CN116396498A - 一种交联聚谷氨酸凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种交联聚谷氨酸凝胶及其制备方法和应用，特别是注射填充用交联聚谷氨酸凝胶及其相关产品。本发明采用交联剂，通过调整溶液的pH，在催化剂的作用下聚谷氨酸盐与交联剂形成酰胺键，再进一步经粉碎、洗涤、干燥、复溶及湿热灭菌得到的交联聚谷氨酸凝胶，其耐受湿热灭菌，特别是交联剂的用量低，增加交联剂和催化剂的去除工艺，提升了凝胶的生物相容性，降低注射使用的安全性风险。所制备的交联聚谷氨酸凝胶安全无毒，弹性模量高，性能稳定，生物相容性好，特别是用于皮肤填充类的产品中时，可保证在填充效果上的维持时间，同时性能的稳定性和较高的弹性模量为组织填充提供更好支撑性和抗压性，具有重要的临床意义和应用价值。

Description

一种交联聚谷氨酸凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种交联聚谷氨酸凝胶及其制备方法和应用，特别是，一种注射填充用交联聚谷氨酸凝胶及其相关产品。
背景技术
聚谷氨酸(γ-PGA)是通过枯草芽孢杆菌发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-胺基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物。γ-PGA的侧链上含有活性较高的羧基，其易与一些物质反应生成稳定的复合物，同时具有很强的亲水性，其保湿能力超出透明质酸，可以在自然界或人体内被完全降解，在人体内可降解为内源性物质谷氨酸，不产生毒副作用，广泛应用于化妆品、医药、保健品和卫生用品等领域，是一类理想的生物可降解的医用高分子材料。
水凝胶是由线性分子链交联形成的高分子三维网状聚合物，能够吸收大量水分而不溶解，有效的提高分子链的降解周期，利用聚谷氨酸制备的水凝胶具有高保水性、优良的生物相容性、降解产物为内源性的谷氨酸等优点，具备应用于注入面部皮肤，减轻皱纹，改善皮肤外观和结构，阻止皮肤衰老的潜质。
对于注射用的交联聚谷氨酸凝胶的制备方法的报道较少，中国专利CN106730029B公开了一种注射填充用交联聚谷氨酸凝胶颗粒及其制备方法和应用，其中公开了，以1,4-丁二醇二缩水甘油醚为交联剂，经预混、匀浆、调节pH、分离和灭菌后得到凝胶颗粒，来增加用于组织填充的维持时长。但该方法制备的凝胶在经过湿热灭菌后弹性模量降低明显，并缺乏交联剂的去除工艺，弹性模量的降低会直接影响组织填充的效果，交联剂的残留或交联反应的副产物也存在潜在的致癌性，特别是为了延长聚谷氨酸凝胶在体内的维持时间，通过增加交联剂的加入量来提高交联度，这更会提高该类产品的安全性风险。中国专利CN109503864 B公开了一类具有内聚增强特性的可注射水凝胶的制备方法，该方法是将多氨基、多羧基的聚合物混合形成离子键，加入EDC/NHS或者DMTMM作催化剂使部分的离子键形成酰胺键，再通过碱化、沉降和复溶的工艺使分子链重排，经湿热灭菌后水凝胶的动力粘度会增加，这种动力粘度的增加是以交联网络结构被破坏形成更多的大分子链结构导致的，这会使凝胶的弹性模量丧失，同时该方法制备的凝胶在灭菌后粘度的会随着存放时间的延长分子链之间的重排而增加是由于聚合物间离子键结合所带来，但这种粘度增加并不稳定，特别是长时间存放，对于产品性能的稳定会产生影响，对实际使用会产生风险。另外，该方法提及采用磷酸盐缓冲液作为溶剂来控制以EDC/NHS作为催化剂反应体系的pH值，这会使催化效率降低，交联剂的有效使用量下降，要达到相同的交联效果，用量会增加，提高经济成本，同时这也增加交联剂残留量的风险，提升了产品安全性风险。
综上所述，对于制造一种低交联剂的加入量、高弹性模量特性的注射填充用聚谷氨酸凝胶的方法未见报道，特别是在湿热灭菌后凝胶仍能够保持较高的弹性模量，存放一段时间后依然保持稳定，作为组织填充剂可提供高的抗压性能，为此提供一种可用于注射组织填充的聚谷氨酸凝胶来满足临床上多样化的需求具有一定的意义。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种交联聚谷氨酸凝胶及其制备方法和应用，特别是，一种注射填充用交联聚谷氨酸凝胶及其相关产品。
