CN116381091A - 一种检测棕榈酰三肽-5含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测棕榈酰三肽‑5含量的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将待测棕榈酰三肽‑5样品配制成供试品溶液；(2)将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图得出待测棕榈酰三肽‑5样品中棕榈酰三肽‑5的含量。本发明提供的检测棕榈酰三肽‑5含量的方法快速、科学、准确，并且采用梯度洗脱的方式进行，是目标物分离度高，并且该方法稳定性好，定量限较低，为0.5mg/L。
Description
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种检测棕榈酰三肽-5含量的方法。
背景技术
棕榈酰三肽-5为胜肽系列应用较早和较广泛的美容胜肽。因为其促进真皮层中胶原蛋白和弹性蛋白的合成性能优良，通过组织生长因子(TGF-β)刺激皮肤胶原蛋白合成，达到抚平皱纹和紧肤的抗皱目的，正因小分子肽的特殊生理活性作用，可以有效改善皮肤问题，应用在化妆品中的效果较好。
棕榈酰三肽-5由氨基酸链组成，具有穿透表皮并深入真皮层的能力，可刺激胶原蛋白的产生和健康的组织生长。它不仅可以加速皮肤中胶原蛋白的合成，而且早期的研究表明，这种肽还具有与皮肤细胞“通讯”的能力，可以防止渗透到皮肤细胞中的毒素造成伤害，这有助于皮肤细胞清除毒素或使其呈惰性。
CN106546673A公开了一种用高效液相色谱法分离棕榈酰五胜肽-3的方法。主要解决在棕榈酰五胜肽-3分离中，由于极性小而消耗大量的有机溶剂技术问题。该方法包括以下步骤：1、高效液相色谱法所用的色谱柱中，固定相为硅胶色谱柱；2、流动相A为：色谱纯乙腈；流动相B为：三氟乙酸:甲醇或者乙醇的体积比＝0.001:1；3、流动相A梯度范围为5％-70％；4、检测波长为230nm；5、转盐时流动相为0.5％质量百分浓度醋酸盐水溶液和色谱纯乙腈两相。该方法可以降低棕榈酰五胜肽-3的保留时间，从而更好地提高纯化效率。
CN111004306A公开了一种棕榈酰三肽-5的液相合成方法，属于生物医药制备方法技术领域，包括以下步骤：Pal-Lys(Boc)-OH的合成，Pal-Lys(Boc)-OSu的合成，Val-NCA的合成，H-Val-Lys(Boc)-OH的合成，Pal-Lys(Boc)Val-Lys(Boc)-OH的合成，棕榈酰三肽-5的合成，产品真空干燥后得到白色固体。该棕榈酰三肽-5的液相合成方法，最终产品可以通过结晶的方法进行纯化，成功避免了固相合成最后需要液相纯化，降低了生产成本，增加了批量生产能力。
CN113980097A公开了一种棕榈酰三肽-5的纯化方法，属于多肽纯化技术领域，具体涉及一种多孔硅胶，该方法采用了三乙氧基硅烷与烯丙基苯胺与己酸丙烯酯制备得到功能化硅烷，然后利用上述功能化硅烷与四乙氧基硅烷共同制备得到功能化聚乙氧基硅烷，以功能化聚乙氧基硅烷作为原料制备得到多孔硅胶，并经处理最终制成反相色谱填料，用以纯化棕榈酰三肽-5。该方法制备得到的多孔硅胶的比表面积大，比表面积为250-320m2/g；多孔硅胶的孔径大，孔径为6-10nm；用以制备的反相色谱填料对棕榈酰三肽-5的纯化效果好，纯度为96％以上。
CN107669564A公开了一种具有修复再生、补水保湿、延缓衰老的护肤组合物，其包括A组分、B组分和C组分；所述A组分为铁皮石斛提取物、芦荟提取物、佛手柑提取物、积雪草提取物、佛手瓜提取物、卷柏提取物；所述B组分为寡肽；其中所述寡肽选自寡肽-1、寡肽-2、寡肽-3、寡肽-4、寡肽-5、寡肽-6、寡肽-10、棕榈酰五肽-3、棕榈酰三肽-1、棕榈酰三肽-5、棕榈酰四肽-3、肉豆蔻五肽-11、乙酰基四肽-5、乙酰基五肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基二肽-1中的一种或多种；所述C组分为化妆品辅料和化妆品基质。
现有技术中报道了众多添加棕榈酰三肽-5的化妆品或清洁用品，并且也报道了棕榈酰三肽-5的制备工艺，但是未公开棕榈酰三肽-5的检测方法，因此，开发一种有效棕榈酰三肽-5含量的检测方法是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测棕榈酰三肽-5含量的方法，可以高效、快速，准确检测样品溶液中棕榈酰三肽-5的含量。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测棕榈酰三肽-5含量的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测棕榈酰三肽-5样品配制成供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图得出待测棕榈酰三肽-5样品中棕榈酰三肽-5的含量。
优选地，所述供试品溶液采用如下方法进行制备，所述方法包括：将待测棕榈酰三肽-5样品与甲醇混合，提取，得到所述供试品溶液。
优选地，所述提取采用超声的方式进行。
优选地，所述提取的料液比为1:(8-12)，例如可以为1:8.5、1:9或1:9.5等。
优选地，所述提取的时间为25-35min，例如可以为27min、30min或32min等。
优选地，所述高效液相色谱检测采用C18反相色谱柱。
优选地，所述高效液相色谱检测的柱温为28-32℃，例如可以为29℃、30℃或31℃等。
优选地，所述高效液相色谱检测的检测波长为210-230nm，例如可以为215nm、220nm或225nm等。
