CN116390954A - 靶向bcma的单域抗体 - Google Patents
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Abstract
提供了一种靶向BCMA的单域抗体,所述单域抗体与BCMA蛋白亲和力高。还提供了所述单域抗体在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的用途。
Description
本申请涉及生物医药领域,具体的涉及一种靶向BCMA的单域抗体。
研究发现,双峰驼、单峰驼、羊驼和美洲驼中存在一种仅由重链组成、但具有完整功能的重链抗体(heavy chain antibody,hcAb),其可变区(variable domains of the hcAb,简称为VHH)分子量仅为常规抗体的1/10,是目前可以得到的具有完整抗体功能的最小分子片段,称为单域抗体(single domain antibody,sdAb)。单域抗体与其它抗体相比,具有免疫原性低、分子小、穿透力强等优点,因此其在基础研究、药物开发、疾病治疗等领域有广阔的应用前景。
BCMA是B细胞成熟抗原,属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族,它主要在浆细胞和成熟B淋巴细胞中表达,在其它正常组织中几乎不表达。它的重要特点是其在所有多发性骨髓瘤细胞上高度表达。
目前,BCMA已成为多发性骨髓瘤和其它血液***恶性肿瘤的一个非常热门的免疫治疗靶点,因此有必要开发对BCMA亲和力高、特异性强的新型抗BCMA抗体。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合片段,其具有下列性质中的一种或多种:1)能够以较高的亲和力和特异性结合BCMA蛋白。本申请还提供了所述分离的抗原结合片段的制备方法和应用。
一方面,本申请提供了一种分离的抗原结合片段,所述分离的抗原结合片段与参比抗体竞争结合所述BCMA蛋白,其中所述参比抗体包括重链可变区,所述参比抗体的重链可变区可包括HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;所述HCDR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列;所述HCDR3包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合片段与BCMA蛋白结合的K
D值是或约是、或少于约或少于100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或0.1nM。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合片段,其包括单域抗体。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合片段包括重链可变区,所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述HCDR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述HCDR3包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合片段包括重链可变区,所述重链可变区包括H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合片段中所述重链可变区包括H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR2包含SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR2包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR3包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR3包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR4包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
另一方面,本申请提供了一种或多种分离的核酸分子,其包含编码本申请所述分离的抗原结合片段的多核苷酸。
在某些实施方式中,所述分离的核酸分子包括一个或多个选自下组的多核苷酸序列:SEQ ID NO:24-29。
另一方面,本申请提供了一种载体,其包括本申请所述分离的核酸分子。
另一方面,本申请提供了一种细胞,其包括本申请所述分离的核酸分子或本申请所述的载体。
另一方面,本申请提供了一种所述的抗原结合片段的方法,所述方法包括在使得所述抗原结合片段表达的条件下,培养本申请所述的细胞。
另一方面,本申请提供了一种药物组合物,其包含本申请所述分离的抗原结合片段、本申请所述分离的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞,以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面,本申请提供了本申请所述的分离的抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的宿主细胞在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的用途。
另一方面,本申请提供了本申请所述的分离的抗原结合片段、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的宿主细胞在制备嵌合抗原受体(CAR)及嵌合抗原受体T细胞(CART)中的用途。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的,本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地,本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的,而非为限制性的。
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下:
图1显示的是本申请所述扩增VHH片段的两轮PCR结果图。
图2显示的是本申请所述链霉亲和素磁珠分选后的流式检测结果图。
图3显示的是本申请所述酵母阳性单克隆(直接涂PAD平板)经诱导结合Biotin-BCMA- Fc蛋白后的流式分析结果图。
图4显示的是本申请所述靶向BCMA的单域抗体结合靶蛋白BCMA的流式分析结果图。
图5显示的是本申请所述配体(BCMA重组蛋白)偶联预富集实验的结果图。
图6显示的是本申请所述配体(BCMA重组蛋白)偶联实验的结果图。
图7显示的是本申请所述单域抗体4811/hu4811/hu4811FGLF结合靶蛋白BCMA的结果图。
图8显示的是本申请所述单域抗体D1/huD1/huD1FGLF结合靶蛋白BCMA的结果图。
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中,术语“分离的抗原结合片段”通常是指完整抗体的一部分,并且能够特异性识别和/或中和特定抗原。例如,分离的抗原结合片段可以包括重链的一部分。例如,分离的抗原结合片段可以包括重链可变区。术语“分离的抗原结合片段”可以包括单域抗体,包括但不限于人单域抗体。
在本申请中,术语“单域抗体”通常是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。在某些情形中,单域抗体可以来自双峰驼、单峰驼、羊驼、美洲驼、护士鲨、大星鲨或鳐鱼(例如,可参见康晓圳等,生物工程学报,2018,34(12):1974-1984)。例如,单域抗体可以来自羊驼。单域抗体可由重链可变区(VH)构成。术语“重链可变区”通常是指抗原结合片段的重链的氨基末端结构域。重链可变区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区,它们散布在成为框架区(FR)的更保守的区域中。每个重链可变区可由三个CDR和四个FR区构成,它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
在本申请中,术语“BCMA蛋白”通常是指B细胞上表达的、属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的一种生物标志物。“BCMA蛋白”也可以称为TNFRSF17或CD269。人BCMA蛋白的氨基酸序列可以见于UniProt/Swiss-Prot登录号Q02223。本申请中,所述分离的抗原结合片段可以结合BCMA蛋白。本申请中,术语“BCMA蛋白”、“BCMA抗原”和“BCMA-Fc重组蛋白”可以互换使用,并且包括由细胞天然表达的其任何变体或同种型。