在本发明第一方面，提供一种交联聚谷氨酸凝胶的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将聚谷氨酸盐、交联剂与水混合，调节所得溶液的pH；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入催化剂，进行反应。
具体地，步骤(1)中所述聚谷氨酸盐选自：聚谷氨酸钠、聚谷氨酸钾、聚谷氨酸钙、聚谷氨酸镁中的一种或多种，特别是聚谷氨酸钠。
具体地，步骤(1)中所述聚谷氨酸盐的分子量为500-2000kDa(例如500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1500、1600、1800、2000kDa)，特别是800-1500kDa。
具体地，步骤(1)中所述交联剂选自：烷基二胺、氨基多糖、氨基酸酯类化合物中的一种或多种，特别是烷基二胺和氨基酸酯类化合物中的一种或多种，优选为烷基二胺和氨基酸酯类化合物的组合。
具体地，烷基二胺分子中含有两个氨基(-NH2)，其可以选自：1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺、双六甲基三胺(N-(6-氨基己基)-1,6-己二胺)，特别是1,3-丙二胺或双六甲基三胺。
具体地，氨基多糖是指含氨基的多糖，例如环糊精、壳聚糖等。
具体地，对于氨基酸酯类化合物，其中氨基酸优选具有两个氨基(-NH2)，例如赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸，特别是赖氨酸；其中形成氨基酸酯的醇可以为C1-6的醇，例如甲醇、乙醇，即氨基酸酯类化合物可以为氨基酸甲酯、氨基酸乙酯，特别是，氨基酸酯类化合物为L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或L-赖氨酸甲酯二盐酸盐。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中所述交联剂为烷基二胺和氨基酸酯类化合物的组合，其中二者的氨基摩尔比为1:0.1-0.5(例如1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5)，特别是1:0.1-0.3。
将烷基二胺与氨基酸酯类化合物组合作为交联剂，其中分子链结构简单的烷基二胺先与聚谷氨酸盐发生交联反应，而分子链较长的氨基酸酯能够与远离烷基二胺且未与其交联反应的聚谷氨酸盐上的羧基发生交联反应，并且氨基酸酯类中酯键在交联中随着反应体系pH的变化，会发生部分水解，生成的羧基与烷基二胺中的氨基形成分子间的氢键，实现了氨基酸酯类化合物与烷基二胺两者在交联过程中的协同作用，提高最终的交联效率，形成了更为致密的三维网状结构；另外，通过加入氨基酸酯类交联剂，使交联聚谷氨酸中也含有一部分酯键，在湿热灭菌后该部分酯键发生水解断裂，生成的羧基与游离的氨基之间也形成分子间的氢键，从而提高了灭菌后凝胶的稳定性，在一定程度上延长了凝胶的降解时间。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述交联剂为1,3-丙二胺与L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或L-赖氨酸甲酯二盐酸盐的组合，其中二者的氨基摩尔比为1:0.1-0.5(例如1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5)，特别是1:0.1-0.3。
在本发明另一个实施例中，步骤(1)中所述交联剂为双六甲基三胺与L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或L-赖氨酸甲酯二盐酸盐的组合，其中二者的氨基摩尔比为1:0.1-0.5(例如1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5)，特别是1:0.1-0.3。
具体地，步骤(1)中聚谷氨酸盐与交联剂的质量比为1:0.01-0.09(例如1:0.01、1:0.02、1:0.04、1:0.05、1:0.06、1:0.08、1:0.09)，特别是1:0.02-0.08。
具体地，步骤(1)中所述溶液中聚谷氨酸盐的质量百分比为10-20％(例如10％、12％、14％、15％、16％、18％、20％)。
具体地，步骤(1)中所述调节pH步骤为调节pH至5.5-6.5(例如5.5、5.8、6.0、6.2、6.5)。
