CN116396912B - 一株拟除虫菊酯类农药中间体降解菌、菌剂及其废水处理方法和处理装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株拟除虫菊酯类农药中间体降解菌、菌剂及其废水处理方法和处理装置,该降解菌菌株分类名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),菌株名为HSY6,于2022年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.26072。本发明的多粘类芽孢杆菌可在高盐条件下对农药中间体废水中的3‑溴‑4‑氟苯甲醛、3‑苯氧基‑4‑氟苯甲醛、3‑苯氧基甲苯、间苯氧基苯甲醛进行高效降解,解决了农药行业生产废水难以达标排放这一卡脖子问题,对促进农药行业的发展具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域,具体涉及一株拟除虫菊酯类农药中间体降解菌、菌剂及其废水处理方法和处理装置。
背景技术
我国是农药生产使用大国,农药工业产生的污水主要是生产中排放的反应、洗涤和冲洗用水。由于合成农药反应需要添加各种药剂,农药生产排放的废水中含有较多的化合物质(如合成原料、盐类、反应中间体以及副产物等),这些化学物质的大量排入使得农药废水有难降解有机物和含盐量高、毒性大、不易生化处理等特点,尤其是一些高毒或具有潜在风险的化合物会对生态环境以及人类的健康造成影响。
拟除虫菊酯类农药是继有机磷和氨基甲酸酯农药之后化学合成的一类生物活性优异环境相容性好的杀虫剂,3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛是氟氯氰菊酯、保德菊酯、氟氯苯菊酯等是拟除虫菊酯类农药的重要中间体。处理拟除虫菊酯类农药化工废水是目前农药废水处理的一个难点,这类农药化工废水的成分复杂,含有大量的难降解和有毒的有机化合物以及CN-、SO4 2-、Cl-等无机盐,对环境中生物体的危害极大。现有废水处理工艺虽能最终达标排放,但仍有诸如稀释用水数量大、排放废水量增加、过程控制不稳定、操作要求高、能耗大,残渣难以处理等缺点,经济效益和社会效益较差,不符合现在企业绿色清洁发展要求。因此,急需开发合适的废水处理工艺,提高废水处理技术水平,降低水资源的耗用,促进拟除虫菊酯类农药生产废水理技术的发展。
生化法广泛应用于菊酯类农药废水的处理,具有投资少、效果好、运行费用低、无二次污染等优点,但普通微生物对废水中难降解污染物缺乏降解能力,农药中间体易在生物体内累积且难以生物降解,会抑制微生物的活性,导致废水处理效果不佳。因此,有必要筛选能高效降解农药且降解性状稳定的菌株,为农药废水中对拟除虫菊酯类农药中间体的降解提供高效的微生物种质资源。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明旨在筛选出一株能够快速降解农药中间体的高效菌株,且该菌株能对高盐环境表现出良好的耐受性,在高盐条件下对污染物仍具有高效降解能力。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一株多粘类芽孢杆菌,该菌株的分类名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),菌株名为HSY6,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.26072,保藏日期为2022年11月7日,保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该多粘类芽孢杆菌的主要生物学特征:产芽孢的***,好氧或兼性厌氧生活。其细胞呈直杆状排列,周生鞭毛;其菌落呈浅黄粘稠状,表面湿润光滑;在LB液体培养基中呈白色絮状生长。
本发明进一步提出了一种菌剂,其包含上述多粘类芽孢杆菌。
进一步地,本发明提出了上述菌剂的制备方法,包括如下步骤:
(1)从斜面培养基上挑取多粘类芽孢杆菌HSY6,接种于LB液体培养基中,摇床振荡培养至对数生长期,得到菌液;
(2)按体积比1%~5%将步骤(1)所得的菌液转接至种子罐中进行培养,获得种子液;
(3)按体积比1%~5%将种子液接种至发酵罐中扩大培养,获得发酵液;
(4)发酵液经离心后,倒去上清液,沉淀悬浮于生理盐水中,制备细胞悬液,即得菌剂。
