CN116377122A - 一种可视化基因分型方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可视化基因分型方法，该方法包括待测目标核酸的等温扩增、酸碱指示剂与金属离子指示剂共介导的溶液颜色变化、双标记嵌合探针与金属离子指示剂共介导的溶液荧光变化，所述等温扩增所采用的试剂包括不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液、具有链置换活性的核苷酸聚合酶、核糖核酸酶、等温核酸扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、待测目标核酸，所述双标记嵌合探针是基于能量共振转移的序列内部嵌有核糖核苷酸的双标记脱氧核糖核酸探针。本发明方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、结果可视化等优点，摆脱当前基因分型方法对大型分析仪器的依赖，可用于新型冠状病毒突变体的快速可视化基因分型。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种可视化基因分型方法。
背景技术
基因分型(Genotyping)作为一种分子生物学分析技术能够对个体基因型进行特征分析以确定遗传构成差异。在临床诊断和传染性病原体鉴定方面，基因分型能够指导治疗和评估疾病风险，以便制定精准治疗方案和防疫措施。
当前，基因分型的分子生物学方法包括PCR、基因测序、DNA片段分析、寡核苷酸探针杂交基因芯片等。然而，上述方法存在明显的技术缺陷。PCR法和基因测序法对大型昂贵精密分析仪器的依赖性大，需要特定的技术人员才能操作完成，耗时耗力，成本高，分析时间长；DNA片段分析法则依赖于毛细管电泳和限制性内切酶的作用，体系优化繁琐，操作复杂；寡核苷酸探针杂交基因芯片分析法则需要借助芯片扫描仪和寡核苷酸探针设计，同样体系构建异常复杂，检测时间长。最重要的是，上述基因分型法都无法做到肉眼可视化检测，难以满足现场快速检测与自我检测。因此，开发一种只需借助简单的便携式蓝光发光仪即可实现肉眼可视化基因分型的方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出了一种可视化基因分型方法，该方法可实现肉眼可视化基因分型。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种可视化基因分型方法，包括待测目标核酸的等温扩增、酸碱指示剂与金属离子指示剂共介导的溶液颜色转变、双标记嵌合探针与金属离子指示剂共介导的溶液荧光变化；
所述等温扩增所采用的试剂包括不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液、具有链置换活性的核苷酸聚合酶、核糖核酸酶、等温核酸扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、待测目标核酸；
所述双标记嵌合探针是基于能量共振转移的序列内部嵌有核糖核苷酸的双标记脱氧核糖核酸-核糖核苷酸-脱氧核糖核酸嵌合型探针；
所述可视化基因分型方法包括以下步骤：
在所述待测目标核酸存在下，所述等温核酸扩增引物在所述具有链置换活性的核苷酸聚合酶作用下促发指数式扩增，所述脱氧核糖核苷三磷酸被聚合，生成氢离子、焦磷酸根离子和包含突变核苷酸的扩增子；
在所述不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，随着等温扩增反应的进行，氢离子不断累积而镁离子不断下降，在所述酸碱指示剂与金属离子指示剂的共同介导下溶液会呈现自然光下肉眼可见颜色转变；
所述双标记嵌合探针与所述包含突变核苷酸的扩增子识别后，其内部所形成的核糖核苷酸-脱氧核糖核苷酸碱基对能被所述核糖核酸酶识别，与突变核苷酸配对的所述核糖核苷酸被切割，使得所述双标记嵌合探针内部被荧光基团修饰的核苷酸与被淬灭基团修饰的3′端核苷酸互相分离，荧光共振能量转移现象消失，产生能感应目标核苷酸碱基突变的特异性荧光；
所述金属离子指示剂在溶液中能与镁离子形成金属螯合物，被蓝光激发时可产生红色荧光，随着等温扩增反应的不断进行，镁离子逐渐被消耗，镁离子指示剂-镁离子螯合物数量减少，红色荧光逐渐变弱，而所述双标记嵌合探针所产生的绿色荧光变强，整体呈现肉眼可见溶液荧光变化；
