CN116376839A - 稳定表达car的nk细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用。将靶向癌细胞表面抗原的CAR基因以非病毒质粒的形式导入NK细胞，CAR稳定表达2周以上，经体外扩增的CAR‑NK细胞增殖良好、纯度高、靶向性好，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。本发明解决了CAR‑NK制备方法面临的CAR阳性率不高及细胞扩增数量有限的问题，满足临床上对于CAR‑NK细胞的需求。并可有效规避慢病毒和逆转录病毒对NK细胞的基因组修饰所产生的不利效应，且可以规避在NK细胞内引入任何慢病毒或逆转录病毒元件。

Description

稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，具体地说，涉及一种稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体天然免疫***的重要组成部分，在监视肿瘤早期恶性转化、清除肿瘤细胞及病毒、调控免疫***反应等过程中具有关键作用。与T、B细胞不同，NK细胞发挥功能无需预先致敏，且无组织相容性复合体MHC限制性，在过继性免疫细胞治疗中能实现异体化使用。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，即CAR)是一种人工设计的含多个功能区的单链跨膜蛋白，它可以嵌入T、NK、巨噬细胞膜表面，将抗原抗体结合机制和细胞的杀伤作用结合，从而特异性地杀伤肿瘤或其他病变细胞。近十年来，CAR-T细胞的制备技术发展迅速，CAR-T产品在治疗血液淋巴细胞瘤疗效显著，其已在多个国家批准上市，作为治疗B系淋巴细胞白血病及淋巴瘤的有效手段。然而，CAR-T治疗多以患者自体来源的T细胞制备使用为主，其存在以下弊端：1)肿瘤细胞污染的可能；2)患者来源T细胞功能异常，无法发挥功能或实现体外扩增；3)生产制备过程中患者的疾病进展；4)价格昂贵等。此外，CAR-T治疗引起的细胞因子风暴往往带来严重的不良反应，危及患者生命。CAR-NK在抗肿瘤过程中不会释放包括IL-6在内的大量细胞因子，因此不会引起严重的细胞因子风暴，较CAR-T治疗安全。过继性移植异基因NK细胞的试验也证明其几乎不存在移植物宿主病GvHD、细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性。
CAR-T的制备一般普遍采用慢病毒或逆转录病毒将CAR转入T细胞，但是这种转染方法会导致T细胞基因组因病毒基因组随机嵌入发生随机突变。此外，病毒载体的价格昂贵直接造成CAR-T治疗费用高昂，无法实现临床大量推广使用，非病毒载体的使用能有效规避以上问题。
综上，慢病毒和逆转录病毒对NK细胞的基因组修饰会引入病毒元件从而带来一定的安全隐患；而相对于T细胞而言，NK细胞的基因改造难度较大，一直是待解决的技术瓶颈问题；且非病毒质粒转染CAR-NK细胞具有转染效率低及不稳定的问题；此外，NK细胞本身较难在体外体系中扩增。因此，若能开发出一种非病毒载体高效转染CAR的NK制备方法，且实现CAR-NK的体外稳定扩增，则能够有效规避病毒载体制备自体CAR-T细胞的弊端，推进过继性异体CAR-NK的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种稳定表达CAR的NK细胞的制备方法，所述方法包括：将靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因通过PB转座子***导入NK细胞中。
所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因选自基于第一代、第二代或第三代CAR-T技术构建的CAR基因。
优选地，所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因为基于第三代CAR-T技术构建的CAR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
所述PB转座子***包括重组转座子质粒(PiggyBac Her2-CAR-puro)和PB转座酶质粒(Super PiggyBac Transposase expression vector)。