其中,步骤(1)中,培养条件为:温度25~35℃,时间12~24h;LB液体培养基组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1~0.3g/L、蛋白胨8~10g/L、酵母提取物3~5g/L和NaCl 8~10g/L。步骤(2)中,培养条件为:温度25~35℃,时间12~24h,转速160~180rpm;种子培养基的组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1~0.3g/L、马铃薯150~200g/L、蛋白胨8~10g/L、牛肉浸膏3~5g/L、NaC1 3~5g/L,pH 7.0~7.5。步骤(3)中,培养条件为:无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1:0.6~1.2,温度25~35℃,时间72~96h,转速180~250rpm;发酵培养基组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1~0.3g/L、马铃薯90~110g/L、胰蛋白胨3~5 g/L、酵母膏3~5 g/L、CaC120.1~0.3 g/L、MgSO40.1~0.3 g/L、K2HPO42~2.5 g/L、KH2PO40.8~1.2 g/L,pH7.2。
本发明进一步提出了上述多粘类芽孢杆菌或所述菌剂在高盐条件下降解农药中间体废水的应用,其中,所述农药中间体废水为包含3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、3-苯氧基甲苯、间苯氧基苯甲醛中的任意一种或多种的废水。
其中,所述农药中间体废水中的中间体污染物初始浓度不高于500mg/L;所述高盐条件为废水中含盐类化合物的浓度为0g/L~70g/L;处理时,废水的温度为20℃~40℃,废水的 pH为7-8;在降解的过程中,将所述多粘类芽孢杆菌或所述菌剂按照体积比5%~10%的投加量投加至农药中间体废水中。
本发明还提出了一种农药中间体废水处理装置,所述农药中间体废水为包含3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、3-苯氧基甲苯、间苯氧基苯甲醛中的任意一种或多种的废水,所述处理***包括依次连接的集水池、废水调节池、厌氧反应器、A/O池、絮凝沉淀池及排放水池,其中,所述A/O池的O池设置有投加单元,所述投加单元中设置有所述多粘类芽孢杆菌或所述菌剂。
本发明还提出了一种降解农药中间体废水的方法,包括以下步骤:
(1)将待处理废水通入厌氧UASB反应器,利用厌氧菌使废水中的一些大分子难降解的污染物转变为小分子污染物,提高废水的B/C,提高废水可生化性、降低色度;
(2)厌氧出水流入A/O池进行硝化-反硝化反应,所述O池投加所述多粘类芽孢杆菌或菌剂;废水在 A段进行水解酸化处理,分解废水中一些难以生化的有机污染物,所述的多粘类芽孢杆菌或菌剂在O段进一步分解废水中的有机污染物,最终将废水中的大部分有机污染物分解为CO2和H2O;
(3)经A/O池处理后的出水自流进入沉淀池中,加药进行混凝沉淀作用,进—步混凝沉淀水中的颗粒物、悬浮物等,提高出水水质,合格废水自流外排水池;
有益效果:本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) HSY6对生存环境的适应能力和耐受力更强,对环境条件要求低,可在高盐环境中高效降解农药废水中的3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛等拟除虫菊酯类中间体。本发明的处理工艺操作简单,不会产生二次污染,处理成本低,应用前景广阔,具有良好的实际应用价值和社会效益。
附图说明
图1是本发明菌株HSY6的菌落形态照片;
图2为本发明菌株HSY6的***发育树;
图3是本发明菌株HSY6对农药中间体的降解效果;
图4是本发明不同盐度对菌株HSY6生长的影响;
图5是本发明菌株HSY6在不同盐度时对农药中间体的降解效果;
图6是本发明菌株HSY6在不同pH时对农药中间体的降解效果;
图7是本发明菌剂降解实际农药生产废水的工艺流程图;
图8是本发明菌剂对实际农药生产废水的污染物降解效果图。
实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步的描述,但并不因此限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。实施例中使用的各种单位,均统一采用国家标准。
实施例1 降解菌株的分离、筛选与鉴定。
(1)降解菌的筛选与分离纯化
本发明是从某农药化工企业废水处理***中取得活性污泥,经过驯化、筛选、分离得到。
具体的筛选方法为:向100mL含有100mg/L 3-苯氧基-4-氟苯甲醛的无机盐培养基中加入10mL泥水混合液,在30℃、160rpm条件下恒温振荡培养7天;然后以5%(V/V)的接种量接入到新鲜无机盐培养基中,连续富集转接培养3次;取1mL最后一次富集液用无菌水进行稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度,取不同浓度梯度的稀释液0.2mL,均匀涂布在含有100mg/L 3-苯氧基-4-氟苯甲醛的无机盐固体培养基上,于30℃的恒温培养箱中恒温培养至菌落长出。用接种环挑选其中长势较好、数量较多、且呈单个分布的菌落,采用梯度平板划线法划线于无机盐培养基,待菌株长出重复该步骤至菌种纯化为纯菌。在无机盐培养基中转接分离纯化后的菌株,在30℃、160rpm条件下恒温振荡培养7天,取样测定间苯氧基甲苯的浓度以验证菌株的降解效果,经分离培养,筛选到一株可以高效降解3-苯氧基-4-氟苯甲醛的菌株,将该菌株进一步纯化后保存于-80℃冰箱中备用。
