诱生增殖，对腹水进行分离、纯化，制得所述抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体。
7.一种如权利要求3所述的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的在检测猪星状病毒五型方面的应用。
8.根据权利要求7所述的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的在检测猪星状病毒五型方面的应用，其特征在于，所述应用为ELISA检测、WB检测或IFA检测。
9.根据权利要求8所述的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体的在检测猪星状病毒五型方面的应用，其特征在于，所述在ELISA检测方面的应用是制备猪星状病毒五型PAstV5间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒包含所述的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体。
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