具体地，调节pH所用试剂可以为无机酸(例如盐酸、硫酸)和/或无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾)。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中所述催化剂为碳鎓盐，例如，O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸盐(HBTU)。
在本发明另一个实施方式中，步骤(2)中所述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)。
具体地，催化剂与交联剂的摩尔比1-1.4:1(例如1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1)。
具体地，步骤(2)中所述反应温度为25-40℃(例如25、30、35、40℃)。
具体地，步骤(2)中所述反应时间为12-18小时(例如12、14、16、18小时)。
具体地，步骤(2)中所述反应在密闭条件下进行，例如在密闭的鼓风干燥箱中进行。
更具体地，该制备方法还包括步骤(3)：将步骤(2)反应所得凝胶溶胀，粉碎，洗涤，分离，干燥。
具体地，溶胀所用溶剂为水，特别是纯化水。
具体地，洗涤多用溶剂为水，特别是纯化水，洗涤次数可以为一次或多次。
具体地，分离步骤包括醇沉步骤；更具体地，所述醇为乙醇。
具体地，干燥方法为真空干燥；更具体地，真空干燥的真空度为-0.10MPa至0MPa(例如-0.09、-0.08、-0.06、-0.04、-0.02MPa)；更具体地，真空干燥的温度为30-50℃(例如30、35、40、45、50℃)；更具体地，真空干燥的时间为6-36小时(例如6、12、18、24、30、36小时)。
更具体地，该制备方法还包括步骤(4)：将步骤(3)所得干燥物复溶，灭菌。
具体地，复溶所得溶液pH值为7.2±2(例如pH 7.2±1，pH 7.2±0.5，pH7.2±0.2)，例如pH 7.0。
具体地，复溶所得溶液的渗透压为280-350mOsm/L(例如280、300、320、340、350mOsm/L)。
具体地，复溶所用溶剂可以为pH中性的缓冲液，例如pH 7.0磷酸盐缓冲液。
具体地，灭菌方式为湿热灭菌；更具体地，灭菌温度为120-130℃(例如120、121、122、124、125、126、128、130℃)；更具体地，灭菌时间为1-30分钟(例如1、5、10、15、20、25、30分钟)。
在本发明的一个实施方式中，灭菌步骤包括：将复溶所得溶液灌封于预灌封注射器中进行湿热灭菌(得到注射填充用交联聚谷氨酸凝胶，其可注射填充于皮肤组织内，用于实现消除皮肤因衰老出现的松弛、修复皮肤缺陷等目的)。
在本发明第二方面，提供第一方面所述方法制备的交联聚谷氨酸凝胶。
具体地，所述交联聚谷氨酸凝胶为注射填充用交联聚谷氨酸凝胶。
具体地，所述交联聚谷氨酸凝胶是无菌的。
在本发明第三方面，提供一种凝胶组合物，其包含第二方面所述的交联聚谷氨酸凝胶，以及一种或多种辅料。
具体地，该组合物还可以包括保湿剂、渗透压调节剂、生物活性剂、美容活性剂、细胞附着剂等中的一种或多种。
具体地，保湿剂包括，但不限于，甘油、丙二醇、丁二醇、乳酸、乳酸钠、尿素、赤藓糖醇、木糖醇、鼠李糖、甘露糖、山梨醇、海藻糖、棉籽糖等；渗透压调节剂包括，但不限于，氯化钠、葡萄糖、甘露醇、氯化钾、氯化钙、山梨醇等；生物活性剂包括，但不限于，细胞生长因子、肽、拟肽、抗体、核酸和多糖等；美容活性剂包括，但不限于，抗衰老剂、抗自由基剂、抗氧化剂、水合剂、美白剂、防晒剂、肌肉松弛剂等。
在本发明第四方面，提供第二方面所述的交联聚谷氨酸凝胶在制备组织填充剂、组织工程支架、创面修复材料、药物载体、化妆品(外用)、食品稳定剂、污水处理剂、保水剂等中的应用，特别是在制备组织填充剂中的应用。
在本发明第五方面，提供一种组织填充用产品，其包括注射器和第二方面所述的交联聚谷氨酸凝胶，其中交联聚谷氨酸凝胶灌封于该注射器中。
具体地，该注射器包括注射器筒体、柱塞挡止装置和封闭装置，其中，注射器筒体具有远端和近端，其内部容纳有交联聚谷氨酸凝胶，柱塞挡止装置可滑动地定位于注射器筒体内部，并提供对注射器筒体内近端的交联聚谷氨酸凝胶的密封，封闭装置连接于注射器筒体的远端，封闭装置具有出口接合部分，该出口接合部分密封地接合并封闭注射器筒体的远端开口出口端。更具体地，该注射器还可包括针头。