进一步地，所述重组转座子质粒的构建方法包括：
(1)人工合成靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因序列；
(2)pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体经酶切分离出T2A-Puro基因片段(SEQ ID NO:2)；
(3)将CAR基因序列、T2A-Puro基因片段***转座子载体PB-EF1-MCS-IRES-Neo的XbaⅠ和SalⅠ酶切位点之间，以取代MCS-IRES-Neo元件。
进一步地，采用电转化的方法将所述PB转座子***转入NK细胞，获得转染的CAR-NK细胞。
还包括对CAR-NK细胞进行体外扩增培养的步骤，具体如下：
将所述CAR-NK细胞与CD2/CD335磁珠(将CD2和CD335生物素抗体包被于磁珠颗粒上)接触，并加入200-800IU/ml IL-2、20-60ng/ml IL-21和30-100ng/ml IL-15(优选500IU/ml IL-2、30ng/ml IL-21和50ng/ml IL-15)进行共培养。
优选地，所述CAR-NK细胞与CD2/CD335磁珠的个数比为1:(0.5-5)，优选1:2。
优选地，所述NK细胞为脐带血来源的NK细胞。
第二方面，本发明提供按照所述方法制备的稳定表达CAR的NK细胞。
第三方面，本发明提供所述稳定表达CAR的NK细胞在制备抗肿瘤药物或组合物中的应用。
优选地，所述肿瘤为HER2阳性肿瘤。
第四方面，本发明提供一种抗肿瘤药物或组合物，其有效成分为所述稳定表达CAR的NK细胞。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明解决了CAR-NK制备方法面临的CAR阳性率不高及细胞扩增数量有限的问题，满足临床上对于CAR-NK细胞的需求。并可有效规避慢病毒和逆转录病毒对NK细胞的基因组修饰所产生的不利效应，且可以规避在NK细胞内引入任何慢病毒或逆转录病毒元件。
(二)本发明首次提供一种通过非病毒质粒稳定表达CAR的NK细胞及其制备方法，将所构建的非病毒重组质粒通过电转的方法导入NK细胞后，可以使之稳定表达2周以上，并且可有效提高NK细胞CAR转染效率(>85％)。
(三)本发明使用电转的方法将PiggyBac转座子酶的质粒与第3代PiggyBacHer2CAR转座子质粒同时导入到脐带血分离纯化的NK细胞中，比外周血来源的NK、造血干细胞诱导的NK或NK92/MI细胞株的转染效率更高。
(四)本发明在CAR-NK转染后，使用CD2/CD335(NKp46)磁珠来刺激扩增CAR-NK细胞，极大增加了CAR-NK的产量，其扩增倍数≥70倍。经该方法扩增的CAR-NK细胞增殖良好、纯度高、靶向性好，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。
(五)本发明在未使用抗生素筛选的基础上即能获取CAR阳性率较高的NK细胞，且在培养14天后仍然稳定表达。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中本发明质粒图谱。
图2为本发明较佳实施例中CAR基因测序结果比对。其中，1为HER2-CAR-puro原核苷酸序列，2为质粒测序结果。
图3为本发明较佳实施例中脐带血中分选出NK细胞(CD56+CD3-)及其活化受体NKG2D和抑制受体KIR2DL1的流式分析图。
图4为本发明较佳实施例中CAR-NK在体外培养体系中增殖状态与形态。
图5为本发明较佳实施例中CAR-NK在体外培养体系中的增殖曲线。
图6为本发明较佳实施例中CAR-NK在培养2周以后CAR阳性表达率。
图7为本发明较佳实施例中CAR-NK对HER2阳性的乳腺癌肿瘤细胞的靶向杀伤能力。
图8为本发明较佳实施例中CAR-NK对HER2阳性的肺腺癌肿瘤细胞的靶向杀伤能力。
图9为本发明较佳实施例中ELISA分析穿孔素(Perforin)产生。
图10为本发明较佳实施例中ELISA分析颗粒酶(Granzyme B)产生。
图11为本发明较佳实施例中来自于3名不同捐赠者的脐带血NK细胞构建的CAR-NK细胞，未选用CD2/CD335磁珠刺激培养时的生长曲线。