通过自然光下肉眼可见溶液颜色转变和蓝光激发时肉眼可见溶液荧光变化，可以对所述待测目标核酸及其核苷酸碱基突变的类型进行可视化检测与鉴定，实现可视化基因分型目的。
在一些实施例中，所述不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液包含0-1000mM硫酸铵、0-5000mM硫酸镁和0-10％(v/v)Tween 20，所述不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液的酸碱度用10-2000mM氢氧化钾溶液调至8.5。
在一些实施例中，所述具有链置换活性的核苷酸聚合酶为Bacillusstearothermophilus DNA聚合酶、Bacillus smithii DNA聚合酶、Bacillus subtilis DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶和Vent(exo-)DNA聚合酶中一种或多种；所述核糖核酸酶为RNaseH、RNase H2、RNase HII和RNase HIII。
在一些实施例中，所述等温核酸扩增引物来源于环介导等温扩增、逆转录环介导等温扩增、重组酶聚合酶反应、逆转录重组酶聚合酶反应、解旋酶扩增、逆转录解旋酶扩增、交叉引物扩增、逆转录交叉引物扩增、等温多自配引发扩增、逆转录等温多自配引发扩增中一种或多种所需的引物。
在一些实施例中，所述酸碱指示剂为硝基酚类、酚酞类、磺代酚酞类和偶氮化合物类中的一种或多种，其终浓度为0.01-10mM；所述金属离子指示剂为镁离子指示剂、钙离子指示剂和锰离子指示剂的一种或多种，其终浓度为0.01-10mM。
在一些实施例中，所述双标记嵌合探针的结构特点为其荧光基团和淬灭基团分别位于探针序列3′端和距离3′端第7-10个核苷酸处，其内部嵌入的核糖核苷酸位于距离3′端第6个核苷酸处，其序列长度为25-30个核苷酸，其终浓度为0.01-10μM。
在一些实施例中，所述待测目标核酸为DNA、RNA、DNA与RNA混合、DNA或RNA预扩增反应产物中一种或多种，所述预扩增反应为聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、环介导等温扩增、逆转录环介导等温扩增、重组酶聚合酶反应、逆转录重组酶聚合酶反应、解旋酶扩增和逆转录解旋酶扩增中一种或多种。
本发明还提供一种可视化基因分型的试剂盒，所述试剂盒包含如上述任一项所述的不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液、具有链置换活性的核苷酸聚合酶、核糖核酸酶、等温核酸扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、待测目标核酸、酸碱指示剂、金属离子指示剂和双标记嵌合探针。
本发明还提供一种应用，所述应用包括以下任一项：
(1)上述所述的可视化基因分型的试剂盒在检测新型冠状病毒与鉴定其突变体类型中的应用；
(2)上述所述的可视化基因分型的试剂盒在检测致病性细菌、病毒、支原体、衣原体、寄生虫与鉴定其基因类型中的应用；
(3)上述所述的可视化基因分型的试剂盒在检测临床标志物与鉴定其基因类型中的应用。
在一些实施例中，所述可视化基因分型的试剂盒在区分新型冠状病毒类型中的应用中，所述可视化基因分型的试剂盒包含用于区分新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体OmicronBA.1、Omicron BA.2、Omicron BA.4/5、Delta的双标记嵌合探针和等温核酸扩增引物组合；
检测Omicron BA.2的环介导等温扩增引物的序列如SEQ ID No.1-6所示；检测OmicronBA.2的双标记嵌合探针RCP-BA.2的序列如SEQ ID No.7所示；
检测Omicron BA.1的环介导等温扩增引物的序列如SEQ ID No.8-13所示；检测OmicronBA.1的双标记嵌合探针RCP-BA.1的序列如SEQ ID No.14所示；
检测Delta的环介导等温扩增引物的序列如SEQ ID No.15-20所示；检测Delta的双标记嵌合探针RCP-Delta的序列如SEQ ID No.21所示；
检测Omicron BA.4/5的环介导等温扩增引物的序列如SEQ ID No.22-27所示；检测Omicron BA.4/5的双标记嵌合探针RCP-BA.4/5的序列如SEQ ID No.28所示。