在本申请中,术语“框架区”(FR)通常是指CDR残基之外的那些可变结构域残基。
在本申请中,术语“互补决定区”(CDR)通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本申请中,所述重链可变区存在3个CDRs,所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。这些CDRs的确切边界已根据不同***不同地限定。由Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991))描述的***,不仅提供了可应用于抗原结合片段的任何可变区的明确残基编号***,还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)以及Chothia等人,Nature 342:877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性,但是Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3,其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs,所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))描述。另外,其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述***之一,但仍将与Kabat CDRs重叠,尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现,它们可以缩短或加长。在本申请中,使用的是IMGT编号***。
在本申请中,术语“同源性”通常可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的氨基酸序列。通常,同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑,也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中,提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
为了确定序列同一性,可进行序列比对,其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行,例如,使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数,包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中,术语“K
D”可与“KD”互换使用,通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数,单位为M(mol/L)。K
D可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓度来计算:K
D=c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知,K
D值越大,说明解离越多,代表物质A、B之间的亲和力越弱;反之,K
D值越小,说明解离越少,代表物质A、B之间 的亲和力越强。
在本申请中,术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中,术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子,其将***的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA***细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体,以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常,通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞,所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中,术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述分离的核酸分子的载体,或者能够表达本申请所述分离的抗原结合片段的个体细胞,细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的,意外的或故意的突变,子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同,但能够表达本申请所述分离的抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌),也可以是真核细胞(例如酵母细胞,例如COS细胞,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,HeLa细胞,HEK293细胞,COS-1细胞,NS0细胞或骨髓瘤细胞)。例如,所述的宿主细胞可以是大肠杆菌细胞。例如,所述的宿主细胞可以是酵母细胞。例如,所述的宿主细胞可以是哺乳动物细胞。例如,所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。
在本申请中,术语“参比抗体”通常是指与本申请所述分离的抗原结合片段竞争结合BCMA蛋白的抗体。在某些情形中,所述分离的抗原结合片段与所述参比抗体对BCMA的亲和力相同或至少基本相同。在某些情形中,所述分离的抗原结合片段的K
D值约等于或低于所述参比抗体的K
D值。在某些情形中,所述分离的抗原结合片段比所述参比抗体的K
D值大不多于约1.5倍或不多于约2倍、不多于3倍,和/或不多于10倍。
在本申请中,术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下,也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中,术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5%-10%的范围内变动,例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的范围内变动。
发明详述
抗原结合片段
本申请所述的分离的抗原结合片段可与参比抗体竞争结合所述BCMA蛋白(例如,人BCMA蛋白),其中所述参比抗体可包含重链可变区,所述参比抗体的重链可变区可以包括HCDR1、HCDR2和HCDR3;在一些实施例中,所述HCDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列;在另一些实施例中,所述HCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
例如,所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:15所示的序列。又例如,所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:16所示的序列。
本申请的分离的抗原结合片段,其与BCMA蛋白结合的K
D值是或约是、或少于约或少于100nM、95nM、90nM、85nM、80nM、75nM、70nM、65nM、60nM、55nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM或0.1nM。
本申请所述的分离的抗原结合片段可与BCMA配体(例如,B细胞激活因子BAFF或APRIL)竞争对BCMA蛋白的结合。