图12为本发明较佳实施例中以外周血分离培养的NK细胞及造血干细胞诱导NK细胞为来源构建的CAR-NK培养2周后的CAR阳性表达率。
图13为本发明较佳实施例中以NK细胞系为来源构建的CAR-NK培养2周后CAR阳性表达率。
具体实施方式
本发明提供一种靶向性杀伤肿瘤的免疫细胞--CAR-NK细胞。
本发明提供一种高表达CAR并在体外稳定扩增CAR-NK细胞的方法与应用。
所述高表达CAR的NK细胞制备方法包括：将靶向癌细胞表面抗原的CAR基因以非病毒质粒的形式，通过电转导入脐带血来源的NK细胞，CAR稳定表达2周以上，经该方法扩增的CAR-NK细胞增殖良好、纯度高、靶向性好，具有明显的肿瘤细胞杀伤效应。
具体地，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种稳定表达CAR的NK细胞的制备方法，所述方法包括：将靶向癌细胞表面抗原的CAR基因通过非病毒载体导入NK细胞中。
本发明所用质粒为PiggyBac HER2 CAR转座子质粒。由GenScript合成Her2 CARcDNA，从pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(购自System Biosciences，货号CD527A-1)载体中利用EcoRI和SalⅠ酶切位点酶切分离出T2A-Puro基因片段(SEQ ID NO:2)，并采用同源重组的方式将以上片段***PiggyBac转座子载体PB-EF1-MCS-IRES-Neo(SystemBiosciences，货号PB533A-2)，以取代MCS-IRES-Neo部分，从而获得PiggyBac HER2-CAR-puro转座子质粒。转座酶质粒(SuperpiggyBac Transposase expression vector)购自SystemBiosciences，货号PB210PA-1。以上获得的质粒转入DH5α感受态细胞中扩增，扩增的一部分细菌悬液用甘油保存，再对剩余的细菌悬液进行超纯内毒素抽提并测序分析。PiggyBacHer-CAR-puro质粒图谱见图1。测序结果表明，扩增后的质粒序列与设计的PiggyBacHER2-CAR-puro转座子质粒吻合(图2)。
所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因选自第一代、二代或三代CAR-T技术构建的CAR基因。
优选地，所述靶向癌细胞表面抗原的CAR基因为基于第三代CAR-T技术构建的CAR基因。CAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面，本发明提供按照上述方法制备的稳定表达CAR的NK细胞。
第三方面，本发明提供所述稳定表达CAR的NK细胞的以下任一应用：
1)用于制备抗肿瘤药物(特别是抗HER2阳性肿瘤的药物)或组合物；
2)用于肿瘤细胞免疫治疗，特别是HER2阳性肿瘤的治疗。
第四方面，本发明提供一种抗肿瘤药物或组合物，有效成分为上述稳定表达CAR的NK细胞。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1同源重组法构建PiggyBac HER2-CAR-puro转座子质粒
1.载体线性化
1.1 PB-EF1-MCS-IRES-Neo载体质粒(购自System Biosciences，货号：PB533A-2)通过酶切(Xba I酶切位点和SalⅠ酶切切位点)获得线性化载体。
酶切反应体系如下：PB-EF1-MCS-IRES-Neo载体质粒(3μl)，Xba Ⅰ(1μl)，SalⅠ(1μL)，10×Buffer H(3μl)，BSA(2μl)，ddH2O(20μl)，共30μl。
酶切反应条件如下：37℃水浴5-6小时反应结束，0.6％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
1.2酶切产物回收
(1)称取空离心管的重量，将切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。一般情况下，凝胶的密度为1g/ml，于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算：凝胶薄片的重量为0.2g，则其体积为0.2ml；加入等倍凝胶体积的BindingBuffer，把混合物置于55℃～65℃水浴中温浴5-10分钟至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次。