本发明的有益效果：
本发明方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强、结果可视化等优点，摆脱当前基因分型方法对大型分析仪器的依赖，可用于新型冠状病毒突变体的快速可视化基因分型。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明方法的原理示意图。
图2为本发明方法所涉及的双标记嵌合探针结构设计图；左为依据环介导等温扩增上游环引物LF所设计的探针，右为依据环介导等温扩增下游环引物LB所设计的探针。
图3为双标记嵌合探针在环介导等温扩增中的作用示意图；在扩增过程中探针识别含目标序列的扩增子，若目标序列含有突变型核苷酸，探针上的核糖核苷酸与该突变型脱氧核苷酸完全匹配，形成RNA-DNA碱基对，能被核糖核酸酶RNase H2特异性识别和切割，释放特异性荧光，否则不产生荧光。
图4为利用本发明方法用于新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体Omicron BA.2快速可视化基因分型的特异性(A)和灵敏度(B)实验结果；待测目标核酸物质为逆转录重组酶聚合酶反应对体外T7转录所得RNA进行预扩增的产物(2μL),NTC为不含目标核酸分子的空白对照组。
图5为利用本发明方法用于新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体Omicron BA.1的快速可视化基因分型的特异性(A)和灵敏度(B)实验结果；待测目标核酸物质为逆转录重组酶聚合酶反应对体外T7转录所得RNA进行预扩增的产物(2μL),NTC为不含目标核酸分子的空白对照组。
图6为利用本发明方法用于新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体Delta的快速可视化基因分型的特异性(A)和灵敏度(B)实验结果；待测目标核酸物质为逆转录重组酶聚合酶反应对体外T7转录所得RNA进行预扩增的产物(2μL),NTC为不含目标核酸分子的空白对照组。
图7为利用本发明方法用于新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体Omicron BA.4/5的快速可视化基因分型的特异性(A)和灵敏度(B)实验结果；待测目标核酸物质为含特定目标序列的质粒(2μL),NTC为不含目标核酸分子的空白对照组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
基于混合染料和双标记嵌合探针的SARS-CoV-2变体Omicron BA.2快速可视化基因分型。采用图1-3所示原理和设计，具体步骤如下：
(1)针对SARS-CoV-2变体Omicron BA.2特异性突变位点Δ156-157，设计一组共计6条LAMP反应的引物组和双标记嵌合探针，序列如下：
F3-BA.2:TGTTTTATTGCCACTAGTCTCT(SEQ ID No.1)；
B3-BA.2:ATCAAACCTCTTAGTACCATTG(SEQ ID No.2)；
FIP-BA.2:CTGAAAACTTTGTCAGGGTAATAAACAGTCAGTGTGTTAATCTTATAACCA G(SEQ IDNo.3)；
BIP-BA.2:ATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGTGTATAGCATGGAACCAAGT(SEQ ID No.4)；
LF-BA.2:CCACGTGTGAAAGAATTAGTGTATG(SEQ ID No.5)；
LB-BA.2:ACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCC(SEQ ID No.6)；
双标记嵌合探针RCP-BA.2:
CCACGTGTGAAAGAATTAGTGTA/i6FAMdT/GrATTGAG/BHQ1/(/i6FAMdT/代指FAM荧光基团修饰的胸腺嘧啶核苷，rA代指核糖核苷酸，/BHQ1/代指BHQ1淬灭基团)；(SEQ ID No.7)；
(2)以Omicron BA.2的RNA为模板，通过逆转录重组酶聚合酶反应合成大量cDNA。