具体地，所述交联聚谷氨酸凝胶是无菌的。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用烷基二胺、氨基多糖、氨基酸酯类化合物中的一种或多种为交联剂，通过调整聚谷氨酸盐的浓度为10-20％，溶液的pH为5.5-6.5，在催化剂的作用下，即使在使用少量交联剂时(聚谷氨酸盐与交联剂的质量比为1:0.01-0.09)，其反应效率也能达到80％以上，有效减少了交联剂的用量，并减少了交联剂的残留；并且在使用少量交联剂的情况下，也能得到湿热灭菌后弹性模量损失低、稳定性好的聚谷氨酸凝胶。
(2)本发明进一步通过将氨基酸酯类化合物，如L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，与烷基二胺形成复合交联剂，其中分子链结构简单的烷基二胺先与聚谷氨酸盐发生交联反应，而分子链较长的氨基酸酯能够与远离烷基二胺且未与其交联反应的聚谷氨酸盐上的羧基发生交联反应，并且氨基酸酯类中酯键在交联中随着反应体系pH的变化，会发生部分水解，生成的羧基与烷基二胺中的氨基形成分子间的氢键，实现了氨基酸酯类化合物与烷基二胺两者在交联过程中的协同作用，提高最终的交联效率，形成了更为致密的三维网状结构；另外，通过加入氨基酸酯类交联剂，使交联聚谷氨酸中也含有一部分酯键，在湿热灭菌中该部分酯键发生水解断裂，生成的羧基与游离的氨基之间也形成分子间的氢键，从而提高了灭菌后凝胶的稳定性，在一定程度上延长了凝胶的降解时间。
(3)通过本发明的制备工艺得到的聚谷氨酸凝胶，安全无毒，耐受湿热灭菌，弹性模量高，长期稳定性好，可用于注射填充于皮肤组织内，消除皮肤因衰老出现的松弛、修复皮肤缺陷等问题，并且填充后降解时间长。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
称取4.00g聚谷氨酸钠(分子量800kDa)，再加入0.08g(摩尔数365μmol)L-赖氨酸乙酯二盐酸盐，溶于36mL水中，用6mol/L的氢氧化钠溶液调节体系的pH值为6.0，称取0.068g(摩尔数365μmol)EDC和0.014g NHS，加入溶液中，搅拌均匀，密封放于40℃的鼓风干燥箱中反应12h。反应结束后加入400mL水，使凝胶充分溶胀，均质粉碎，将凝胶与游离的水分离，将凝胶用400mL纯化水连续清洗5次，再向凝胶中加等量的入无水乙醇，分离沉淀，将沉淀物放入真空烘箱内，以-0.09MPa的真空度40℃真空干燥24h。完全干燥后，取干燥物1.0g，加入浓度为10mg/mL的pH 7.0磷酸盐缓冲液共50mL，待凝胶完全溶胀后，将凝胶灌装至预灌封注射器中，以121℃1，5min的条件进行湿热灭菌，获得终产品凝胶。
实施例2
称取4.00g聚谷氨酸钾(分子量1,500kDa)，再加入0.32g(摩尔数1373μmol)L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，加入纯化水16mL，搅拌使其完全溶解，用6mol/L的氢氧化钠溶液调节体系的pH值为5.5，称取0.3672g(摩尔数1922μmol)EDC和0.0734g NHS，加入溶液中，搅拌均匀，密封放于25℃的鼓风干燥箱中反应18h。其他步骤与实施例1相同。
实施例3
称取4.00g聚谷氨酸镁(分子量2,000kDa)，再加入0.08g(摩尔数1081μmol)1,3-丙二胺，加入纯化水26mL，搅拌使其完全溶解，用6mol/L的盐酸溶液调节体系的pH值5.7，加入1297μmol HATU到溶液中，搅拌均匀，密封放于30℃的鼓风干燥箱中反应14h。其他步骤与实施例1相同。
实施例4
称取4.00g聚谷氨酸钙(分子量500kDa)，再加入0.32g(摩尔数1116μmol)双六甲基三胺，加入纯化水26mL，搅拌使其完全溶解，用6mol/L的盐酸溶液调节体系的pH值为6.5，加入1451μmol HATU到溶液中，搅拌均匀，密封放于40℃的鼓风干燥箱中反应16h。其他步骤与实施例1相同。
实施例5
交联剂为1,3-丙二胺与L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，其按照氨基摩尔比1:0.1复配混合，交联剂摩尔数为1081μmol。其他步骤与实施例3相同。
实施例6
交联剂为1,3-双六甲基三胺与L-赖氨酸乙酯二盐酸盐，其按照氨基摩尔比1:0.3复配混合，交联剂摩尔数为1116μmol。其他步骤与实施例4相同。