(2)转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集管内，室温下，10,000g离心1分钟，弃去液体。
(3)将柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA柱子中；室温下，10,000g离心1分钟，弃去滤出液。
(4)将柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000g离心1分钟，弃去滤出液。
(5)将柱子重新套回收集管中，重复加入700μl SPW Washbuffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000g离心1分钟，弃去滤出液。
(6)弃去液体将空柱子重新套回收集管中，10,000g离心1分钟以甩干柱基质残余的液体。这步可以去除柱子基质上残余的乙醇。
(7)将柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30～50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10,000g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20℃。
(8)测定回收产物浓度，再次跑胶验证。
2.T2A-Puro片段及目的片段获得
pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体质粒(购自System Biosciences，货号CD527A-1)通过酶切(EcoR I和SalⅠ酶切位点)获得片段T2A-Puro。酶切反应体系如下:pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体质粒(3μl)，EcoRⅠ(1μl)，SalⅠ(1μl)，10×Buffer H(3μl)，BSA(2μl)，ddH2O20μl，共30μl。
酶切反应条件如下：37℃水浴5-6小时反应结束，0.6％琼脂糖凝胶电泳观察结果。酶切产物回收同1.2。
用GenScript设计合成Her2 CAR cDNA，序列如SEQ ID NO:1所示。
3.重组反应
将线性化载体和各***目的片段按比例混合，在Exnase催化下，50℃反应15分钟即可完成重组反应。反应体系：线性化载体(1μl)、Her2 CAR cDNA(1μl)、T2A-Puro基因片段(SEQ ID NO:2，1μl)、ClonExpress Mix(2μl)、ddH2O(5μl)至总体积10μl。
4.PiggyBac HER2-CAR-puro转座子质粒转化、阳性克隆扩增培养和质粒提取
4.1质粒转化
a.从-80℃冰箱将E.coli感受态细胞DH5α快速取出并放置冰上孵育5分钟，待其慢慢融化。
b.取1μl质粒加入到装有100μl E.coli感受态细胞DH5α中的1.5ml EP管中，并用枪头轻轻混匀。
c.放置冰上孵育30分钟，同时打开金属浴调温至42℃，打开恒温摇床，调温至37℃。
d.将EP管快速放置到已预热42℃的金属浴锅中热激90秒。
e.快速取出EP管，再放置冰上孵育2分钟。
f.2分钟后，向EP管中加入37℃预温的700μl无氨苄抗生素的液体LB培养基。
g.放置37℃摇床，以每分钟255转的速度摇45分钟。
h.提前从4℃冰箱取出LB培养基培养皿，放入37℃温箱中预热。
i.45分钟后，若EP管培养基变浑浊，取出50μl或100μl摇好的菌液加入到37℃预温的LB固体培养基上，加入3-5粒灭菌玻璃珠进行涂布摇匀。
j.倒置放置37℃温箱中过夜培养10-12小时，挑选阳性菌落。
注意：上述过程要严格无菌操作，减少杂菌，防止其影响大肠杆菌生长。
4.2阳性克隆扩增培养
a.在10ml玻璃管中加入37℃预温的4ml含有氨苄抗生素的LB液体培养基。
b.用10μl灭菌枪头挑取2-3个较单一，周围无杂菌，较边缘的菌落放入其中，标记名称。
c.放置37℃摇床摇3小时(可见LB培养基变浑浊)，则将摇好的菌液全部加入到200ml含有氨苄抗生素的LB培养基中。