本申请所述的BCMA蛋白可包括人BCMA蛋白。例如,所述BCMA蛋白可包含参见UniProt/Swiss-Prot登录号Q02223所示的氨基酸序列。例如,所述BCMA蛋白可包含人BCMA蛋白的同源物。在本申请中,术语“同源物”通常是指与人BCMA蛋白氨基酸序列和人BCMA蛋白核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的氨基酸序列。通常,同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑,也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中,提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。为了确定序列同一性,可进行序列比对,其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行,例如,使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数,包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。本申请中,术语“BCMA蛋白”、 “BCMA抗原”和“BCMA-Fc重组蛋白”可以互换使用。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合片段可以是单域抗体。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合片段包含重链可变区,所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3:其中,所述HCDR1包含下述任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9;所述HCDR2包含下述任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11;所述HCDR3包含下述任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:13。
例如,所述HCDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
又例如,在另一些实施例中,所述HCDR1包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列,所述HCDR2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列,且所述HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中,所述分离的抗原结合片段包含重链可变区,所述重链可变区包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。
在一些实施方式中,所述H-FR1可包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
QVQLVESGGGLVQX
1GGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:49),其中,X
1可以是A或P。
QVQLVESGGGLVQX
1GGSLRLSCX
2AS(SEQ ID NO:50),其中,X
1可以是A或P,X
2可以是A或V。
例如,所述H-FR1可包含下述任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:30。
在一些实施方式中,所述H-FR2可包含SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
MGWFRQX
1PGKX
2X
3EFVAA(SEQ ID NO:51),其中,X
1可以是A或T,X
2可以是E或G,X
3可以是L或R。
MGWFRQAPGKX
1X
2X
3FVAA(SEQ ID NO:52),其中,X
1可以是E或G,X
2可以是L或R,X
3可以是E或R。
例如,所述H-FR2可包含下述任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:33。
在一些实施方式中,所述H-FR3可包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示的氨基酸 序列。
YYX
1X
2SVKGRFTISRDNX
3KNTX
4YLQMNSLX
5X
6EDTAVYYC(SEQ ID NO:53),其中,X
1可以是A或R,X
2可以是D或T,X
3可以是A或S,X
4可以是L或V,X
5可以是K或R,X
6可以是A或P。
YYX
1X
2SVKGRFTISRDNX
3KNTX
4YLQMNSLX
5X
6EDTAVYYC(SEQ ID NO:54),其中,X
1可以是A或G,X
2可以是D或E,X
3可以是D或S,X
4可以是L或V,X
5可以是K或R,X
6可以是A或P。
例如,所述H-FR3可包含下述任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:31。
在一些实施方式中,所述H-FR4可包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
WGQGTX
1VTVSS(SEQ ID NO:55),其中,X
1可以是L或Q。
WGQGTX
1VTVX
2S(SEQ ID NO:56),其中,X
1可以是L或P,X
2可以是P或S。
例如,所述H-FR4可包含下述任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:32。
又例如,所述的分离的抗原结合片段中所述H-FR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,所述H-FR2可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列,所述H-FR3可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列,所述H-FR4可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
又例如,所述的分离的抗原结合片段中所述H-FR1可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,所述H-FR2可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,所述H-FR3可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,所述H-FR4可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
又例如,所述分离的抗原结合片段中所述H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:30;所述H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:3;所述H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31;所述H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:32。例如,所述分离的抗原结合片段可包括抗原结合片段hu4811或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
又例如,所述分离的抗原结合片段中所述H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:30;所述H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33;所述H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31;所述H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:32。例如,所述分离的抗原结合片段可包括抗原结合片段hu4811FGLF或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在某些实施方式中,所述重链可变区包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基 酸序列。
QVQLVESGGGLVQX
1GGSLRLSCAASGHTPSNYAMGWFRQX
2PGKX
3X
4EFVAAITWSAVTRDDAIPYYX
5X
6SVKGRFTISRDNX
7KNTX
8YLQMNSLX
9X
10EDTAVYYCAVDASLVMTPTPRYWGQGTX
11VTVSS(SEQ ID NO:47),其中,X
1可以是A或P,X
2可以是A或T,X
3可以是E或G,X
4可以是L或R,X
5可以是A或R,X
6可以是D或T,X
7可以是A或S,X
8可以是L或V,X
9可以是K或R,X
10可以是A或P,X
11可以是L或Q。
QVQLVESGGGLVQX
1GGSLRLSCX
2ASGRTSTTSVMGWFRQAPGKX
3X
4X
5FVAAITRTDDRQNDGITYYX