实施例7
交联剂为1,3-丙二胺与L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，其按照氨基摩尔比1:0.5复配混合，交联剂摩尔数为1081μmol。其他步骤与实施例3相同。
实施例8
交联剂为壳聚糖(脱乙酰度为95％，重均分子量为5,000Da)，加入0.05g壳聚糖，其他步骤与实施例1相同。
对比例1
称取4.00g聚谷氨酸钠(分子量300kDa)，再加入0.5g(摩尔数2281μmol)L-赖氨酸乙酯二盐酸盐，加入纯化水56mL，搅拌使其完全溶解，用6mol/L的氢氧化钠溶液调节体系的pH值为5.0，称取0.421g(摩尔数2281μmol)EDC和0.087g NHS，加入溶液中，搅拌均匀，密封放于40℃的鼓风干燥箱中反应12h。其他步骤与实施例1相同。
对比例2
称取4.00g聚谷氨酸镁(分子量2,000kDa)，向聚谷氨酸镁溶液中加入0.08g(摩尔数1081μmol)1,3-丙二胺，加入纯化水26mL，搅拌使其完全溶解，用6mol/L的盐酸溶液调节体系的pH值为7.0，加入1297μmol HATU到溶液中，搅拌均匀，密封放于30℃的鼓风干燥箱中反应14h。其他步骤与实施例1的操作方法相同。
对比例3
称取4.00g聚谷氨酸钾(分子量1,500kDa)，向聚谷氨酸钠溶液中加入0.32g(摩尔数1373μmol)L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，加入纯化水56mL，搅拌使其完全溶解，用6mol/L的氢氧化钠溶液调节体系的pH值在5.5，称取0.3672g(摩尔数1922μmol)EDC和0.0734g NHS，加入溶液中搅拌均匀，密封放于25℃的鼓风干燥箱中反应18h。其他步骤与实施例1相同。。
对比例4(参照CN 106730029 B的交联方法)
将1,4-丁二醇二缩水甘油醚1.4g加入去离子水110g中，搅拌均匀后，再加入重均分子量170万道尔顿的聚谷氨酸钠25g，搅拌均匀，100℃保温0.5h；加入0.9％NaCl水溶液1.0L进行匀浆，向匀浆物中加入约0.074g NaH2PO4和0.040g Na2HPO4，调节pH 6.5；再加入NaCl约0.65g，调节渗透压288mOsm/kg·H2O；5000r/min离心10min，收集沉淀层凝胶颗粒物；分装，157℃高压蒸汽灭菌3s即得。
对比例5(参照CN 109503864 B的交联方法)
称取6.0g多聚赖氨酸溶于100g 0.2M PBS溶液中，再加入8g聚谷氨酸(分子量800kDa)并在37℃下搅拌混匀。然后加入6.8g DMTMM，在37℃下搅拌反应1小时然后转入2～8℃反应23h。接着加入300g 0.1M NaOH溶液进行碱化，在室温下搅拌0.5小时，再在2～8℃下搅拌18小时。然后用1600mL乙醇进行沉降。得到的粉末用400mL乙醇充分洗涤，洗涤步骤重复3次。粉末沥干后用400g 0.9％NaCl溶液进行复溶，充分搅拌均匀后于透析袋中进行透析，透析外液为3000g 0.9％NaCl溶液。一共透析3天，每天更换2次透析液。透析结束后灌装于玻璃注射器中，灭菌采用实施例1的操作方法。
对比例6
交联剂为1,3-丙二胺与L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，其按照氨基摩尔比0.1:1复配混合，交联剂摩尔数为1081μmol，调整pH值为5.7，其他步骤与实施例3相同。
对比例7
交联剂为1,3-丙二胺与L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，其按照氨基摩尔比1:0.08复配混合，交联剂摩尔数为1081μmol。其他步骤与实施例3相同。
对比例8
交联剂为1,3-丙二胺与L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，其按照氨基摩尔比1:0.6复配混合，交联剂摩尔数为1081μmol。其他步骤与实施例3相同。
应用例1：交联聚谷氨酸凝胶剪切黏度和弹性模量的检测
将实施例1～8和对比例1～8中获得的交联聚谷氨酸凝胶，分别在灭菌前后采用TADHR-2型平板流变仪检测凝胶的弹性模量(G’)和剪切黏度(Pa·s)。