逆转录重组酶聚合酶反应体系如下：7.6μL的Rehydrated Pellet,0.9μL的primer-enzyme mix,RNA模板1μL,0.5μL的MgOAc，共计10μL。其中primer-enzyme mix包括5U/μL RNase H，10U/μLAMVRT，20μM F3-BA.2，20μM B3-BA.2以及0.1μL的无核酸酶水。取出2μL至反应管中。反应参数：42℃ 20min；
(3)以上述合成的cDNA为模板，与引物组、双标记嵌合探针、混合染料等均匀混合，进行LAMP等温扩增。
LAMP等温扩增反应体系如下：10×Low buffer,100mM MgSO4,10mM dNTPs,10μMF3-BA.2,10μM B3-BA.2,40μM FIP-BA.2,40μM BIP-BA.2,20μM LF-BA.2,20μM LB-BA.2,20μM RCP-BA.2,0.02U/uL RNase H2,8U/μL Bst 2.0WS,1mM HNB+0.6mM CR混合染料，以及2μL逆转录扩增产物。共计组成10μL的反应体系。反应参数：60℃ 40min。
(4)检测结果判定
自然光下显色为蓝绿色的样本为SARS-CoV-2阳性样本，蓝紫色的为SARS-CoV-2阴性样本。蓝光激发下发出绿色荧光的为要检测的目标突变体，发出红色或红橙色荧光的为非目标突变体，发出强烈红色荧光的为阴性样本。Omicron BA.2的检测结果如图4所示，显示灵敏度检测可达100拷贝，特异性检测为100％。
实施例2：
基于混合染料和双标记嵌合探针的SARS-CoV-2变体Omicron BA.1快速可视化基因分型。采用图1-3所示原理和设计，具体步骤如下：
(1)针对SARS-CoV-2变体Omicron BA.1特异性突变位点Δ142-144，设计一组共计6条LAMP反应的引物组和双标记嵌合探针，序列如下：
F3-BA.1:ATAACCCTGTCCTACCATTTAAT(SEQ ID No.8)；
B3-BA.1:ACTAGAATAAACTCTGAACTCACTT(SEQ ID No.9)；
FIP-BA.1:GGTCTTCGAATCTAAAGTAGTACCAATGTTTATTTTGCTTCCATTGAGA(SEQ IDNo.10)；
BIP-BA.1:ACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTCCATCCAACTTTTGTTGTTTT(SEQ IDNo.11)；
LF-BA.1:AAATCCAGCCTCTTATTATGTTAGACT(SEQ ID No.12)；
LB-BA.1:TGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGG(SEQ ID No.13)；
双标记嵌合探针RCP-BA.1:
TGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTT/i6FAMdT/GGrACCACA/BHQ1/(/i6FAMdT/代指FAM荧光基团修饰的胸腺嘧啶核苷，rA代指核糖核苷酸，/BHQ1/代指BHQ1淬灭基团)；(SEQID No.14)；
(2)以Omicron BA.1的RNA为模板，通过逆转录重组酶聚合酶反应合成大量cDNA。
逆转录重组酶聚合酶反应体系如下：7.6μL的Rehydrated Pellet,0.9μL的primer-enzyme mix,RNA模板1μL,0.5μL的MgOAc，共计10μL。其中primer-enzyme mix包括5U/μL RNase H，10U/μLAMVRT，20μM F3-BA.1，20μM B3-BA.1以及0.1μL的无核酸酶水。取出2μL至反应管中。反应参数：42℃ 20min；
(3)以上述合成的cDNA为模板，与引物组、双标记嵌合探针、混合染料等均匀混合，进行LAMP等温扩增。
LAMP等温扩增反应体系如下：10×Low buffer,100mM MgSO4,10mM dNTPs,10μMF3-BA.1,10μM B3-BA.1,40μM FIP-BA.1,40μM BIP-BA.1,20μM LF-BA.1,20μM LB-BA.1,20μM RCP-BA.1,0.02U/uL RNase H2,8U/μL Bst 2.0WS,1mM HNB+0.6mM CR混合染料，以及2μL逆转录扩增产物。共计组成10μL的反应体系。反应参数：60℃ 40min。
(4)检测结果判定