6X
7SVKGRFTISRDNX
8KNTX
9YLQMNSLX
10X
11EDTAVYYCAAHTSLVFTPDPRYWGQGTX
12VTVX
13S(SEQ ID NO:48),其中,X
1可以是A或P,X
2可以是A或V,X
3可以是E或G,X
4可以是L或R,X
5可以是E或R,X
6可以是A或G,X
7可以是D或E,X
8可以是D或S,X
9可以是L或V,X
10可以是K或R,X
11可以是A或P,X
12可以是L或P,X
13可以是P或S。
在本申请中,所述重链可变区可包含下述任一项所示的氨基酸序列:SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。
例如,所述分离的抗原结合片段可包含HCDR1-3和H-FR1-4,且所述HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2;所述HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4;所述HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:6;所述H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:1;所述H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:3;所述H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:5;所述H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:7。该抗原结合片段可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列,命名为4811。
例如,所述分离的抗原结合片段可包含HCDR1-3和H-FR1-4,且所述HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2;所述HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4;所述HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:6;所述H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:30;所述H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:3;所述H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31;所述H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:32。该抗原结合片段可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列,命名为hu4811。
例如,所述分离的抗原结合片段可包含HCDR1-3和H-FR1-4,且所述HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2;所述HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4;所述HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:6;所述H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:30;所述H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33;所述H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO: 31;所述H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:32。该抗原结合片段可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列,命名为hu4811FGLF。
例如,所述分离的抗原结合片段可包含HCDR1-3和H-FR1-4,且所述HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9;所述HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11;所述HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13;所述H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:8;所述H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10;所述H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:12;所述H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:14。该抗原结合片段可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列,命名为D1。
例如,所述分离的抗原结合片段可包含HCDR1-3和H-FR1-4,且所述HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9;所述HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11;所述HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13;所述H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:30;所述H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:10;所述H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31;所述H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:32。该抗原结合片段可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列,命名为huD1。
例如,所述分离的抗原结合片段可包含HCDR1-3和H-FR1-4,且所述HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9;所述HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11;所述HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:13;所述H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:30;所述H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33;所述H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31;所述H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:32。该抗原结合片段可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列,命名为huD1FGLF。
在本申请中涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列,还应理解为至少包含以下的范围:与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中,所述变体可以为在所述蛋白质和/或所述多肽(例如,特异性结合BCMA蛋白的抗原结合片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如,所述功能性变体可包含已经通过至少1个,例如1-30个、1-20个或1-10个,又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或***而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如,所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60%,70%,80%,90%,或100%的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如,所述取代可以为保守取代。