无机盐培养基包括以下成分:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1g/L、NaCl 1.0g/L,NH4Cl1.0 g/L,K2HPO4·3H2O 1.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,pH 7.0~7.5,固体培养基中加入2%的琼脂,培养基121℃灭菌30min。
(2)降解菌株的鉴定
将菌株HSY6的16S rRNA 基因序列通过GenBank数据库中Blasting程序与NCBI中的核酸数据进行比对分析,结合16S rRNA基因***发育分析(图2),菌株HSY6鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。并于2022年11月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No.26072。
菌株HSY6的菌落形态如图1所示,菌落呈浅黄粘稠状、圆形、凸起、边缘整齐、菌点圆滑、菌体略微***、表面光滑、质地湿润,不透明;菌株HSY6的菌体明亮、呈杆状、两端钝圆;菌体细胞单个排列出现,革兰氏染色结果发现经过染色的菌体颜色变为紫色,表明菌株HSY6为革兰氏阳性菌。
实施例2 降解菌株HSY6对目标污染物的降解性能研究。
将实施例1筛选获得的降解菌株HSY6单菌落接种至LB培养基中,在30℃、160 rpm条件下富集培养,待菌体进入对数生长期后期, 将所得培养液于4℃、10000g离心10min收集菌体,用无菌无机盐液体培养基洗涤三次后重悬于无机盐液体培养基中作为菌悬液,控制菌悬液OD600约为1.0。
分别配置初始浓度为500mg/L的3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛的无机盐培养基,调至培养基pH为7。按体积5%(V/V)的接种量将菌悬液接种到各培养基中,在30℃、160rpm的恒温震荡培养箱中培养,定时取样检测污染物的降解情况,降解效果如图3所示。
由图3可知,72h后3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛的浓度均在20mg/L以下,降解率均在96%以上。这一结果表明菌株HSY6可以快速、高效的降解苯甲醛、甲苯类农药中间体,为农药中间体污染的修复提供了一种新的优良的微生物种质资源。
实施例3 菌株HSY6在不同盐度下生长及对降解效果的影响性能研究。
配置盐度为0、10g NaCl/L、20g NaCl/L、30g NaCl/L、40g NaCl/L、50g NaCl/L、60g NaCl/L、70g NaCl/L的各污染物(3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛)初始浓度均为500mg/L的无机盐培养基中,将降解菌株HSY6的菌悬液按体积5%(V/V)的接种量接到无机盐培养基中,在30℃、160 rpm条件下摇床培养72h,间隔12h取样,分别测定菌株HSY6在不同盐度培养基中的生长(OD600表示),如图4所示。72h测定各污染物浓度并计算降解率,如图5所示。
由图4可知,菌株HSY6能够在无盐环境和10g/L~70g/L盐度范围内生长,盐度升高会引起菌株HSY6的延滞期增长,当盐度分别为0、10g NaCl/L、20g NaCl/L、30g NaCl/L、40gNaCl/L、50g NaCl/L、60g NaCl/L和70g NaCl/L时,菌株HSY6分别经过12h、12h、12h、12h、24h、24h、24h和36h的延滞期后进入快速生长的对数期。与此同时,虽然菌株的生长在高盐度下会有一定的延滞期,但一旦进入对数期,菌株可以快速生长并降解污染物,降解率最高可达98.9%,随着盐度的提高,各污染物的降解率略有下降,当盐度达到70g/L时,各污染物的降解率仍都在90%以上(如图5所示)。因此,菌株HSY6具有良好的耐盐性,为高盐度农药废水处理提供了有利条件。
实施例4 菌株HSY6在不同pH下对降解效果的影响性能研究。
将将降解菌株HSY6的菌悬液按体积5%(V/V)的接种量接到各污染物(3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛)初始浓度均为500mg/L的无机盐培养基中,初始pH用1mol/L的盐酸和1mol/L的NaOH来调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,在30℃、160 rpm条件下摇床培养72h,取样测定各污染物浓度并计算降解率,如图6所示。