弹性模量检测设定参数：操作间隙：1000mm，装载间隙：45000μm，运行温度：37℃，形变量：1％，频率：0.9Hz，运行时间：60s。
检测剪切粘度(Pa·s)检测设定参数：操作间隙：1000μm，测试模式：flowpeakhold模式，测试温度：25℃，到达指定温度后平衡时间：60s，测试时间：60s，测试转速：100s-1。
样品的检测结果如表1所示：
表1凝胶样品的弹性模量和剪切粘度的检测结果
Figure BDA0004039534920000121
凝胶灭菌前后的弹性模量变化可作为凝胶热稳定性的指标，通过表1可以看出，实施例1～8在灭菌后仍具有很高的弹性模量，弹性模量的变化量均在10％以内，并且在灭菌后30天样品的弹性模量和剪切粘度依然保持稳定，其中实施例5-7在灭菌后的弹性模量变化量均在2％左右，并且灭菌后30天样品的弹性模量和剪切粘度依然保持稳定，说明采用L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或L-赖氨酸甲酯二盐酸盐，与烷基二胺形成复合交联剂，其中L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或L-赖氨酸甲酯二盐酸盐中的酯键在交联中随着反应体系pH的变化，会发生部分水解，生成的羧基与烷基二胺中的氨基形成分子间的氢键，实现了氨基酸酯类化合物与烷基二胺两者在交联过程中的协同作用，提高了最终的交联效率，形成了更为致密的三维网状结构，因此，湿热灭菌后弹性模量损失低，热稳定性高；对比例1、对比例2和对比例3在灭菌后弹性模量降低明显，这可能是由于反应体系的pH值、聚谷氨酸浓度不在适宜的反应条件内，导致其交联效率不高，最终得到的凝胶交联度较低，所以灭菌后弹性模量变化较大。对比例4灭菌后弹性模量变化大，说明最终的凝胶耐热性差；对比例5在灭菌前后凝胶的弹性模量变化超过了50％，并且灭菌后存放30天剪切粘度会增加。对比例6、8湿热灭菌后弹性模量损失分别为9％,7.5％，远高于实施例5中2％的损失率，这可能是由于1,3-丙二胺与L-赖氨酸甲酯二盐酸盐复合交联剂中，L-赖氨酸甲酯二盐酸盐的量过多，交联凝胶主要由L-赖氨酸甲酯二盐酸盐连接聚谷氨酸盐分子上的羧基形成，少量的1,3-丙二胺与聚谷氨酸盐结构单元上的羧基连接形成酰胺键，故1,3-丙二胺中的氨基不能与L-赖氨酸甲酯二盐酸盐中酯基水解后的羧基形成氢键，交联聚谷氨酸骨架结构相对松散，湿热灭菌后，弹性模量损失率较高。另外，对比例7中，湿热灭菌后弹性模量损失也明显高于实施例5，可能是由于复合交联剂中L-赖氨酸甲酯二盐酸盐的量偏低，难以与1,3-丙二胺形成有效的协同作用，因此湿热灭菌后，弹性模量损失率较高。这也进一步说明，通过将烷基二胺与氨基酸酯类化合物形成复合交联剂，并将两者的比例设置在适合范围，可以有效的提高两者的协同作用，形成交联效率高，结构更稳定的凝胶产物。
应用例2：交联效率的检测
供试品溶液的制备：
取实施例、对比例凝胶各2.0g，每个样品中加入0.5mol/L硫酸溶液10mL，置于90℃±10℃的鼓风干燥箱中60～70min，加入1mol/L氢氧化钠溶液中和，定容至50ml，备用。
另配制20mg/ml的聚谷氨酸溶液，取2.0mL，同法处理，作为供试品空白备用。
标准品溶液的配制：
称取适量实施例、对比例中使用的交联剂适量，溶于蒸馏水，使其浓度为50μg/mL。
检测：将标准溶液稀释为0.5～50μg/mL的一系列浓度，取其1mL加入0.2mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH5.0)1mL充分混合，然后加入1mL KCN-乙二醇甲醚-茚三酮溶液(称取1.25g重结晶茚三酮溶于25mL经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5％溶液，将1.5mL 10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125mL充分混合，然后将125mL KCN-乙二醇甲醚溶于25mL茚三酮-乙二醇甲醚溶液相混合)，充分混合，沸水浴加热15min，取出加入3mL 60％乙醇稀释，然后冷却，在波长为570nm测定吸光度，同法对供试品进行检测，绘制吸光度-浓度的标准曲线，从标准曲线中查得供试品中的交联剂的含量c(μg/ml)，并按式(I)计算实际交联摩尔比m，然后根据式(II)计算交联效率e。
Figure BDA0004039534920000141