在本申请中,所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如,特异性结合BCMA蛋白的抗原结合片段)的氨基酸序列具有至少约85%(例如,具有至少约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中,所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”:将两条待比对的序列在比较窗中进行比较,确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如,A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即,窗大小),并且将结果乘以100,以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对,可以按本领域已知的多种方式实现,例如,使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数,包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定:FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),85:2444-2448,1988;和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”,Science,227:1435-1441,1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”,分子生物学杂志,215:403-410,1990。
核酸、载体、宿主细胞和制备方法
另一个方面,本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子,所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述分离的抗原结合片段。例如,所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合片段,也可以编码其中的一部分(例如,HCDR1-3、重链可变区中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如,其可以是通过以下方法产生或合成的:(i)在体外扩增的,例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的,(ii)通过克隆重组产生的,(iii)纯化的,例如通过酶切和凝胶电泳分级分离,或者(iv)合成的,例如通过化学合成。例如,所述分离的核酸可以是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中,可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述分离的抗原结合片段的核酸,这些方法包括但不限于,采用逆转录PCR和PCR获得本申请所述分离的抗原结合片段的 核酸分子。
另一个方面,本申请提供了一种或多种载体,其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外,所述载体中还可包含其他基因,例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外,所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的,例如,可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中,所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化,但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列,例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如,5’非转录表达控制序列可包含启动子区,启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中,适当的启动子可包括,例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV),其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合,其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括,例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如,所述载体为表达载体。
另一方面,本申请提供了宿主细胞,所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。例如,每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。例如,每种或每个宿主细胞可包含多个(例如,2个或以上)或多种(例如,2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如,可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中,例如原核细胞(例如,细菌细胞)、CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞或HEK293A细胞,或者其他真核细胞,如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中,例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如,所述宿主细胞可以为酵母细胞。例如,所述宿主细胞可以为大肠杆菌细胞。例如,所述宿主细胞可以为哺乳动物细胞。例如,所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1。
另一个方面,本申请提供了制备本申请所述分离的抗原结合片段的方法。所述方法可包括,在使得所述分离的抗原结合片段表达的条件下,培养本申请所述的宿主细胞。
例如,可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等,这些方法是本领域普通技 术人员所了解的。
在某些情形中,所述方法还可包括收获(例如分离和/或纯化)本申请所述分离的抗原结合片段的步骤。例如,可以采用蛋白G-琼脂糖或蛋白A-琼脂糖进行亲和层析,还可通过凝胶电泳和/或高效液相色谱等来纯化和分离本申请所述分离的抗原结合片段。例如,还可以通过使用高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
药物组合物和应用
另一个方面,本申请提供了一种药物组合物,其可包含本申请所述分离的抗原结合片段,以及任选地药学上可接受的载体。
在本申请中,所述药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中,所述药物组合物可被配制用于口服给药,静脉内给药,肌肉内给药,在肿瘤部位的原位给药,吸入,直肠给药,***给药,经皮给药或通过皮下储存库给药。
例如,所述药物组合物可以用于抑制或延缓疾病或病症的发展或进展,和/或可以减轻和/或稳定疾病或病症的状态。
本申请所述的药物组合物可以包含预防和/或治疗有效量的所述分离的抗原结合片段。
所述预防和/或治疗有效量是能够预防和/或治疗(至少部分治疗)患有或具有发展风险的受试者中的疾病或病症和/或其任何并发症而所需的剂量。
另一方面,本申请提供了所述分离的抗原结合片段在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的用途。
另一方面,本申请提供的所述分离的抗原结合片段,可用于预防或治疗疾病或病症。
另一方面,本申请提供了预防或治疗疾病或病症的方法,其包括施用(例如,向有需要的受试者施用)本申请所述分离的抗原结合片段、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。
本申请所述分离的抗原结合片段可缓解或治疗与BCMA的过度表达相关的疾病或病症。例如,所述的疾病或病症可以选自以下组:多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、自身免疫性疾病。