自然光下显色为蓝绿色的样本为SARS-CoV-2阳性样本，蓝紫色的为SARS-CoV-2阴性样本。蓝光激发下发出绿色荧光的为要检测的目标突变体，发出红色或红橙色荧光的为非目标突变体，发出强烈红色荧光的为阴性样本。Omicron BA.1的检测结果如图5所示，显示灵敏度检测可达200拷贝，特异性检测为100％。
实施例3：
基于混合染料和双标记嵌合探针的SARS-CoV-2变体Delta快速可视化基因分型。采用图1-3所示原理和设计，具体步骤如下：
(1)针对SARS-CoV-2变体Delta特异性突变位点Δ24-26，设计一组共计6条LAMP反应的引物组和双标记嵌合探针，序列如下：
F3-Delta:GAGGCTGGATTTTTGGTA(SEQ ID No.15)；
B3-Delta:GAAAAGGCTGAGAGACAT(SEQ ID No.16)；
FIP-Delta:GACTTTAATAACAACATTAGTAGCGCTACTTTAGATTCGAAGACC(SEQ IDNo.17)；
BIP-Delta:GATCCATTTTTGGATGTTTATTACCGCAATTATTCGCACTAGAAT(SEQ IDNo.18)；
LF-Delta:TTATTAACAATAAGTAGGGACTG(SEQ ID No.19)；
LB-Delta:AACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTG(SEQ ID No.20)；
双标记嵌合探针RCP-Delta:
AACAACAAAAGTTGGATGGAAAG/i6FAMdT/GrGAGTTT/BHQ1/(/i6FAMdT/代指FAM荧光基团修饰的胸腺嘧啶核苷，rG代指核糖核苷酸，/BHQ1/代指BHQ1淬灭基团)；(SEQ ID No.21)；
(2)以Delta的RNA为模板，通过逆转录重组酶聚合酶反应合成大量cDNA。
逆转录重组酶聚合酶反应体系如下：7.6μL的Rehydrated Pellet,0.9μL的primer-enzyme mix,RNA模板1μL,0.5μL的MgOAc，共计10μL。其中primer-enzyme mix包括5U/μL RNase H，10U/μLAMV RT，20μM F3-Delta，20μM B3-Delta以及0.1μL的无核酸酶水。取出2μL至反应管中。反应参数：42℃ 20min；
(3)以上述合成的cDNA为模板，与引物组、双标记嵌合探针、混合染料等均匀混合，进行LAMP等温扩增。
LAMP等温扩增反应体系如下：10×Low buffer,100mM MgSO4,10mM dNTPs,10μMF3-Delta,10μM B3-Delta,40μM FIP-Delta,40μM BIP-Delta,20μM LF-Delta,20μM LB-Delta,20μM RCP-Delta,0.02U/uL RNase H2,8U/μL Bst 2.0WS,1mM HNB+0.6mM CR混合染料，以及2μL逆转录扩增产物。共计组成10μL的反应体系。反应参数：60℃ 40min。
(4)检测结果判定
自然光下显色为蓝绿色的样本为SARS-CoV-2阳性样本，蓝紫色的为SARS-CoV-2阴性样本。蓝光激发下发出绿色荧光的为要检测的目标突变体，发出红色或红橙色荧光的为非目标突变体，发出强烈红色荧光的为阴性样本。Delta的检测结果如图6所示，显示灵敏度检测可达200拷贝，特异性检测为100％。
实施例4：
基于混合染料和双标记嵌合探针的SARS-CoV-2变体Omicron BA.4/5快速可视化基因分型。采用图1-3所示原理和设计，具体步骤如下：
(1)针对SARS-CoV-2变体Omicron BA.4/5特异性突变位点L452R，设计一组共计6条LAMP反应的引物组和双标记嵌合探针，序列如下：
F3-BA.4/5:CGTTATAGCTTGGAATTCTAACA(SEQ ID No.22)；
B3-BA.4/5:CCAATAGTGGGTCGGAAA(SEQ ID No.23)；
FIP-BA.4/5:GTTGAAATATCTCTCTCAAAAGGTTTGATGATTCTAAGGTTGGTGGTAA(SEQ IDNo.24)；
BIP-BA.4/5:TGAAATCTATCAGGCCGGTAACACCATATGATTGTAAAGGAAAGTAAC(SEQ IDNo.25)；
LF-BA.4/5:TAGACTTCCTAAACAATCTATAC(SEQ ID No.26)；