式(I)中：
m为实际交联摩尔比；
n1为交联剂加入量的摩尔数，单位为摩尔(mol)；
c为供试品中氨基的含量，单位为微克每毫升(μg/ml)；
v为供试品的稀释体积，单位为毫升(ml)；
M为交联剂的分子量；
n3为交联反应中聚谷氨酸盐中羧基的摩尔数，单位为摩尔(mol)。
Figure BDA0004039534920000151
式(II)中：
e为交联效率；
m为实际交联摩尔比；
n为理论交联摩尔比，n＝n1/n3*100。
样品的检测结果如表2所示：
表2 凝胶样品交联效率的检测结果
实施例 理论交联摩尔比 实际交联摩尔比 交联效率
实施例1 1.34％ 1.13％ 84％
实施例2 5.05％ 4.29％ 85％
实施例3 3.97％ 3.65％ 92％
实施例4 4.10％ 3.81％ 93％
实施例5 3.97％ 3.75％ 94.5％
实施例6 3.97％ 3.78％ 95.1％
实施例7 3.97％ 3.70％ 93.1％
实施例8 1.06％ 0.83％ 78.3％
对比例1 7.36％ 2.84％ 39％
对比例2 3.97％ 1.19％ 30％
对比例3 5.05％ 2.02％ 40％
对比例4* 22.36％ 10.06％ 45％
对比例5 78.75％ 15.75％ 20％
对比例6 3.97％ 3.38％ 85％
对比例7 3.97％ 3.45％ 87％
对比例8 3.97％ 3.34％ 84％
*表示该样品的交联效率的检测方法与其他的实施例和对比例不同，具体方法如下：
样品制备：取灭菌前的对比例4的样品4.0g，精密称定，置于冷冻干燥机内冻干，加丙酮10ml，振摇后用超声波清洗器超声1h(控制温度不超过25℃)，取上清液适量，过滤膜，取续滤液作为供试品溶液，取1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)对照品适量，精密称定，加丙酮制成每1ml中含0.8～50μg丙酮的溶液，作为对照品溶液。
色谱条件：色谱柱：DB-17柱(30m×0.32mm，0.50μm)；柱温：程序升温，150℃，以每分钟30℃升温至260℃，维持10分钟；检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度为300℃；进样口温度为260℃；分流进样，分流比为1:1；载气为氮气，柱流量为5ml/min，隔垫吹扫流量为10ml/min；进样体积为1μl。
检测方法：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图，绘制峰面积-浓度的标准曲线，从标准曲线中查得供试品中的交联剂的含量c1(μg/ml)，通过下式(III)计算实际摩尔交联比m：
Figure BDA0004039534920000161
式(III)中：
m为实际交联摩尔比；
n1为交联剂加入量的摩尔数，单位为摩尔(mol)；
c1为供试品中BDDE的含量，单位为微克每毫升(μg/ml)；
M为交联剂BDDE的分子量；
n3为交联反应中聚谷氨酸盐中羧基的摩尔数，单位为摩尔(mol)。
通过表2可以看出，实施例1～8交联效率远高于对比例1-8，这是使凝胶在灭菌前后保持弹性模量稳定的关键，而对比例5中交联效率低，说明其存在大量的游离的氨基，这一方面可能是由于多聚赖氨酸的反应程度低，另一方面也可能是在加入氢氧化钠溶液使聚谷氨酸的分子量断裂而引起的。而对比例1-3中由于反应体系的pH值、聚谷氨酸浓度不在适宜的反应条件内，导致其交联效率不高；对比例6-8中，由于烷基二胺与L-赖氨酸甲酯二盐酸盐复合交联剂中两者的比例没有设置在适宜的范围内，难以实现两者的协同作用，交联效率也明显低于实施例5，也进一步说明将交联剂复配，通过合理控制体系的反应条件，对于提高交联效率有明显的积极作用。
应用例3：体外降解表征
分别取实施例1～8以及对比例1～8的样品适量，置于真空冷冻干燥机中冻干，称取冻干后的样品0.2g，精密称定，记为m1，浸泡于50mlPBS溶液中，置于37℃摇床中分别在第7天、14天、21天、28天、35天、42天和49天取出，用去离子水浸泡至残余PBS溶液完全被洗出，冻干后称量，记为m2，按公式(m1-m2)/m1*100％计算降解率，每个样品平行制备3份，计算降解率平均值。检测结果如图1所示。