d.放置37℃摇床，255转/分，摇12-24小时(可过夜)。
4.3质粒提取(EndoFree PlasmidMaxi Kit，QIAGEN，货号12362)
1)用前注意事项
a将RNaseAsolution加到BufferP1中，混匀，放置2-8℃。
b以1：1000的比例将Lyse Blue reagent加到BufferP1中。
c将BufferP3放置4℃预先冷却，检查BufferP2是否有沉淀。
d准备异丙醇。
e在endotoxin-free water中加入96-100％的乙醇40ml。
f使用无内毒素或无发热原的塑料制品。
2)收集菌体：将摇好的250ml细菌悬液用移液器吸取均分放进50ml离心筒内，4℃，6000g离心15分钟。
3)小心地弃去上清，用移液器吸除多余的上清，避免吸到菌体沉淀，加入10mlBufferP1重悬细菌。
4)再加入10ml BufferP2，混匀(上下颠倒4-6次)，室温下孵育5分钟，如果用LyseBlue reagent，溶液将会变蓝。
5)在孵育过程中，将QIAfilter cartridge cap套在QIAfilter Cartridge的出口喷嘴上，放在一个离心架上或用胶带固定至纸盒上。
6)在第四步后，加入10ml预先冷却的BufferP3，上下轻柔颠倒4-6次，混匀。如果用Lyse Blue reagent，则混匀到无色为止。
7)将溶菌产物加到QIAfiltercartridge的滚筒内，室温孵育10分钟，不要***活塞。10分钟后，移除Cap，在QIAfilter cartridge上***活塞，使溶菌产物过滤到新的50ml离心管中。
8)加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌产物中，上下颠倒10次混匀，冰上孵育30min。
9)用10ml Buffer QBT加入到QIAGEN-Tip，用于综合与平衡，并让其通过重力流下排空。
10)将第8步的溶菌产物加到QIAGEN-Tip，让其通过重力过滤流入Tip中，弃去收集的废液，此时质粒被吸附到Tip中。
11)用30ml Buffer QC洗QIAGEN-Tip两次。
12)加15ml Buffer QN到QIAGEN-Tip中洗脱DNA，并用无内毒素，无致热源的50ml离心管收集洗脱液。
13)用10.5ml室温的异丙醇沉淀并洗涤DNA，混匀，平均分成两份至15ml离心管离心，4℃，10000g，30分钟，弃上清时要小心。
14)用5ml无内毒素、室温的70％乙醇洗涤DNA，10000g离心20分钟。
15)让DNApellets在空气中干燥5-10min，用适量(500μl-1ml)的BufferTE
(endotoxin-free)完全溶解DNA，收集到无菌、无致热源1.5mlEP管中，测定浓度。
16)吸取20μl质粒溶液至1.5无菌EP管，送检测序。
实施例2稳定表达CAR的NK细胞的制备方法
1.NK细胞的分离纯化
1.1从脐带血中分选单个核细胞(UCBMC)
a.向sepmate离心管下层加满LymphoprepTM(STEMCELL Technologies)，300g离心2分钟去除气泡，吸掉上层多余液体。
b.以0.9％氯化钠溶液等比稀释脐带血，吹打混匀后沿管壁向SepMateTM-50管中轻轻注入，每管20ml。
c.1200g离心12分钟，离心机刹车采用升速3，降速3。
d.吸弃7-10ml上清(视白膜层所在位置而定，不要吸到白膜层)。
e.倒出含白膜层的上清至新的45ml离心管中，2管合并为1管，添加生理盐水至45ml。
f.500g离心8分钟，离心机刹车采用升速9，降速3。
g.以红细胞裂解液重悬沉淀，2管合并为1管，添加生理盐水至45ml，室温孵育5-8分钟。
h.800g离心5分钟，离心机刹车采用升速9，降速9。
i.以0.9％氯化钠溶液洗两次，去除红细胞裂解液，300g离心5分钟，离心机刹车采用升速9，降速9。
1.2UCBMC扩增培养
a.配制扩增培养基：40ml X-VIVOTM 15培养基(Lonza)+48μl IL-2(300IU/ml)+40μl IL-15(配置浓度50ng/μl，终浓度50ng/ml)+2.5μl IL-21(30ng/ml)。
b.以扩增培养基重悬上一步分选剩余的UCBMC，调整密度为1×106/ml。