LB-BA.4/5:GTAATGGTGTTGCAGGTGTTAATT(SEQ ID No.27)；
双标记嵌合探针RCP-BA.4/5:
TAGACTTCCTAAACAATCTA/i6FAMdT/ACrCGGTAA/BHQ1/(/i6FAMdT/代指FAM荧光基团修饰的胸腺嘧啶核苷，rC代指核糖核苷酸，/BHQ1/代指BHQ1淬灭基团)；(SEQ IDNo.28)；
(2)以含Omicron BA.4/5特异性突变位点L452R的目标质粒为模板，与引物组、双标记嵌合探针、混合染料等均匀混合，进行LAMP等温扩增。
LAMP等温扩增反应体系如下：10×Low buffer,100mM MgSO4,10mM dNTPs,10μMF3-BA.4/5,10μM B3-BA.4/5,40μM FIP-BA.4/5,40μM BIP-BA.4/5,20μM LF-BA.4/5,20μMLB-BA.4/5,20μM RCP-BA.4/5,0.02U/uL RNase H2,8U/μL Bst 2.0WS,1mM HNB+0.6mM CR混合染料，以及2μL目标质粒。共计组成10μL的反应体系。反应参数：60℃ 40min。
(3)检测结果判定
自然光下显色为蓝绿色的样本为SARS-CoV-2阳性样本，蓝紫色的为SARS-CoV-2阴性样本。蓝光激发下发出绿色荧光的为要检测的目标突变体，发出红色或红橙色荧光的为非目标突变体，发出强烈红色荧光的为阴性样本。Omicron BA.4/5的检测结果如图7所示，显示灵敏度检测可达500拷贝，特异性检测为100％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (10)
1.一种可视化基因分型方法，其特征在于，包括待测目标核酸的等温扩增、酸碱指示剂与金属离子指示剂共介导的溶液颜色转变、双标记嵌合探针与金属离子指示剂共介导的溶液荧光变化；
所述等温扩增所采用的试剂包括不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液、具有链置换活性的核苷酸聚合酶、核糖核酸酶、等温核酸扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、待测目标核酸；
所述双标记嵌合探针是基于能量共振转移的序列内部嵌有核糖核苷酸的双标记脱氧核糖核酸-核糖核苷酸-脱氧核糖核酸嵌合型探针；
所述可视化基因分型方法包括以下步骤：
在所述待测目标核酸存在下，所述等温核酸扩增引物在所述具有链置换活性的核苷酸聚合酶作用下促发指数式扩增，所述脱氧核糖核苷三磷酸被聚合，生成氢离子、焦磷酸根离子和包含突变核苷酸的扩增子；
在所述不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，随着等温扩增反应的进行，氢离子不断累积而镁离子不断下降，在所述酸碱指示剂与金属离子指示剂的共同介导下溶液会呈现自然光下肉眼可见颜色转变；
所述双标记嵌合探针与所述包含突变核苷酸的扩增子识别后，其内部所形成的核糖核苷酸-脱氧核糖核苷酸碱基对能被所述核糖核酸酶识别，与突变核苷酸配对的所述核糖核苷酸被切割，使得所述双标记嵌合探针内部被荧光基团修饰的核苷酸与被淬灭基团修饰的3′端核苷酸互相分离，荧光共振能量转移现象消失，产生能感应目标核苷酸碱基突变的特异性荧光；
所述金属离子指示剂在溶液中能与镁离子形成金属螯合物，被蓝光激发时可产生红色荧光，随着等温扩增反应的不断进行，镁离子逐渐被消耗，镁离子指示剂-镁离子螯合物数量减少，红色荧光逐渐变弱，而所述双标记嵌合探针所产生的绿色荧光变强，整体呈现肉眼可见溶液荧光变化；
通过自然光下肉眼可见溶液颜色转变和蓝光激发时肉眼可见溶液荧光变化，可以对所述待测目标核酸及其核苷酸碱基突变的类型进行可视化检测与鉴定，实现可视化基因分型目的。
2.根据权利要求1所述的可视化基因分型方法，其特征在于，所述不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液包含0-1000mM硫酸铵、0-5000mM硫酸镁和0-10％(v/v)Tween 20，所述不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液的酸碱度用10-2000mM氢氧化钾溶液调至8.5。