通过体外降解的图1可以看出，实施例样品与对比例的样品相比，实施例的降解时间更长，相同的时间范围内降解速率更低，特别是实施例5-7，在整个降解周期内只有60％左右的降解，这可能由于烷基二胺与氨基酸酯类交联剂组合后，分子结构简单的烷基二胺交联剂与相邻的聚谷氨酸分子链相连的同时，分子结构较大的L-赖氨酸甲酯二盐酸盐或L-赖氨酸乙酯二盐酸盐与相隔较远的结构单元结合，而烷基二胺和氨基酸酯类两者之间存在氢键相互作用，从而形成更为致密的交联网状结构，更利于维持更长体外降解时间。
综上所述，本发明所公开的注射填充用交联聚谷氨酸凝胶作为皮肤填充类的产品，该凝胶仿生天然细胞外基质的多肽成分，促进细胞粘附增长，降低交联剂的加入量，增加交联剂和催化剂的去除工艺，提升凝胶的生物相容性，降低注射使用的安全性风险，通过湿热灭菌，使凝胶保持交联凝胶的颗粒态，仍具有一定的弹性模量，保证了在填充效果上的维持时间，同时性能的稳定性和较高的弹性模量为组织填充提供更好支撑性和抗压性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

Claims (10)

1.一种交联聚谷氨酸凝胶的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将聚谷氨酸盐、交联剂与水混合，调节所得溶液的pH；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入催化剂，进行反应；
优选地，步骤(1)中所述交联剂选自：烷基二胺、氨基多糖、氨基酸酯类化合物中的一种或多种；
优选地，步骤(1)中聚谷氨酸盐与交联剂的质量比为1:0.01-0.09；
优选地，步骤(1)中所述溶液中聚谷氨酸盐的质量百分比为10-20％；
优选地，步骤(1)中所述调节pH步骤为调节pH至5.5-6.5；
优选地，步骤(2)中所述反应温度为25-40℃。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述聚谷氨酸盐选自：聚谷氨酸钠、聚谷氨酸钾、聚谷氨酸钙、聚谷氨酸镁中的一种或多种；
优选地，所述聚谷氨酸盐的分子量为500-2000kDa。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述交联剂选自：烷基二胺和氨基酸酯类化合物中的一种或多种，优选为烷基二胺和氨基酸酯类化合物的组合；
优选地，所述烷基二胺选自：1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,6-己二胺、双六甲基三胺；
优选地，所述氨基酸酯类化合物为L-赖氨酸乙酯二盐酸盐或L-赖氨酸甲酯二盐酸盐；
更优选地，步骤(1)中所述交联剂为烷基二胺和氨基酸酯类化合物的组合，其中二者的氨基摩尔比为1:0.1-0.5，优选为1:0.1-0.3。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述催化剂为碳鎓盐，优选为O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲氨基)碳鎓六氟磷酸盐(HBTU)；或，
步骤(2)中所述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂与交联剂的摩尔比例1-1.4:1。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤(3)：将步骤(2)反应所得凝胶溶胀，粉碎，洗涤，分离，干燥。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括步骤(4)：将步骤(3)所得干燥物复溶，灭菌；
优选地，复溶所得溶液pH值为7.2±2；
优选地，复溶所得溶液的渗透压为280-350mOsm/L；
优选地，所述灭菌步骤包括：将复溶所得溶液灌封于预灌封注射器中进行湿热灭菌。
8.权利要求1-7任一项所述的方法制备的交联聚谷氨酸凝胶。
9.一种组织填充用产品，其包括注射器和权利要求8所述的交联聚谷氨酸凝胶，其中所述交联聚谷氨酸凝胶灌封于所述注射器中。
10.权利要求8所述的交联聚谷氨酸凝胶在制备组织填充剂、组织工程支架、创面修复材料、药物载体、化妆品、食品稳定剂、污水处理剂、保水剂中的应用；
优选地，所述应用为所述交联聚谷氨酸凝胶在制备组织填充剂中的应用。
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