c.将细胞悬液放入T75培养瓶中，每瓶20ml。
d.培养4天。
1.3分选NK细胞
a.收集扩增后的UCBMC，计数。
b.离心，弃上清，以EasySepTM(STEMCELLTechnologies)Buffer重悬细胞，调整密度为5×107/ml，将细胞转移至5ml分选专用管中，每管体积范围为0.25-2ml。
c.向细胞悬液中加入Isolation Cocktail 50μl/ml，吹打2-3次混匀，室温孵育5分钟。
d.震荡RapidSpheresTM 30秒，充分混匀。
e.向细胞悬液中加入RapidSpheresTM 50μl/ml，添加EasySepTM Buffer至总体积2.5ml，吹打2-3次混匀，放到磁力架中孵育3分钟。
f.拿起磁力架，将其翻转180°收集管中的液体至一个新的15ml离心管，悬空静置2-3秒，不要抖动也不要接触离心管口，倒出的液体中即含有分选得到的NK细胞。
g.离心，弃上清，加入适量X-VIVOTM 15培养基重悬。
1.4流式检测NK细胞表型
检测分选出的NK细胞纯度(CD3-CD56+)与活化受体(NKG2D)及抑制性受体(KIR2DL1)，具体操作如下：
a.收集细胞，重悬混匀并计数，取出0.5×106-1×106NK细胞于流式分析管中。
b.1000rpm离心5分钟，弃上清。
c.加入1ml PBS进行充分重悬混匀。
d.1000rpm离心5分钟，弃上清。
e.加入100μl预备好的流式分析鞘液和适量比例抗体(BD PharmingenTM，FITCMouse anti-Human CD56(NCAM-1)，PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD3，Biolegend TM，PE anti-human CD314(NKG2D)，PE anti-human CD158(KIR2DL1/S1/S3/S5)，轻轻震荡充分混匀，放于4℃避光孵育30分钟。
f.孵育后，再加入1ml流式分析鞘液充分混匀。
g.1000rpm离心5分钟，弃上清。
h.加入200-400μl流式分析鞘液，重悬混匀，等待上机。
流式细胞术检测结果显示，利用NK细胞特异性表面标志物CD56+CD3-检测NK细胞纯度，经过扩增培养的脐带血单个核细胞(UCBMC)中分选出的NK细胞能达到87.2％以上。并且其分选出的NK细胞的活化受体NKG2D表达率有96.8％，抑制受体表达率有19.5％(图3)，可用于后续电转。
2.电转
2.1预热培养基：将培养基放入37℃，5％CO2培养箱中预热(在12孔板中，每孔加入3ml的培养基，至少预热半小时)。
2.2 37℃，5％CO2孵育2小时后，重悬细胞，并计数，将适量的细胞转移到离心管中，2×106-3×106细胞/管/反应，200g离心10分钟，弃上清(在弃上清时，先倒掉上清，2分钟后，用200μl移液枪吸尽剩余的上清)。
准备电转液(Lonza，VPA-1005)：在1.5ml EP管中加入电转液，100μl/反应(82μlNucleofector转染溶液+18μl supplement补充物)。
2.3加入DNA质粒：在准备好的1.5ml EP管的电转液中加入DNA质粒，即5μgPiggyBac HER2-CAR-puro和5μg Super PiggyBac转座酶质粒(或者10μg:5μg，10μg:10μg)，并混匀。
其中，PiggyBac HER2-CAR-puro的构建方法为见实施例1。
2.4将质粒+电转液的混合液加入2.2的细胞管内。(注意：避免细胞在电转液中超过20分钟)
2.5一旦重悬混匀，马上转移到电转杯中(当转移的细胞悬液量多余电转程序设置量时，不能超过10％，且在转移的过程中要沿着杯壁加)，注意在转移时不能有气泡出现。
2.6电转：电转时轻拍电转杯底部确保液面覆盖底部。电转NK细胞采用Necleofector2b的U-001程序。
2.7将之前预热的12孔板和电转好的电转杯移至生物安全柜中，用小吸管吸取500μl左右预热的培养基加到电转杯中，慢慢重悬一至两次后，直接加到之前预热的12孔板的培养基中。
2.8孵育：在37℃，5％CO2培养箱中孵育2小时。
3.电转后培养
3.12小时后，观察细胞，有雾白色团块出现时加入1mg/ml DNA酶处理(DNA酶体积：细胞悬液体积＝1:100)，观察5分钟，看是否有解散开，如团块已散开则终止，重悬并收集细胞，140g离心8分钟，弃尽上清。