优选地，所述高效液相色谱检测的进样量为8-12μL，例如可以为9μL、10μL或11μL等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述高效液相色谱检测采用梯度洗脱的方式。
优选地，所述梯度洗脱的流动相为：流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈。
优选地，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的质量百分含量为0.05-0.15％，例如可以为0.08％、0.1％或0.12％等。
优选地，所述流动相的流速为1-1.4mL/min，例如可以为1.1mL/min、1.2mL/min或1.3mL/min等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述梯度洗脱的过程为：0-8min，流动相A：60％，流动相B：40％；8-13min，流动相A：60-0％，流动相B：40-100％；13-24min，流动相A：0-60％，流动相B：100-40％；24-27min，流动相A：60％，流动相B：40％。
优选地，所述方法还包括制备对照品溶液的步骤，以及采用和供试品溶液相同的检测方法，检测对照品溶液得到特征谱图并得出对照品溶液中棕榈酰三肽-5的含量的步骤。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测棕榈酰三肽-5样品与甲醇按照1:(8-12)混合，超声提取25-35min，得到供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图得出待测棕榈酰三肽-5样品中棕榈酰三肽-5的含量；
所述高效液相色谱检测的条件包括：采用C18反相色谱柱，柱温为28-32℃，检测波长为210-230nm，进样量为8-12μL，采用梯度洗脱的方式，流动相的流速为1-1.4mL/min，流动相A为三氟乙酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的质量百分含量为0.05-0.15％，流动相B为乙腈，0-8min，流动相A：60％，流动相B：40％；8-13min，流动相A：60-0％，流动相B：40-100％；13-24min，流动相A：0-60％，流动相B：100-40％；24-27min，流动相A：60％，流动相B：40％。
第二方面，本发明提供一种如第一方面提供的方法检测得到的特征谱图。
所述特征谱图中棕榈酰三肽-5的特征峰的保留时间为13-14min，例如可以为13.2min、13.4min、13.6min或13.8min等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的检测棕榈酰三肽-5含量的方法快速、科学、准确，并且采用梯度洗脱的方式进行，是目标物分离度高，并且该方法稳定性好，定量限较低，为0.5mg/L。
附图说明
图1为实施例2检测标准溶液溶液得到的特征谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
以下实施例中试剂或仪器来源如下：
三氟乙酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，HPLC级别；
棕榈酰三肽-5标准品：购于维克奇有限公司；
高效液相色谱仪：Agilent 1260Infinity II；
色谱柱：Eclipse XDB-C18 Colmu(40mm*150μm*5μm)。
实施例1
本实施例提供一种棕榈酰三钛-5含量的检测方法，所述方法包括如下步骤：
称取样品1g(精确到0.001g)于10mL刻度管中，加甲醇溶液定容，振摇，涡旋混匀，超声提取30min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。
称取棕榈酰三肽-5标准品50mg(精确到0.0001g)置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，震荡摇匀，即为1mg/mL棕榈酰三肽-5的对照品溶液。
检测方法：将供试品溶液和对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，进样体积10μL，采用C18反相色谱柱，柱温为30℃，检测波长为220nm，采用梯度洗脱的方式，流动相的流速为1.0mL/min，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，0-8min，流动相A：60％，流动相B：40％；8-13min，流动相A：60→0％，流动相B：40→100％；13-24min，流动相A：0→60％，流动相B：100→40％；24-27min，流动相A：60％，流动相B：40％。检测供试品溶液得到的特征谱图，其中棕榈酰三肽-5的保留时间为13.481min。
实施例2
本实施例提供一种棕榈酰三钛-5含量的检测方法，所述方法包括如下步骤：
称取棕榈酰三肽-5标准品，精确到0.0001g，置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，震荡摇匀，再用甲醇稀释分别制得5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的棕榈酰三肽-5的系列标准溶液。