另一方面,本申请提供了抑制BCMA蛋白与BCMA配体结合的方法,其包括施用本申请所述分离的抗原结合片段、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。例如,所述方法可以为体外或离体方法。
不欲被任何理论所限,下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合片段、制备方 法和用途等,而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1羊驼免疫
1.1使用制备好的BCMA-Fc重组蛋白对羊驼进行六次免疫,分离免疫羊驼血清采用ELISA检测免疫效果,根据效价检测结果,进行冲击免疫,冲击免疫10天后,采集外周血分离PBMC进行建库。
实施例2免疫效价的检测
2.1采集5ml外周血,将收集有外周血的离心管置于37℃培养箱内放置1小时;然后将外周血转移至4℃过夜,分离免疫羊驼血清。
2.2将分离免疫羊驼血清转移至一个新的无菌离心管中,5000rpm离心20min;按照1:1k、1:2k、1:4k、1:8k、1:16k、1:32k、1:64k的血清稀释比例进行有限稀释,与BCMA-Fc重组蛋白预包被的96孔板进行ELISA实验检测免疫效价,如表1所示。根据ELISA检测效果,BCMA-Fc重组蛋白免疫效价较高。
表1免疫效价ELISA检测结果
血清稀释比例 | OD值 |
1:1k | 2.866 |
1:2k | 2.744 |
1:4k | 2.498 |
1:8k | 2.14 |
1:16k | 1.748 |
1:32k | 1.2 |
1:64k | 0.768 |
PBS | 0.072 |
实施例3 Biotin偶联抗原蛋白
3.1准备1mg的BCMA-Fc重组蛋白,缓冲体系为PBS,浓度1mg/mL。
3.2称取NHS-biotin,使用DMSO溶解,配制10mM的NHS-biotin。
3.3向上述BCMA-Fc重组蛋白中加入新鲜制备的10mM的NHS-biotin溶液,将样品管装入避光自封袋中,180RPM,室温偶联30min。
3.4使用PBS进行置换,去除未标记的Biotin,将标记好的BCMA-Fc重组蛋白保存于-80℃。
3.5使用ELISA的方案检测Biotin偶联效果。
实施例4 PBMC分离及VHH抗体片段的获得
4.1采集150ml外周血,使用淋巴细胞分离液分离PBMC。
4.2提取RNA,使用PrimeScript
TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录,制备cDNA。
1)在200μLPCR管中配制下列反应混合液Mix1(如表2所示):
表2反应混合液Mix1
试剂 | 用量 |
Oligo dT Primer(50μM) | 8μL |
dNTP Mixture(10mM each) | 8μL |
总RNA样品 | 20μg |
RNase-Free水 | up to 80μL |
2)65℃保温5min后,冰上迅速冷却。
3)在上述PCR管中配制下列反应液(如表3所示):
表3反应液组分
试剂 | 用量 |
上述变性后的反应液 | 80μL |
5×PrimeScript II Buffer | 32μL |
RNase Inhibitor(40Μ/μL) | 4μL |
PrimeScript Ⅱ RTase(200Μ/μL) | 8μL |
RNase-Free水 | 36μL |
4)吹打混匀后,分装80μL/管,置于PCR仪中42℃、1小时,70℃热失活15分钟,最后将cDNA样品置于冰上或-20℃长期保存。
4.3 VHH片段的扩增
1)配置第一轮PCR反应体系(50μL/管,如表4所示):
表4第一轮PCR反应体系
成分 | 用量 |
上游引物(5μM) | 2μL |
下游引物(10μM) | 1μL |
NuHi Power mix(2×) | 25μL |
cDNA模板 | 2μL |
无菌水 | 20μL |
2)配置好PCR反应体系后,按照如下程序设置PCR仪(如表5所示):
表5 PCR程序设置
3)PCR产物的琼脂糖电泳
使用1%的琼脂糖进行电泳分析PCR产物,分离分子量大小为750bp左右的片段。使用胶回收试剂盒回收PCR产物,并用NanoDrop测定浓度。
4)配置第二轮PCR反应体系(50μL/管,如表6所示):
表6第二轮PCR反应体系
成分 | 用量 |
2 nd F引物 | 2μL |
2 nd R引物 | 2μL |
NuHi Power mix(2×) | 25μL |
第一轮PCR回收产物 | 200ng |
无菌水 | 补足至50μL |
5)配置好PCR反应体系后,按照如下程序设置PCR仪(如表7所示):
表7 PCR设置程序
6)第二轮PCR产物的琼脂糖电泳分析
使用1%的琼脂糖进行电泳分析PCR产物,分离分子量大小为400bp左右的VHH片段。使用胶回收试剂盒回收VHH PCR产物,并用NanoDrop测定浓度。
如图1所示,第一轮PCR分别获得1000bp和750bp左右的PCR条带(无CH1区),胶回收750bp的片段作为二轮PCR的模板。第二轮PCR获得400bp左右的条带,为VHH片段。
实施例5酵母展示库的构建
5.1酵母展示载体的构建
1)使用SfiI分别酶切pBlue载体和上述获得的VHH片段,50℃酶切过夜。
2)使用1%的琼脂糖凝胶分离pBlue载体片段,切取9000bp的载体片段进行胶回收;同时使用DNA片段回收试剂盒纯化PCR酶切产物,并用NanoDrop测定浓度。
3)酶切好的pBlue载体和VHH片段使用T4ligase连接,16℃连接过夜,得到酵母展示载体。
5.2酵母展示载体电转化获得大肠杆菌库
1)准备电转杯、酵母展示载体和电转感受态置于冰上预冷;
2)取预冷的酵母展示载体加入到电转感受态中,置于冰上1min,向每个电转杯中加入70μL酵母展示载体/电转感受态混合物,将电转杯放于冰上;
3)按照2500V,5ms进行电转;
4)电击结束后,立刻加入平衡至室温的SOC培养基重悬菌体,37℃摇床培养1小时。
5)取20μL菌液进行库容QC以及多样性QC,其余菌液接种含Amp抗性的LB培养基中,180rpm,37℃选择培养过夜。
6)从上述过夜培养的菌液中,离心收集菌体沉淀,使用质粒大抽试剂盒进行质粒大抽。并用Nanodrop测定大肠杆菌库质粒浓度,计算获得的大肠杆菌库质粒总量。
实施例6电转化获得酵母展示库
6.1大肠杆菌库质粒的PmeI线性化,酶切体系如表8所示:
表8酶切体系
试剂 | 用量 |
大肠杆菌库质粒 | 12μg |
10Xbuffer | 5μL |
PmeI | 1μL |
无菌水 | up to 50μL |
6.2 37℃酶切3h,取5μL进行1%琼脂糖电泳检测,剩余酶切产物沉淀浓缩后待用,共酶切1mg大肠杆菌库质粒。
6.3制备酵母感受态细胞
1)从酵母甘油菌挑取酵母菌体,在YPD琼脂平板上划线,将平板置于24℃-30℃的培养箱中连续培养3-5天,直至单克隆长出。
2)从平板上挑取酵母菌单克隆,并加入至YPD液体培养基中,置于24℃-30℃的摇床中250RPM培养1-2天。
3)使用1L的无菌锥形瓶,加入100mL YPD培养基,将上述准备的摇菌产物加入瓶中,置于24℃-30℃的摇床中250RPM培养1-2天。
4)取样检测OD
600直至1.3-1.5(对数生长期)。
5)将菌液全部转移至离心管内,1500xg、4℃离心5分钟,去掉上清后,使用250mL冰上预冷的无菌水重悬菌体沉淀。
6)再进行一轮1500xg、4℃离心5分钟,去掉上清后,使用50mL冰上预冷的无菌水重悬菌体沉淀。
7)再进行一次1500xg、4℃离心5分钟,去掉上清后,使用10mL冰上预冷的1M山梨糖醇重悬菌体沉淀。
8)再进行一次1500xg、4℃离心5分钟,去掉上清后,使用500μL冰上预冷的1M山梨糖醇重悬菌体沉淀。
9)最终获得500μL酵母感受态细胞,分装为80μl/管备用,感受态细胞一般现做现用,以确保电转效率更高。
6.4电转酵母感受态细胞
1)取80μL酵母感受态细胞,加入1μg线性化的大肠杆菌库质粒,充分混匀后,加入至冰上预冷的电击杯中,将电击杯置于冰上冰浴5分钟。
2)电转化条件为:电压:1500V,时间:5ms,电击2次
3)电击结束后,立即加入1mL冰上预冷的YPDS培养基,轻轻吹打混匀后,将电击杯 的液体全部转移到新的EP管中,30℃的培养箱中静置培养2小时。
4)孵育结束后,取50μL电转化后产物,分别均匀的涂布在PAD选择性平板上。将平板置于28℃的培养箱中3天,直至单克隆长出。
5)其余转化产物,转移至液体的PAD培养基中,28℃震荡培养3天。
6)观察当白色菌体成为优势菌群后,1500xg,离心5min收集菌体,取一部分用于酵母展示库的诱导表达。剩余加入50%无菌甘油,保存在-80℃。
实施例7酵母展示库诱导表达以及分选
7.1酵母展示库诱导表达