3.根据权利要求1所述的可视化基因分型方法，其特征在于，所述具有链置换活性的核苷酸聚合酶为Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶、Bacillus smithii DNA聚合酶、Bacillus subtilis DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶和Vent(exo-)DNA聚合酶中一种或多种；所述核糖核酸酶为RNase H、RNase H2、RNase HII和RNase HIII。
4.根据权利要求1所述的可视化基因分型方法，其特征在于，所述等温核酸扩增引物来源于环介导等温扩增、逆转录环介导等温扩增、重组酶聚合酶反应、逆转录重组酶聚合酶反应、解旋酶扩增、逆转录解旋酶扩增、交叉引物扩增、逆转录交叉引物扩增、等温多自配引发扩增、逆转录等温多自配引发扩增中一种或多种所需的引物。
5.根据权利要求1所述的可视化基因分型方法，其特征在于，所述酸碱指示剂为硝基酚类、酚酞类、磺代酚酞类和偶氮化合物类中的一种或多种，其终浓度为0.01-10mM；所述金属离子指示剂为镁离子指示剂、钙离子指示剂和锰离子指示剂中的一种或多种，其终浓度为0.01-10mM。
6.根据权利要求1所述的可视化基因分型方法，其特征在于，所述双标记嵌合探针的结构特点为其荧光基团和淬灭基团分别位于探针序列3′端和距离3′端第7-10个核苷酸处，其内部嵌入的核糖核苷酸位于距离3′端第6个核苷酸处，其序列长度为25-30个核苷酸，其终浓度为0.01-10μM。
7.根据权利要求1所述的可视化基因分型方法，其特征在于，所述待测目标核酸为DNA、RNA、DNA与RNA混合、DNA或RNA预扩增反应产物中一种或多种，所述预扩增反应为聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、环介导等温扩增、逆转录环介导等温扩增、重组酶聚合酶反应、逆转录重组酶聚合酶反应、解旋酶扩增和逆转录解旋酶扩增中一种或多种。
8.一种可视化基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1至7中任一项所述的不含三羟甲基氨基甲烷的缓冲液、具有链置换活性的核苷酸聚合酶、核糖核酸酶、等温核酸扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、待测目标核酸、酸碱指示剂、金属离子指示剂和双标记嵌合探针。
9.一种应用，所述应用包括以下任一项：
(1)权利要求8所述的可视化基因分型的试剂盒在检测新型冠状病毒与鉴定其突变体类型中的应用；
(2)权利要求8所述的可视化基因分型的试剂盒在检测致病性细菌、病毒、支原体、衣原体、寄生虫与鉴定其基因类型中的应用；
(3)权利要求8所述的可视化基因分型的试剂盒在检测临床标志物与鉴定其基因类型中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述可视化基因分型的试剂盒在区分新型冠状病毒类型中的应用中，所述可视化基因分型的试剂盒包含用于区分新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体Omicron BA.1、Omicron BA.2、Omicron BA.4/5、Delta的双标记嵌合探针和等温核酸扩增引物组合；
检测Omicron BA.2的环介导等温扩增引物的序列如SEQ ID No.1-6所示；检测OmicronBA.2的双标记嵌合探针RCP-BA.2的序列如SEQ ID No.7所示；
检测Omicron BA.1的环介导等温扩增引物的序列如SEQ ID No.8-13所示；检测OmicronBA.1的双标记嵌合探针RCP-BA.1的序列如SEQ ID No.14所示；
检测Delta的环介导等温扩增引物的序列如SEQ ID No.15-20所示；检测Delta的双标记嵌合探针RCP-Delta的序列如SEQ ID No.21所示；
检测Omicron BA.4/5的环介导等温扩增引物的序列如SEQ ID No.22-27所示；检测Omicron BA.4/5的双标记嵌合探针RCP-BA.4/5的序列如SEQ ID No.28所示。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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