检测方法：将标准溶液分别注入高效液相色谱仪，进样体积10μL，采用C18反相色谱柱，柱温为30℃，检测波长为220nm，采用梯度洗脱的方式，流动相的流速为1.0mL/min，流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，0-8min，流动相A：60％，流动相B：40％；8-13min，流动相A：60→0％，流动相B：40→100％；13-24min，流动相A：0→60％，流动相B：100→40％；24-27min，流动相A：60％，流动相B：40％。其中检测0.5mg/L标准溶液得到的特征谱图如图1所示，如图所示，棕榈酰三肽-5的保留时间为13.479min，表明本发明提供的检测方法灵敏度高，检测限低。
实施例3
线性关系实验
称取棕榈酰三钛-5标准品153.22mg，加入甲醇稀释至50mL，得到线性贮备液；
取2mL线性贮备液，加入甲醇稀释至100mL，得到0.06％线性溶液；
取1mL线性贮备液，加入甲醇稀释至20mL，得到0.15％线性溶液；
取2mL线性贮备液，加入甲醇稀释至20mL，得到0.3％线性溶液；
取1.5mL线性贮备液，加入甲醇稀释至10mL，得到0.45％线性溶液；
取2mL线性贮备液，加入甲醇稀释至10mL，得到0.6％线性溶液；
将0.06％、0.15％、0.3％、0.45％、0.6％线性溶液分别采用与实施例1相同的检测方法进行检测，检测结果如表1所示。
表1
根据表格数据可知，本发明提供的检测棕榈酰三肽-5含量的方法线性关系良好。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种检测棕榈酰三肽-5含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测棕榈酰三肽-5样品配制成供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图得出待测棕榈酰三肽-5样品中棕榈酰三肽-5的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液采用如下方法进行制备，所述方法包括：将待测棕榈酰三肽-5样品与甲醇混合，提取，得到所述供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取采用超声的方式进行；
优选地，所述提取的料液比为1:(8-12)；
优选地，所述提取的时间为25-35min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测采用C18反相色谱柱；
优选地，所述高效液相色谱检测的柱温为28-32℃。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的检测波长为210-230nm；
优选地，所述高效液相色谱检测的进样量为8-12μL。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测采用梯度洗脱的方式；
优选地，所述梯度洗脱的流动相为：流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈；
优选地，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的质量百分含量为0.05-0.15％；
优选地，所述流动相的流速为1-1.4mL/min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程为：0-8min，流动相A：60％，流动相B：40％；8-13min，流动相A：60-0％，流动相B：40-100％；13-24min，流动相A：0-60％，流动相B：100-40％；24-27min，流动相A：60％，流动相B：40％。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备对照品溶液的步骤，以及采用和供试品溶液相同的检测方法，检测对照品溶液得到特征谱图并得出对照品溶液中棕榈酰三肽-5的含量的步骤。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测棕榈酰三肽-5样品与甲醇按照1:(8-12)混合，超声提取25-35min，得到供试品溶液；
(2)将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到特征谱图，根据所述特征谱图得出待测棕榈酰三肽-5样品中棕榈酰三肽-5的含量；
所述高效液相色谱检测的条件包括：采用C18反相色谱柱，柱温为28-32℃，检测波长为210-230nm，进样量为8-12μL，采用梯度洗脱的方式，流动相的流速为1-1.4mL/min，流动相A为三氟乙酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的质量百分含量为0.05-0.15％，流动相B为乙腈，0-8min，流动相A：60％，流动相B：40％；8-13min，流动相A：60-0％，流动相B：40-100％；13-24min，流动相A：0-60％，流动相B：100-40％；24-27min，流动相A：60％，流动相B：40％。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的方法检测得到的特征谱图，其特征在于，棕榈酰三肽-5的特征峰的保留时间为13-14min。
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