1)将PAD液体培养基选择生长的酵母菌用无菌PBS清洗一次后,重悬在BMMY培养基中,添加氨苄和卡那霉素抗生素,28℃,220rpm诱导表达24-48h。
2)诱导前取1ml菌液,加入YPD培养基,添加氨苄和卡那霉素抗生素,28℃,220rpm震荡培养,此样品为诱导前对照。
7.2酵母展示库磁分选
1)链霉亲和素磁珠预吸附:取10OD诱导酵母菌,使用500μL预冷的0.5%PBSA重悬;取50μL链霉亲和素磁珠,充分吹打混合均匀后,加入1mL PBSA,置于磁力架上,放置3-5min,小心去除上清;加入1mL PBSA,重复洗涤一次磁珠。吸去上清,将步骤1)中的酵母菌加入,混合均匀,4℃孵育1h;置于磁力架上,放置3-5min,小心吸出上清,将酵母菌转移至一新的EP管中,重复吸附一次;小心吸出上清,用于下一步实验。
2)Biotin-Fc负分选:取预吸附后的酵母菌,800g离心5min,重悬在Biotin-Fc中,4℃孵育1h;将孵育结束的酵母中加入1mL的PBSA,800g离心5min,弃去上清。重复洗涤2次,最终重悬在500μL的PBS中;取50μL链霉亲和素磁珠,充分吹打混合均匀后,加入1mL PBSA,置于磁力架上,放置3-5min,小心去除上清;加入1mL PBSA,重复洗涤一次磁珠。吸去上清,将孵育Biotin-Fc的酵母菌加入,混合均匀,4℃孵育1h;置于磁力架上,放置3-5min,小心吸出上清,将酵母菌转移至一新的EP管中,重复吸附一次;小心吸出上清,800g离心5min,收集酵母菌用于下一步实验。
3)Biotin-BCMA-Fc磁分选:取Biotin-Fc负分选后的酵母菌,800g离心5min,重悬在Biotin-BCMA-Fc中,4℃孵育1h;将孵育结束的酵母中加入1mL的PBSA,800g离心5min,弃去上清;重复洗涤2次,最终重悬在500μL的PBS中;取100μL链霉亲和素磁珠,充分吹打混合均匀后,加入1mL PBSA,置于磁力架上,放置3-5min,小心去除上清;加入1mL PBSA,重复洗涤一次磁珠。吸去上清,将孵育Biotin-BCMA-Fc的酵母菌加入,混合均匀,4℃孵育 1h;孵育结束后,置于磁力架上,放置3-5min,小心吸出上清;加入1mL PBSA,重复洗涤两次磁珠,使用YPD培养基重悬酵母菌,进行培养和诱导表达,流式分析结果如图2所示,使用Fc封闭或者不封闭,二次磁分选的酵母展示库与Fc反应基本不结合;Fc封闭前后,二次磁分选的酵母展示库与BCMA-Fc的结合一致;说明使用链霉亲和素磁珠分选结合Fc去除的方案来进行酵母阳性克隆的筛选,可以获得特异性结合BCMA的酵母阳性克隆。去除和Fc结合的克隆,挑选单克隆。
7.3酵母单克隆的流式检测
重复两轮磁分选后,一部分酵母进行培养,诱导表达流式检测,一部分直接涂PAD平板,挑取单克隆培养,诱导表达24h后,同时与Biotin-Fc和Biotin-BCMA-Fc孵育,二抗使用PE-Streptavidin,孵育完成后进行流式检测,结果如图3所示,与Biotin-BCMA-Fc结合的克隆有14个。
实施例8 VHH真核表达载体的构建
8.1根据酵母单克隆流式检测结果,选择与目的抗原不同结合能力的阳性克隆,抽提基因组DNA,使用pBlue载体的通用引物进行PCR,将PCR产物进行测序,获得VHH抗体序列。将分析获得的VHH抗体序列分别进行基因合成,与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体Lenti-hIgG1-Fc2中。重组抗体表达载体Lenti-hIgG1-Fc2经测序验证无误后,使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。
实施例9重组抗体的表达
9.1从冰箱中取出LVTransm转染试剂及重组抗体表达载体Lenti-hIgG1-Fc2,室温解冻后,用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液,温热至室温。取500μLPBS至24孔板的一个孔,加入4μg重组抗体表达载体Lenti-hIgG1-Fc2,移液枪上下吹打充分混匀后,加入12μL LVTransm,立即用移液器上下吹打混匀,室温下静置10分钟。此处的混合物称为DNA/LVTransm复合物。
9.2将上述532μL DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F细胞中,轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5%CO
2培养箱,130RPM培养6~8小时后,加入1.5mL新鲜的FreeStyle
TM293培养基,将细胞重新放回培养箱中继续培养。
9.3连续培养3天后,离心收集培养基上清,用0.45μm的滤膜过滤,滤液转至无菌离心管中,滤液中的重组抗体即为单域抗体,进行后续的流式和ELISA检测。
实施例10流式检测单域抗体与靶蛋白的结合
10.1从液氮中复苏CHO-K1和CHO-K1-BCMA细胞株,调整细胞状态至对数生长期。
10.2将两种细胞分别分为若干份,每份细胞的数量为5×10
5个细胞。
10.3将表达的单域抗体4811(氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示)、D1(氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)、C6(氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示)、C2(氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示)和D10(氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示)分别孵育靶细胞,充分混匀后,室温孵育1小时。
10.4 800xg室温离心5分钟,去掉含有单域抗体的上清,使用PBS洗涤细胞3次。
10.5加入1μL PE标记的Anti-human IgG,充分混匀后,室温避光孵育30分钟;
10.6 800xg室温离心5分钟,去掉含有PE标记的Anti-human IgG的上清,使用PBS洗涤细胞3次;
10.7使用500μL PBS重悬细胞,进行流式分析,结果如图4所示,单域抗体4811和D1与CHO-K1-BCMA重组细胞株的结合能力最强,安排纯化单域抗体进行亲和力检测。
实施例11单域抗体的表达纯化
11.1从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单域抗体表达载体Lenti-hIgG1-Fc2,室温解冻后,用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液,温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔,分别加入130μg Lenti-hIgG1-Fc2,移液枪上下吹打充分混匀后,加入400μL LVTransm,立即用移液器上下吹打混匀,室温下静置10分钟。
11.2将上述DNA/LVTransm复合物加入到50mL 293F细胞中,轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5%CO
2培养箱,130RPM培养6~8小时后,加入50mL新鲜的FreeStyle
TM293培养基,将细胞重新放回培养箱中继续培养。
11.3连续培养7天后,离心收集培养基上清,用0.45μm的滤膜过滤,滤液转至无菌离心管中,使用Protein A柱子纯化抗体,最后得到单域抗体。
实施例12单域抗体人源化
羊驼来源的抗体可能引起人特异性免疫反应,因此对上述两种抗BCMA单域抗体都进行序列人源化。
将实施例11获得的单域抗体序列与IMGT数据库进行比对分析,通过IMGT抗体CDR区编号方案,得到抗体CDR与FR区域信息以及氨基酸位置编号,以人生殖系DP-47序列为 模板,替换抗体原有FR区域序列,保留抗体CDR区域序列,从而进行人源化改造。其中,hu4811与huD1人源化序列保留了对CDR3构象有影响的抗体原有FR2序列,;hu4811FGLF与huD1FGLF人源化序列替换了FR1、FR3与FR4区域序列,FR2区域进行T45A、E49G、R50L突变。为了验证人源化单域抗体的亲和力,将原始单域抗体以及设计好的人源化单域抗体进行融合蛋白表达。使用Biacore测定原始单域抗体及人源化抗体亲和力。得到的人源化抗体分别命名为:hu4811(氨基酸序列SEQ ID NO:22,核酸序列SEQ ID NO:28)、hu4811FGLF(氨基酸序列SEQ ID NO:23,核酸序列SEQ ID NO:29)、huD1(氨基酸序列SEQ ID NO:20,核酸序列SEQ ID NO:26)和huD1FGLF(氨基酸序列SEQ ID NO:21,核酸序列SEQ ID NO:27)。