由图6可知,各初始pH条件下菌株HSY6对各污染物降解能力存在显著性差异,其中初始pH为7时,菌株HSY6对各污染物的降解效果最好,去除率均在为95%以上。不难发现,菌株HSY6在初始pH为4或9时仍能够生长,但此时污染物的去除率较低,表明菌株可在强酸或强碱的环境中生长并降解苯甲醛、甲苯类农药中间体,但酸性或碱性越强对菌株HSY6生长抑制性越大。以上实验结果表明菌株HSY6可在pH 4~9的范围内存活,选定pH为7为菌株HSY6的优选pH。
实施例5 降解菌剂的制备。
将斜面保存的菌株HSY6接种于LB液体培养基(LB液体培养基组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1g/L、蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L和NaCl 10g/L)中,30℃、160rpm振荡培养至对数生长期;将处在对数生长期的菌株HSY6菌液转接体积比为5%转接至种子罐(种子培养基的组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1g/L、马铃薯200g/L、蛋白胨10g/L、牛肉浸膏5g/L、NaC1 5g/L,pH 7.2)中进行培养,培养条件为:温度30℃,时间24h,转速160rpm。将种子罐培养后的菌液以5%的接种量转接至发酵罐(发酵培养基组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1g/L、马铃薯100g/L、胰蛋白胨5 g/L、酵母膏5 g/L、CaC120.2 g/L、MgSO40.2 g/L、K2HPO42.5g/L、KH2PO41 g/L,pH7.2)中扩大培养,培养条件为:无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1:1.0,温度30℃,时间96h,转速180rpm;发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL以上,发酵液经离心后,倒去上清液,沉淀悬浮于生理盐水中,制备细胞悬液,即得菌剂。
实施例6 菌剂在农药生产废水处理中的应用。
本实施例给出了用菌剂(实施例5制备)处理实际农药生产废水的处理方法,所用装置包括依次连接的废水集水池、废水调节池、厌氧UASB反应器、A/O池、絮凝沉淀池及排放水池(如图7所示)。
调节池:用来调节水质水量,有效容积4L,停留时间10 h。
厌氧反应器:采用UASB厌氧反应器,厌氧池有效容积为10L,停留时间为24 h。利用厌氧菌使废水中的一些大分子难降解的污染物转变为小分子污染物,可有效提高废水的B/C。
A/O池:有效容积13L,其中A池停留时间8 h,O池停留时间24h。设置消化液回流,回流比100%。O池设置有多粘类芽孢杆菌CGMCC No.26072的菌剂投加单元。厌氧出水流入A/O池进行硝化-反硝化反应;废水在 A段进行水解酸化处理,分解废水中一些难以生化的有机污染物,多粘类芽孢杆菌菌剂在O段进一步分解废水中的有机污染物,最终将废水中的大部分有机污染物分解为CO2和H2O。
加药沉淀池:絮凝剂为PAM或PAC,HRT=7h。主要是进一步混凝沉淀水中的颗粒物,提高出水水质。
下面通过利用该处理装置实现对农药废水的处理。
处理水质来源为农药生产废水,处理量为10L/d,CODCr为1800mg/L,其中3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛的浓度分别为93.2mg/L、103.3mg/L、89.4mg/L、82.1mg/L。废水在集水池经泵提升至调节池,用1mol/L盐酸或氢氧化钠调节废水的 pH 值至7~8,调节完的废水经泵提升进入厌氧反应器进行厌氧反应,厌氧反应器出水自流入A/O池,将菌株HSY6制备的菌剂按照10%体积比的投加量投加至O池中,废水进行硝化-反硝化反应。处理后的废水经沉淀池加药絮凝沉淀后,废水流入排放水池收集排放。定期取样跟踪其降解情况,如图8所示。
表1
实验结果表明,普通活性污泥工艺CODCr去除率低于40%,3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛的降解率均低于30%;投加多粘类芽孢杆菌菌剂后,CODCr去除率为97.8%,废水中的3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、间苯氧基甲苯和间苯氧基苯甲醛的降解率分别达到97.9%、97.2%、98.5%、99.2%。因此,多粘类芽孢杆菌HSY6在降解实际拟除虫菊酯类农药中间体废水中具有良好的应用前景。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一株拟除虫菊酯类农药中间体降解菌,其特征在于,所述农药中间体降解菌的分类名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),菌株名为HSY6,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.26072,保藏日期为2022年11月7日。