3.2加入适量的培养基重悬细胞，计数，调整为106个细胞/ml的浓度。
3.3将其放入合适的培养板或培养瓶中，在培养箱中过夜(注意：培养过程中细胞不能太密集，六孔板的每个孔中培养基量在5-6ml左右)。
3.4加入CD2/CD335磁珠(Miltenyi Biotec)刺激：培养24小时后，按CD2/CD335磁珠：转染NK细胞＝2:1的比例，加入CD2/CD335磁珠至转染的NK细胞中；并加入细胞因子IL-2(500IU/ml)、IL-21(30ng/ml)和IL-15(50ng/ml)。
注意：
1)复苏CD2/CD335磁珠时，涡旋>30秒，或倾斜和旋转5分钟。
2)将CD2/CD335磁珠所需的体积转移到1.5ml EP管中。
3)添加1ml的培养基，混匀。
4)以1000rpm离心5分钟，弃去上清液。
5)加入适量培养基混匀后，移至细胞悬液中。
3.5培养至3天左右，观察细胞的状态进行半量换液。半量换液时，IL-2(500IU/ml)、IL-21(30ng/ml)和IL-15(50ng/ml)按半量体积加入至培养瓶(孔)。
3.6每2天半量换液，按IL-2(500IU/ml)、IL-21(30ng/ml)和IL-15(50ng/ml)添加，观察细胞增殖状况，视情况传代。
3.7培养14-15天左右，观察细胞增殖状况，取细胞利用流式细胞术检测细胞标志及进行杀瘤活性验证。
分别在细胞电转过后的第1、5、7、9、11、12、14、15天观察细胞状态及对细胞进行细胞计数，细胞形态见图4。细胞数量从0.5×106增殖到36.5×106，扩增倍数为70倍以上(图5)。
需要说明的是，在未使用CD2/CD335磁珠刺激培养时，虽然CAR阳性率平均值为85％，但CAR-NK细胞增殖倍数较低，平均增殖倍数仅为6.82倍(图11)。在增加CD2/CD335磁珠培养后，增殖倍数增长至70倍以上(图5)。
4.流式细胞术检测CAR-NK的CAR阳性率
4.1收取5×106个细胞，以1000rpm转速离心5分钟，离心后丢弃上清液，加入适量鞘液混匀，将细胞均分入流式管内。
4.2在避光条件下，加入所要检测表型对应的抗体：CD3 PerCP-Cy5.5(BDPharmingen，Clone SP34-2)，CD56 FITC(BD Pharmingen，Clone B159)，Myc-Tag PE(CST，#3739)，将抗体与细胞悬液轻微混匀后置于4℃避光条件下孵育20分钟，孵育后每管加入1ml鞘液以1000rpm转速离心5分钟，离心后每管加入300μl鞘液，震荡后可上机检测。CAR结构中设计了Myc序列(图1)，利用检测Myc来分析CAR阳性率。
流式细胞术检测表明，培养15天后的CAR-NK细胞的CAR阳性率可以达到89.1％(图6)，且该CAR阳性表达并未使用抗生素筛选。以上结果表明，本发明构建培养的CAR-NK细胞具有较高的CAR阳性率，意味着其应该具备较好的靶向肿瘤杀伤功能。
实施例3携带CAR基因的NK细胞对靶细胞的效应实验
为了进一步验证携带CAR-Her2的NK细胞是否具有针对靶细胞的杀伤效应，我们采用CCK8分析肿瘤细胞杀伤及ELISA分析穿孔素(Perforin)与颗粒酶(Granzyme B)的产生，以此作为分析CAR-NK细胞效应的指标。CCK8试剂中的WST–8能被细胞线粒体中的脱氢酶氧化为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。颗粒酶与穿孔素是在NK细胞遭遇靶细胞时释放出来的对靶细胞具有杀伤效应的酶和糖蛋白。颗粒酶与穿孔素可以引起靶细胞表面质膜的穿孔和细胞凋亡。因此分析黄色甲臜物的数量，以及颗粒酶与穿孔素的产生可以作为分析CAR-NK细胞效应的一个有效手段。
其中，乳腺癌肿瘤细胞SK-BR-3天然表达Her2，我们利用慢病毒敲减Her2得到SK-BR-3 shHer2。肺腺癌细胞SPC-A-1不表达HER2，我们过表达Her2得到SPC-A-1Her2+(westernblot检测Her2表达，图7和图8)。肿瘤靶细胞构建好以后，按照每孔5000个接种至96孔板，培养24小时。将检测过CAR阳性率的NK细胞按照效靶比2:1，4:1，8:1，16:1共同孵育24小时。移除培养基和CAR-NK细胞，并用PBS溶液清洗孔板两次后，用CCK-8试剂定量检测剩余的肿瘤细胞活率。移除的培养基使用ELISA分析颗粒酶与穿孔素产生的数量。