实施例13单域抗体亲和力检测
将BCMA-Fc重组蛋白使用10mM醋酸盐缓冲液固定在CM5芯片上,分别以上述制备的单域抗体作为流动相,检测筛选获得的单域抗体与BCMA-Fc重组蛋白的结合能力。
1.试剂配制
运行试剂:含10mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2磺酸(HEPES),150mM氯化钠(NaCl),3mM乙二胺四乙酸(EDTA),0.005%吐温-20(Tween-20),pH调节至7.4。
人IgG(Fc)捕获试剂盒,其中包括:鼠抗人IgG(Fc)抗体,固定试剂(醋酸钠,pH5.0),再生试剂(氯化镁)。
氨基偶联试剂盒,包括:N-羟基丁二酰亚胺(NHS),1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和乙醇胺(pH8.5)。每管EDC和NHS分别加入10mL去离子水,分装保存到-18℃至更低温度,保质期两个月。
2.芯片制备
将鼠抗人IgG(Fc)抗体用固定试剂(醋酸钠,pH 5.0)稀释,950μL固定试剂加入50μL鼠抗人IgG(Fc)抗体用于固定八个通道。首先,CM5芯片的表面用EDC和NHS以10μL/min的流速进行360s的活化。其次,将鼠抗人IgG(Fc)抗体以10μL/min的流速注入到通道(channel 1-8,Fc1,2)约360s,固定量约为7000至14000RU。最后,芯片用乙醇胺以10μL/min进行420s封闭。
3.缓冲液置换
使用脱盐柱及相应运行试剂将人BCMA蛋白进行缓冲液置换,置换后的样品进行浓度测定。
4.捕获配体
将抗体用运行试剂稀释至10μg/mL并以10μL/min的流速注入到人IgG(Fc)捕获实验通道(Fc2)约300RU。参比通道(Fc1)不需要进行配体的捕获。
5.分析物多循环分析
将人BCMA蛋白用运行试剂进行2倍倍比稀释。将稀释后的人BCMA蛋白依次以30μL/min的流速注入到实验通道与参比通道,结合和解离相应时间。结合解离步骤均在运行试剂中进行。每一个浓度分析后,芯片需要用氯化镁以20μL/min的流速再生30s,洗掉配体以及未解离的分析物。进行下一个浓度分析时,实验通道需要重新捕获相同量的配体。
6.数据分析
使用Biacore 8K分析软件Biacore Insight Evaluation Software计算每个样品的KD值。参比通道(Fc1)用于背景的扣减。
结果如图7-8、表9所示,本申请的BCMA单域抗体D1和4811及其人源化抗体hu4811/hu4811FGLF或huD1/huD1FGLF均与人BCMA蛋白具有较高亲和力。
表9单域抗体与BCMA-Fc重组蛋白的结合结果
Ka(M -1s -1) | Kd(s -1) | KD(M) | |
D1 | 8.73E+06 | 2.12E-03 | 2.43E-10 |
huD1 | 7.41E+06 | 1.41E-02 | 1.90E-09 |
huD1FGLF | 6.26E+06 | 5.79E-02 | 9.25E-09 |
4811 | 3.42E+07 | 1.30E-03 | 3.79E-11 |
hu4811 | 7.19E+06 | 6.98E-02 | 9.71E-09 |
hu4811FGLF | 1.24E+07 | 1.26E-01 | 1.02E-08 |
Claims (23)
- 分离的抗原结合片段,其与参比抗体竞争结合所述BCMA蛋白,其中所述参比抗体包括重链可变区,所述参比抗体的重链可变区可包括HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;所述HCDR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列;所述HCDR3包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1所述分离的抗原结合片段,其包括单域抗体。
- 根据权利要求1-2中任一项所述分离的抗原结合片段,其中所述分离的抗原结合片段包括重链可变区,所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:9中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求3所述分离的抗原结合片段,所述HCDR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求3-4中任一项所述分离的抗原结合片段,所述HCDR3包含SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:13中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-5中任一项所述分离的抗原结合片段,其中所述分离的抗原结合片段包括重链可变区,所述重链可变区包括H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求6所述分离的抗原结合片段,其所述分离的抗原结合片段包括重链可变区,所述重链可变区包括H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4,所述H-FR1包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:30中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求6所述分离的抗原结合片段,所述H-FR2包含SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求8所述分离的抗原结合片段,所述H-FR2包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:33中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求6所述分离的抗原结合片段,所述H-FR3包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求10所述分离的抗原结合片段,所述H-FR3包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:31中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求6所述分离的抗原结合片段,所述H-FR4包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求12所述分离的抗原结合片段,所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO:32中任一项所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-13中任一项所述分离的抗原结合片段,所述分离的抗原结合片段包括重链可变区,所述重链可变区包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1-14中任一项所述分离的抗原结合片段,所述分离的抗原结合片段包括重链可变区,所述重链可变区包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
- 分离的核酸分子,其包含编码权利要求1-15中任一项所述分离的抗原结合片段的多核苷酸。
- 根据权利要求16所述分离的核酸分子,其包括一个或多个选自下组的多核苷酸序列:SEQ ID NO:24-29。
- 载体,其包括权利要求16-17中任一项所述分离的核酸分子。
- 宿主细胞,其包括权利要求16-17中任一项所述分离的核酸分子或权利要求18所述的载体。
- 制备权利要求1-15任一项所述分离的抗原结合片段的方法,所述方法包括在使得所述分离的抗原结合片段表达的条件下,培养权利要求19所述的宿主细胞。
- 药物组合物,其包含权利要求1-15中任一项所述分离的抗原结合片段、权利要求16-17中任一项所述的核酸分子、权利要求18所述的载体和/或权利要求19所述的宿主细胞,以及任选地药学上可接受的佐剂。
- 权利要求1-15中任一项所述分离的抗原结合片段、权利要求16-17中任一项所述的核酸分子、权利要求18所述的载体和/或权利要求19所述的宿主细胞在制备预防或治疗疾病或病症的药物中的用途。
- 权利要求1-15中任一项所述分离的抗原结合片段、权利要求16-17中任一项所述的核酸分子、权利要求18所述的载体和/或权利要求19所述的宿主细胞在制备嵌合抗原受体(CAR)及嵌合抗原受体T细胞(CART)中的用途。
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