2.一种菌剂,其特征在于,包含权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌。
3.权利要求2所述的菌剂的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)从斜面培养基上挑取多粘类芽孢杆菌HSY6,接种于LB液体培养基中,摇床振荡培养至对数生长期,得到菌液;
(2)按体积比1%~5%将步骤(1)所得的菌液转接至种子罐中进行培养,获得种子液;
(3)按体积比1%~5%将种子液接种至发酵罐中扩大培养,获得发酵液;
(4)发酵液经离心后,倒去上清液,沉淀悬浮于生理盐水中,制备细胞悬液,即得菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,培养条件为:温度25~35℃,时间12~24h;LB液体培养基组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1~0.3g/L、蛋白胨8~10g/L、酵母提取物3~5g/L和NaCl 8~10g/L。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,培养条件为:温度25~35℃,时间12~24h,转速160~180rpm;种子培养基的组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1~0.3g/L、马铃薯150~200g/L、蛋白胨8~10g/L、牛肉浸膏3~5g/L、NaC1 3~5g/L,pH 7.0~7.5。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,培养条件为:无菌空气的通气量与发酵培养基的体积比为1:0.6~1.2,温度25~35℃,时间72~96h,转速180~250rpm;发酵培养基组份为:3-苯氧基-4-氟苯甲醛0.1~0.3g/L、马铃薯90~110g/L、胰蛋白胨3~5 g/L、酵母膏3~5 g/L、CaC12 0.1~0.3 g/L、MgSO4 0.1~0.3 g/L、K2HPO4 2~2.5 g/L、KH2PO4 0.8~1.2 g/L,pH7.2。
7.权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药中间体降解菌或权利要求2所述的菌剂在高盐条件下降解农药中间体废水的应用,其中,所述农药中间体废水为包含3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、3-苯氧基甲苯、间苯氧基苯甲醛中的任意一种或多种的废水。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述农药中间体废水中的中间体污染物初始浓度不高于500mg/L;所述高盐条件为废水中含盐类化合物的浓度为0g/L~70g/L;处理时,废水的温度为20℃~40℃,废水的 pH为7-8;在降解的过程中,将权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂按照体积比5%~10%的投加量投加至农药中间体废水中。
9.一种农药中间体废水处理装置,所述农药中间体废水为包含3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、3-苯氧基甲苯、间苯氧基苯甲醛中的任意一种或多种的废水,其特征在于,包括依次连接的集水池、废水调节池、厌氧反应器、A/O池、絮凝沉淀池及排放水池,其中,所述A/O池的O池设置有投加单元,所述投加单元中设置有权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药中间体降解菌或权利要求2所述的菌剂。
10.一种农药中间体废水处理方法,所述农药中间体废水为包含3-溴-4-氟苯甲醛、3-苯氧基-4-氟苯甲醛、3-苯氧基甲苯、间苯氧基苯甲醛中的任意一种或多种的废水,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将待处理废水通入厌氧UASB反应器;
(2)厌氧出水流入A/O池进行硝化-反硝化反应,所述O池投加权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药中间体降解菌或权利要求2所述的菌剂;废水在 A段进行水解酸化处理,所述的多粘类芽孢杆菌或菌剂在O段进一步分解废水中的有机污染物;
(3)经A/O池处理后的出水自流进入沉淀池中经加药进—步混凝沉淀水中的颗粒物,提高出水水质,合格废水自流外排水池。
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一株农药降解生防细菌的分离与鉴定;安霞等;微生物学通报;第36卷(第12期);第1838-1841页 * |
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