CCK-8试剂检测结果表明，抗Her2的CAR-NK细胞对天然表达Her2的SK-BR-3乳腺癌细胞的杀伤作用显著大于对低表达Her2的SK-BR-3shHer2细胞的杀伤作用(图7)；同时，该CAR-NK细胞对过表达Her2的肺腺癌细胞SPC-A-1Her2+也显示出比不表达Her2的SPC-A-1癌细胞更强的杀伤作用(图8)。以上结果说明本发明培养出的CAR-NK细胞具有较好的Her2靶向能力。
此外，利用ELISA分析CAR-NK细胞发挥杀伤作用的颗粒酶与穿孔素也显示，在CAR-NK与肿瘤细胞(效靶比为2:1)的共培养体系中，杀伤作用较强的CAR-NK+SK-BR-3及CAR-NK+SPC-A-1Her2+其释放的穿孔素(图9)及颗粒酶(图10)也相对杀伤作用较弱的CAR-NK+SK-BR-3shHer2及CAR-NK+SPC-A-1少，特别是在穿孔素中尤为显著。以上结果进一步验证了本发明培养出的CAR-NK细胞具有较好的Her2靶向杀伤功能。
实施例4不同来源的NK细胞表达CAR的效率
目前可以从脐带血，NK细胞系，外周血，或者不同干细胞诱导获得NK细胞。本发明考查了不同来源的NK细胞利用piggybac转座子***电转构建CAR-NK细胞的转染效率。结果表明：仅脐带血来源的NK细胞具有较好的电转效率，达到89.1％(图6)；而其他几种来源的NK细胞，包括外周血分离培养的NK细胞、造血干细胞诱导的NK细胞和常见的NK细胞株NK92/MI，在使用piggybac转座子***电转及培养15天后CAR阳性百分率仅分别为0.51％、29.7％及0.012％(图12和图13)。因此，本发明采用脐带血来源的NK细胞构建CAR-NK是最优选的结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.稳定表达CAR的NK细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因通过PB转座子***导入NK细胞中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因选自基于第一代、第二代或第三代CAR-T技术构建的CAR基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因为基于第三代CAR-T技术构建的CAR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PB转座子***包括重组转座子质粒和PB转座酶质粒；
所述重组转座子质粒的构建方法包括：
(1)人工合成靶向癌细胞表面抗原HER2的CAR基因序列；
(2)pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体经酶切获得T2A-Puro基因片段；
(3)将CAR基因序列、T2A-Puro基因片段***转座子载体PB-EF1-MCS-IRES-Neo的XbaⅠ和SalⅠ酶切位点之间，以取代MCS-IRES-Neo元件。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用电转化的方法将所述PB转座子***转入NK细胞，获得转染的CAR-NK细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括对CAR-NK细胞进行体外扩增培养的步骤，具体如下：
将所述CAR-NK细胞与CD2/CD335磁珠接触，并加入200-800IU/mlIL-2、20-60ng/mlIL-21和30-100ng/mlIL-15进行共培养；
优选地，所述CAR-NK细胞与CD2/CD335磁珠的个数比为1:(0.5-5)。
7.根据权利要求1-6任一项所述方法，其特征在于，所述NK细胞为脐带血来源的NK细胞。
8.按照权利要求1-7任一项所述方法制备的稳定表达CAR的NK细胞。
9.权利要求8所述稳定表达CAR的NK细胞在制备抗肿瘤药物或组合物中的应用；
优选地，所述肿瘤为HER2阳性肿瘤。
10.一种抗肿瘤药物或组合物，其特征在于，有效成分为权利要求8所述稳定表达CAR的NK细胞。
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